저자는 IBIS MX96에 대한 기술 지원을 노아 디토 아담 마일 감사합니다.

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이 비디오 기사에 대한 출판 비용은 베링거 인 겔 하임 제약 지불했다.

우리의 일대일 비교 연구는 각 바이오 센서 플랫폼은 자신의 강점과 약점을 가지고 있음을 보여준다. 항체의 결합 프로파일 (도 3 - 6) 시각 비교 유사하다하더라도, 취득 된 운동 속도 상수의 순위가 악기에 걸쳐 고도의 일치 (도 7), 우리의 결과와 악기 SPR 기반 보여 연속 흐름 유체는) 느린 해리 속도와 높은 친화력 상호 작용을 해결에서 더 낫다. 해리 단계에서 상향 드리프트는 데이터 세트에서 관찰된다 (예, 항체 2, 5 항체, 단클론 항체 및 9;도 5)의 유체 BLI없는 악기에 의해 발생. 이러한 결과는 시스템의 기본 제한되는 마이크로 플레이트, 경시 시료 증발에 상당 부분 기인 할 수있다. 이 고유 한 한계로, 실험 시간은 12 시간 이하로 제한되고; 실험 따라서 쉬로 프로그램 된배의 orter 다른 플랫폼들 (10 분 및 45 분 연관 해리)에 비해 (500 S 협회 30 분간 해리). BLI 기반기구에 의해 생성 된 속도 상수가 오프 비율의 일부 변동의 결과 (도 8의 (c)으로서 이하의 선형성을 표시하지만, 실험 시간을 단축하여 데이터 품질 / 일관성 증발의 영향을 완화하기 위해 나타나지 않았다 ). 시료 증발에 더하여, 사용되는 캡쳐 시약의 차이는 또한 얻어지는 결과의 차이에 기여 할 수있다. 단백질 A / G가 세 유체 기반 SPR 플랫폼에 사용되는 동안, AHC 센서는 비 유체의 BLI 플랫폼에서 사용되었다. 단백질 A / G가 AHC 항체 기반의 바이오 센서의 표면, 단백질 A / G 표면에서 항체 - 항원 복합체의 오프 속도 인위적보다 빨리 나타나는 않는보다 mAb에 대한 강한 친 화성을 가질 가능성이 있기 때문에 AHC 표면으로부터 얻어진. 이러한 가능성은 b를 지원설명 y BLI 플랫폼에 의해 발생 된 오프 속도 값은 다른 장치 (도 7의 적색 선)에 의한 것보다 더 지속적으로 낮았다 것을 보여주는 실험 데이터. 그럼에도 불구하고, BLI 플랫폼은 다른 플랫폼에 걸쳐 서로 다른 장점이 있습니다. 예를 들면, 즉시 사용으로 인해 다양한 사전 - 코팅 센서 센서 선택 및 분석에 관한 구성이 매우 유연하다. 우리의 실험에서 AHC 센서의 사용은 준비 시간을 줄이고, 리간드의 고정화 단계의 필요성을 제거. 또한, BLI 플랫폼은 복잡한 튜브 및 가치 스위치 구성을 특징으로 다른 유체의 SPR 플랫폼에 비해 훨씬 적은 유지 보수를 필요로한다. 이 기능은 막힘 오염 문제가 발생할 수 있습니다 원유 샘플을 포함하는 실험 장점이다. 치료 후보 증가, 효율적으로 신속하고 정확한 식별에 대한 수요, BI에 대한 요구로osensor 처리량도 증가하고있다. 네 개의 바이오 센서 플랫폼 중에서 96 리간드 어레이 인쇄 할 수있는 바이오 센서의 처리량 궁극적 증가 십자 36 리간드 포맷 및 16 채널 동시 판독과 BLI 기반 바이오 센서에 결합 된 바이오 센서, 다음으로 높은은 각각 96, 36, 16, 단일 결합 사이클에서 측정 된 상호 작용의 수. 이 처리량 기능은 하나의 일련의 흐름에 의해 연결된 네 개의 흐름 세포를 가지고에 의해 제한되는 기존의 SPR 플랫폼보다 훨씬 더 높다. 우리의 실험은 긴 해리 시간으로 다수의 표면 밀도에서 평가 10 단클론 항체의 비교적 작은 샘플 세트를 포함하기 때문에, 악기 처리량은 실험의 효율성을 결정하는 중간 역할을했다. 이 세 개의 높은 처리량 플랫폼의 실험 시간에 유의 한 차이는 없었다, 그리고 모든 경우에 실험은 하루에 완료되었습니다. 한편, 기존의 직렬 흐름 SPR 실험은 설치 후 데이터 수집의 도보 거리에 자동화에도 불구하고, 완료 삼일이 필요합니다. 오프 속도 순위 / 운동 검사 또는 에피토프 비닝 (binning)을 위해, (수백 또는 수천의 예) 샘플의 큰 숫자를 포함하는 다른 연구에서, 처리량은 중요한 요소가된다. IBIS MX96의 처리량이 다른 바이오 센서보다 수십 배 더 높다 따라서 이러한 목적을위한 최적의 선택이지만, 몇 가지 단점을 가지고있다. 특히, CFM하여 배열 인쇄 큰 표면 불일치 (도 1) 및 감소 된 데이터 재현성 (도 8D 및 8E)을 나타낸다. 정확한 동역학 측정을 위해 바이오 센서의 표면 리간드의 양은 결합 반응은 같은 보조 요소들에 의해 방해되지 않도록 제어 할 필요가 중요한 파라미터이다물질 전달 또는 입체 장애. 바이아 코어 T100 및 ProteOn XPR36 들어, 최적의 R L 레벨이 연구 제 17에서 설명한 바와 같이 설정된 R의 최대 값의 표준 계산에 기초하여 결정 하였다. 한편, 옥텟 RED384 및 IBIS MX96 플랫폼, 단클론 항체 캡쳐 레벨은 경험적 상수 배에서 2 배 희석 한 항체의 시리즈를 사용하여 달성 하였다. 기술 또는 캡처 단계의 제어의 부족은 고밀도 표면 운동 속도 상수의 정밀도를 손상 수도 높은 결합 응답 신호 (도 2)였다. 재생성 관련된 여러 바인딩 사이클 측정을 수행 할 때 또한, SPR 검출기로부터 프린터의 분리도 문제를 제시한다. 멀티 사이클 동역학 설정을 수행 할 수있는 유일한 방법은, 고정 된 단백질 A / G에서 단클론 항체를 통해 캡처 된 Fc 반대로 모노클 직접 아민 커플 링으로했다다른 세 개의 바이오 센서 플랫폼의 표면. 결과적으로, 추가로 재생 정찰 실험 최적의 재생 조건을 결정하기 위해 필요했다. 이 설정의 결과는 더 이상 실험 시간 이외에의 Fc 캡처 방법 (그림 9)에 비해 ~ 90 % 낮은 관찰 된 표면 활동과 연결되었다. 은 FC 캡처 방법을 실행하려면, 다른 하나의주기 운동 방식이 채택되었다. 이러한 접근법은 각각의 분사 (도 2) 사이에 재생하지 않고, 증가하는 농도의 분석 물질의 연속 주입을 포함한다. 이것은 매우 편리하지만, 일반적으로 덜 적용 방법뿐만 실험 시간 단축 및 시약의 소비를 줄일뿐만 아니라 다른 바이오 센서 (도 7)의 것과 매우 유사한 운동 속도 상수를 생성. 따라서,이 단일 사이클 반응 속도 접근 방식을 적용하면 악기의 고유 한 구성의 한계를 극복하고 선물높은 처리량 방식으로 고해상도의 운동 속도 상수를 얻기위한 기회를 제공합니다. 처리량이 비아 코어 T100의 주요 제한에도 불구하고, 우리의 결과는 총체적으로는 최고의 품질과 가장 일치하는 데이터를 생성 한 것으로 나타났다. 이것은 ~ 10 배 높은 처리량을 가지고 ProteOn XPR36,으로 이어졌습니다. 악기 &#39;검출 한계에 도달하면 기술적으로 어려울 수 고친 화성 항체 - 항원 상호 작용을 특성화 할 때 고품질의 데이터를 생성하는 능력이있는 장점이된다. 옥 테트 RED384의 장비의 체계적인 제한 해리 속도 상수의 정확한 측정을 방해하는 동안 (즉, 감도의 짧은 떨어지는 속도가 느린 오프 요금에 대한 충분한 신호 부패를 해결하기 위해), 모두 비아 코어 T100 및 ProteOn XPR36는 민감하고 안정적인 제공 할 수 있습니다 차별화를위한 탐지.

The acquisition of reliable kinetic parameters for characterizing antibody-antigen interactions is an essential component of the drug discovery and development process1. Optical Surface Plasmon Resonance (SPR) biosensors, the "gold standard" for real-time detection of these interactions, have been used for approximately two decades to enable early selection of criteria-meeting therapeutic antibody candidates2,3. In addition to providing an affinity ranking of antibody candidates by the rapid binding screening of crude supernatants4, and rigorous kinetic constant determinations of purified preparations5, biosensors can further differentiate the functional activity of lead candidates via epitope binning studies6,7. 
To meet the growing demand of antibody-based products for various therapeutic indications8, a wide variety of innovative biosensor instruments have been developed in recent years that increase the efficiency of candidate identification and characterization9,10. These instruments differ in microfluidic channel configuration design and/or in the optical principles involved in detecting biomolecular interactions. Specifically, the Octet RED38411, ProteOn XPR3612, and IBIS MX967 have expanded the number of interactions measured in a single binding cycle to 16, 36, and 96 respectively, representing significant throughput improvements over the traditional Biacore platform. Although these various biosensor platforms all provide essential kinetic data for characterizing antibody-antigen interactions, they differ in experimental setup and operational procedures due to variations in instrumental configurations. For example, in the IBIS MX96's SPR imaging array platform, the multiplex ligand immobilization step is performed in an off-line mode in an external printing device separate from the detector7,13; in contrast, the other three biosensor platforms utilize an "all-in-one" setup, where the addition of component onto the sensor surface, whether it is the activation reagent, ligand, or analyte, is recorded in real time and through pre-programmed commands in sequential order. In the Octet RED384, a unique feature of this BioLayer Interferometry (BLI)-based platform is the availability of pre-coated optical fiber biosensors for immediate "dip-and-read" use14, eliminating the need for ligand surface preparation and initiation/conditioning steps, which are often required for the sensor chips in SPR-based platforms. This instrument's fluidic-free design also simplifies the mechanics and avoids clogging and contamination concerns when dealing with crude samples. With the novel 6 x 6 crisscrossing fluidic design in the ProteOn XPR36, a "one-shot" kinetics approach can be implemented by switching the flow channels between horizontal and vertical directions to create 36 interaction spots15. Instead of assessing binding kinetics one ligand or analyte concentration at a time, as is done in the traditional serial flow Biacore T100 platform, this approach offers the ability to monitor up to 36 different interactions simultaneously in a single binding cycle. 
Despite their differences, these four biosensor platforms are all widely used by many laboratories worldwide. For new users with little hands-on biosensor experience, deciding which instrument to use can be a challenging task given the differences in instrumental design. To determine the most appropriate instrument for their research purposes, factors such as data quality, performance consistency, throughput, ease of operation, and material consumption need to be considered collectively. While several benchmark studies have explored the variability of kinetic rate constants obtained from multiple laboratories and biosensors5,16, a recently published head-to-head comparison study further addresses the systematic factors that influence data reliability from the instrumental performance point of view17,18. The protocols supplied in this video focus on the experimental setup and procedures in detail, and are accompanied by the research article entitled, "Comparison of biosensor platforms in the evaluation of high affinity antibody-antigen binding kinetics"17. These protocols are intended not only to help new biosensor users implement these instruments for their research purposes, but also to provide additional insights for current biosensor users regarding technical challenges and considerations in experimental designs for evaluating high-affinity antibody-antigen interactions.

<table><tbody><tr><td>Biacore T100 System</td><td>GE Healthcare</td><td>28975001</td><td>The T100 system has been upgraded to T200</td></tr><tr><td>CM5 Sensor Chip&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100012</td><td></td></tr><tr><td>BIAevaluation&amp;nbsp;</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>Version 4.1</td></tr><tr><td>Biacore T100 Control Software</td><td>GE Healthcare</td><td></td><td>The T100 control software has been upgraded to T200</td></tr><tr><td>Amine Coupling Kit</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100050&amp;nbsp;</td><td>It contains: 750 mg 1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)carbodiimide hydrochloride (EDC), 115 mg N-hydroxysuccinimide (NHS), 10.5 mL 1.0 M ethanolamine-HCl pH 8.5&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>HBS-EP+ Buffer 10&amp;times;</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100669</td><td>Concentrated stock solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Plastic Vials, o.d. 7 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100212&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Rubber Caps, type 3</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100502</td><td></td></tr><tr><td>Plastic Vials and Caps, o.d. 11 mm</td><td>GE Healthcare</td><td>BR100214&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>ProteOn XPR36 Protein Interaction Array System</td><td>Bio-Rad</td><td>1760100</td><td></td></tr><tr><td>ProteOn Manager Software&amp;nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td>1760200</td><td>Version 3.1.0.6</td></tr><tr><td>GLM Sensor Chip</td><td>Bio-Rad</td><td>1765012</td><td></td></tr><tr><td>Amine Coupling Kit</td><td>Bio-Rad</td><td>1762410</td><td>It includes EDAC (EDC), sulfo-NHS, ethanolamine HCl&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Regeneration and Conditioning Kit and Buffers</td><td>Bio-Rad</td><td>1762210</td><td>It includes 1 each glycine buffer (pH 1.5, 2.0, 2.5, 3.0), and NaOH, SDS, HCl, phosphoric acid, NaCl; 50 mL each solution&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>2 L PBS/Tween/EDTA buffer</td><td>Bio-Rad</td><td>1762730</td><td>It includes hosphate buffered saline (PBS), pH 7.4, 0.005% Tween 20, 3 mM EDTA&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Octet RED384 System</td><td>Fort&amp;eacute;Bio</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Data Analysis Software</td><td>Fort&amp;eacute;Bio</td><td></td><td>Version 9.0.0.4</td></tr><tr><td>Dip and Read Anti-hIgG Fc Capture (AHC) Biosensors</td><td>Fort&amp;eacute;Bio</td><td>18-5060</td><td>One tray of 96 biosensors&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>384-Well Tilted-Bottom Plate&amp;nbsp;</td><td>Fort&amp;eacute;Bio</td><td>18-5080</td><td></td></tr><tr><td>Biosensor Dispenser</td><td>Fort&amp;eacute;Bio</td><td>18-5016</td><td></td></tr><tr><td>Kinetics Buffer 10x</td><td>Fort&amp;eacute;Bio</td><td>18-1092</td><td>10x concentration. Contains ProClin 300.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>IBIS MX96 SPRi System</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microfluidics Continuous Flow Microspotter (CFM) Printer</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>Version 2.0</td></tr><tr><td>SensEye COOH-G chip</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>1-09-04-004</td></tr><tr><td>Data Analysis Software</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>Version 6.19.3.17</td></tr><tr><td>SPRint Data Analysis Software</td><td>Wasatch Microfluidics</td><td></td><td>Version 6.15.2.1</td></tr><tr><td>Scrubber 2</td><td>BioLogic Software</td><td></td><td>Version 2</td></tr><tr><td>Pierce Recombinant Protein A/G</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>21186</td><td></td></tr></tbody></table>

determination of high-affinity antibody-antigen binding kinetics using four biosensor platforms

라벨이없는 광 바이오 센서는 생체 분자 상호 작용의 특성에 대한 신약 개발에 강력한 도구입니다. 이 연구에서 우리는 결합 친화와 인간의 proprotein convertase의 서브 틸리 켁신 유형 (9)에 대한 열 높은 친화력 단일 클론 항체 (단클론 항체) (PCSK9)의 역학을 평가하기 위해 우리의 실험실에서 네 일상적으로 사용되는 바이오 센서 플랫폼의 사용을 설명합니다. 비아 코어 T100 및 ProteOn XPR36 모두 노포 표면 플라스 몬 공명 (SPR) 기술에서 유도되는 반면, 전자는 즉석에서 6 × 6 십자 통해 병렬 후자 선물 반면 36 반응 반점, 직렬 흐름 구성 형태로 연결된 네 개의 플로우 셀을 갖고 미세 유체 채널 구성. 비스 MX96은 공간 방향에서 검출을 제공하는 추가의 촬상 기능은 SPR 센서 기술을 기반으로 동작한다. 연속 흐름 Microspotter (CFM)와 결합이 검출 기술은 전자에 의해 크게 처리량을 확대동시에 반응 96 개 스포츠 다중 어레이 인쇄 및 감지 nabling. 대조적으로 옥텟 RED384는 광섬유 프로브 간섭 패턴을 검출하는 바이오 센서의 역할과 BioLayer 간섭계 (BLI) 광학 원리에 기반은 팁 표면에서 상호 결합에 바꾼다. 표면 플라즈몬 공명 기반 플랫폼과는 달리, BLI 시스템은 연속 흐름 유체에 의존하지 않는다; 그들은 오비탈 교반 중에 384- 웰 마이크로 플레이트의 분석 용액에 침지하면서 대신, 센서 팁 판독을 수집한다. 이러한 바이오 센서 플랫폼은 각각 자신의 장점과 단점이 있습니다. 1 분자 상호 작용 모델 : 상기 설명한 프로토콜은 단순한 1 맞 항체 - 항원 동력학을 특성화하기 위해 동일한 분석 포맷과 동일한 고품질의 시약을 사용하여 실험을 보여 질 운동 데이터를 제공하기 위해 이러한 기기 능력의 직접적인 비교를 제공한다 .

도 1은 두 고정화 방법에 의해 CFM 및 발견 항체 농도에서 항체 어레이 이미지를 도시하고,도 2는 이러한 항체 어레이의 다중 사이클에서 MX96에 운동 생성 대응 결합 sensorgrams 및 단일주기 운동 측정을 도시 . 6 - 바인딩 4 개 개의 바이오 센서 플랫폼에서 발생하는 다수의 항체가 코팅 된 표면으로부터 역학적으로 장착 곡선 실시간은도 3에 도시된다. 도 7은 이러한 결합 곡선의 글로벌 분석으로부터 얻어진 최종 운동 속도 및 평형 결합 상수를 비교 한 것이다. 개별 협회 (a를 K), 해리 (유전율 d), 평형 (K D) 결합 상수를 표 1에 나타내었다. 같은 기기 내에서 생성 된 데이터 세트의 변동성을 설명하기 위해, <st룽&gt;도 8은 다른 항체 표면 밀도에서 k 개의 A, K의 D 및 K D의 플롯을 도시하고,도 9에있어서, 상기 바이오 센서 플랫폼 단클론 항체 표면의 산출 결속 액티비티를 비교한다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig1.jpg" /> 아민 결합 (A) 및 IBIS MX96에 CFM에서 출력 (B) 표면 항체를 포획 된 Fc-그림 1. 다중 리간드 어레이. 인쇄 어레이 이미지 붉은 사각형으로 둘러싸인 회색 영역은 항체의 존재를 나타내는 왼쪽 패널에 나타낸다. 활성 항체 스폿 간의 위치 진한 interspots 참조 감산에 사용된다. 각 열은 다음과 화상의 좌측 식별 적정 농도로 인쇄하는 항체를 포함한다. 디을 계산하여 정량 인쇄 된 항체의 양은활성과 기준 위치 사이의 부피 변화에 fference는 우측 패널에 도시되어있다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig2.jpg" /> 멀티 사이클 (A)에서 Sensorgrams 바인딩 실시간 및 단일 - 사이클 (B)를 IBIS MX96의 운동 실험 그림 2. 비교. 10 × 8 항체 어레이에 걸쳐 증가하는 농도에서 사람 PCSK9의 순차 주사는 각 해당 센서 그램 세그먼트 위에서 언급된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig3.jpg" /> <st바이아 코어 T100 1 운동 모델 맞추기 오버레이 : 룽&gt;도 3은 인간의 PCSK9 1과 상호 작용하는 항체의 캡쳐 Sensorgrams 바인딩. 상호 작용은 하이 (상단 패널), 중간 (중간 패널), 및 낮은 (하단 패널) 밀도면에 걸쳐 평가된다. 한 상호 작용 모델 : 포개어 부드러운 검은 선은 (1) 서로 다른 사람 PCSK9 농도 (컬러 라인)에서 바인딩 응답 신호의 운동 착용감을 나타낸다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig4.jpg" /> ProteOn XPR36 1 운동 모델 맞춤 오버레이 : 그림 4. 인간의 PCSK9 1과 상호 작용 캡처 항체의 Sensorgrams 바인딩. 상호 작용은 고 (상단 패널), 메디을 통해 평가각하, (중간 패널), 및 낮은 (하단 패널) 밀도면. 한 상호 작용 모델 : 포개어 부드러운 검은 선은 (1) 서로 다른 사람 PCSK9 농도 (컬러 라인)에서 바인딩 응답 신호의 운동 착용감을 나타낸다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig5.jpg" /> 옥 테트 RED384 1 운동 모델 맞춤 오버레이 : 그림 5. 인간의 PCSK9 1과 상호 작용 캡처 항체의 Sensorgrams 바인딩. 상호 작용은 하이 (상단 패널), 중간 (중간 패널), 및 낮은 (하단 패널) 밀도면에 걸쳐 평가된다. 포개어 적색 라인 1에 다른 사람 PCSK9 농도 (컬러 라인)에서 바인딩 응답 신호의 운동 착용감을 나타낸다 :<html> 1 개 상호 작용 모델. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 6" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig6.jpg" /> IBIS MX96 1 운동 모델 맞추기 오버레이 :도 6 인간 PCSK9 1과 상호 작용 아민 결합 (A)과의 Fc- 캡처 (B) 항체의 Sensorgrams 바인딩. 바인딩 정보는도 1의 배열 판지도를 따라 10 × 8 패널로 구성된다. 검은 색 선은 다른 사람 PCSK9 농도에서 기록 된 결합 응답 신호를 나타내고, 포개어 적색 라인 피팅 곡선을 나타낸다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> gure 7 &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 55659 / 55659fig7.jpg &quot;/&gt; 도 협회 항 비교 포 바이오 센서 플랫폼에 의해 생성 된 바인딩 상수 A (A), 해리 (K)의 D (B)를 K, 평형 K D (C). 6 - 운동 파라미터는도 3의 결합 곡선 글로벌 분석으로부터 유도된다. 다음과 같은기구가 표현된다 : 비아 코어 T100 (블루) ProteOn XPR36 (녹색), 옥텟 RED384 (적색), 아민 결합 (보라색) IBIS MX96 및 IBIS MX96 (오렌지색)이 된 Fc-캡처. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 8" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig8.jpg" /> BIAC의 여러 항체 표면 밀도 이상 운동 속도 상수의 일관성의 그림 8. 비교<html> T100 석 (A), ProteOn XPR36 (B), 옥텟 RED384 (C) IBIS MX96 아민 결합 (D), 및 캡처 된 Fc-IBIS MX96 (E). 운동 파라미터는 (상위 서브 패널), 케이 D (중간 서브 패널) K, D 및 K (하단 서브 패널) 개별 항체 표면 밀도 그룹 분석으로부터 유도된다. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55659/55659fig8large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 9" src="/files/ftp_upload/55659/55659fig9.jpg" /> 그림 네 개의 바이오 센서 플랫폼의 항체 표면과 그 표준 편차 (오차 막대)의 9 바인딩 활동. 값은 연구 논문 (17)에 기재된 식을 사용하여 계산된다.large.jpg &quot;target =&quot;_ blank &quot;&gt; 검색이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td rowspan="2"></td><td> (KA) </td><td> K D </td><td> K D </td></tr><tr><td> (M -1 (S) -1) </td><td> (S-1) </td><td> (㎚) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (1) </td><td> (7.8) 11.7 10 5 X </td><td> (4.18) 4.89 10 X -5 </td><td> 0.052 (0.05) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 2 </td><td> (0.28) 1.53 10 5 X </td><td> (1.54) 1.30 10 X -5 </td><td> 0.092 (0.12) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 3 </td><td> (8.3) 11.4 10 5 X </td><td> (11.0) 27.6 10 X -5 </td><td> 0.333 (0.20) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 4 </td><td> (1.6) 3.61 10 5 X </td><td> (12.3) 20.1 10 X -5 </td><td> 0.659 (0.54) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (5) </td><td> (0.21) 0.59 10 5 X </td><td> (2.50) 3.46 10 X -5 </td><td> 0.663 (0.46) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (6) </td><td> (0.78) 1.19 10 5 X </td><td> (3.83) 7.21 10 X -5 </td><td> 0.894 (0.64) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (7) </td><td> (0.53) 1.29 10 5 X </td><td> (5.63) 16.4 10 X -5 </td><td> 1.57 (1.02) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (8) </td><td> (2.23) 4.02 10 5 X </td><td> (10.7) 22.8 10 X -5 </td><td> 0.768 (0.68) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (9) </td><td> (2.13) 4.20 10 5 X </td><td> (4.3) 6.67 10 X -5 </td><td> 0.197 (0.16) </td></tr><tr><td> 단클론 항체 (10) </td><td> (0.49) 1.20 (1) X0 5 </td><td> (7.64) 12.5 10 X -5 </td><td> 1.27 (0.80) </td></tr></tbody></table> 표 1 : 1 상호 작용 모델 : 운동 요금 및 평형이 1 개의 바이오 센서 인스트루먼트의 바인딩 곡선의 글로벌 피팅에 의해 획득 (10) 단클론 항체의 상수 바인딩.

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Determination of High-affinity Antibody-antigen Binding Kinetics Using Four Biosensor Platforms

우리는 여기에 설명 친화력 네 일반적으로 사용되는 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 반응 속도를 결합 항체 - 항원의 측정을위한 프로토콜.

네 개의 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 높은 친 화성 항체 - 항원 결합 속도론의 결정

Label-free optical biosensors are powerful tools in drug discovery for the characterization of biomolecular interactions. In this study, we describe the ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

20.6K 조회수.  Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc..  우리는 여기에 설명 친화력 네 일반적으로 사용되는 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 반응 속도를 결합 항체 - 항원의 측정을위한 프로토콜. 

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Microfluidic On-chip Capture-cycloaddition Reaction to Reversibly Immobilize Small Molecules or Multi-component Structures for Biosensor Applications

Methods for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over orientation and immobilization density are highly desirable for biosensor and microarray applications. In this Study, we use a highly efficient covalent bioorthogonal [4+2] cycloaddition reaction between trans-cyclooctene (TCO) and 1,2,4,5-tetrazine (Tz) to enable the microfluidic immobilization of TCO/Tz-derivatized molecules. We monitor the process in real-time under continuous flow conditions using surface plasmon resonance (SPR). To enable reversible immobilization and extend the experimental range of the sensor surface, we combine a non-covalent antigen-antibody capture component with the cycloaddition reaction. By alternately presenting TCO or Tz moieties to the sensor surface, multiple capture-cycloaddition processes are now possible on one sensor surface for on-chip assembly and interaction studies of a variety of multi-component structures. We illustrate this method with two different immobilization experiments on a biosensor chip; a small molecule, AP1497 that binds FK506-binding protein 12 (FKBP12); and the same small molecule as part of an immobilized and in situ-functionalized nanoparticle.

We present a method for rapid, reversible immobilization of small molecules and functionalized nanoparticle assemblies for Surface Plasmon Resonance (SPR) studies, using sequential on-chip bioorthogonal cycloaddition chemistry and antibody-antigen capture.

역으로 작은 분자 또는 바이오 센서 애플리케이션을위한 다중 구성 요소 구조를 무력화하는 미세 유체 온칩 캡처 - 고리 화 반응

Methods  for rapid surface immobilization of bioactive small molecules with control over  orientation and immobilization density are highly desirable for ...

연구

화학

Bio-layer Interferometry for Measuring Kinetics of Protein-protein Interactions and Allosteric Ligand Effects

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia coli&#160;ATP synthase. Bacterial F-type ATP synthase is the target of a new, FDA-approved antibiotic to combat drug-resistant tuberculosis. Understanding bacteria-specific auto-inhibition of ATP synthase by the C-terminal domain of subunit &#949;&#160;could provide a new means to target the enzyme for discovery of antibacterial drugs. The C-terminal domain of &#949;&#160;undergoes a dramatic conformational change when the enzyme transitions between the active and inactive states, and catalytic-site ligands can influence which of &#949;&#39;s conformations is predominant. The assay measures kinetics of &#949;&#39;s binding/dissociation with the catalytic complex, and indirectly measures the shift of enzyme-bound &#949;&#160;to and from the apparently nondissociable inhibitory conformation. The Bio-layer Interferometry signal is not overly sensitive to solution composition, so it can also be used to monitor allosteric effects of catalytic-site ligands on &#949;&#39;s conformational changes.

The protocols here describe kinetic assays of protein-protein interactions with Bio-layer Interferometry. F-type ATP synthase, which is involved in cellular energy metabolism, can be inhibited by its &#949; subunit in bacteria. We have adapted Bio-layer Interferometry to study interactions of the catalytic complex with &#949;&#8217;s inhibitory C-terminal domain.

단백질 - 단백질 상호 작용 및 알로 스테 릭 리간드 효과의 속도론을 측정하는 바이오 층 간섭

We describe the use of Bio-layer Interferometry to study inhibitory interactions of subunit &#949;&#160;with the catalytic complex of Escherichia ...

Analyzing Dynamic Protein Complexes Assembled On and Released From Biolayer Interferometry Biosensor Using Mass Spectrometry and Electron Microscopy

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this work, the pre-endosomal anthrax toxin is assembled and transitioned into the endosomal complex. First, the N-terminal domain of a cysteine mutant lethal factor (LFN) is attached to a biolayer interferometry (BLI) biosensor through disulfide coupling in an optimal orientation, allowing protective antigen (PA) prepore to bind (Kd 1 nM). The optimally oriented LFN-PAprepore complex then binds to soluble capillary morphogenic gene-2 (CMG2) cell surface receptor (Kd 170 pM), resulting in a representative anthrax pre-endosomal complex, stable at pH 7.5. This assembled complex is then subjected to acidification (pH 5.0) representative of the late endosome environment to transition the PAprepore into the membrane inserted pore state. This PApore state results in a weakened binding between the CMG2 receptor and the LFN-PApore and a substantial dissociation of CMG2 from the transition pore. The thio-attachment of LFN to the biosensor surface is easily reversed by dithiothreitol. Reduction on the BLI biosensor surface releases the LFN-PAprepore-CMG2 ternary complex or the acid transitioned LFN-PApore complexes into microliter volumes. Released complexes are then visualized and identified using electron microscopy and mass spectrometry. These experiments demonstrate how to monitor the kinetic assembly/disassembly of specific protein complexes using label-free BLI methodologies and evaluate the structure and identity of these BLI assembled complexes by electron microscopy and mass spectrometry, respectively, using easy-to-replicate sequential procedures.

Here we present a protocol to monitor the assembly and disassembly of the anthrax toxin using biolayer interferometry (BLI). Following assembly/disassembly on the biosensor surface, the large protein complexes are released from the surface for visualization and identification of components of the complexes using electron microscopy and mass spectrometry, respectively.

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

In vivo, proteins are often part of large macromolecular complexes where binding specificity and dynamics ultimately dictate functional outputs. In this ...

생화학

Creating Highly Specific Chemically Induced Protein Dimerization Systems by Stepwise Phage Selection of a Combinatorial Single-Domain Antibody Library

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the dissection and manipulation of biological pathways. Currently, only a limited number of chemically induced dimerization (CID) systems exist and engineering new ones with desired sensitivity and selectivity for specific small-molecule ligands remains a challenge in the field of protein engineering. We here describe a high throughput screening method, combinatorial binders-enabled selection of CID (COMBINES-CID), for the de novo engineering of CID systems applicable to a large variety of ligands. This method uses the two-step selection of a phage-displayed combinatorial nanobody library to obtain 1) &#34;anchor binders&#34; that first bind to a ligand of interest and then 2) &#34;dimerization binders&#34; that only bind to anchor binder-ligand complexes. To select anchor binders, a combinatorial library of over 109 complementarity-determining region (CDR)-randomized nanobodies is screened with a biotinylated ligand and hits are validated with the unlabeled ligand by bio-layer interferometry (BLI). To obtain dimerization binders, the nanobody library is screened with anchor binder-ligand complexes as targets for positive screening and the unbound anchor binders for negative screening. COMBINES-CID is broadly applicable to select CID binders with other immunoglobulin, non-immunoglobulin, or computationally designed scaffolds to create biosensors for in vitro and in vivo detection of drugs, metabolites, signaling molecules, etc.

Creating chemically induced protein dimerization systems with desired affinity and specificity for any given small molecule ligand would have many biological sensing and actuation applications. Here, we describe an efficient, generalizable method for de novo engineering of chemically induced dimerization systems via the stepwise selection of a phage-displayed combinatorial single-domain antibody library.

결합 단일 도메인 항체 라이브러리의 단계별 파지 선택에 의해 고도로 특이적 화학적으로 유도된 단백질 이분화 시스템 생성

Protein dimerization events that occur only in the presence of a small-molecule ligand enable the development of small-molecule biosensors for the ...

Rapid Determination of Antibody-Antigen Affinity by Mass Photometry

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this protocol, we describe the implementation of a new single-molecule technique, mass photometry (MP), for this purpose. MP is a label- and immobilization-free technique that detects and quantifies molecular masses and populations of antibodies and antigen-antibody complexes on a single-molecule level. MP analyzes the antigen-antibody sample within minutes, allowing for the precise determination of the binding affinity and simultaneously providing information on the stoichiometry and the oligomeric state of the proteins. This is a simple and straightforward technique that requires only picomole quantities of protein and no expensive consumables. The same procedure can be used to study protein-protein binding for proteins with a molecular mass larger than 50 kDa. For multivalent protein interactions, the affinities of multiple binding sites can be obtained in a single measurement. However, the single-molecule mode of measurement and the lack of labeling imposes some experimental limitations. This method gives the best results when applied to measurements of sub-micromolar interaction affinities, antigens with a molecular mass of 20 kDa or larger, and relatively pure protein samples. We also describe the procedure for performing the required fitting and calculation steps using basic data analysis software.

We describe a single-molecule approach to antigen-antibody affinity measurements using mass photometry (MP). The MP-based protocol is fast, accurate, uses a very small amount of material, and does not require protein modification.

질량 광합성에 의한 항체 항원 선호도의 신속한 결정

Measurements of the specificity and affinity of antigen-antibody interactions are critically important for medical and research applications. In this ...

Exploring Biomolecular Interaction Between the Molecular Chaperone Hsp90 and Its Client Protein Kinase Cdc37 using Field-Effect Biosensing Technology

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. Biomolecules such as proteins, carbohydrates, vitamins, fatty acids, nucleic acids, and enzymes are fundamental building blocks of living beings; they assemble into complex networks in biosystems to synchronize a myriad of life events. Proteins typically utilize complex interactome networks to carry out their functions; hence it is mandatory to evaluate such interactions to unravel their importance in cells at both cellular and organism levels. Toward this goal, we introduce a rapidly emerging technology, field-effect biosensing (FEB), to determine specific biomolecular interactions. FEB is a benchtop, label-free, and reliable biomolecular detection technique to determine specific interactions and uses high-quality electronic-based biosensors. The FEB technology can monitor interactions in the nanomolar range due to the biocompatible nanomaterials used on its biosensor surface. As a proof of concept, the protein-protein interaction (PPI) between heat shock protein 90 (Hsp90) and cell division cycle 37 (Cdc37) was elucidated. Hsp90 is an ATP-dependent molecular chaperone that plays an essential role in the folding, stability, maturation, and quality control of many proteins, thereby regulating multiple vital cellular functions. Cdc37 is regarded as a protein kinase-specific molecular chaperone, as it specifically recognizes and recruits protein kinases to Hsp90 to regulate their downstream signal transduction pathways. As such, Cdc37 is considered a co-chaperone of Hsp90. The chaperone-kinase pathway (Hsp90/Cdc37 complex) is hyper-activated in multiple malignancies promoting cellular growth; therefore, it is a potential target for cancer therapy. The present study demonstrates the efficiency of FEB technology using the Hsp90/Cdc37 model system. FEB detected a strong PPI between the two proteins (KD values of 0.014 &#181;M, 0.053 &#181;M, and 0.072 &#181;M in three independent experiments). In summary, FEB is a label-free and cost-effective PPI detection platform, which offers fast and accurate measurements.

Field-effect biosensing (FEB) is a label-free technique for detecting biomolecular interactions. It measures the electric current through the graphene biosensor to which the binding targets are immobilized. The FEB technology was used to evaluate biomolecular interactions between Hsp90 and Cdc37 and a strong interaction between the two proteins was detected.

필드 이펙트 바이오센싱 기술을 이용한 분자 샤페론 Hsp90과 클라이언트 단백질 키나제 Cdc37 사이의 생체분자 상호작용 탐구

Biomolecular interactions play versatile roles in numerous cellular processes&#160;by regulating and coordinating functionally relevant biological events. ...

The Use of a &#946;-lactamase-based Conductimetric Biosensor Assay to Detect Biomolecular Interactions

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental monitoring, and food safety control. In this context, we used &#946;-lactamases as efficient reporter enzymes in several protein-protein interaction studies. Furthermore, their ability to accept insertions of peptides or structured proteins/domains strongly encourages the use of these enzymes to generate chimeric proteins. In a recent study, we inserted a single-domain antibody fragment into the Bacillus licheniformis BlaP &#946;-lactamase. These small domains, also called nanobodies, are defined as the antigen-binding domains of single chain antibodies from camelids. Like common double chain antibodies, they show high affinities and specificities for their targets. The resulting chimeric protein exhibited a high affinity against its target while retaining the &#946;-lactamase activity. This suggests that the nanobody and &#946;-lactamase moieties remain functional. In the present work, we report a detailed protocol that combines our hybrid &#946;-lactamase system to the biosensor technology. The specific binding of the nanobody to its target can be detected thanks to a conductimetric measurement of the protons released by the catalytic activity of the enzyme.

In this work, we report a new method to study protein-protein interactions using a conductimetric biosensor based on the hybrid &#946;-lactamase technology. This method relies on release of protons upon hydrolysis of &#946;-lactams.

바이오 상호 작용을 검출 하는 β-lactamase 기반 Conductimetric 바이오 센서 분석 결과의 사용

Biosensors are becoming increasingly important and implemented in various fields such as pathogen detection, molecular diagnosis, environmental ...

생체공학

<meta charset="utf8"></head><body>Label-Free 방법을 사용한 RPA-ssDNA 결합 동역학의 정량 분석

Analyzing DNA-Protein Interactions with Streptavidin-Based Biolayer Interferometry

Protein-DNA interactions underpin essential cellular processes. Understanding these interactions is critical for elucidating the molecular mechanisms of various pathways. Key factors such as the structure, sequence, and length of a DNA molecule can significantly influence protein binding. Bio-layer interferometry (BLI) is a label-free technique that measures binding kinetics between molecules, offering a straightforward and precise approach to quantitatively study protein-DNA interactions. A major advantage of BLI over traditional gel-based methods is its ability to provide real-time data on binding kinetics, enabling accurate measurement of the equilibrium dissociation constant (KD) for dynamic protein-DNA interactions. This article presents a basic protocol for determining the KD value of the interaction between a DNA replication protein, replication protein A (RPA), and a single-stranded DNA (ssDNA) substrate. RPA binds ssDNA with high affinity but must also be easily displaced to facilitate subsequent protein interactions within biological pathways. In the described BLI assay, biotinylated ssDNA is immobilized on a streptavidin-coated biosensor. The binding kinetics (association and dissociation) of RPA to the biosensor-bound DNA are then measured. The resulting data are analyzed to derive precise values for the association rate constant (ka), dissociation rate constant (kd), and equilibrium binding constant (KD) using system software.

<meta charset="utf8"></head><body>스트렙타비딘 기반 생물층 간섭계를 사용한 DNA-단백질 상호작용 분석

This article describes a protocol for studying DNA-protein interactions using a streptavidin-based biolayer interferometry (BLI) system. It outlines the essential steps and considerations for utilizing either basic or advanced binding kinetics to determine the equilibrium binding affinity (KD) of the interaction.

스트렙타비딘 기반 생물층 간섭계를 사용한 DNA-단백질 상호작용 분석

Protein-DNA interactions underpin essential cellular processes. Understanding these interactions is critical for elucidating the molecular mechanisms of ...

네 개의 바이오 센서 플랫폼을 사용하여 높은 친 화성 항체 - 항원 결합 속도론의 결정

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역으로 작은 분자 또는 바이오 센서 애플리케이션을위한 다중 구성 요소 구조를 무력화하는 미세 유체 온칩 캡처 - 고리 화 반응

단백질 - 단백질 상호 작용 및 알로 스테 릭 리간드 효과의 속도론을 측정하는 바이오 층 간섭

동적 단백질 복합물 분석에 조립 하 고 질량 분석 및 전자 현미경을 사용 하 여 Biolayer 간섭계 바이오 센서에서 발표

결합 단일 도메인 항체 라이브러리의 단계별 파지 선택에 의해 고도로 특이적 화학적으로 유도된 단백질 이분화 시스템 생성

질량 광합성에 의한 항체 항원 선호도의 신속한 결정

필드 이펙트 바이오센싱 기술을 이용한 분자 샤페론 Hsp90과 클라이언트 단백질 키나제 Cdc37 사이의 생체분자 상호작용 탐구

바이오 상호 작용을 검출 하는 β-lactamase 기반 Conductimetric 바이오 센서 분석 결과의 사용

스트렙타비딘 기반 생물층 간섭계를 사용한 DNA-단백질 상호작용 분석

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