이 작품은 NIH R01 DK110355, DK093776 [NTS], DK102450 [NTS] 및 P30 DK034987 [UNC-Chapel Hill에]의 NIH 교부금으로 지원되었습니다. 저자는 qPCR 및 웨스턴 블랏 실험에 대한 도움을 주신 Deekshita Ramanarayanan에게 감사드립니다.

이 프로토콜은 노스 캐롤라이나 대학 (University of North Carolina)의 기관 동물 케어 및 사용위원회 (IACUC)에 따라 승인되고 수행됩니다. 1. 준비 사항 <ol><li> 트리톤 -X 버퍼 (1 % 트리톤 X-100, 5mM 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA), 인산염 완충 생리 식염수 (PBS), pH 7.4)를 준비한다. 500 mL를 만들려면 Triton X-100과 500 mM EDTA 각각 5 mL를 PBS 490 mL, pH 7.4에 넣으십시오. 4 ℃에서 Triton-X 완충 용액을 보관하십시오. </li><li> 고 염분 완충액 (10 mM Tris-HCl, pH 7.6, 140 mM NaCl, 1.5 M KCl, 5 mM EDTA, 0.5 % Triton X-100, 이중 증류수 (dd) H 2 O에서 부피를 높임)를 준비한다. 500 mL를 만들 때 : 0.5 M Tris-HCl (pH 7.6) 10 mL, 5 M NaCl 14 mL, KCl 55.9 g, 0.5 M EDTA 5 mL 및 트리톤 X-100 2.5 mL를 넣고 부피를 500 mL). 4 ° C에서 고 염분 완충 용액을 보관하십시오. </li><li> 사용하기 바로 전에 적절한 양의 Triton-X와 High Salt Buffer ( <em&gt; 25 mL 조직 샘플 당 1 mL)를 프로테아제 또는 프로 테아 제 / 포스 파타 아제 억제제 칵테일로 처리하고 억제제가 포함 된 사용하지 않은 완충액을 버립니다. </li><li> 1X PBS, 산도 7.4에서 5 MM EDTA를 준비합니다. 500 mL를 만들려면 0.5 M EDTA 5 mL를 1X PBS (pH 7.4) 495 mL로 저어줍니다. </li><li> 수의과 지침 및 기관 표준을 준수하는 승인 된 프로토콜을 사용하여 다른 마우스 장기 (뇌, 심장, 폐, 간, 췌장, 결장, 내장, 신장, 비장)를 분리하십시오. 조직 수집 절차는 protease가 풍부한 조직 ( 예 : 췌장을 먼저 처리해야 함)의 RNA 및 단백질 완전성을 보존하기 위해 5 분 이상 걸리지 않아야합니다. </li><li> IF 유전자 발현을위한 후속 RNA 추출, cDNA 합성 및 정량적 실시간 PCR 분석을 위해 소량의 조직 (~ 5 ~ 20mg)을 잘라내어 RNA 보관 용액에 넣으십시오. 밤새 4 ° C에서 조직과 RNA 저장 솔루션 튜브를 배치하고 추가로 s의 제조 업체 프로토콜을 따르십시오torage 및 격리 단계. </li><li> 조직의 나머지 부분을 작은 조각 ( 예 : 0.5cm)으로 자르고 냉동 보관하십시오. 장기 보관을 위해 -80 ° C 또는 액체 질소에서 바이 얼을 고정하고 저장하십시오. </li></ol> 2. IF 유전자 발현 분석 <ol><li> RNA 저장 용액 시약으로 보존 된 조직에서 RNA를 추출합니다. 제조업체의 프로토콜에 따라 적합한 / 바람직한 RNA 추출 방법을 사용하십시오. </li><li> RNA 농도를 정량하고 RNA의 2 μg을 사용하여 제조 업체의 프로토콜에 따라 적절한 역전사 키트를 사용하여 cDNA를 생성합니다. </li><li> 생성 된 cDNA 및 마우스 IF 유전자 특이 적 프라이머를 사용하여 제조사의 프로토콜에 따라 블랭크 컨트롤뿐만 아니라 각 샘플의 3 가지 기술 복제를 포함하여 qPCR 반응을 셋업 하였다. </li><li> IF 유전자 발현을 다른 조건 ( 예 : 젊은 조직 대 오래된 조직)을 비교 한 배수 변화로 정량화하십시오. </li></ol> 3. PImmunoblot에 대한 전체 조직 용 해물의 배상 <ol><li> 2x 비 환원성 SDS 시료 완충액 1 mL에 조직 25 mg을 균질화한다. 단백질 농도를 정량하기 위해 비색계 단백질 분석을 수행해야하는 경우 샘플 버퍼에서 bromophenol blue 염료를 생략하십시오. </li><li> 환원 된 시료를 만들기 위해 2- 메르 캅토 에탄올 (2-ME) 5 % (v / v)를 첨가하십시오. 비 환원 시료 200 μL에 2-ME 10 μL를 첨가합니다. </li><li> 세제 및 환원제 호환 단백질 분석을 사용하여 단백질 농도를 결정하십시오. 염료가 이미 시료 완충액에 포함되어있는 경우, 쿠마시 (Coomassie) 기반 얼룩 24를 비롯한 다양한 기술을 통해 겔을 실행 한 후 단백질 양을 추정 할 수 있습니다. </li><li> 95 ° C에서 5 분간 가열 한 후 모든 시료를 소용돌이 친다. </li><li> 환원 조건과 비 환원 조건 모두에서 웨스턴 블 랏팅을 수행하십시오. 막을 단시간에 (&lt;1 분) 노출시켜 단량체 종을 나타내며, 더 길게 (&gt; 1 분) 고 분자량 복합체를 나타냄.IF 단백질. 응집체를 모니터링하는 경우 전체 겔 / 멤브레인 (겔 웰의 바닥 포함)을 검사하십시오. </li><li> 병렬 젤을 실행하고 단백질 얼룩과 함께 로딩 컨트롤 24 로 얼룩. 질병 모델이나 상해 실험에서, 총 단백질 얼룩은 로딩 대조군으로 사용되어야한다. 대조군은 다른 스트레스 조건 하에서 변화하기 때문에 &#39;하우스 키핑&#39;단백질 ( 예 : 액틴, GAPDH)에 대한 면역 블록과 대조적이다. </li></ol> 4. 조직 특이적인 IF의 세제 가용성 및 고염 추출물의 제조 <ol><li> 빙냉 Triton X-100 완충액 1 mL를 유리 튜브 균질화기에 넣고 얼음 위에 놓습니다. </li><li> 액체 질소 저장 장치에서 작은 조각 (~ 25mg)을 꺼내고 유리 균질기에 직접 놓습니다. 균질화 (50 스트로크) 및 거품 생성을 피하기 위해 폴리 테트라 플루오르 에틸렌 유봉을 사용하십시오. 항상 균질 기와 lysate를 보관하십시오. </li><li> lysate를 1.5 mL micr로 옮긴다.미리 냉각 된 원심 분리기 (4 ° C)에서 10 분 동안 20,000 xg에서 얼음과 원심 분리기에 튜브를 원심 분리하십시오. </li><li> 상등액 분획을 별도의 튜브에 수집합니다. 이것은 Triton X-soluble fraction으로 면역 침전 (IP) 및 IF 단백질의 세제 가용성 풀 분석에 사용할 수 있습니다. 뇌 조직에서 더 깨끗한 IF 추출물을 얻으려면 4.1-4.4 단계를 반복해야합니다. </li><li> 조직 펠렛에 1 mL의 High Salt Buffer를 넣고 깨끗한 균질기로 옮겨 100 스트로크를 내 보낸다. 균질 물을 다시 마이크로 원심 분리 관으로 옮기고 차가운 방에있는 회전 진탕기에 1 시간 동안 튜브를 놓습니다. </li><li> 4 ℃에서 20 분 동안 20,000 xg에서 균질 물을 원심 분리한다. 뜨는 물을 버린다. </li><li> 펠렛에 얼음처럼 차가운 PBS / EDTA 버퍼 1 ML을 추가하고 최종 정리 단계 *로 깨끗한 균질 기에서 펠렛 (20 스트로크)를 균질. 새로운 튜브로 옮기고 4 ℃에서 10 분 동안 20,000 xg에서 원심 분리하여 IF 단백질 -풍부한 고염 추출물 (HSE). * 선택적으로,이 단계에서 균질화 대신에 와동. </li><li> 뜨는을 버리고 사전 가열 된 비 환원성 SDS 샘플 버퍼 300 μL에 알약을 용해. 초기에 pipetting과 vortexing으로 pellet을 분리 한 후 95 ℃에서 5 분간 시료를 가열한다. </li><li> 펠렛이 녹아있는 것을 확인하기 위해 필요에 따라 와동과 피펫을 사용하십시오. 알약을 완전히 녹이기까지 몇 분이 걸릴 수 있습니다. </li><li> 분석 전까지 -20 ° C에서 모든 시료를 보관하십시오. </li></ol> 5. 대량 실험에서 IF 단백질 추출을위한 자동화 된 조직 용해 <ol><li> RNA 추출의 경우 lysing matrix D (작은 세라믹 구를 사용)와 tissue lyser에서 25 초 동안 두 번 맥박하는 튜브에 lysis buffer (조직 25mg 당 600μL 완충액)를 놓습니다. 20,000 xg에서 원심 분리하여 매트릭스에서 용 해물을 분리하고 다음 단계로 격리하십시오. </li><li> 단백질 추출을 위해, Trit 배치용해 매트릭스 SS (단일 스테인리스 스틸 비드 사용)가 포함 된 용해 튜브에서 X-100 (또는 총 용 해물을 준비하는 경우 SDS 샘플 버퍼)에 넣습니다. 여러 매트릭스를 테스트 한 후 전통적인 douncing 방법과 비슷한 품질의 IF 단백질 추출물을 생산하기 때문에이 매트릭스를 선택했습니다. 자동 방법은 췌장 및 비장에 최적이 아니므로 표준 균질화 프로토콜을 이러한 조직에 사용해야합니다. </li><li> High Salt Extract를 준비하려면 자석을 사용하여 스테인레스 강 비드를 튜브에서 꺼내고 4 ℃에서 20,000 xg로 10 분간 원심 분리합니다. </li><li> 수동 프로토콜의 4.4 단계 (위)를 계속 진행하십시오. </li><li> 분석 전까지 -20 ° C에서 모든 시료를 보관하십시오. </li></ol> 6. 번역 후 변형 된 IF 단백질의 면역 강화 <ol><li> PBST 완충액 (PBS에 0.02 % 트윈 -20)을 준비합니다. 50 mL를 만들려면 PBS, pH 7.4의 50 mL에 Tween-20 10 μL를 넣으십시오. </li><li> PTM 항체 준비용액 (PBST 200 μL 중 항체 1 ~ 10 μg). 일반적으로 3 μg의 항체 / 반응은 필요한 경우 더 최적화 할 수있는 좋은 시작 조건입니다. </li><li> 각각의 반응에 대해 50μL의 자기 비드를 미세 원심 분리기 튜브에 분주하고 자석 위에 놓고 비드 보관 용액을 대기음을냅니다. </li><li> 항체 용액에 다시 부유하고 20 분 동안 실온에서 회 전자 (end-over-end, 소량의 혼합을 보장하기 위해)에서 배양하여 면역 침전 항체에 구슬을 접합시킨다. </li><li> 튜브를 자석에 놓고 항체 용액을 대기시 키십시오. </li><li> 200 μL PBST에 한 번 항체 - 복합 비드를 린스하고 세척 버퍼를 제거하십시오. </li><li> 차가운 방에 rotator에서 3 시간 동안 부드러운 pipetting 및 부화로 비즈에 조직 lysate 0.6-1 ML을 추가하십시오. </li><li> 자석에 튜브를 놓고 용해 액을 제거하고 PBST 200 μL로 5 번 구슬을 씻으십시오. 마지막 세척 단계 후, 100에서 비즈를 수집 _6, L의 PBS (트윈 -20)없이 깨끗한 새 튜브로 옮긴다. 튜브를 자석 위에 놓습니다. </li><li> PBS를 대기음으로하고 비 환원 시료 완충액 100 μL를가합니다. 50 μL를 제거하고 2-ME (5 %)를 첨가하여 환원 시료를 만듭니다. 샘플을 95 ℃에서 5 분간 가열합니다. </li><li> 자석에있는 구슬에서 ip 분수를 분리하고 새로운 관으로 그것을 모으십시오. </li><li> 분석 할 때까지 -20 ° C에서 시료를 보관하십시오. </li></ol> 7. 질량 분석을위한 IF 단백질 시료의 준비 <ol><li> 질량 분석법 분석과 관련하여 상당한 시간과 비용이 소요되므로 연구를 시작하기 전에 프로테오믹스 전문가와 상담하십시오. </li><li> 오염을 피하기 위해 특별한 예방 조치를 취하십시오. 깨끗한 장갑으로 모든 젤을 처리하고 ddH 2 O (비누 방지)만을 사용하여 씻은 깨끗한 용기에 품습니다. </li><li> 표준 조건에 따라 SDS - PAGE 젤에 HSE 샘플 (섹션 4와 5에서) 20 ~ 50 μL를 실행합니다. </li&gt; <li> 1 시간 동안 단백질 얼룩이있는 얼룩이 있습니다. 여러 번 헹구고 ddH 2 O에서 얼룩 제거하십시오. IF 단백질 밴드는 탈 염색 후 쉽게 볼 수 있어야합니다. </li><li> 플라스틱 시트 보호 장치 사이에 젤을 놓고 분석하기 위해 잘라내어 보낼 밴드를 스캔하고 표시하십시오. </li><li> 새로운 깨끗한 면도기를 사용하여 IF 단백질 밴드를 제거하십시오. </li><li> 젤 밴드를 깨끗한 미세 원심 분리 튜브에 넣고 질량 분석기로 옮깁니다. </li></ol>

저자는 경쟁적인 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.

IF 단백질이 생체 화학적 특성을 나타낼 수있는 방법은 IF 단백질이 세포 및 조직 스트레스의 마커이자 모듈레이터이기 때문에 포유류 시스템에서 수많은 병태 생리 현상을 이해하는 데 유용합니다. 현재의 방법 뒤에있는 원리는 일반적으로 저염소 용액과 고염 용액을 사용하는 세포와 조직으로부터 IF 단백질을 분리, 분리 및 재구성하기위한 1970 년대와 1980 년대에 개발 된 초기 절차를 토대로하?...

<html> IFs는 인간에서 73 개의 유전자로 코드화되며 여섯 가지 주요 유형으로 분류되는 단백질 군입니다. 유형 I-IV는 세포질 ( 예 : 상피와 모발 케라틴 (K), 근육 세포 데민 (amocyte desmin), 신경 섬유 (neurofilaments), 신경 교세포 성 산성 단백질 (GFAP) 다른 사람); type V는 핵 라미네이트입니다. 및 VI 형은 눈 렌즈 ( 1) 에서 IF이다. 분자 구조면에서 보면, IF 단백질은 크게 보존 된 코일 형 코일 &quot;막대&quot;도메인과 구형 &quot;머리&quot;및 &quot;꼬리&quot;도메인의 세 가지 공통 도메인을 가지고 있습니다. IF 단백질 4 량체는 조립되어 짧은 필라멘트 전구체를 형성하며 궁극적으로는 성숙 필라멘트에 결합되어 기계적 보호에 관련된 동적 세포 골격 및 핵 골격 구조를 형성 2 , 스트레스 센싱 3 , 4 , 전사 5 조절 및 성장 및 기타 중요한 세포 기능&quot;&gt; 1 , 6 , 7 . IF 시스템의 기능적 중요성은 신경 병증, 근육 병증, 피부 허약 장애, 대사 기능 장애 및 조기 노화 증후군을 포함하여 IF 유전자의 미스 돌연변이로 인한 많은 인간 질병의 존재에 의해 강조됩니다. 일부 IF 유전자 돌연변이는 간 질환 9 의 단순한 상피 각질과 같은 병의 진행을 야기하지는 않지만 캐리어를 질병에 걸리기 쉽게 만든다. 후자는 상피 세포에서 IF의 중요한 스트레스 - 보호 기능에 기인한다. IFs는 일반적으로 기저 조건 하에서 가장 풍부한 세포 단백질 중 하나이지만, 다양한 유형의 스트레스 중에 더욱 강하게 유도됩니다 10 . 예를 들어 선충류 C. elegans 의 프로테옴 전반에 걸친 변화를 평가 한 최근의 연구에 따르면 여러 IF가 고도로 상향 조절되고 응집되기 쉬운 것으로 나타났습니다유기체 노화 동안 11 , 12 . 적절한 IF 구조의 유지가 다양한 형태의 스트레스에 대한 세포 내성에 필수적이기 때문에, IF 응집 또한 노화 동안 기능 저하에 기여할 수있다. 그러나 스트레스를받는 여러 조직에서 여러 포유류 IF 단백질을 검사하는 유기체 수준의 연구가 부족합니다. IF는 세포의 요구를 충족시키기 위해 적응하는 매우 역동적 인 구조입니다. 예를 들어, 케라틴은 용해성 (비 섬유 성)과 불용성 (섬유 성) 단백질 풀 사이의 생합성과 무관 한 순환을 거친다. 정상적인 생리 조건에서 총 K8 / K18 풀의 약 5 %는 트리톤 (non-ionic) 세제 인 Nonidet P-40에서 가용화 될 수있는 약 20 %와 비교하여 세제가없는 완충액에서 추출 될 수 있습니다. X100 14 , </s&gt; 15 . 유사 분열 중에는 표피 각질에서 덜 명백하지만 vimentin 및 기타 III 형 IF 단백질에서 더 뚜렷한 단순형 상피 K8 및 K18 14 의 용해도가 현저히 증가합니다 15,16. IF 단백질의 용해도 특성은 필라멘트 재 배열 및 용해성을위한 주요 번역 후 변형 (PTM) 인 인산화에 의해 엄격하게 조절됩니다 17 , 18 , 19 , 20 . 대부분의 IF는 보존 된 장소에서 다수의 PTM에 의해 광범위한 규제를 받아 기능적 변화가 일어납니다 17 . 이 방법의 목적은 여러 가지 마우스 조직에서 IF 단백질 연구를위한 생화학 적 추출 및 분석 방법에 대해 IF 분야에 처음으로 연구자를 소개하는 것입니다. 특유한우리는 고염 추출법을 사용하여 IF 단백질을 분리하고 질량 분광기 및 PTM 표적 항체를 통해 PTM의 변화를 평가하는 데 초점을 맞 춥니 다. 이 방법은 이전에 발표 된 절차를 바탕으로하지만 IF 가족 전체의 규제에 대한 일반적인 메커니즘을 밝히기 위해 다양한 IF 단백질 유형을 추출하기위한 수정을 포함합니다. 예를 들어 특정 라이신 잔기의 K8 아세틸 화는 필라멘트 구성을 조절하는 반면과 아세틸 화는 K8 불용성 및 응집체 형성을 촉진합니다 22 . 최근의 세계적 proteomic 프로파일 링 연구는 또한 대부분의 조직 특이적인 IF 단백질이 또한 아세틸 화의 표적이며 대부분의 IF 아세틸 화 부위가 고도로 보존 된로드 도메인에 국한됨을 보여 주었다. 이는 IF 시스템의 글로벌 프로파일 링에 적합한 방법의 필요성을 강조합니다. 우리는 또한 opti에서 자동 균질화를 사용하여 여러 조직에서 IF 단백질을 단리하는 신속한 방법을 소개합니다mized lysing matrix. 생성 된 준비물은 질량 분광법 및 기타 방법을 통한 다운 스트림 PTM 분석에 적합합니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Dynabeads Protein G</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10009</td>
			<td>immunoprecipitation beads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>10010049</td>
			<td>for buffers</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink RNA mini kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12183018</td>
			<td>RNA extraction from tissue</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Purelink DNAse set</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12185010A</td>
			<td>on column DNA digestion</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dynamag-2</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>12321D</td>
			<td>magnet for use with dynabeads</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GelCode Blue Stain Reagent</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>24592</td>
			<td>mass spectrometry-compatible gel stain</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pierce ECL Western Blotting Substrate</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>32106</td>
			<td>for use in western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>High Capacity cDNA reverse transcription kit</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4368813</td>
			<td>for use in gene expression analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Proflex 3x32-well PCR System</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>4484073</td>
			<td>PCR system</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PVDF transfer membrane&#160;</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>88520</td>
			<td>for western blot</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Power Up SYBR master mix</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>A25778</td>
			<td>for qPCR analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNAlater</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>AM7020</td>
			<td>solution for tissue storage prior to RNA isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Novex 4-20% Tris Glycine Gel</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>XP04205BOX</td>
			<td>Precast protein gel</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Keratin 8 antibody (TS1)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA514428</td>
			<td>for western blot detection of K8</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Vimentin</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>MA511883</td>
			<td>for western blot detection of vimentin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine Transfer Buffer (25X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC3675</td>
			<td>for wet transfer of protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SDS Sample Buffer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC2676</td>
			<td>for preparing protein gel samples</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tris Glycine SDS Running Buffer (10X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>LC26755</td>
			<td>for running protein gels</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix D</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116913100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysing beads - Matrix SS</td>
			<td>MP Biomedicals</td>
			<td>116921100</td>
			<td>Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NanoDrop Lite Spectrophotometer</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>ND-LITE</td>
			<td>measurement of protein and nucleic acid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precellys 24 homogenizer</td>
			<td>Bertin Instruments</td>
			<td>EQ03119</td>
			<td>Automated tissue homogenizer</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of intermediate filament proteins from multiple mouse tissues to study aging-associated post-translational modifications

중급 필라멘트 (IF)는 액틴 필라멘트 및 미세 소관과 함께 모든 세포의 중요한 구조 요소 인 세포 뼈대를 형성합니다. 정상 기능 IFs는 세포에 기계적 및 응력 복원력을 제공하는 반면 기능 장애 IF 세포 뼈대는 세포 건강을 손상시키고 많은 인간 질병과 관련이 있습니다. 생체 변화 및 스트레스 조건에 따라 IF 역학을 비판적으로 조절합니다. 따라서 IF의 PTM 시그니처의 변화를 모니터링하는 능력은 세포 손상 동안 스트레스 리스폰 더로서의 IF 시스템의 더 나은 기능적 이해 및 궁극적으로 컨디셔닝에 기여할 수 있습니다. 그러나, 70 개 이상의 개별 유전자에 의해 암호화되고 조직에 의존적 인 방법으로 표현되는 많은 수의 IF 단백질은 다른 PTM의 상대적인 중요성을 분류하는 데있어 주요한 과제입니다. 이를 위해 IF 단백질에서 PTM을 모니터링 할 수있는 방법고립 된 가족 구성원이 아닌 유기체 차원에서이 분야의 연구 진행을 가속화 할 수 있습니다. 여기에 우리는 9 개의 다른 마우스 조직 (뇌, 심장, 폐, 간, 소장, 대장, 췌장, 신장 및 간세포)에서 IF 단백질의 전체, 세제 가용성 및 세제 내성 분획을 분리하는 생화학 적 방법을 제시합니다 비장). 우리는 lysing 매트릭스와 다른 마우스 조직의 자동화 균질화를 사용하여 IF 단백질의 신속한 분리를위한 최적화 된 프로토콜을 입증합니다. 자동화 된 프로토콜은 높은 샘플 양 (예 : 여러 동물 및 실험 그룹이 포함 된 질병 모델)이있는 실험에서 IF를 프로파일 링하는 데 유용합니다. 결과 샘플은 질량 분석 기반 PTM 프로파일 링을 포함한 다양한 다운 스트림 분석에 활용할 수 있습니다. 이 방법들을 이용하여, 우리는 다른 마우스 조직 (뇌 및 간)에있는 IF 단백질이 그들의 표현과 관련하여 평행 한 변화를 겪는다는 것을 보여주는 새로운 데이터를 제공한다시온 (sion) 수준 및 PTMs.

lysing matrix를 이용한 다중 마우스 조직으로부터 IF 단백질의 고염 기반 추출을위한 새로운 신속한 방법. 상피 조직으로부터 중간 필라멘트 단백질 분획의 대량을 분리하는 전통적인 방법 25 , 26 은 9 개의 다른 기관을 포함하고 조직 용해를?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications at JoVE.com

Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

이 방법에서는 여러 개의 마우스 조직에서 중간 필라멘트 (IF) 단백질을 신속하고 효율적으로 분리하기위한 생화학 적 절차를 제시합니다. 분리 된 IF는 질량 분광법 및 기타 생화학 적 분석법에 의한 번역 후 변형의 변화를 연구하는데 사용될 수 있습니다.

노화 관련 post-translational 수정을 공부하기 위해 여러 마우스 조직에서 중간 필라멘트 단백질의 분리

Intermediate filaments (IFs), together with actin filaments and microtubules, form the cytoskeleton &#8211; a critical structural element of every cell. ...

isolation-intermediate-filament-proteins-from-multiple-mouse-tissues

Research

JoVE Journal

Biochemistry

8.4K 조회수.  University of North Carolina at Chapel Hill.  이 방법에서는 여러 개의 마우스 조직에서 중간 필라멘트 (IF) 단백질을 신속하고 효율적으로 분리하기위한 생화학 적 절차를 제시합니다. 분리 된 IF는 질량 분광법 및 기타 생화학 적 분석법에 의한 번역 후 변형의 변화를 연구하는데 사용될 수 있습니다. 

비디오: Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies have revealed that these reversible RNA modifications affect RNA splicing, translation, degradation, and localization. Multiple physiological processes, like circadian rhythms, stem cell pluripotency, fibrosis, triglyceride metabolism, and obesity are also controlled by m6A modifications. Immunoprecipitation/sequencing, mass spectrometry, and modified northern blotting are some of the methods commonly employed to measure m6A modifications. Herein, we present a northeastern blotting technique for measuring m6A modifications. The current protocol provides good size separation of RNA, better accommodation and standardization for various experimental designs, and clear delineation of m6A modifications in various sources of RNA. While m6A modifications are known to have a crucial impact on human physiology relating to circadian rhythms and obesity, their roles in other (patho)physiological states are unclear. Therefore, investigations on m6A modifications have immense possibility to provide key insights into molecular physiology.

A Method for Measuring RNA N6-methyladenosine Modifications in Cells and Tissues

A modified northern blotting method for measuring N6-methyladenosine (m6A) modifications in RNA is described. The current method can detect modifications in diverse RNAs and controls under various experimental designs.

RNA 측정 방법<em&gt; N</em<sup&gt; 6</sup세포와 조직에서&gt; -methyladenosine 수정

N6-Methyladenosine (m6A) modifications of RNA are diverse and ubiquitous amongst eukaryotes. They occur in mRNA, rRNA, tRNA, and microRNA. Recent studies ...

연구

생화학

Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy for the Identification of Multiple Phosphorylations of Intrinsically Disordered Proteins

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau's heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

본질적으로 무질서 단백질의 여러 인산화의 식별을위한 핵 자기 공명 분광학

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer's disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, ...

Utilizing a Comprehensive Immunoprecipitation Enrichment System to Identify an Endogenous Post-translational Modification Profile for Target Proteins

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which may be essential for a given protein&#39;s role both physiologically and pathologically. Enrichment of PTMs is often necessary when investigating the PTM status of a target protein, because PTMs are often transient and relatively low in abundance. Many pitfalls are encountered when enriching for a PTM of a target protein, such as buffer incompatibility, the target protein antibody is not IP-compatible, loss of PTM signal, and others. The degree of difficulty is magnified when investigating multiple PTMs like acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation for a given target protein. Studying a combination of these PTMs may be necessary, as crosstalk between PTMs is prevalent and critical for protein regulation. Often, these PTMs are studied in different lysis buffers and with unique inhibitor compositions. To simplify the process, a unique denaturing lysis system was developed that effectively isolates and preserves these four PTMs; thus, enabling investigation of potential crosstalk in a single lysis system. A unique filter system was engineered to remove contaminating genomic DNA from the lysate, which is a problematic by-product of denaturing buffers. Robust affinity matrices targeting each of the four PTMs were developed in concert with the buffer system to maximize the enrichment and detection of the endogenous states of these four PTMs. This comprehensive PTM detection toolset streamlines the process of obtaining critical information about whether a protein is modified by one or more of these PTMs.

Investigating multiple, endogenous post-translational modifications for a target protein can be extremely challenging. Techniques described here utilize an optimized lysis buffer and filter system developed with specific PTM-targeting, affinity matrices to detect the acetylation, ubiquitination, SUMOylation 2/3, and tyrosine phosphorylation modifications for a target protein using a single, streamlined system.

대상 단백질에 대 한 내 생 포스트 번역 상 수정 프로필을 식별 하는 포괄적인 Immunoprecipitation 농축 시스템을 활용 하 여

It is now well-appreciated that post-translational modifications (PTMs) play an integral role in regulating a protein&#39;s structure and function, which ...

Leaf Spray Mass Spectrometry: A Rapid Ambient Ionization Technique to Directly Assess Metabolites from Plant Tissues

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing plant metabolites because it provides molecular weights with high sensitivity and specificity. Leaf spray MS is an ambient ionization technique where plant tissue is used for direct chemical analysis via electrospray, eliminating chromatography from the process. This approach to sampling metabolites allows for a wide range of chemical classes to be detected simultaneously from intact plant tissues, minimizing the amount of sample preparation needed. When used with a high-resolution, accurate mass MS, leaf spray MS facilitates the rapid detection of metabolites of interest. It is also possible to collect tandem mass fragmentation data with this technique to facilitate a compound identification. The combination of accurate mass measurements and fragmentation is beneficial in confirming compound identities. The leaf spray MS technique requires only minor modifications to a nanospray ionization source and is a useful tool to further expand the capabilities of a mass spectrometer. Here, fresh leaf tissue from Sceletium tortuosum (Aizoaceae), a traditional medicinal plant from South Africa, is analyzed; numerous mesembrine alkaloids are detected with leaf spray MS.

Leaf spray mass spectrometry is a direct chemical analysis technique that minimizes the sample preparation and eliminates chromatography, allowing for the rapid detection of small molecules from plant tissues.

잎 스프레이 질량 분석: 식물 조직에서 대사를 직접 평가 하는 급속 한 대기 이온화 기술

Plants produce thousands of small molecules that are diverse in their chemical properties. Mass spectrometry (MS) is a powerful technique for analyzing ...

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and podocytes with their slit diaphragms. The delicate structure of the glomerular filter, especially the slit diaphragm, relies on the interplay of diverse cell surface proteins. Studying these cell surface proteins has so far been limited to in vitro studies or histologic analysis. Here, we present a murine in vivo biotinylation labeling method, which enables the study of glomerular cell surface proteins under physiologic and pathophysiologic conditions. This protocol contains information on how to perfuse mouse kidneys, isolate glomeruli, and perform endogenous immunoprecipitation of a protein of interest. Semi-quantitation of glomerular cell surface abundance is readily available with this novel method, and all proteins accessible to biotin perfusion and immunoprecipitation can be studied. In addition, isolation of glomeruli with or without biotinylation enables further analysis of glomerular RNA and protein as well as primary glomerular cell culture (i.e., primary podocyte cell culture).

Isolation of Glomeruli and In Vivo Labeling of Glomerular Cell Surface Proteins

Here we present a protocol for murine in vivo labeling of glomerular cell surface proteins with biotin. This protocol contains information on how to perfuse mouse kidneys, isolate glomeruli, and perform endogenous immunoprecipitation of the protein of interest.

절연 Glomeruli와 비보에 사 세포 표면 단백질의 라벨

Proteinuria results from the disruption of the glomerular filter that is composed of the fenestrated endothelium, glomerular basement membrane, and ...

Looking Outwards: Isolation of Cyanobacterial Released Carbohydrate Polymers and Proteins

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The identification and characterization of these biomolecules can improve knowledge about their secretion pathways and help to manipulate them. Furthermore, some of these biomolecules are also interesting in terms of biotechnological applications. Described here are two protocols for easy and rapid isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and proteins. The method for isolation of released carbohydrate polymers is based on conventional precipitation techniques of polysaccharides in aqueous solutions using organic solvents. This method preserves the characteristics of the polymer and simultaneously avoids the presence of contaminants from cell debris and culture medium. At the end of the process, the lyophilized polymer is ready to be used or characterized or can be subjected to further rounds of purification, depending on the final intended use. Regarding the isolation of the cyanobacterial exoproteome, the technique is based on the concentration of the cell-free medium after removal of the major contaminants by centrifugation and filtration. This strategy allows for reliable isolation of proteins that reach the extracellular milieu via membrane transporters or outer membrane vesicles. These proteins can be subsequently identified using standard mass spectrometry techniques. The protocols presented here can be applied not only to a wide range of cyanobacteria, but also to other bacterial strains. Furthermore, these procedures can be easily tailored according to the final use of the products, purity degree required, and bacterial strain.

Here, protocols for the isolation of cyanobacterial released carbohydrate polymers and isolation of their exoproteomes are described. Both procedures embody key steps to obtain polymers or proteins with high purity degrees that can be used for further analysis or applications. They can also be easily adapted according to specific user needs.

바깥쪽을 바라보며: 시안박테리아 방출 탄수화물 고분자 및 단백질 의 분리

Cyanobacteria can actively secrete a wide range of biomolecules into the extracellular environment, such as heteropolysaccharides and proteins. The ...

Profiling Ubiquitin and Ubiquitin-like Dependent Post-translational Modifications and Identification of Significant Alterations

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the cell by controlling protein stability, activity, interactions, and intracellular localization. They enable the cell to respond to signals and to adapt to changes in its environment. Alterations within these mechanisms can lead to severe pathological situations such as neurodegenerative diseases and cancers. The aim of the technique described here is to establish ub/ubls dependent PTMs profiles, rapidly and accurately, from cultured cell lines. The comparison of different profiles obtained from different conditions allows the identification of specific alterations, such as those induced by a treatment for example. Lentiviral mediated cell transduction is performed to create stable cell lines expressing a two-tags (6His and Flag) version of the modifier (ubiquitin or a ubl such as SUMO1 or Nedd8). These tags permit the purification of ubiquitin and therefore of ubiquitinated proteins from the cells. This is done through a two-step purification process: The first one is performed in denaturing conditions using the 6His tag, and the second one in native conditions using the Flag tag. This leads to a highly specific and pure isolation of modified proteins which are subsequently identified and semi-quantified by liquid chromatography followed by tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) technology. Easy informatics analysis of MS data using Excel software enables the establishment of PTM profiles by eliminating background signals. These profiles are compared between each condition in order to identify specific alterations which will then be studied more specifically, starting with their validation by standard biochemistry techniques.

This protocol aims at establishing ubiquitin (Ub) and ubiquitin-likes (Ubls) specific proteomes in order to identify alterations of these kind of post-translational modifications (PTMs), associated with a specific condition such as a treatment or a phenotype.

유비퀴틴 및 유비퀴틴과 같은 종속 적 번역 후 수정 및 중대한 변경 식별 프로파일링

Ubiquitin (ub) and ubiquitin-like (ubl) dependent post-translational modifications of proteins play fundamental biological regulatory roles within the ...

Transverse Sectioning of Mature Rice (Oryza sativa L.) Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm phenotyping can be used to classify genotypes based on SG morphotype using scanning electron microscopic (SEM) analysis. SGs can be visualized using SEM by slicing through the kernel (pericarp, aleurone layers, and endosperm) and exposing the organellar contents. Current methods require the rice kernel to be embedded in plastic resin and sectioned using a microtome or embedded in a truncated pipette tip and sectioned by hand using a razor blade. The former method requires specialized equipment and is time-consuming, while the latter introduces a new host of problems depending on rice genotype. Chalky rice varieties, particularly, pose a problem for this type of sectioning due to the friable nature of their endosperm tissue. Presented here is a technique for preparing translucent and chalky rice kernel sections for microscopy, requiring only pipette tips and a scalpel blade. Preparing the sections within the confines of a pipette tip prevents rice kernel endosperm from shattering (for translucent or &#8216;vitreous&#8217; phenotypes) and crumbling (for chalky phenotypes). Using this technique, endosperm cell patterning and the structure of intact SGs can be observed.

Transverse Sectioning of Mature Rice Oryza sativa L. Kernels for Scanning Electron Microscopy Imaging Using Pipette Tips as Immobilization Support

This protocol allows for the preparation of transverse sections of cereal seeds (e.g., rice) for the analysis of endosperm and starch granule morphology using scanning electron microscopy.

성숙한 쌀의 횡단 단면(오리자 사티 라 L.) 파이펫 팁을 사용하여 전자 현미경 이미징을 스캐닝하기 위한 커널

Starch granules (SGs) exhibit different morphologies depending on the plant species, especially in the endosperm of the Poaceae family. Endosperm ...

Purification of Tubulin with Controlled Posttranslational Modifications and Isotypes from Limited Sources by Polymerization-Depolymerization Cycles

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They allow the analysis of the intrinsic properties of microtubules, such as dynamics, and their interactions with microtubule-associated proteins (MAPs). The &#8220;tubulin code&#8221; is an emerging concept that points to different tubulin isotypes and various posttranslational modifications (PTMs) as regulators of microtubule properties and functions. To explore the molecular mechanisms of the tubulin code, it is crucial to perform in vitro reconstitution experiments using purified tubulin with specific isotypes and PTMs.
To date, this was technically challenging as brain tubulin, which is widely used in in vitro experiments, harbors many PTMs and has a defined isotype composition. Hence, we developed this protocol to purify tubulin from different sources and with different isotype compositions and controlled PTMs, using the classical approach of polymerization and depolymerization cycles. Compared to existing methods based on affinity purification, this approach yields pure, polymerization-competent tubulin, as tubulin resistant to polymerization or depolymerization is discarded during the successive purification steps.
We describe the purification of tubulin from cell lines, grown either in suspension or as adherent cultures, and from single mouse brains. The method first describes the generation of cell mass in both suspension and adherent settings, the lysis step, followed by the successive stages of tubulin purification by polymerization-depolymerization cycles. Our method yields tubulin that can be used in experiments addressing the impact of the tubulin code on the intrinsic properties of microtubules and microtubule interactions with associated proteins.

This protocol describes tubulin purification from small/medium-scale sources such as cultured cells or single mouse brains, using polymerization and depolymerization cycles. The purified tubulin is enriched in specific isotypes or has specific posttranslational modifications and can be used in in vitro reconstitution assays to study microtubule dynamics and interactions.

중합-비합화 주기에 의해 제한된 소스에서 제어 된 번역 후 수정 및 동형으로 투불린의 정화

One important aspect of studies of the microtubule cytoskeleton is the investigation of microtubule behavior in in vitro reconstitution experiments. They ...

Purification of Ubiquitinated p53 Proteins from Mammalian Cells

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate protein. The ubiquitination process occurs intracellularly in eukaryotes and regulates almost all basic cellular biological processes. Purification of ubiquitinated proteins aids the investigation of the role of ubiquitination in controlling the function of substrate proteins. Here, a step-by-step procedure to purify ubiquitinated proteins in mammalian cells is described with the p53 tumor suppressor protein as an example. Ubiquitinated p53 proteins were purified under stringent nondenaturing and denaturing conditions. Total cellular Flag-tagged p53 protein was purified with anti-Flag antibody-conjugated agarose under nondenaturing conditions. Alternatively, total cellular His-tagged ubiquitinated protein was purified using nickel-charged resin under denaturing conditions. Ubiquitinated p53 proteins in the eluates were successfully detected with specific antibodies. Using this procedure, the ubiquitinated forms of a given protein can be efficiently purified from mammalian cells, facilitating studies on the roles of ubiquitination in regulating protein function.

The protocol describes a step-by-step method to purify ubiquitinated proteins from mammalian cells using the p53 tumor suppressor protein as an example. Ubiquitinated p53 proteins were purified from cells under stringent nondenaturing and denaturing conditions.

포유류 세포에서 유비퀴틴화된 p53 단백질의 정제

Ubiquitination is a type of posttranslational modification that regulates not only the stability but also the localization and function of a substrate ...