우리는 자신의 자원을 사용할 수있는 기회뿐만 아니라 원고에 대한 자신의 귀중한 의견뿐만 아니라, 트리볼륨 라이브 이미징, 기술 지원을위한 스벤 플래스뿐만 아니라 일란 데이비스, 니콜 Grieder와 게롤드 슈비거블루밍 스톡 센터를 통해 자신의 형질전환 Drosophila 라인을 공유에 대한 자신의 자원을 사용할 수있는 기회에 감사드립니다.

1. 준비 작업
<ol><li>과학적 질문에 맞는 LSFM용 조명 렌즈/감지 렌즈/카메라 조합을 선택하고 현미경을 설정합니다. 시야의 크기는 카메라 칩 크기의 지수와 감지 렌즈의 배율입니다. 조명 렌즈는 전체 시야가 대략 평면 라이트시트(34)로덮여 있도록 선택해야 합니다. 권장되는 세 가지 조합은 표 1에나열됩니다.</li>
	<li>아가로즈 알리쿼트 및 회수 접시를 준비하려면 2g의 저연아가로즈를 200mL 의 자동 수돗물에 넣고 모든 아가로즈 입자가 용해될 때까지 600-800W의 전자레인지에 혼합물을 가열합니다. 1.5mL 또는 2mL 반응 튜브에 1mL 아가로즈 알리쿼트 몇 개 준비한 다음 아가로즈로 3-5mm 높이의 90mm Ø 페트리 요리를 채웁니다. 고형화된 알리코와 요리를 4°C에 보관하십시오.</li>
	<li>Drosophila의경우 : 신선한 사육 바이알을 준비하려면, 맞춤형 또는 시판 가능한 Drosophila 배지의 적절한 양을 요리하고, 넓은 유리병에 5-15 mL을 전송하고 4 ° C에 저장합니다. 달걀 누워 접시를 준비하려면 50mL의 오토클레이브 수돗물에 저용 아가로즈 1 g을 넣고 모든 아가로즈 입자가 용해될 때까지 600-800W의 전자 레인지에 혼합물을 가열합니다. 혼합물을 45°C로 식힌 다음 50mL 과일 주스(바람직하게는 사과 또는 붉은 포도)를 넣고 철저히 섞어 줍니다. 혼합물을 35mm Ø Petri 접시에 붓고 고형화된 달걀 누워 접시를 4°C에 저장합니다.</li>
	<li>트리볼륨의경우 : 성장 배지를 준비하려면 710 μm 메쉬 크기의 체로 통밀가루와 비활성 건조 효모를 통과한 다음 체질 된 밀가루를 체질 효모를 5 %(w /w)로 보충하십시오. 달걀 누워 매체를 준비하려면 250 μm 메쉬 크기의 체로 미세 밀가루와 비활성 건조 효모를 통과한 다음 체질 된 밀가루를 5 % (w / w) 체질 효모로 보충하십시오.</li>
</ol>2. 형광 마이크로스피어를 이용한 샘플 챔버 기반 LSFMs 의 교정
참고: 교정의 목적은 선명한 이미지의 전제이기 때문에 조명 및 검출렌즈(도 2A)의초점 지점을 정렬하는 것입니다. LSFM은 3-4주에 한 번 이상 정기적으로 보정해야 합니다.
<ol><li>80°C의 드라이 블록 히터/믹서에서 아가로즈 알리쿼트를 다시 액화한 다음 아가로즈 알리쿼트가 35°C까지 식힙니다.</li>
	<li>아가로즈 50 μL을 1.5mL 반응 튜브로 옮기고 형광 마이크로스피어 용액의 0.5 μL을 추가한다. 1분 동안 1,400rpm에서 섞으세요.</li>
	<li>거미줄 홀더의 구멍에 아가로즈/형광 마이크로스피어 용액 혼합물의 10μL로 채우고, 얇은 아가로즈 필름만 남아있을 때까지 가능한 한 많은 아가로즈를 흡인합니다. 30-60을 기다립니다.</li>
	<li>샘플 챔버를 자동 수돗물로 채웁니다. 거미줄 홀더를 샘플 챔버에 천천히 삽입하고 검출 렌즈 앞에 미세 번역 단계로 슬롯 구멍을 이동합니다.</li>
	<li>회전 스테이지로 거미줄 홀더를 일루미네이션(x) 및 검출(z) 축에 비해 45° 위치로 회전합니다. 거미줄 홀더는 전송 라이트 채널에 표시되지 않아야 합니다.</li>
	<li>각각의 형광 채널로 전환하고 형광 마이크로스피어가 적절한 신호를 제공하도록 레이저 전력뿐만 아니라 노출 시간을 조정한다.</li>
	<li>이제 횡방향 방향의 아가로즈 필름을 완전히 덮는 뷰 볼륨을 지정합니다. 각각의 조명 렌즈/검출 렌즈조합(34)에대해 최대한 가능한 축 분해능을 계산하여 z 간격을 정의한다. 또는, 4배의 측면 해상도는 대략적인 근사치로 사용될 수 있다.</li>
	<li>형광 마이크로스피어의 3차원 테스트 z 스택을 기록하고 x, y 및 z 최대 투영을 교정차트(그림 2)와비교한다. 마이크로스피어가 흐릿하게 나타나거나 퍼지거나 왜곡된경우(그림 2B,C)는조명 및/또는 검출 렌즈의 위치를 조정합니다.</li>
</ol>3. 드로소필라 배아 컬렉션
<ol><li>드로소필라 라인의 성인 100~200명을 영상 분석 전에 2-3일 전에 신선한 양육 바이알로 옮겨 계란 수집 문화를 확립합니다. 아직 존재하지 않는 경우, 자손 문화를 시작하기 위해 오래된 양육 바이알을 사용하는 것이 좋습니다. 성인이 2 주 이상 오래되지 않도록하려면 배아 수집 문화를 자손 문화로 교체하십시오.</li>
	<li>달걀 누워 접시를 실온에 데우고 한천 위에 효모 페이스트를 넣습니다.</li>
	<li>어른을 달걀 수집 문화에서 빈 좁은 유리병으로 옮기고 달걀 누워 접시 위에 놓습니다. 15분 동안 실온에서 달걀 컬렉션 설정을 배양합니다. 가능하면이 단계에서 마취 (감기, CO2)를피하십시오.</li>
	<li>어른을 양육 바이알로 되돌려 보냅니다. 달걀 누워 접시를 편리한 온도/시간 조합으로 배양한 다음, 달걀 누워 접시에서 100 μm 메쉬 크기의 세포 여과기로 작은 페인트 브러시로 10-20 배아를 옮긴다. 달걀 누워 접시를 버리십시오.</li>
	<li>각 드로소필라 라인에 대해 3.1~ 3.4단계를 반복합니다.</li>
</ol>4. 트리볼륨 배아 의 수집
참고: 편의를 위해 트리볼륨 계란 수집 절차의 계획이제공되며(그림 3A)는이 단계에서 괄호 내의 숫자도 참조한다.
<ol><li>알 수집문화(도 3A_01)를확립하기 위해 이미징 분석 전에 2-10일 전에 트리볼륨 라인의 200-300성인(약 400-700 mg)을 빈 1 L 유리 병으로 옮긴다. 50-100 g의 신선한 성장 매체로 병을 채웁니다. 아직 존재하지 않는 경우, 사용 가능한 애벌레와 강아지를 사용하여 자손 문화를 시작하는 것이 좋습니다. 성인이 생후 3개월 이상되지 않도록 하기 위해, 계란 수집 문화를 자손 문화로 대체하십시오.</li>
	<li>800 μm 메쉬 크기 체(그림 3A_02)를통해 계란 수집 문화를 전달합니다. 비단계 배아를 함유한 성장 배지를 초기병(그림 3A_03)으로되돌리고 성인을 빈 1L 유리병(도3A_04)으로이송한다. 계란 누워 매체 10 g(도 3A_05)를추가하고 1 시간(그림 3A_06,07)에대한 실온에서 계란 수집 설정을 배양.</li>
	<li>800 μm 메쉬 크기체(그림 3A_08)를통해 달걀 컬렉션 설정을 전달합니다. 초기 병에 성인을 반환(그림 3A_09). 이미지해야 하는 발달 과정에 따라, 현재 약 30-100개의 배아를 함유하고 있는 계란 누워 매체를 편리한 온도/시간조합(도 3A_10)에서배양한다.</li>
	<li>300 μm 메쉬 크기체(도 3A_11)를통해 계란 누워 배지를 통과하고 배아(도3A_12)를100μm 메쉬 크기의 세포 여과로 이송한다. 체질 계란 누워 매체를 폐기(그림 3A_13).</li>
	<li>각 트리볼륨 라인에 대해 4.1 ~ 4.4 단계를 반복합니다.</li>
</ol>5. 나트륨 하이포염소산 비초화
참고: 드로소필라와 트리볼륨 배아는 제거 후 습한 채 유지되는 한 적절한 발달에 필수적이지 않은 보호 및 광산단백질 층인 초리온(chorion)에 의해 덮여 있습니다. 두 종의 배아에 대한 비반향 프로토콜은 동일합니다.
<ol><li>A1, A2, A3 및 B3 우물을 8mL의 오토클레이브 수돗물과 B1 및 B2 우물을 7mL의 오토클레이브 수돗물과 1mL의 나트륨 하이포염염(NaOCl) 용액(그림3B)으로채우어 6웰 플레이트를 준비한다. 스테레오 현미경으로, 이상적으로 전송 광에서 점등 공정을 관찰하십시오. 주의: 염산염 나트륨은 부식성입니다.</li>
	<li>배아 함유 세포 스트레이너(3.4단계 및/또는 4.4단계)를 A1에 잘 삽입하고 부드러운 동요 하에서 약 30-60s의 배아를 세척합니다.</li>
	<li>세포 스트레이너를 B1로 잘 이동시키고 플레이트를 30초 동안 격렬하게 흔들어 A2로 잘 옮긴 다음 부드러운 동요 하에서 1분 동안 배아를 씻습니다.</li>
	<li>세포 스트레이너를 B2로 잘 이동시키고 대부분의 배아가 완전히 비반향(도 3C)될때까지 격렬하게 플레이트를 흔들어 서 A3로 옮기고 부드러운 동요 하에서 1 분 동안 배아를 씻습니다.</li>
	<li>장착 절차를 진행하기 전에 셀 스트레이너를 B3에 잘 보관하십시오.</li>
	<li>각 줄에 대해 5.1에서 5.5단계를 반복합니다.</li>
</ol>6. 거미줄 홀더를 사용하여 여러 배아의 장착
<ol><li>80°C의 드라이 블록 히터/믹서에서 아가로즈 알리쿼트를 다시 액화한 다음 아가로즈 알리쿼트가 35°C까지 식힙니다.</li>
	<li>거미줄 홀더의 구멍 위에 아가로즈의 파이프 10 μL. 파이펫 팁으로 아가로즈를 구멍 에 퍼뜨리고, 얇은 아가로즈 필름만 남을 때까지 가능한 한 많은 아가로즈를 흡인합니다. 30-60을 기다립니다.</li>
	<li>각 라인에 대해 작은 페인트 브러시로 하나 이상의 배아를 조심스럽게 선택하고 아가로즈 필름에 놓습니다.</li>
	<li>구멍구멍의 긴 축을 따라 배아를 정렬한 다음 전방 후방 축을 슬롯 구멍의 긴 축(도3D)과정렬합니다.</li>
	<li>아가로오스의 1-2 μL을 배아와 아가로즈 필름 사이의 간격으로 배아를 피펫팅하여 배아를 조심스럽게 안정화시다. 30-60을 기다립니다.</li>
	<li>장착된 배아와 함께 거미줄 홀더를 천천히 이미지 버퍼 로 채워진 샘플 챔버에 삽입합니다.</li>
</ol>7. 샘플 챔버 기반 LSFM에서 비교 라이브 이미징
<ol><li>검출 렌즈 앞에 마이크로 번역 단계로 배아 중 하나를 이동합니다. 거미줄 홀더가 조명(x) 및 검출(z) 축(참조) 축(참조) 및 감지(그림 1C)에비해 45° 위치에 있는지 확인합니다.</li>
	<li>전송 광 채널에서 배아를 시야의 중심으로 이동합니다. 거미줄 홀더를 표시해서는 안 됩니다.</li>
	<li>배아의 중비행기가 초점 평면과 겹치때까지, 즉 윤곽선이 날카로울 때까지 z의 마이크로 번역 스테이지로 배아를 이동합니다. 형광 채널로 전환하지 않고 미드 플레인에서 250 μm을 양방향으로 이동하여 뷰 볼륨을 지정합니다.</li>
	<li>선택적으로, 여러 방향을 따라 이미징이 필요한 경우, 배아를 적절히 회전시키고 7.2 및 7.3 단계를 반복한다. 거미줄 홀더는 90°의 단계에서 최대 4개의 방향을 지원합니다.</li>
	<li>cobweb 홀더에 장착된 다른 모든 배아에 대해 7.1 ~ 7.3(또는 7.4)을 반복한다(도3E). 최상부 배아가 검출 렌즈 앞에 있을 때 가장 상부 배아가 이미징 버퍼를 남기지 않도록 하십시오.</li>
	<li>형광 채널(레이저 파워, 노출 시간, 검출 필터) 및 시간 경과(간격, 총 지속 시간) 매개 변수를 정의하고 이미징 프로세스를 시작합니다. 표시 값의 경우 예제 데이터 집합의 메타데이터테이블(보충 표 1)을참조하십시오. 며칠 동안 지속되는 아세의 경우, 증발을 줄이기 위해 적어도 부분적으로 샘플 챔버 개구부를 덮는 것이 좋습니다.</li>
</ol>8. 이미지 배아의 회수 및 추가 재배
<ol><li>이미징 분석이 끝나면 샘플 챔버에서 거미줄 홀더를 조심스럽게 제거하십시오.</li>
	<li>작은 페인트 브러시로 아가로즈 필름에서 배아를 분리하고 적절하게 표지된 현미경 슬라이드로 옮겨냅니다. 슬라이드를 검색 접시에 넣고 각 표준 양육 조건하에서 인큐베이션합니다.</li>
	<li>실험 양식에 관해서는, 배아 발생이 완료될 때 추정합니다. 부화 시점이 다가오면 검색 접시를 자주 확인하고 부화한 드로소필라 애벌레를 개별 사육 바이알과 트리볼륨 애벌레로 24웰 플레이트의 개별 우물로 옮겨놓습니다. 성장 매체로 우물을 절반까지 채웁니다. 각 표준 양육 조건하에서 인큐베이션.</li>
	<li>관찰 된 개인이 성인이되면, 적절한 짝짓기 파트너를 제공하고 며칠 후 자손을 확인하십시오.</li>
</ol>9. 이미지 데이터 처리 및 메타데이터 설명서
참고: 이미지 데이터 처리를 위해 ImageJ 는피지(35)를 유도하는 것이 좋습니다(imagej.net/Fiji/Downloads). FIJI는 설치가 필요하지 않으며 32- 64 비트 버전을 사용할 수 있습니다. LSFM 데이터에 가장 자주 사용되는 형식 중 하나는 TIFF 컨테이너 형태로 이미지 스택을 저장할 수 있는 태그가 지정된 이미지 파일 형식(TIFF)입니다.
<ol><li>모든 z 스택에 대한 z 최대 투영을 계산합니다(이미지| 스택 | Z 프로젝트, 최대 강도를선택). 최대 투영은 공간 치수수를 3개에서 2개로 줄이는 데이터 단순화 접근 방식입니다. 일괄 처리를 위한 FIJI 스크립트가제공됩니다(보충 파일 1).</li>
	<li>각 z 최대 투영을 연결하여 시간 스택(t 스택)을 만듭니다. 이를 하나의 TIFF 컨테이너에 저장합니다. 모든 기록된 배아뿐만 아니라 해당되는 경우 각 방향 및 형광 채널을 위해 이 작업을 수행하십시오.</li>
	<li>z축 주위의 z 및 t 스택을 회전하여 배아의 전방 후방 축을 x 또는 y 이미지축(이미지 | | 변환 회전). x 및 y 이미지 축에 있는 세 개의 이미지 축과 t 스택을 모두 따라 z 스택을 자르면 배아 주위의 최소 버퍼 공간(x 및 y 축을 따라 20-40 픽셀, z 축을 따라 5-10 개의 이미지)만 남아 있습니다(이미지 | 조정 | x 및 y 축용 캔버스 크기, 이미지 | 스택 | 도구 | z 축에 대한 슬라이스 키퍼).<ol>
<li>모든 기록된 배아뿐만 아니라 해당되는 경우 개별적으로 이 작업을 수행하십시오. 해당되는 경우 형광 채널은 동일한 회전 및 자르기 매개 변수로 처리되어야 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>메타데이터를 가능한 한 자세히 문서화합니다. 지침으로 대표 결과 섹션에 나와 있는 예제 데이터 집합의 메타데이터 테이블을 사용할 수있습니다(보충표 1).</li>
</ol>10. 데이터 시각화
참고: 이 데이터 시각화 지침은 주로 여러 방향 및/또는 시간이 지남에 따라 여러 개의 기록된 배아를 표시하는 z 최대 프로젝션 이미지 행렬을 만드는 데 중점을 둡니다. 다음 단계는 표시된 수치 및 대표 결과 섹션에 연결된 비디오를 만들기 위해 예제 데이터 집합에 적용된 데이터 시각화 절차를 설명합니다.
<ol><li>여러 방향의 t 스택을 결합(이미지 | 스택 | 도구 | 결합)및/또는 여러 형광 채널병합(이미지 | 색상 | 채널병합) 생물학적 구조 및/또는 관심 있는 과정을 시각화합니다.</li>
	<li>t 스택의 강도를 조정(이미지 | 조정 | 밝기/대비)필요에 따라 "설정" 함수를 사용합니다. 표시최소 값은 배경 신호 보다 약간 높게 설정되어야 하며, 표시된 최대 값은 편리한 콘트라스트를 초래해야 합니다. 각 z 스택을 일관되게 조정하는 데 사용할 수 있는 두 값을 모두 문서화합니다. "적용"함수를 사용하여 각인 조정. 실험 양식에 따라 기록된 모든 배아를 동일한 값으로 처리하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>강도 조정 된 t 스택을 별도의 파일로 저장하고 조정되지 않은 t 스택을 재정의하지 않습니다. 전용 이미지 선택 기능(예: 이미지 | 조정된 t 스택에서 적절한 하위 스택을 컴필레이트합니다. 스택 | 도구 | 슬라이스 키퍼)몽타주 도구를 사용(이미지 | 스택 | 몽타주를 확인)그림 디자인에 사용할 수있는 이미지 그리드를 만들 수 있습니다.</li>
</ol>

저자는 공개 할 것이 없습니다.

LSFM의 독점적 인 응용 분야 중 하나는 발달 생물학입니다. 이 분야에서, 살아있는 표본을 보는 것이 중요합니다, 그렇지 않으면 형태 유전학 과정은 동적 방식으로 설명 될 수 없다. 여기에 설명된 바와 같이 샘플 챔버 기반 LSFM에서 동시 라이브 이미징을 위한 실험 프레임워크는 두 가지 주요 이유로 편리합니다.
순차적인 라이브 이미징에서 피할 수 없는 주변 분산은 적극적으로 해결할 수 있습니다. 곤충 배아 관련 라이브 이미징에서, 우리는 예를 들면, 다음 감수성을 봅습니다. 계란 수집 문화는 배아 수집시에 다른 나이를 가질 수 있습니다. 드로소필라에서,이것은 자손45의자질에 영향을 미친다는 것을 보여주었습니다. 적절히 비동기화된 배양으로 작업하는 것이 선택사항이지만 동기화된 문화와의 동시 이미징은 훨씬 더 편리합니다. 드로소필라와 트리볼륨기반의 대표적인 결과는 동기화된 계란 수집 배양에서 파생되며, 다른 형광 특성이 부모의 노화의 의도하지 않은 효과라는 것을 자신있게 배제할 수 있습니다.
비하염나트륨에 장기간 노출되면 배아 생존가능성이 감소하기 때문에 불반향은 중요한 단계입니다. 불편하게도, 나트륨 하이포염의 이온 강도는 시간이 지남에 따라 감소합니다. 이온 강도의 측정은46이면가능하지만 힘들고 번거롭습니다. 동시 라이브 이미징에서, 마스터 믹스는 모든 라인 및/또는 비반향 관련 6웰 플레이트의 제조 중에 조건에 사용될 수 있다.
효율적인 공기 상태를 가진 실험실에서도 작지만 불규칙한 온도 변동이 불가피하며 온도 제어9 샘플 챔버 기반 LSFM에 영향을 미칩니다. 동시 라이브 이미징에서 이러한 변동은 또한 발생하지만 모든 배아에도 똑같이 영향을 미칩니다.
실용적인 관점에서, 다중 태아의 동시 화상 진찰을 위한 프로토콜은 처리량을 증가시킵니다. 라이브 이미징에서 개발 과정의 기간은 주어진 기간 내에 수행 될 수있는 얼마나 많은 애법을 결정하며, 이는 LSFM에 대한 액세스가 제한될 때 중요한 고려 사항입니다. 장기 기록을 위한 주요 예는 세포가 추적되는 살아있는 화상 진찰 삽서입니다. 이러한 실험은 일반적으로 긴 개발 기간에 걸쳐 범위. 드로소필라의 배아 발달은 실온47에서하루 정도 걸리지만 트리볼륨은 약 7일48일입니다. 따라서,이 종의 경우, 병렬화는 특히 많은 조건이 비교되는 아약과 관련하여 합리적인 기간 내에 남아 있는 것이 필수적입니다.
처리량, 즉, 동시에 배양되는 배아의 수는 주로 두 가지 요인에 의해 제한됩니다: 첫째는 샘플 챔버 내의 y 축을 따라 사용할 수 있는 공간이다. 가장 낮은 배아가 이미지될 때, 가장 상부 배아는 화상 진찰 완충을 남겨두지 않아야 합니다. 또한, cobweb 홀더 및 관련 지원 시스템은 z 스택 기록 과정에서 눈에 띄게 흔들리거나 불안감이 너무 길어서는 안 됩니다. 두 번째는 의도된 시간적 해결입니다. 배아당 기록 시간은 z 스택당 비행기 수(보통 10-200ms)를 z 스택당 평면 수(보통 수백 개), 채널 수(보통 1~3개), 방향 수(보통 1~8개) 및 번역 및 회전 이동에 대한 설정 의존인수(1.2~1.5사이 추정)로 곱하여 대략화될 수 있다. 의도된 측두해상도와 배아당 기록 시간의 비율은 동시에 이미지화될 수 있는 배아의 최대 수를 나타낸다. 요약하자면, 당사의 프로토콜은 순차적인 라이브 이미징에서 중간 처리량으로 진행하는 것이 적절하지만 일반적으로 높은 처리량으로 간주되는 것에는 적합하지 않습니다. 후자의 경우, 현미경 슬라이드49,50,51 또는 웰플레이트(52)에 적합한 LSFM은 고려할 수 있지만 이러한 구현에는 일반적으로 다른 제한이 있습니다.
실험적 질문에 따라 이미징 파라미터와 함께 조명 렌즈/검출 렌즈/카메라 조합에 따라 동시에 이미지된 LSFM 데이터 세트는 원시 상태의 방대한 저장 공간이 필요할 수 있습니다. 이 문제는 제공된 Drosophila 예제 데이터 집합(보충표 1)즉 DS0001-3을 고려하여 가장 잘 설명될 수 있습니다. 각 2차원 원시 이미지는 약 2.8메가바이트의 데이터 볼륨을 가지고 있으며, 각 원시 z 스택은 120평면으로 구성되었으며, 3개의 배아는 모두 총 143회 4방향으로 기록되었다. 그 결과 원시 데이터 집합은 테라바이트의 절반 정도를 차지했습니다. 이미지 데이터 처리를 통해, 즉 ZIP 기반 압축과 함께 모든 공간 치수(9단계)를 따라 자르면서 데이터 볼륨이 53.3기가바이트로 감소하여 초기 금액의 약 10%를 감소시게 하였다. 테라바이트 정권의 데이터 세트를 처리하기 위해, 피지에 사전 설치된 BigDataViewer53 플러그인(플러그인 | 빅데이터뷰어)를추천합니다.
대표 결과 섹션에 설명된 5가지 시나리오 외에도 당사의 프로토콜은 Tribolium54에서인기있는 접근 방식인 RNAi 녹다운 효과의 효과를 특성화하는 데 사용할 수도 있습니다. 그러나, 대조군 배아의 동시 이미징이 불가능하기 때문에 가장 간단한 접근법인 이미징 버퍼를 통해 이를 적용해야 하는 화합물(예를 들어, 살충제 또는 기타 생화학적 스트레스)의 분석을 위한 제한된 사용만이다.
당사는 맞춤형 현미경8,55를사용하여 프로토콜을 시연했지만, OpenSPIM56 또는 대부분의 상용 LSM과 같은 모든 샘플 챔버 기반 설정에 적용할 수 있습니다. 이 프로토콜은 초보자가 경량 시트 기반 기술을 연구 계획에 적극적으로 통합하도록 장려하는 것을 목표로 하는 LSFM 관련 리소스 설립 이니셔티브를 보완합니다. 현재 대부분의 대학과 기관은 잘 갖추어진 형광 현미경시설(57)을운영하고 있습니다. 이들은 일반적으로 하나 이상의 챔버 기반 LSFM에 대한 액세스를 제공하지만, 직원은 손에 모든 과학적 질문에 대한 적절한 실험 솔루션을 기대할 수 없습니다.
우리의 결과는 우리의 실험 프레임 워크가 Drosophila와 트리볼륨에적합하다는 것을 보여줍니다. 우리는 우리의 비교 중심 의정서가 그밖 곤충 종의 배아 발생을 연구하기 위하여 이용될 수 있다는 것을 확신합니다. 예를 들어, LSFM 기반 접근 방식은 스커틀 플라이 메가셀리아 abdita58의야생 형 및 녹다운 개발을 비교하기 위해 적용되었으며 후속 연구는 장착 방법의 이점을 누릴 수 있습니다. 또한, 형광 라이브이미징(59)을 위해 특별히 설계된 2개의 발견된 크리켓 그릴루스 양막염의 형질전환선은 이용 가능하지만, 현재 이용 가능한 유일한 비교 중심프로토콜(60)은 기존의 반전 현미경을 위한 것이므로 3차원 이미지 수집 또는 샘플 회전을 다루지 않는다. 추가적으로, 거미줄 홀더는 이미 배아 발생61동안 그들의 모양을 상당히 바꾸는 제브라피시를 위한 편리한 선택이다는 것을 이미 보여주었습니다. 기본적으로 최적화 노력이 필요하지 않은 프로토콜의 적응은 이 모델 유기체에 대해서도 위에서 설명한 이점을 제공할 것입니다.

형광 현미경 검사는 특히 세포 및 발달 생물학에서 생명 과학에서 가장 필수적인 이미징 기술 중 하나입니다. 1990년대 중반부터 3차원 형광 영상에 대한 최첨단 형광 현미경1에서동일한 렌즈가 형광 발암 및 방출 광 검출에 사용된다. 조명 레이저 빔은 조명/검출 축을 따라 모든 형광을 자극하고 핀홀에 의해 검출되기 전에 각각의 초점이 벗어난 신호가 차별된다. 따라서 각 2차원 이미지에 대해 전체 표본이 조명됩니다. 따라서, 각 3차원 이미지, 즉 공간적으로 연속적인 2차원 이미지의 스택에 대해, 전체 표본은 12~수백배2의조명을 통해 광표백 및광독성3를촉진한다.
거의 20년 전, 광시트 기반 기술4는 3차원 형광 이미징을 위한 유망한 대안으로 등장하여 발달 생물학5에서귀중한 도구가 되었습니다. 이 접근 방식에서는 조명 및 감지가 분리됩니다. 조명 렌즈는 수직으로 배열된 검출 렌즈의 초점 평면 내에서 몇 마이크로미터의 깊이만 있는 라이트 시트를 생성하는 데 사용됩니다. 따라서 각 2차원 이미지에 대해 초점 평면 주위의 얇은 평면 부피만 조명됩니다. 따라서, 각 입체 이미지에 대해, 전체 표본은 한 번만 조명되어 광표백 및 광독성6을강하게 감소시다. 이러한 이유로, 광 시트 형광 현미경 (LSFM)은 여러 생물학적으로 관련된 비늘에 복잡한 프로세스를 연구하는 효율적인 솔루션을 제공하므로, 따라서, 개발 생물학에서 특히 가치, 여기서 몇 밀리미터만큼 큰 표본은 세포 극이하 수준에서 분석되어야.
역사적으로 LSFM은 챔버 기반7,8을샘플링했습니다. 이러한 설정에서 조명(x) 및 검출(z) 축은 일반적으로 중력 축(y)에 수직으로 배열됩니다. 샘플 챔버는 충분한 실험적 자유를 제공합니다. 첫째, 그들은 차례로 환경을 제어하기 위해 관류 시스템의 사용을 용이하게 큰 이미징 버퍼 용량을 제공합니다, 예를 들어, 특정온도를 유지하거나 생화학 적 스트레스를 적용. 또한, 시편의 동적 11, 무결성을 유지하면서 각각의 실험 요구에 맞는 맞춤형 장착방법(10)을 지원합니다. 또한, 샘플 챔버 기반 설정은 일반적으로 y 축 을 중심으로 표본을 회전시키고 따라서 2, 4 또는 더 많은 방향을 따라 이미지를 그리는 데 사용되는 회전 기능이 장착되어 있습니다. 일반적으로 사용되는 모델 유기체의 배아는 현미경 검사법의 맥락에서, 상대적으로 크고 연속적인 화상 진찰이 복부-등주, 측면 및/또는 전방 후방 바디 축을 보다 포괄적인 표현을 제공한다. 이를 통해 예를 들어, 복잡한 3차원 마이그레이션 경로를 따라 이동하는 셀의 장기추적(12,13)을허용한다.
광시트 계형현미경검사는 드로소필라 멜라노가스터의배아 형태발생을 연구하기 위해 광범위하게 적용되었으며, 둘 다 체계적으로14,15뿐만 아니라 발달의 생물물리학적 측면에 대한 구체적인 초점을 맞추고 있다. 예를 들어, 고분해능 형태유전학 데이터를 수집하여 생식기연신기(16)의 내막질 질 및 축 확장 사이의 생체 기계적 연관성을 검출하고,가스화(17)동안 힘 발생 패턴과 복잡한 세포 흐름을 더욱 연관시키는 데 사용되었다. 또한 다른 최첨단 기술, 예를 들어, 표피18에서전방 후방 패터닝 중 Wnt 신호의 조절을 조사하기 위해 광유전학과 결합되었다.
그러나, 단 하나의 종을 공부하는 것은 개발의 진화에 대한 통찰력을 제공하지 않습니다. 계통 유전학 적 맥락 내에서 배아 발생을 이해하기 위해, 집중적 인 연구는 대체 곤충 모델 유기체와 함께 실시되었습니다. 가장 포괄적으로 조사된 종 중 하나는 적색 밀가루 딱정벌레 트리볼륨 카스타늄(Tribolium castaneum)으로,경제적으로 관련된 저장된 곡물해충(19)이며,배아 형태발생또한 이미 LSFM20으로체계적으로 이미지화되었다. 이 두 종의 배아 형태발생은 여러 양상에서 현저하게 다르다, 예를 들어, 세분화모드(21)뿐만아니라 엑스트라 배아막(22)의형성 및 분해. 후자의 측면은 이미 LSFM을 사용하여 광범위하게 분석되었습니다. 예를 들어, 그 배아 발생23,24의더 나은 부분에 대한 다양한 위험으로부터 트리볼륨 배아를 포위하고 보호하는 엑스트라 배아 조직인 세로사는 등쪽 폐쇄25시 자체 철수 과정을 위한 형태유전학적 "운전자"로 작용하는 것으로 나타났다. 또한, 위트포송 시, 블라스트로드름의 특정 부위가 비대칭 조직 운동을 만들기 위해 비텔린 막에 고정되어있으며, 이러한 관찰에 따라 지역화된 조직 유동화를 통해 세포가 세로사 창폐쇄(27)동안 세포가 순차적으로 세로사 가장자리를 떠날 수 있다는 것이 입증되었다.
모든 드로소필라에서- 그리고 Tribolium-연관된 연구 위에서 인용, 견본 챔버 기지를 둔 LSFM가 이용되었습니다. 대부분의 경우, 배아는 샘플 회전 기능을 사용하여 여러 방향을 따라 기록되었다. 명시적으로 명시되지는 않지만, 트리볼륨20,28에대한 이전 작업과 유사한 순차적인 라이브 이미징 소에서 개별적으로 서로 독립적으로 기록되었다고 가정할 수 있습니다. 특정 시나리오에서는 이러한 접근 방식이 허용되지만 특히 양적 비교 접근 방식에서는 주변 분산이 결과를 왜곡할 수 있습니다. 예를 들어, 곤충의 발달 속도가 온도의존29라는것은 오랫동안 알려져 왔지만, 최근 연구에 따르면 드로소필라에서는온도가 모르포겐(30)의 농도에도 영향을 미칠 수 있음을 시사한다. 따라서, 배아 발생의 특정 특성, 예를 들어, 세포의 동적 비율, 분할 비율 및 이주 속도, 정확하게 정량화되어야하며, 주변 분산이 없는 충분한 반복이 필요하다. 이렇게 하면 표준 편차 및 표준 오류를 최소화하므로 다른 실험 조건과 병치가 용이합니다.
그러나 샘플 챔버 기반 LSFM은 주로 높은 처리량 애서가 아닌 높은 함량을 위해 설계되었습니다. 일반적으로 현미경 슬라이드, 페트리 접시 및 웰 플레이트에 대한 표준화된 클램프 메커니즘이 장착된 공초점 현미경과 달리 거의 모든 샘플 챔버 기반 LSFM은 실린더 기반 클램프 메커니즘을 사용합니다. 이러한 메커니즘은 회전 호환뿐만 아니라 비침습적10인맞춤형 샘플 홀더를 위한 것이지만 일반적으로 둘 이상의 표본20,31,32를위해 설계되지 는 않습니다. 샘플 챔버 기반 설정의 장점이 손상되지 않는 두 개 이상의 배아의 동시 라이브 이미징을 위한 프레임워크는 주변 분산 문제를 해결하여 비교 연구를 위한 LSFMs의 가치를 증가시합니다.
우리의 프로토콜에서, 우리는 y 축이 배아를 "스택"하는 옵션으로 사용되는 샘플 챔버 기반 LSFM(도 1A)에서비교 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 제시한다. 첫째, 우리는 교정 도우미가 부족한 기기에 특히 중요한 샘플 챔버 기반 LSFM에 대한 형광 마이크로스피어 기반 교정 지침을 제공합니다. 둘째, 시료 회전과 호환되는 거미줄홀더(28)(도 1B)를기반으로 다중 배아에 대한 장착 방법을 설명하고 따라서 다중 방향을 따라 다중 시편의 동시 이미징을 허용한다(도1C). 몇몇 배아는 얇은 아가로즈 필름 위에 정렬되고, 샘플 챔버에 삽입 한 후, 3 차원 이미지를 얻기 위해 라이트 시트를 통해 연속적으로 이동. 셋째, 드로소필라와 트리볼륨에대한 세 가지 모범적인 라이브 이미징 데이터 세트를 제공합니다. 전자의 경우 형광으로 표지된 핵을 가진 형질전환선을 병치합니다. 후자의 경우 동일한 트랜스진을 운반하는 트랜스제닉 하위 라인의 성능을 비교하지만 다른 게놈 위치에서 비교합니다. 마지막으로, 비교 라이브 이미징 및 주변분산(33)과관련하여 병렬화의 중요성에 대해 논의하고, 실험 프레임워크의 처리량 한계에 대해 논의하고 다른 모델 유기체에 대한 접근 방식의 적응을 평가합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Orange Scientific</td>
			<td>4430500</td>
			<td>&#160;</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>24-well plate</td>
			<td>Orange Scientific</td>
			<td>4430300</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>35-mm &#216; Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>153066</td>
			<td>Only for live imaging involving Drosophila.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>90-mm &#216; Petri dish</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>L9004575</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100-&#181;m mesh size cell strainer</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352360</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>250-&#181;m mesh size sieve</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>200.025.222-038</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>300-&#181;m mesh size sieve</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>200.025.222-040</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>710-&#181;m mesh size sieve</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>200.025.222-050</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>800-&#181;m mesh size sieve</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>200.025.222-051</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>405 fine wheat flour</td>
			<td>Demeter e.V.</td>
			<td>SP061006</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>commercially available Drosophila medium</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>66-115</td>
			<td>Only for live imaging involving Drosophila / Custom-made Drosophila medium may also be used</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fluorescent microspheres, 1.0 &#181;m &#216;</td>
			<td>Thermo Fisher Scientific</td>
			<td>T7282</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>inactive dry yeast</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>62-108</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>low-melt agarose</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>6351.2</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>narrow vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-109</td>
			<td>Only for live imaging involving Drosophila</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>small paint brush</td>
			<td>VWR International</td>
			<td>149-2121</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium hypochlorite (NaOCl), ~12% active Cl</td>
			<td>Carl Roth</td>
			<td>9062.3</td>
			<td>Caution: sodium hypochlorite is corrosive</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>whole wheat flour</td>
			<td>Demeter e.V.</td>
			<td>SP061036</td>
			<td>Only for live imaging involving Tribolium / United Kingdom: wholemeal flour</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>wide vials</td>
			<td>Genesee Scientific</td>
			<td>32-110</td>
			<td>Only for live imaging involving Drosophila</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

simultaneous live imaging of multiple insect embryos in sample chamber-based light sheet fluorescence microscopes

광 시트 기반 형광 현미경 검사는 여러 생물학적 관련 저울에서 복잡한 프로세스를 연구하는 효율적인 솔루션을 제공합니다. 시편의 3차원 무결성을 보존하도록 특별히 설계된 샘플 챔버 기반 설정은 일반적으로 샘플 회전을 특징으로 하며, 발달 생물학에서 최선의 선택입니다. 예를 들어, 그들은 과일 플라이 Drosophila 멜라노가스터와 붉은 밀가루 딱정벌레 트리볼륨 카스타뉴움의전체 배아 형태 발생을 문서화하는 데 사용되었습니다. 그러나, 유효한 많은 살아있는 화상 진찰 프로토콜은 단 하나 태아를 위한 단지 실험적인 프레임 워크를 제공합니다. 특히 비교 연구를 위해 순차적으로 이미지된 표본이 주변 분산의 영향을 받고 있기 때문에 이러한 접근 방식이 불편합니다. 또한, 이것은 주어진 시간 내에 분석될 수 있는 표본의 수를 제한한다. 당사는 샘플 챔버 기반 설정의 처리량을 증가시키고 따라서 모든 표본에 대해 유사한 주변 조건을 보장하는 동시 라이브 이미징을 위한 실험 프레임워크를 제공합니다. 첫째, 우리는 광 시트 형광 현미경에 대한 교정 지침을 제공합니다. 둘째, 샘플 회전과 호환되는 다중 배아에 대한 장착 방법을 제안합니다. 셋째, Drosophila의예시적인 3차원 라이브 이미징 데이터 세트를 제공하며, 3개의 형질표시 핵과 트리볼륨을병치하여 동일한 트랜스유전자를 운반하는 3개의 트랜스제닉 서브라인의 성능을 비교하지만 다른 게놈 위치에서 제공합니다. 우리의 프로토콜은 항상 순차적인 라이브 이미징에 항상 존재하는 주변 분산을 적극적으로 해결하므로 비교 연구를 위해 특별히 설계되었습니다. 이는 녹아웃 실험과 같은 비정상적인 표현형의 정량적 분석 및 특성화에 특히 중요합니다. 또한, 전체 처리량을 증가시킵니다, 이는 광시트 형광 현미경에 접근할 때 매우 편리하며, 이는 제한적이다. 마지막으로, 제안된 장착 방법은 기본적으로 최적화 노력이 없는 다른 곤충 종 및 추가 모델 유기체(예: 제브라피시)에 적응할 수 있다.

우리의 프로토콜은 샘플 챔버 기반 LSFM에서 비교 형광 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명합니다. 예를 들어, 프레임워크는 두 종 이상의 종의 배아,(ii) 하나 이상의 유전자가 두개 이상의 유전자를 두드리고, (iii) 동일한 형질형 선의 다발배, (iv) 다른 형질대사로부터의 배아, 또는 동일한 트랜스젠선으로부터의 배아를 병치하는 데 사용될 수 있다. 그러나 다른 게놈 위치에서. 이 섹션에서는 마지막 두 시나리오에 대한 예제를 제공합니다.
우리의 첫번째 예시적인 응용프로그램에서, 우리는 대략 1일의 기간 동안 다른 형질전환 Drosophila 선(표 2)에서파생되는 3개의 태아의 형광 신호 역학을 보여줍니다(도 4, 보충 영화 1). 이러한 라인의 경우, 우리는 그들 모두가 다른 아마도 유비쿼터스 및 구성 활성 프로모터의 제어하에 핵 지역화 EGFP / GFP를 표현하기 때문에 오히려 유사한 형광 패턴을 기대했다. 그러나, 우리의 비교 라이브 이미징 결과 주변 분산으로 인해 확실히 이차 효과 되지 않는 표현 패턴에 강한 현면 차이가 있다는 것을 보여줍니다.
두 번째 적용 예에서는, 우리는 AGOC{Zen1'#O(LA)-mEmerald} #1, #2 및 #3(Zen1'LA-mE #1, #2 및 #3) 트랜스제닉 트리볼륨 서브라인(36)에서파생된 3개의 배아의 성능을 비교한다. 이들 모두는 mEmerald 연결37 Lifeact38의 발현에 이르게 동일한 돼지박 기반의 트랜스진을 수행 저크누엘트 139 프로모터, 세로사 사양에 관련된 전사 인자. 위트레이션 중 세로사 창 폐쇄 과정을 보여주는 비교 라이브 이미징 결과는 서브라인 #2 다른 두 하위라인(그림 5,보충 영화 2)보다 훨씬 더 강한 전체 신호를 제공한다는것을 시사합니다. 이는 또한 트리볼륨에서게놈 컨텍스트가 발현 카세트를 운반하는 전분의 발현 수준에 강한 영향을 미칠 수 있음을 나타낸다.
이 섹션에 표시된 모든 6개의 태아의 성공적인 검색은 우리의 프로토콜의 단계 8에 기술된 것과 같이 가능했습니다. 그들 모두는 완전 기능및 비옥한 성인으로 발전(보충 표 1,"검색" 행), 전체 절차, 장착에 대한 불반향에서 기록에 이르기까지, 비 침습적이었다는 것을 나타내는. 야생형 개발이 예상될 때마다, 예를 들어 하나 이상의 유전자가 쓰러지거나 쓰러지는 배아와 동시에 이미지되는 조절 배아와 관련하여 이러한 수준의 품질 관리가 필수적입니다.
대표 적인 결과를 만드는 데 사용된 모든 데이터 집합은 특히 LSFM 초보자가 자신의 작업의 품질을 평가하는 데 도움이 되는 리소스로 제공됩니다. 디지털 개체 식별자 기반 다운로드 링크는 메타데이터테이블(보조 표 1,"데이터 액세스"행)에서 찾을 수 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61713/61713fig01.jpg"> 그림 1: 실험 프레임워크 및 장착 방법 개요입니다. (A)짧은 미리 알림과 필요한 시간의 추정과 10 개의 프로토콜 단계의 순서도. 별표로 표시된 작업은 모든 분석 중에 수행 될 필요는 없지만 상황에 따라 수행됩니다. 녹색 상자는 Drosophila 및/또는 Tribolium과관련되었던 단계를 나타내며, 파란색 상자는 현미경 검사법과 관련된 단계를 나타냅니다. (B)거미줄 홀더의 세부 도면. 제시된 설계는 샘플 챔버 기반 LSFM에 일반적으로 사용되는 실린더 기반 클램프 메커니즘에 적합합니다. 홀더는 검출 렌즈의 작동 거리를 존중하는 한 확장할 수 있습니다. (C)여러 방향을 따라 다중 배아의 라이브 이미징을 위한 기록 서열. 처음에는 상위 배아의 z 스택이 최대 4개의 방향(즉, 0°, 90°, 180°및 270°)에 따라 기록됩니다. 이어서, 아래 배아는 검출 렌즈 앞에서 이동하고 기록/회전 시퀀스가 새롭게 시작된다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61713/61713fig01large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61713/61713fig02v2.jpg"> 그림 2: LSFM용 형광 마이크로스피어 기반 교정 차트. 이 차트는 LSFM이 올바르게 보정된 경우 x, y 및 z 최대 투영에 형광 마이크로스피어가 나타나는 방식을 보여줍니다(A),또는조명(B)또는 검출 오프셋(C)이 있는 경우. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61713/61713fig02large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61713/61713fig03v2.jpg"> 그림 3: 여러 배아의 수집, 반향, 마운팅 및 이미징. (A) 트리볼륨 배아 수집 개요. 그림은 왼쪽 상단의 숫자에 따라 4 단계 전체에 걸쳐 인용됩니다. (B)5단계에서 사용되는 6웰 플레이트에 대한 준비 및 전송 방식. B1 및 B2 우물에는 희석된 저염나트륨(NaOCl)이 함유되어 있어 비반향을 유발합니다. (C)100 μm 세포 스트레이너는 B2 내에서 배아를 하나의 우물에서 다른 우물로 옮기는 데 사용되었다. 상층상 이미지는 세포 스트레이너 메쉬 위에 여러 트리볼륨 배아의 클로즈업을 보여 주며, 상세 이미지는 부분적으로 분리된 초리온을 가진 여러 트리볼륨 배아의 전송 광 스테레오 현미경 이미지를 나타낸다. (D)3개의 장착트리볼륨 배아를 가진 거미줄 홀더. 배아뿐만 아니라 전방 후방 축은 슬롯 구멍의 긴 축을 따라 정렬되었습니다. (E)3개의 배아의 기록 동안 LSFM의 샘플 챔버 내의 거미줄 홀더의 이동. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61713/61713fig03large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61713/61713fig04.jpg"> 그림 4: #01691, #29724 및 #24163 트랜스제닉 Drosophila 라인에서 각각 하나의 배아의 비교 형광 라이브 이미징. 배아는 20:00 h의 기간 (23:40 h의 총 화상 진찰 기간에서) 2개의 (기록된 4개의) 방향을 따라 표시됩니다. 시간이 지남에 따라 동적 강도 보정이 수행되지 않았습니다. Drosophila 데이터 집합에 대한 메타데이터는 보충 표 1에서찾을 수 있습니다. 이미지 조정을 통해 ZA, Z 최대 프로젝션. 스케일 바, 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61713/61713fig04large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/61713/61713fig05.jpg"> 그림 5: 젠1'LA-mE #1, #2 및 #3 형질전환 트리볼륨 서브라인에서 각각 하나의 배아의 비교 형광 라이브 이미징. (A)배아는 세로사 창 폐쇄 직전에 위화 시 4가지 방향으로 표시됩니다. (B)배아는 01:30 h(총 이미징 기간 118:00h)에 걸쳐 통풍구를 나타내고 있다. 이미지 조정은 동일한 최소 값과 최대 표시값으로 수행되었으며 시간이 지남에 따라 동적 강도 보정이 수행되지 않았습니다. 트리볼륨 데이터 집합에 대한 메타데이터는 보충 표 1에서찾을 수 있습니다. 데이터 집합은(A)에표시된 스테이지에 동기화되었습니다. 이미지 조정을 통해 ZA, Z 최대 프로젝션. 스케일 바, 100 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/61713/61713fig05large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>조합</td>
			<td>근거</td>
			<td>조명 렌즈</td>
			<td>감지 렌즈</td>
			<td>사진기</td>
			<td>참조</td>
		</tr>
<tr>
<td>#1</td>
			<td>세포 수준에서 전체 배아, 큰 픽셀 간격 (작은 데이터 볼륨)</td>
			<td>2.5× 배율 수치 조리개 0.06 (공기)</td>
			<td>10× 배율 수치 조리개 0.3 (물 담그기)</td>
			<td>1.4 메가 픽셀CCD (1392×1040, 6.45 μm 피치)</td>
			<td>이 연구, 드로소필라41,트리볼륨20,41 
</td>
		</tr>
<tr>
<td>#2</td>
			<td>세포/세포 외 수준, 작은 픽셀 간격(대용량 데이터 볼륨)의 전체 배아</td>
			<td>2.5× 배율 수치 조리개 0.06 (공기)</td>
			<td>20× 배율 수치 조리개 0.5 (물 담그기)</td>
			<td>5.5 메가 픽셀 (2560×2160, 6.5 μm 피치)와 sCMOS</td>
			<td>트리볼륨9</td>
		</tr>
<tr>
<td>#3</td>
			<td>해부된 세균대42,43의 라이브 이미징과 같은 세포 외 수준 또는 특수 응용 분야의 배아의 특정 영역
</td>
			<td>5.0× 배율 수치 조리개 0.16 (공기)</td>
			<td>40× 배율 수치 조리개 0.75 (물 담그기)</td>
			<td>1.4 메가 픽셀CCD (1392×1040, 6.45 μm 피치)</td>
			<td>트리볼륨44</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: LSFM을 사용하여 드로소필라와 트리볼륨 배아의 라이브 이미징을 위한 권장 조명 렌즈/검출 렌즈/카메라 조합. 모든 조합은 이전 연구에서 성공적으로 사용되었습니다(참조 행 참조). 대부분의 샘플 챔버 기반 LSFM은 검출을 위해 수질 침지 렌즈를 사용하며, 주로 굴절률 1.33(예: 자동 수돗물 또는 기타 수성 물질)이 있는 이미징 버퍼를 위해 설계되었습니다. 다른 굴절률을 가진 이미징 버퍼는40을사용할 수 있지만, 이는 작업 거리와 같은 광학 시스템의 특정 특성을 변경합니다.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>줄</td>
			<td>유전자 형</td>
			<td>플루오로포레 발현</td>
		</tr>
<tr>
<td>#01691</td>
			<td>y[1] w[67c23]; P{w[+mC]=Ubi-GFP.nls}ID-2; P{Ubi-GFP.nls}ID-3</td>
			<td>폴리비비퀴틴 프로모터의 통제하에 있는 NLS-GFP</td>
		</tr>
<tr>
<td>#29724</td>
			<td>w [*]; P{w[+mC]=Tub84B-EGFP.NLS}3</td>
			<td>알파 튜룰린 84B 프로모터의 제어하에 있는 NLS-GFP</td>
		</tr>
<tr>
<td>#24163</td>
			<td>w [*]; P{w[+mC]=His2Av-EGFP.C}2/SM6a</td>
			<td>모든 셀에서 EGFP 라벨히스톤 2A 변종</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 첫 번째 응용 프로그램 예제에서 사용되는 세 가지 형질전환 Drosophila 라인. "라인" 열은 블루밍턴 드로소필라 주식 센터(bdsc.indiana.edu) 주식 번호를 나타냅니다.
보충 비디오 1: #01691, #29724 및 #24163 형질 전환 성 Drosophila 라인에서 각각 하나의 배아의 비교 형광 라이브 이미징. 각 형질전환선은 유비쿼터스 및 구성 활성 프로모터를 제어할 때 핵국산화 EGFP/GFP를 표현합니다. 이미지 조정을 통해 ZA, Z 최대 프로젝션. 시간이 지남에 따라 동적 강도 보정이 수행되지 않았습니다. 이미지 조정을 통해 ZA, Z 최대 프로젝션. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61713/Supplementary_Video_1_JQ.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보조 비디오 2: 젠1'LA-mE #1, #2 및 #3 트랜스제닉 트리볼륨 서브라인에서 각각 하나의 배아의 비교 형광 라이브 이미징. 각 형질 전환기 서브라인은 체르크울트 1 프로모터의 통제하에 있는 mEmerald 라벨이 부착된 Lifeact를 표현하며, 세로사 사양에 관련된 전사 인자를 표현합니다. 젠1'LA-mE #1 배아는 세로사 창 폐쇄 직후 세로사 내에서 약 90°로 변합니다. 데이터 집합은 그림 4A에표시된 스테이지에 동기화되었습니다. 이미지 조정은 동일한 최소 값과 최대 표시값으로 수행되었으며 시간이 지남에 따라 동적 강도 보정이 수행되지 않았습니다. 배아는 48:00 h. ZA의 기간 동안 통풍구 및 측면으로 표시되며, Z 최대 프로젝션은 이미지 조정을 합니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61713/Supplementary_Video_2_JQ.avi" target="_blank">이 비디오를 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보충 파일 1: 하나의 폴더 내의 모든 z 스택에서 z 최대 투영의 자동화 된 계산을위한 FIJI 배치 처리 스크립트. 드래그 앤 드롭을 통해 피지에서 스크립트를 열 수 있습니다. 시작 시("실행")에서는 입력 폴더만 지정해야 합니다. 출력 하위 폴더("Z 최대 투영")가 자동으로 생성됩니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61713/Supplementary_File_1_FIJI_Batch_Processing_Script.zip" target="_blank">이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>
보조 표 1: 장기 라이브 이미징 데이터에 대한 메타데이터 및 매개변수는 DS0001-6을 설정합니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/61713/20_07_11_JoVE_LiveImaging_SupplementaryTable1_Revision.docx" target="_blank">이 테이블을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

광 시트 기반 형광 현미경 검사는 발달 생물학에서 가장 가치있는 도구입니다. 비교 연구의 주요 문제는 주변 분산입니다. 우리의 프로토콜은 여러 표본의 동시 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명하고, 따라서, 적극적으로이 문제를 해결.

샘플 챔버 기반 광시트 형광 현미경에서 여러 곤충 배아의 동시 라이브 이미징

Light sheet-based fluorescence microscopy offers efficient solutions to study complex processes on multiple biologically relevant scales. Sample ...

simultaneous-live-imaging-multiple-insect-embryos-sample-chamber

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

2.9K 조회수.  Goethe-Universität. 광 시트 기반 형광 현미경 검사는 발달 생물학에서 가장 가치있는 도구입니다. 비교 연구의 주요 문제는 주변 분산입니다. 우리의 프로토콜은 여러 표본의 동시 라이브 이미징을위한 실험 프레임 워크를 설명하고, 따라서, 적극적으로이 문제를 해결.

비디오: Simultaneous Live Imaging of Multiple Insect Embryos in Sample Chamber-Based Light Sheet Fluorescence Microscopes

Two-photon axotomy and time-lapse confocal imaging in live zebrafish embryos

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo. Here we describe a method to mount zebrafish embryos for long-term imaging and demonstrate how to automate the capture of time-lapse images using a confocal microscope. We also describe a method to create controlled, precise damage to individual branches of peripheral sensory axons in zebrafish using the focused power of a femtosecond laser mounted on a two-photon microscope. The parameters for successful two-photon axotomy must be optimized for each microscope. We will demonstrate two-photon axotomy on both a custom built two-photon microscope and a Zeiss 510 confocal/two-photon to provide two examples.

Zebrafish trigeminal sensory neurons can be visualized in a transgenic line expressing GFP driven by a sensory neuron specific promoter 1. We have adapted this zebrafish trigeminal model to directly observe sensory axon regeneration in living zebrafish embryos. Embryos are anesthetized with tricaine and positioned within a drop of agarose as it solidifies. Immobilized embryos are sealed within an imaging chamber filled with phenylthiourea (PTU) Ringers. We have found that embryos can be continuously imaged in these chambers for 12-48 hours. A single confocal image is then captured to determine the desired site of axotomy. The region of interest is located on the two-photon microscope by imaging the sensory axons under low, non-damaging power. After zooming in on the desired site of axotomy, the power is increased and a single scan of that defined region is sufficient to sever the axon. Multiple location time-lapse imaging is then set up on a confocal microscope to directly observe axonal recovery from injury.

Here we describe a method for mounting zebrafish embryos for long-term imaging, two-photon imaging and tissue-damage techniques, and time-lapse confocal imaging.

라이브 zebrafish의 배아에서 두 광자의 axotomy하고 시간이 경과 공촛점 영상

Zebrafish have long been utilized to study the cellular and molecular mechanisms of development by time-lapse imaging of the living transparent embryo.  ...

연구

생물학

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

의 준비 Drosophila</em공중 드롭 프로토콜을 사용하여 라이브 영상을위한> 태아

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

Time-lapse Imaging of Mitosis After siRNA Transfection

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and cellular content. Hallmark events of mitosis, such as chromosome movement, can be readily tracked on an individual cell basis using time-lapse fluorescence microscopy of mammalian cell lines expressing specific GFP-tagged proteins. In combination with RNAi-based depletion, this can be a powerful method for pinpointing the stage(s) of mitosis where defects occur after levels of a particular protein have been lowered. In this protocol, we present a basic method for assessing the effect of depleting a potential mitotic regulatory protein on the timing of mitosis. Cells are transfected with siRNA, placed in a stage-top incubation chamber, and imaged using an automated fluorescence microscope. We describe how to use software to set up a time-lapse experiment, how to process the image sequences to make either still-image montages or movies, and how to quantify and analyze the timing of mitotic stages using a cell-line expressing mCherry-tagged histone H2B. Finally, we discuss important considerations for designing a time-lapse experiment. This strategy is complementary to other approaches and offers the advantages of 1) sensitivity to changes in kinetics that might not be observed when looking at cells as a population and 2) analysis of mitosis without the need to synchronize the cell cycle using drug treatments. The visual information from such imaging experiments not only allows the sub-stages of mitosis to be assessed, but can also provide unexpected insight that would not be apparent from cell cycle analysis by FACS.

Here we describe a basic protocol to image and quantify the mitotic timing of live mammalian tissue culture cells after siRNA transfection.

siRNA Transfection 후의 유사 분열의 시간 저속 영상

Changes in cellular organization and chromosome dynamics that occur during mitosis are tightly coordinated to ensure accurate inheritance of genomic and ...

Monitoring Plasmid Replication in Live Mammalian Cells over Multiple Generations by Fluorescence Microscopy

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells. Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus (EBV) and Kaposi's Sarcoma-associated herpesvirus (KSHV), which cause multiple human malignancies 1-3. These two genomes are replicated in a licensed manner, each using a single viral protein and cellular replication machinery, and are passed to daughter cells during cell division despite their lacking traditional centromeres 4-8.
Much work has been done to characterize the replications of these plasmid genomes using methods such as Southern blotting and fluorescence in situ hybridization (FISH). These methods are limited, though. Quantitative PCR and Southern blots provide information about the average number of plasmids per cell in a population of cells. FISH is a single-cell assay that reveals both the average number and the distribution of plasmids per cell in the population of cells but is static, allowing no information about the parent or progeny of the examined cell.
Here, we describe a method for visualizing plasmids in live cells. This method is based on the binding of a fluorescently tagged lactose repressor protein to multiple sites in the plasmid of interest 9. The DNA of interest is engineered to include approximately 250 tandem repeats of the lactose operator (LacO) sequence. LacO is specifically bound by the lactose repressor protein (LacI), which can be fused to a fluorescent protein. The fusion protein can either be expressed from the engineered plasmid or introduced by a retroviral vector. In this way, the DNA molecules are fluorescently tagged and therefore become visible via fluorescence microscopy. The fusion protein is blocked from binding the plasmid DNA by culturing cells in the presence of IPTG until the plasmids are ready to be viewed.
This system allows the plasmids to be monitored in living cells through several generations, revealing properties of their synthesis and partitioning to daughter cells. Ideal cells are adherent, easily transfected, and have large nuclei. This technique has been used to determine that 84% of EBV-derived plasmids are synthesized each generation and 88% of the newly synthesized plasmids partition faithfully to daughter cells in HeLa cells. Pairs of these EBV plasmids were seen to be tethered to or associated with sister chromatids after their synthesis in S-phase until they were seen to separate as the sister chromatids separated in Anaphase10. The method is currently being used to study replication of KSHV genomes in HeLa cells and SLK cells. HeLa cells are immortalized human epithelial cells, and SLK cells are immortalized human endothelial cells. Though SLK cells were originally derived from a KSHV lesion, neither the HeLa nor SLK cell line naturally harbors KSHV genomes11. In addition to studying viral replication, this visualization technique can be used to investigate the effects of the addition, removal, or mutation of various DNA sequence elements on synthesis, localization, and partitioning of other recombinant plasmid DNAs.

A method of observing individual DNA molecules in live cells is described. The technique is based on the binding of a fluorescently tagged lac repressor protein to binding sites engineered into the DNA of interest. This method can be adapted to follow many recombinant DNAs in live cells over time.

형광 현미경으로 여러 세대 이상 라이브 포유류의 세포에 플라스미드 복제 모니터링

Few naturally-occurring plasmids are maintained in mammalian cells.  Among these are genomes of gamma-herpesviruses, including Epstein-Barr virus  (EBV) ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Multilayer Mounting for Long-term Light Sheet Microscopy of Zebrafish

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is particularly suited for long-term time-lapse imaging over many hours up to several days. However, an appropriate sample mounting strategy is needed that offers both confinement and normal development of the sample. Multilayer mounting, a new embedding technique using low-concentration agarose in optically clear tubes, now overcomes this limitation and unleashes the full potential of light sheet microscopy for real-time developmental biology.

The development of zebrafish can be followed over days with light sheet microscopy when embryos are embedded in optically clear polymer tubes with low-concentration agarose.

다층 제브라 피쉬의 장기 라이트 시트 현미경에 장착

Light sheet microscopy is the ideal imaging technique to study zebrafish embryonic development. Due to minimal photo-toxicity and bleaching, it is ...

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces photo-bleaching and phototoxic effects compared to confocal microscopy, while providing 3D images with subcellular resolution. Here we present the setup of a light sheet based microscope, which is composed of an upright microscope and a small set of opto-mechanical elements for the generation of the light sheet. The protocol describes how to build, align the microscope and characterize the light sheet. In addition, it details how to implement the method for in toto imaging of C. elegans embryos using a simple observation chamber. The method allows the capture of 3D two-colors time-lapse movies over few hours of development. This should ease the tracking of cell shape, cell divisions and tagged proteins over long periods of time.

Setting Up a Simple Light Sheet Microscope for In Toto Imaging of C. elegans Development

This protocol describes the setup of a light sheet microscope and its implementation for in vivo imaging of C. elegans embryos.

에 대한 간단한 라이트 시트 현미경 설정<em&gt; 토토에서</em&gt; 이미징<em&gt; C. 엘레</em&gt; 개발

Fast and low phototoxic imaging techniques are pre-requisite to study the development of organisms in toto. Light sheet based microscopy reduces ...

Sample Preparation for Single Virion Atomic Force Microscopy and Super-resolution Fluorescence Imaging

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule imaging assays which allows adhesion of single virions to glass surfaces with specificity. This preparation is based on grafting the surface of the glass with a mixture of PLL-g-PEG and PLL-g-PEG-Biotin, adding a layer of avidin, and finally creating virion anchors through attachment of biotinylated virus specific antibodies. We have applied this technique across a range of experiments including atomic force microscopy (AFM) and super-resolution fluorescence imaging. This sample preparation method results in a control adhesion of the virions to the surface.

The attachment of virions to a surface is a requirement for single virion imaging by Super-resolution fluorescence imaging or atomic force microscopy (AFM). Here we demonstrate a sample preparation method for controlled adhesion of virions to glass surfaces suitable for use in AFM and super-resolution fluorescence imaging.

단일 비리온 원자력 현미경 검사및 초분해성 형광 이미징을 위한 샘플 준비

Immobilization of virions to glass surfaces is a critical step in single virion imaging. Here we present a technique&#160;adopted from single molecule ...

Semi-automated Imaging of Tissue-specific Fluorescence in Zebrafish Embryos

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are frequently used to identify chemicals that modulate gene expression. Chemical screens that assay fluorescence in live zebrafish often rely on expensive, specialized equipment for high content screening. We describe a procedure using a standard epifluorescence microscope with a motorized stage to automatically image zebrafish embryos and detect tissue-specific fluorescence. Using transgenic zebrafish that report estrogen receptor activity via expression of GFP, we developed a semi-automated procedure to screen for estrogen receptor ligands that activate the reporter in a tissue-specific manner. In this video we describe procedures for arraying zebrafish embryos at 24-48 hours post fertilization (hpf) in a 96-well plate and adding small molecules that bind estrogen receptors. At 72-96 hpf, images of each well from the entire plate are automatically collected and manually inspected for tissue-specific fluorescence. This protocol demonstrates the ability to detect estrogens that activate receptors in heart valves but not in liver.

Described here is a protocol for semi-automated imaging of tissue-specific fluorescence in zebrafish embryos.

Zebrafish의 태아의 조직 특이 형광의 반 자동화 이미징

Zebrafish embryos are a powerful tool for large-scale screening of small molecules. Transgenic zebrafish that express fluorescent reporter proteins are ...

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) maintain the turnover of all mature blood cell lineages. The coordination of the complex signals leading to specific HSC fates relies upon the interaction between HSCs and the intricate bone marrow microenvironment, which is still poorly understood[1-2].
We describe how by combining a newly developed specimen holder for stable animal positioning with multi-step confocal and two-photon in vivo imaging techniques, it is possible to obtain high-resolution 3D stacks containing HSPCs and their surrounding niches and to monitor them over time through multi-point time-lapse imaging. High definition imaging allows detecting ex vivo labeled hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) residing within the bone marrow. Moreover, multi-point time-lapse 3D imaging, obtained with faster acquisition settings, provides accurate information about HSPC movement and the reciprocal interactions between HSPCs and stroma cells.
Tracking of HSPCs in relation to GFP positive osteoblastic cells is shown as an exemplary application of this method. This technique can be utilized to track any appropriately labeled hematopoietic or stromal cell of interest within the mouse calvarium bone marrow space.

In Vivo 4-Dimensional Tracking of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells in Adult Mouse Calvarial Bone Marrow

The nature of the interactions between hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) and bone marrow niches is poorly understood. Custom hardware modifications and a multi-step acquisition protocol allow the use of two-photon and confocal microscopy to image ex vivo labeled HSPCs homed within bone marrow areas, tracking interactions and movement.

성인 마우스 두개골 골수에서 조혈 줄기 및 전구 세포의 생체 내 4 차원 추적에서

Through a delicate balance between quiescence and proliferation, self renewal and production of differentiated progeny, hematopoietic stem cells (HSCs) ...