Name: isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications
Uploaded: 2017-05-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 29 s
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이 작품은 NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] 및 P30 DK034987 [UNC-Chapel Hill에]의 NIH 교부금으로 지원되었습니다. 저자는 qPCR 및 웨스턴 블랏 실험에 대한 도움을 주신 Deekshita Ramanarayanan에게 감사드립니다.

이 프로토콜은 노스 캐롤라이나 대학 (University of North Carolina)의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 승인되고 수행됩니다. 1. 준비 사항 <ol><li> 트리톤 -X 버퍼 (1 % 트리톤 X-100, 5mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 인산염 완충 생리 식염수 (PBS), pH 7.4)를 준비한다. 500 mL를 만들려면 Triton X-100과 500 mM EDTA 각각 5 mL를 PBS 490 mL, pH 7.4에 넣으십시오. 4 ℃에서 Triton-X 완충 용액을 보관하십시오. </li><li> 고 염분 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 140 mM NaCl, 1.5 M KCl, 5 mM EDTA, 0.5 % Triton X-100, 이중 증류수 (dd) H 2 O에서 부피를 높임)를 준비한다. 500 mL를 만들 때 : 0.5 M Tris-HCl (pH 7.6) 10 mL, 5 M NaCl 14 mL, KCl 55.9 g, 0.5 M EDTA 5 mL 및 트리톤 X-100 2.5 mL를 넣고 부피를 500 mL). 4 ° C에서 고 염분 완충 용액을 보관하십시오. </li><li> 사용하기 바로 전에 적절한 양의 Triton-X와 High Salt Buffer ( <em&gt; 25 mL 조직 샘플 당 1 mL)를 프로테아제 또는 프로 테아 제 / 포스 파타 아제 억제제 칵테일로 처리하고 억제제가 포함 된 사용하지 않은 완충액을 버립니다. </li><li> 1X PBS, 산도 7.4에서 5 MM EDTA를 준비합니다. 500 mL를 만들려면 0.5 M EDTA 5 mL를 1X PBS (pH 7.4) 495 mL로 저어줍니다. </li><li> 수의과 지침 및 기관 표준을 준수하는 승인 된 프로토콜을 사용하여 다른 마우스 장기 (뇌, 심장, 폐, 간, 췌장, 결장, 내장, 신장, 비장)를 분리하십시오. 조직 수집 절차는 protease가 풍부한 조직 ( 예 : 췌장을 먼저 처리해야 함)의 RNA 및 단백질 완전성을 보존하기 위해 5 분 이상 걸리지 않아야합니다. </li><li> IF 유전자 발현을위한 후속 RNA 추출, cDNA 합성 및 정량적 실시간 PCR 분석을 위해 소량의 조직 (~ 5 ~ 20mg)을 잘라내어 RNA 보관 용액에 넣으십시오. 밤새 4 ° C에서 조직과 RNA 저장 솔루션 튜브를 배치하고 추가로 s의 제조 업체 프로토콜을 따르십시오torage 및 격리 단계. </li><li> 조직의 나머지 부분을 작은 조각 ( 예 : 0.5cm)으로 자르고 냉동 보관하십시오. 장기 보관을 위해 -80 ° C 또는 액체 질소에서 바이 얼을 고정하고 저장하십시오. </li></ol> 2. IF 유전자 발현 분석 <ol><li> RNA 저장 용액 시약으로 보존 된 조직에서 RNA를 추출합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 적합한 / 바람직한 RNA 추출 방법을 사용하십시오. </li><li> RNA 농도를 정량하고 RNA의 2 μg을 사용하여 제조 업체의 프로토콜에 따라 적절한 역전사 키트를 사용하여 cDNA를 생성합니다. </li><li> 생성 된 cDNA 및 마우스 IF 유전자 특이 적 프라이머를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 블랭크 컨트롤뿐만 아니라 각 샘플의 3 가지 기술 복제를 포함하여 qPCR 반응을 셋업 하였다. </li><li> IF 유전자 발현을 다른 조건 ( 예 : 젊은 조직 대 오래된 조직)을 비교 한 배수 변화로 정량화하십시오. </li></ol> 3. PImmunoblot에 대한 전체 조직 용 해물의 배상 <ol><li> 2x 비 환원성 SDS 시료 완충액 1 mL에 조직 25 mg을 균질화한다. 단백질 농도를 정량하기 위해 비색계 단백질 분석을 수행해야하는 경우 샘플 버퍼에서 bromophenol blue 염료를 생략하십시오. </li><li> 환원 된 시료를 만들기 위해 2- 메르 캅토 에탄올 (2-ME) 5 % (v / v)를 첨가하십시오. 비 환원 시료 200 μL에 2-ME 10 μL를 첨가합니다. </li><li> 세제 및 환원제 호환 단백질 분석을 사용하여 단백질 농도를 결정하십시오. 염료가 이미 시료 완충액에 포함되어있는 경우, 쿠마시 (Coomassie) 기반 얼룩 24를 비롯한 다양한 기술을 통해 겔을 실행 한 후 단백질 양을 추정 할 수 있습니다. </li><li> 95 ° C에서 5 분간 가열 한 후 모든 시료를 소용돌이 친다. </li><li> 환원 조건과 비 환원 조건 모두에서 웨스턴 블 랏팅을 수행하십시오. 막을 단시간에 (&lt;1 분) 노출시켜 단량체 종을 나타내며, 더 길게 (&gt; 1 분) 고 분자량 복합체를 나타냄.IF 단백질. 응집체를 모니터링하는 경우 전체 겔 / 멤브레인 (겔 웰의 바닥 포함)을 검사하십시오. </li><li> 병렬 젤을 실행하고 단백질 얼룩과 함께 로딩 컨트롤 24 로 얼룩. 질병 모델이나 상해 실험에서, 총 단백질 얼룩은 로딩 대조군으로 사용되어야한다. 대조군은 다른 스트레스 조건 하에서 변화하기 때문에 &#39;하우스 키핑&#39;단백질 ( 예 : 액틴, GAPDH)에 대한 면역 블록과 대조적이다. </li></ol> 4. 조직 특이적인 IF의 세제 가용성 및 고염 추출물의 제조 <ol><li> 빙냉 Triton X-100 완충액 1 mL를 유리 튜브 균질화기에 넣고 얼음 위에 놓습니다. </li><li> 액체 질소 저장 장치에서 작은 조각 (~ 25mg)을 꺼내고 유리 균질기에 직접 놓습니다. 균질화 (50 스트로크) 및 거품 생성을 피하기 위해 폴리 테트라 플루오르 에틸렌 유봉을 사용하십시오. 항상 균질 기와 lysate를 보관하십시오. </li><li> lysate를 1.5 mL micr로 옮긴다.미리 냉각 된 원심 분리기 (4 ° C)에서 10 분 동안 20,000 xg에서 얼음과 원심 분리기에 튜브를 원심 분리하십시오. </li><li> 상등액 분획을 별도의 튜브에 수집합니다. 이것은 Triton X-soluble fraction으로 면역 침전 (IP) 및 IF 단백질의 세제 가용성 풀 분석에 사용할 수 있습니다. 뇌 조직에서 더 깨끗한 IF 추출물을 얻으려면 4.1-4.4 단계를 반복해야합니다. </li><li> 조직 펠렛에 1 mL의 High Salt Buffer를 넣고 깨끗한 균질기로 옮겨 100 스트로크를 내 보낸다. 균질 물을 다시 마이크로 원심 분리 관으로 옮기고 차가운 방에있는 회전 진탕기에 1 시간 동안 튜브를 놓습니다. </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 20,000 xg에서 균질 물을 원심 분리한다. 뜨는 물을 버린다. </li><li> 펠렛에 얼음처럼 차가운 PBS / EDTA 버퍼 1 ML을 추가하고 최종 정리 단계 *로 깨끗한 균질 기에서 펠렛 (20 스트로크)를 균질. 새로운 튜브로 옮기고 4 ℃에서 10 분 동안 20,000 xg에서 원심 분리하여 IF 단백질 -풍부한 고염 추출물 (HSE). * 선택적으로,이 단계에서 균질화 대신에 와동. </li><li> 뜨는을 버리고 사전 가열 된 비 환원성 SDS 샘플 버퍼 300 μL에 알약을 용해. 초기에 pipetting과 vortexing으로 pellet을 분리 한 후 95 ℃에서 5 분간 시료를 가열한다. </li><li> 펠렛이 녹아있는 것을 확인하기 위해 필요에 따라 와동과 피펫을 사용하십시오. 알약을 완전히 녹이기까지 몇 분이 걸릴 수 있습니다. </li><li> 분석 전까지 -20 ° C에서 모든 시료를 보관하십시오. </li></ol> 5. 대량 실험에서 IF 단백질 추출을위한 자동화 된 조직 용해 <ol><li> RNA 추출의 경우 lysing matrix D (작은 세라믹 구를 사용)와 tissue lyser에서 25 초 동안 두 번 맥박하는 튜브에 lysis buffer (조직 25mg 당 600μL 완충액)를 놓습니다. 20,000 xg에서 원심 분리하여 매트릭스에서 용 해물을 분리하고 다음 단계로 격리하십시오. </li><li> 단백질 추출을 위해, Trit 배치용해 매트릭스 SS (단일 스테인리스 스틸 비드 사용)가 포함 된 용해 튜브에서 X-100 (또는 총 용 해물을 준비하는 경우 SDS 샘플 버퍼)에 넣습니다. 여러 매트릭스를 테스트 한 후 전통적인 douncing 방법과 비슷한 품질의 IF 단백질 추출물을 생산하기 때문에이 매트릭스를 선택했습니다. 자동 방법은 췌장 및 비장에 최적이 아니므로 표준 균질화 프로토콜을 이러한 조직에 사용해야합니다. </li><li> High Salt Extract를 준비하려면 자석을 사용하여 스테인레스 강 비드를 튜브에서 꺼내고 4 ℃에서 20,000 xg로 10 분간 원심 분리합니다. </li><li> 수동 프로토콜의 4.4 단계 (위)를 계속 진행하십시오. </li><li> 분석 전까지 -20 ° C에서 모든 시료를 보관하십시오. </li></ol> 6. 번역 후 변형 된 IF 단백질의 면역 강화 <ol><li> PBST 완충액 (PBS에 0.02 % 트윈 -20)을 준비합니다. 50 mL를 만들려면 PBS, pH 7.4의 50 mL에 Tween-20 10 μL를 넣으십시오. </li><li> PTM 항체 준비용액 (PBST 200 μL 중 항체 1 ~ 10 μg). 일반적으로 3 μg의 항체 / 반응은 필요한 경우 더 최적화 할 수있는 좋은 시작 조건입니다. </li><li> 각각의 반응에 대해 50μL의 자기 비드를 미세 원심 분리기 튜브에 분주하고 자석 위에 놓고 비드 보관 용액을 대기음을냅니다. </li><li> 항체 용액에 다시 부유하고 20 분 동안 실온에서 회 전자 (end-over-end, 소량의 혼합을 보장하기 위해)에서 배양하여 면역 침전 항체에 구슬을 접합시킨다. </li><li> 튜브를 자석에 놓고 항체 용액을 대기시 키십시오. </li><li> 200 μL PBST에 한 번 항체 - 복합 비드를 린스하고 세척 버퍼를 제거하십시오. </li><li> 차가운 방에 rotator에서 3 시간 동안 부드러운 pipetting 및 부화로 비즈에 조직 lysate 0.6-1 ML을 추가하십시오. </li><li> 자석에 튜브를 놓고 용해 액을 제거하고 PBST 200 μL로 5 번 구슬을 씻으십시오. 마지막 세척 단계 후, 100에서 비즈를 수집 _6, L의 PBS (트윈 -20)없이 깨끗한 새 튜브로 옮긴다. 튜브를 자석 위에 놓습니다. </li><li> PBS를 대기음으로하고 비 환원 시료 완충액 100 μL를가합니다. 50 μL를 제거하고 2-ME (5 %)를 첨가하여 환원 시료를 만듭니다. 샘플을 95 ℃에서 5 분간 가열합니다. </li><li> 자석에있는 구슬에서 ip 분수를 분리하고 새로운 관으로 그것을 모으십시오. </li><li> 분석 할 때까지 -20 ° C에서 시료를 보관하십시오. </li></ol> 7. 질량 분석을위한 IF 단백질 시료의 준비 <ol><li> 질량 분석법 분석과 관련하여 상당한 시간과 비용이 소요되므로 연구를 시작하기 전에 프로테오믹스 전문가와 상담하십시오. </li><li> 오염을 피하기 위해 특별한 예방 조치를 취하십시오. 깨끗한 장갑으로 모든 젤을 처리하고 ddH 2 O (비누 방지)만을 사용하여 씻은 깨끗한 용기에 품습니다. </li><li> 표준 조건에 따라 SDS - PAGE 젤에 HSE 샘플 (섹션 4와 5에서) 20 ~ 50 μL를 실행합니다. </li&gt; <li> 1 시간 동안 단백질 얼룩이있는 얼룩이 있습니다. 여러 번 헹구고 ddH 2 O에서 얼룩 제거하십시오. IF 단백질 밴드는 탈 염색 후 쉽게 볼 수 있어야합니다. </li><li> 플라스틱 시트 보호 장치 사이에 젤을 놓고 분석하기 위해 잘라내어 보낼 밴드를 스캔하고 표시하십시오. </li><li> 새로운 깨끗한 면도기를 사용하여 IF 단백질 밴드를 제거하십시오. </li><li> 젤 밴드를 깨끗한 미세 원심 분리 튜브에 넣고 질량 분석기로 옮깁니다. </li></ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

IF 단백질이 생체 화학적 특성을 나타낼 수있는 방법은 IF 단백질이 세포 및 조직 스트레스의 마커이자 모듈레이터이기 때문에 포유류 시스템에서 수많은 병태 생리 현상을 이해하는 데 유용합니다. 현재의 방법 뒤에있는 원리는 일반적으로 저염소 용액과 고염 용액을 사용하는 세포와 조직으로부터 IF 단백질을 분리, 분리 및 재구성하기위한 1970 년대와 1980 년대에 개발 된 초기 절차를 토대로하?...

<html> IFs는 인간에서 73 개의 유전자로 코드화되며 여섯 가지 주요 유형으로 분류되는 단백질 군입니다. 유형 I-IV는 세포질 ( 예 : 상피와 모발 케라틴 (K), 근육 세포 데민 (amocyte desmin), 신경 섬유 (neurofilaments), 신경 교세포 성 산성 단백질 (GFAP) 다른 사람); type V는 핵 라미네이트입니다. 및 VI 형은 눈 렌즈 ( 1) 에서 IF이다. 분자 구조면에서 보면, IF 단백질은 크게 보존 된 코일 형 코일 &quot;막대&quot;도메인과 구형 &quot;머리&quot;및 &quot;꼬리&quot;도메인의 세 가지 공통 도메인을 가지고 있습니다. IF 단백질 4 량체는 조립되어 짧은 필라멘트 전구체를 형성하며 궁극적으로는 성숙 필라멘트에 결합되어 기계적 보호에 관련된 동적 세포 골격 및 핵 골격 구조를 형성 2 , 스트레스 센싱 3 , 4 , 전사 5 조절 및 성장 및 기타 중요한 세포 기능&quot;&gt; 1 , 6 , 7 . IF 시스템의 기능적 중요성은 신경 병증, 근육 병증, 피부 허약 장애, 대사 기능 장애 및 조기 노화 증후군을 포함하여 IF 유전자의 미스 돌연변이로 인한 많은 인간 질병의 존재에 의해 강조됩니다. 일부 IF 유전자 돌연변이는 간 질환 9 의 단순한 상피 각질과 같은 병의 진행을 야기하지는 않지만 캐리어를 질병에 걸리기 쉽게 만든다. 후자는 상피 세포에서 IF의 중요한 스트레스 - 보호 기능에 기인한다. IFs는 일반적으로 기저 조건 하에서 가장 풍부한 세포 단백질 중 하나이지만, 다양한 유형의 스트레스 중에 더욱 강하게 유도됩니다 10 . 예를 들어 선충류 C. elegans 의 프로테옴 전반에 걸친 변화를 평가 한 최근의 연구에 따르면 여러 IF가 고도로 상향 조절되고 응집되기 쉬운 것으로 나타났습니다유기체 노화 동안 11 , 12 . 적절한 IF 구조의 유지가 다양한 형태의 스트레스에 대한 세포 내성에 필수적이기 때문에, IF 응집 또한 노화 동안 기능 저하에 기여할 수있다. 그러나 스트레스를받는 여러 조직에서 여러 포유류 IF 단백질을 검사하는 유기체 수준의 연구가 부족합니다. IF는 세포의 요구를 충족시키기 위해 적응하는 매우 역동적 인 구조입니다. 예를 들어, 케라틴은 용해성 (비 섬유 성)과 불용성 (섬유 성) 단백질 풀 사이의 생합성과 무관 한 순환을 거친다. 정상적인 생리 조건에서 총 K8 / K18 풀의 약 5 %는 트리톤 (non-ionic) 세제 인 Nonidet P-40에서 가용화 될 수있는 약 20 %와 비교하여 세제가없는 완충액에서 추출 될 수 있습니다. X100 14 , </s&gt; 15 . 유사 분열 중에는 표피 각질에서 덜 명백하지만 vimentin 및 기타 III 형 IF 단백질에서 더 뚜렷한 단순형 상피 K8 및 K18 14 의 용해도가 현저히 증가합니다 15,16. IF 단백질의 용해도 특성은 필라멘트 재 배열 및 용해성을위한 주요 번역 후 변형 (PTM) 인 인산화에 의해 엄격하게 조절됩니다 17 , 18 , 19 , 20 . 대부분의 IF는 보존 된 장소에서 다수의 PTM에 의해 광범위한 규제를 받아 기능적 변화가 일어납니다 17 . 이 방법의 목적은 여러 가지 마우스 조직에서 IF 단백질 연구를위한 생화학 적 추출 및 분석 방법에 대해 IF 분야에 처음으로 연구자를 소개하는 것입니다. 특유한우리는 고염 추출법을 사용하여 IF 단백질을 분리하고 질량 분광기 및 PTM 표적 항체를 통해 PTM의 변화를 평가하는 데 초점을 맞 춥니 다. 이 방법은 이전에 발표 된 절차를 바탕으로하지만 IF 가족 전체의 규제에 대한 일반적인 메커니즘을 밝히기 위해 다양한 IF 단백질 유형을 추출하기위한 수정을 포함합니다. 예를 들어 특정 라이신 잔기의 K8 아세틸 화는 필라멘트 구성을 조절하는 반면과 아세틸 화는 K8 불용성 및 응집체 형성을 촉진합니다 22 . 최근의 세계적 proteomic 프로파일 링 연구는 또한 대부분의 조직 특이적인 IF 단백질이 또한 아세틸 화의 표적이며 대부분의 IF 아세틸 화 부위가 고도로 보존 된로드 도메인에 국한됨을 보여 주었다. 이는 IF 시스템의 글로벌 프로파일 링에 적합한 방법의 필요성을 강조합니다. 우리는 또한 opti에서 자동 균질화를 사용하여 여러 조직에서 IF 단백질을 단리하는 신속한 방법을 소개합니다mized lysing matrix. 생성 된 준비물은 질량 분광법 및 기타 방법을 통한 다운 스트림 PTM 분석에 적합합니다.

<table><tbody><tr><td>Dynabeads Protein G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10009</td><td>immunoprecipitation beads</td></tr><tr><td>PBS</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10010049</td><td>for buffers</td></tr><tr><td>Purelink RNA mini kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12183018</td><td>RNA extraction from tissue</td></tr><tr><td>Purelink DNAse set</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12185010A</td><td>on column DNA digestion</td></tr><tr><td>Dynamag-2</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12321D</td><td>magnet for use with dynabeads</td></tr><tr><td>GelCode Blue Stain Reagent</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>24592</td><td>mass spectrometry-compatible gel stain</td></tr><tr><td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>32106</td><td>for use in western blot</td></tr><tr><td>High Capacity cDNA reverse transcription kit</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4368813</td><td>for use in gene expression analysis</td></tr><tr><td>Proflex 3 x 32-well PCR System</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>4484073</td><td>PCR system</td></tr><tr><td>PVDF transfer membrane&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>88520</td><td>for western blot</td></tr><tr><td>Power Up SYBR master mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>A25778</td><td>for qPCR analysis</td></tr><tr><td>RNAlater</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM7020</td><td>solution for tissue storage prior to RNA isolation</td></tr><tr><td>Novex 4-20% Tris Glycine Gel</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>XP04205BOX</td><td>Precast protein gel</td></tr><tr><td>Anti-Keratin 8 antibody (TS1)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MA514428</td><td>for western blot detection of K8</td></tr><tr><td>Anti-Vimentin</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>MA511883</td><td>for western blot detection of vimentin</td></tr><tr><td>Tris Glycine Transfer Buffer (25x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC3675</td><td>for wet transfer of protein gels</td></tr><tr><td>2x SDS Sample Buffer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC2676</td><td>for preparing protein gel samples</td></tr><tr><td>Tris Glycine SDS Running Buffer (10x)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>LC26755</td><td>for running protein gels</td></tr><tr><td>Lysing beads - Matrix D</td><td>MP Biomedicals</td><td>116913100</td><td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction</td></tr><tr><td>Lysing beads - Matrix SS</td><td>MP Biomedicals</td><td>116921100</td><td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction</td></tr><tr><td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>ND-LITE</td><td>measurement of protein and nucleic acid</td></tr><tr><td>Precellys 24 homogenizer</td><td>Bertin Instruments</td><td>EQ03119</td><td>Automated tissue homogenizer</td></tr></tbody></table>

isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications

중급 필라멘트 (IF)는 액틴 필라멘트 및 미세 소관과 함께 모든 세포의 중요한 구조 요소 인 세포 뼈대를 형성합니다. 정상 기능 IFs는 세포에 기계적 및 응력 복원력을 제공하는 반면 기능 장애 IF 세포 뼈대는 세포 건강을 손상시키고 많은 인간 질병과 관련이 있습니다. 생체 변화 및 스트레스 조건에 따라 IF 역학을 비판적으로 조절합니다. 따라서 IF의 PTM 시그니처의 변화를 모니터링하는 능력은 세포 손상 동안 스트레스 리스폰 더로서의 IF 시스템의 더 나은 기능적 이해 및 궁극적으로 컨디셔닝에 기여할 수 있습니다. 그러나, 70 개 이상의 개별 유전자에 의해 암호화되고 조직에 의존적 인 방법으로 표현되는 많은 수의 IF 단백질은 다른 PTM의 상대적인 중요성을 분류하는 데있어 주요한 과제입니다. 이를 위해 IF 단백질에서 PTM을 모니터링 할 수있는 방법고립 된 가족 구성원이 아닌 유기체 차원에서이 분야의 연구 진행을 가속화 할 수 있습니다. 여기에 우리는 9 개의 다른 마우스 조직 (뇌, 심장, 폐, 간, 소장, 대장, 췌장, 신장 및 간세포)에서 IF 단백질의 전체, 세제 가용성 및 세제 내성 분획을 분리하는 생화학 적 방법을 제시합니다 비장). 우리는 lysing 매트릭스와 다른 마우스 조직의 자동화 균질화를 사용하여 IF 단백질의 신속한 분리를위한 최적화 된 프로토콜을 입증합니다. 자동화 된 프로토콜은 높은 샘플 양 (예 : 여러 동물 및 실험 그룹이 포함 된 질병 모델)이있는 실험에서 IF를 프로파일 링하는 데 유용합니다. 결과 샘플은 질량 분석 기반 PTM 프로파일 링을 포함한 다양한 다운 스트림 분석에 활용할 수 있습니다. 이 방법들을 이용하여, 우리는 다른 마우스 조직 (뇌 및 간)에있는 IF 단백질이 그들의 표현과 관련하여 평행 한 변화를 겪는다는 것을 보여주는 새로운 데이터를 제공한다시온 (sion) 수준 및 PTMs.

lysing matrix를 이용한 다중 마우스 조직으로부터 IF 단백질의 고염 기반 추출을위한 새로운 신속한 방법. 상피 조직으로부터 중간 필라멘트 단백질 분획의 대량을 분리하는 전통적인 방법 25 , 26 은 9 개의 다른 기관을 포함하고 조직 용해를?...

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Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

이 방법에서는 여러 개의 마우스 조직에서 중간 필라멘트 (IF) 단백질을 신속하고 효율적으로 분리하기위한 생화학 적 절차를 제시합니다. 분리 된 IF는 질량 분광법 및 기타 생화학 적 분석법에 의한 번역 후 변형의 변화를 연구하는데 사용될 수 있습니다.

노화 관련 post-translational 수정을 공부하기 위해 여러 마우스 조직에서 중간 필라멘트 단백질의 분리

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.4K 조회수.  University of North Carolina at Chapel Hill.  이 방법에서는 여러 개의 마우스 조직에서 중간 필라멘트 (IF) 단백질을 신속하고 효율적으로 분리하기위한 생화학 적 절차를 제시합니다. 분리 된 IF는 질량 분광법 및 기타 생화학 적 분석법에 의한 번역 후 변형의 변화를 연구하는데 사용될 수 있습니다. 

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Robust Comparison of Protein Levels Across Tissues and Throughout Development Using Standardized Quantitative Western Blotting

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances in both basic and clinical research. However, as with many similar experimental techniques, the outcome of Western blot analyses is easily influenced by choices made in the design and execution of the experiment. Specific housekeeping proteins have traditionally been used to normalize protein levels for quantification, however, these have a number of limitations and have therefore been increasingly criticized over the past few years. Here, we describe a detailed protocol that we have developed to allow us to undertake complex comparisons of protein expression variation across different tissues, mouse models (including disease models), and developmental timepoints. By using a fluorescent total protein stain and introducing the use of an internal loading standard, it is possible to overcome existing limitations in the number of samples that can be compared within experiments and systematically compare protein levels across a range of experimental conditions. This approach expands the use of traditional western blot techniques, thereby allowing researchers to better explore protein expression across different tissues and samples.

This method describes a robust and reproducible approach for the comparison of protein levels in different tissues and at different developmental timepoints using a standardized quantitative western blotting approach.

단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교

Western blotting is a technique that is commonly used to detect and quantify protein expression. Over the years, this technique has led to many advances ...

연구

생화학

Gait Analysis of Age-dependent Motor Impairments in Mice with Neurodegeneration

Motor behavior tests are commonly used to determine the functional relevance of a rodent model and to test newly developed treatments in these animals. Specifically, gait analysis allows recapturing disease relevant phenotypes that are observed in human patients, especially in neurodegenerative diseases that affect motor abilities such as Parkinson&#39;s disease (PD), Alzheimer&#39;s disease (AD), amyotrophic lateral sclerosis (ALS), and others. In early studies along this line, the measurement of gait parameters was laborious and depended on factors that were hard to control (e.g., running speed, continuous running). The development of ventral plane imaging (VPI) systems made it feasible to perform gait analysis at a large scale, making this method a useful tool for the assessment of motor behavior in rodents. Here, we present an in-depth protocol of how to use kinematic gait analysis to examine the age-dependent progression of motor deficits in mouse models of neurodegeneration; mouse lines with decreased levels of endophilin, in which neurodegenerative damage progressively increases with age, are used as an example.

In this study, we demonstrate the use of kinematic gait analysis based on ventral plane imaging to monitor the subtle changes in motor coordination as well as the progression of neurodegeneration with advancing age in mouse models (e.g., endophilin mutant mouse lines).

연령에 따라 모터 손상 Neurodegeneration와 쥐의 걸음 걸이 분석

Motor behavior tests are commonly used to determine the functional relevance of a rodent model and to test newly developed treatments in these animals. ...

발생학

Quantitative Microtubule Fractionation Technique to Separate Stable Microtubules, Labile Microtubules, and Free Tubulin in Mouse Tissues

Microtubules, composed of &#945;/&#946;-tubulin dimers, are a crucial component of the cytoskeleton in eukaryotic cells. These tube-like polymers exhibit dynamic instability as tubulin heterodimer subunits undergo repetitive polymerization and depolymerization. Precise control of microtubule stability and dynamics, achieved through tubulin post-translational modifications and microtubule-associated proteins, is essential for various cellular functions. Dysfunctions in microtubules are strongly implicated in pathogenesis, including neurodegenerative disorders. Ongoing research focuses on microtubule-targeting therapeutic agents that modulate stability, offering potential treatment options for these diseases and cancers. Consequently, understanding the dynamic state of microtubules is crucial for assessing disease progression and therapeutic effects.
Traditionally, microtubule dynamics have been assessed in vitro or in cultured cells through rough fractionation or immunoassay, using antibodies targeting post-translational modifications of tubulin. However, accurately analyzing tubulin status in tissues using such procedures poses challenges. In this study, we developed a simple and innovative microtubule fractionation method to separate stable microtubules, labile microtubules, and free tubulin in mouse tissues.
The procedure involved homogenizing dissected mouse tissues in a microtubule-stabilizing buffer at a 19:1 volume ratio. The homogenates were then fractionated through a two-step ultracentrifugation process following initial slow centrifugation (2,400 &#215; g) to remove debris. The first ultracentrifugation step (100,000 &#215; g) precipitated stable microtubules, while the resulting supernatant was subjected to a second ultracentrifugation step (500,000 &#215; g) to fractionate labile microtubules and soluble tubulin dimers. This method determined the proportions of tubulin constituting stable or labile microtubules in the mouse brain. Additionally, distinct tissue variations in microtubule stability were observed that correlated with the proliferative capacity of constituent cells. These findings highlight the significant potential of this novel method for analyzing microtubule stability in physiological and pathological conditions.

Microtubules, which are tubulin polymers, play a crucial role as a cytoskeleton component in eukaryotic cells and are known for their dynamic instability. This study developed a method for fractionating microtubules to separate them into stable microtubules, labile microtubules, and free tubulin to evaluate the stability of microtubules in various mouse tissues.

마우스 조직에서 안정적인 미세소관, 불안정한 미세소관 및 유리 튜불린을 분리하기 위한 정량적 미세소관 분획 기술

Microtubules, composed of &#945;/&#946;-tubulin dimers, are a crucial component of the cytoskeleton in eukaryotic cells. These tube-like polymers exhibit ...

Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle

Muscle regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite cells. Satellite cells are defined by their position between the basal lamina and the sarcolemma of each myofiber. Current knowledge of their behavior heavily relies on the use of the single myofiber isolation protocol. In 1985, Bischoff described a protocol to isolate single live fibers from the Flexor Digitorum Brevis (FDB) of adult rats with the goal to create an in vitro system in which the physical association between the myofiber and its stem cells is preserved 1. In 1995, Rosenblattmodified the Bischoff protocol such that myofibers are singly picked and handled separately after collagenase digestion instead of being isolated by gravity sedimentation 2, 3. The Rosenblatt or Bischoff protocol has since been adapted to different muscles, age or conditions 3-6. The single myofiber isolation technique is an indispensable tool due its unique advantages. First, in the single myofiber protocol, satellite cells are maintained beneath the basal lamina. This is a unique feature of the protocol as other techniques such as Fluorescence Activated Cell Sorting require chemical and mechanical tissue dissociation 7. Although the myofiber culture system cannot substitute for in vivo studies, it does offer an excellent platform to address relevant biological properties of muscle stem cells. Single myofibers can be cultured in standard plating conditions or in floating conditions. Satellite cells on floating myofibers are subjected to virtually no other influence than the myofiber environment. Substrate stiffness and coating have been shown to influence satellite cells' ability to regenerate muscles 8, 9 so being able to control each of these factors independently allows discrimination between niche-dependent and -independent responses. Different concentrations of serum have also been shown to have an effect on the transition from quiescence to activation. To preserve the quiescence state of its associated satellite cells, fibers should be kept in low serum medium 1-3. This is particularly useful when studying genes involved in the quiescence state. In serum rich medium, satellite cells quickly activate, proliferate, migrate and differentiate, thus mimicking the in vivo regenerative process 1-3. The system can be used to perform a variety of assays such as the testing of chemical inhibitors; ectopic expression of genes by virus delivery; oligonucleotide based gene knock-down or live imaging. This video article describes the protocol currently used in our laboratory to isolate single myofibers from the Extensor Digitorum Longus (EDL) muscle of adult mice (6-8 weeks old).

Isolation and culture of myofibers is the gold standard in vitro system to study the transition of satellite cells through quiescence, activation and differentiation. Importantly, the single myofiber culture system preserves the myofiber/stem cell association, which is an essential component of the muscle stem cell niche.

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

Muscle  regeneration in the adult is performed by resident stem cells called satellite  cells. Satellite cells are defined by  their position between the ...

생물학

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

사용<em&gt; 예쁜 꼬마 선충</em&gt; 다세포 생물의 단백질 항상성을 연구하는 모델 시스템으로

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Single Myofiber Isolation and Culture from a Murine Model of Emery-Dreifuss Muscular Dystrophy in Early Post-Natal Development

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate filament proteins that sustain the nuclear envelope and the components of the nucleoplasm. We recently reported that muscle wasting in EDMD can be ascribed to intrinsic epigenetic dysfunctions affecting muscle (satellite) stem cells regenerative capacity. Isolation and culture of single myofibers is one of the most physiological ex-vivo approaches to monitor satellite cells behavior within their niche, as they remain between the basal lamina surrounding the fiber and the sarcolemma. Therefore, it represents an invaluable experimental paradigm to study satellite cells from a variety of murine models. Here, we describe a re-adapted method to isolate intact and viable single myofibers from post-natal hindlimb muscles (Tibialis Anterior, Extensor Digitorum Longus, Gastrocnemius and Soleus). Following this protocol, we were able to study satellite cells from Lamin &#916;8-11 -/- mice, a severe EDMD murine model, at only 19 days after birth.
We detail the isolation procedure, as well as the culture conditions for obtaining a good amount of myofibers and their associated satellite-cells-derived progeny. When cultured in growth-factors rich medium, satellite cells derived from wild type mice activate, proliferate, and eventually differentiate or undergo self-renewal. In homozygous Lamin &#916;8-11 -/- mutant mice these capabilities are severely impaired.
This technique, if strictly followed, allows to study all processes linked to the myofiber-associated satellite cell even in early post-natal developmental stages and in fragile muscles.

Here, we propose a method to efficiently obtain single muscle fibers at early post-natal developmental stages from homozygous mutant Lamin &#916;8-11 mouse model, a very severe model for Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD).

초기 산후 발달에 있는 에머리 드레이푸스 근 이영양증의 Murine 모형에서 단 근섬유 격리 및 문화

Autosomal dominant Emery-Dreifuss muscular dystrophy (EDMD) is caused by mutations in the LMNA gene, which encodes the A-type nuclear lamins, intermediate ...

의학

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

꼬마 선 충 나이 연구 변화 내재 단백질 집계에 방법

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

Caenorhabditis 예인단에서 조직 특정 전립선 성 감소를 정량화

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

Quantification of Insoluble Protein Aggregation in Caenorhabditis elegans during Aging with a Novel Data-Independent Acquisition Workflow

We and others have shown that the aging process results in a proteome-wide accumulation of insoluble proteins. Knocking down genes encoding the insoluble proteins over 40% of the time results in an extension of the lifespan in C. elegans, suggesting that many of these proteins are key determinants of the aging process. Isolation and quantitative identification of these insoluble proteins are crucial to understand key biological processes that occur during aging. Here, we present a modified and improved protocol that details how to extract and isolate the SDS-insoluble proteins (insolublome) from C. elegans more efficiently to streamline mass spectrometric workflows via a novel label-free quantitative proteomics analysis. This improved protocol utilizes a highly efficient sonicator for worm lysis that greatly increases efficiency for protein extraction and allows us to use significantly less starting material (approximately 3,000 worms) than in previous protocols (typically using at least 40,000 worms). Subsequent quantitative proteomic analysis of the insolublome was performed using data-dependent acquisition (DDA) for protein discovery and identification and data-independent acquisition (DIA) for comprehensive and more accurate protein quantification. Bioinformatic analysis of quantified proteins provides potential candidates that can be easily followed up with other molecular methods in C. elegans. With this workflow, we routinely identify more than 1000 proteins and quantify more than 500 proteins. This new protocol enables efficient compound screening with C. elegans. Here, we validated and applied this improved protocol to wild-type C. elegans N2-Bristol strain and confirmed that aged day-10 N2 worms showed greater accumulation of the insolublome than day-2 young worms.

Quantification of Insoluble Protein Aggregation in Caenorhabditis elegans during Aging with a Novel Data-Independent Acquisition Workflow

This novel workflow efficiently extracts and isolates SDS-insoluble proteins (insolublome) from Caenorhabditis elegans with minimal starting material for quantitative differential proteomic analysis. The protocol uses a comprehensive data-independent acquisition mass spectrometry analysis to quantify the insolublome and bioinformatic analysis to gain biological insights into aging mechanisms and pathologies.

We and others have shown that the aging process results in a proteome-wide accumulation of insoluble proteins. Knocking down genes encoding the insoluble ...

다양한 길이의 마우스 근육 섬유의 효소 분리 및 특성화

Intact Short, Intermediate, and Long Skeletal Muscle Fibers Obtained by Enzymatic Dissociation of Six Hindlimb Muscles of Mice: Beyond Flexor Digitorum Brevis

Skeletal muscle fibers obtained by enzymatic dissociation of mouse muscles are a useful model for physiological experiments. However, most papers deal with the short fibers of the flexor digitorum brevis (FDB), which restrains the scope of results dealing with fiber types, limits the amount of biological material available, and impedes a clear connection between cellular physiological phenomena and previous biochemical and dynamical knowledge obtained in other muscles.
This paper describes how to obtain intact fibers from six muscles with different fiber type profiles and lengths. Using C57BL/6 adult mice, we show the muscle dissection and fiber isolation protocol and demonstrate the suitability of the fibers for Ca2+ transient studies and their morphometric characterization. The fiber type composition of the muscles is also presented. When dissociated, all muscles rendered intact, living fibers that contract briskly for more than 24 h. FDB gave short (&#60;1 mm), peroneus digiti quarti (PDQA) and peroneus longus (PL) gave intermediate (1-3 mm), while extensor digitorum longus (EDL), extensor hallucis longus (EHL), and soleus muscles released long (3-6 mm) fibers.
When recorded with the fast dye Mag-Fluo-4, Ca2+ transients of PDQA, PL, and EHL fibers showed the fast, narrow kinetics reminiscent of the morphology type II (MT-II), known to correspond to type IIX and IIB fibers. This is consistent with the fact that these muscles have over 90% of type II fibers compared with FDB (~80%) and soleus (~65%). Moving beyond FDB, we demonstrate for the first time the dissociation of several muscles, which render fibers spanning a range of lengths between 1 and 6 mm. These fibers are viable and give fast Ca2+ transients, indicating that the MT-II can be generalized to IIX and IIB fast fibers, regardless of their muscle source. These results increase the availability of models for mature skeletal muscle studies.

저자 스포트라이트: Isolation of Long Muscle Fibers from Mouse Hindlimb Muscles for Studying Excitation-Contraction Coupling Across Fiber Across Excitation-Contraction Coupling (섬유 유형 간 흥분-수축 결합 연구를 위한 쥐 뒷다리 근

We describe a protocol to obtain enzymatically dissociated fibers of different lengths and types from six muscles of adult mice: three of them already described (flexor digitorum brevis, extensor digitorum longus, soleus) and three of them successfully dissociated for the first time (extensor hallucis longus, peroneus longus, peroneus digiti quarti).

생쥐의 6개 뒷다리 근육의 효소 해리로 얻은 온전한 짧은, 중간 및 긴 골격근 섬유: Beyond Flexor Digitorum Brevis

Skeletal muscle fibers obtained by enzymatic dissociation of mouse muscles are a useful model for physiological experiments. However, most papers deal ...

노화 관련 post-translational 수정을 공부하기 위해 여러 마우스 조직에서 중간 필라멘트 단백질의 분리

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단백질 수준 및 개발 표준화 양적 부 럽을 사용 하 여 전체 조직에 걸쳐 강력한 비교

연령에 따라 모터 손상 Neurodegeneration와 쥐의 걸음 걸이 분석

마우스 조직에서 안정적인 미세소관, 불안정한 미세소관 및 유리 튜불린을 분리하기 위한 정량적 미세소관 분획 기술

성인 골격근의 개인 Myofibers 및 위성 세포의 분리와 문화

사용

초기 산후 발달에 있는 에머리 드레이푸스 근 이영양증의 Murine 모형에서 단 근섬유 격리 및 문화

꼬마 선 충 나이 연구 변화 내재 단백질 집계에 방법

Caenorhabditis 예인단에서 조직 특정 전립선 성 감소를 정량화

Quantification of Insoluble Protein Aggregation in Caenorhabditis elegans during Aging with a Novel Data-Independent Acquisition Workflow

생쥐의 6개 뒷다리 근육의 효소 해리로 얻은 온전한 짧은, 중간 및 긴 골격근 섬유: Beyond Flexor Digitorum Brevis