이 프로토콜은 다양한 소분자에 대한 바이오 센서로서 단백질 이량화 시스템을 엔지니어링하는 일반적인 접근 방식을 제공하기 때문에 중요합니다. 또한, 매우 다양한 단백질 라이브러리를 사용하여 특수 장비 없이 효율적이고 비용 효율적인 방식으로 다양한 리간드용 바이오 센서를 선택합니다. 엔지니어링 된 바이오 센서는 세포 거동을 화학적으로 제어하고 세포 대사 산물의 실시간 변화를 모니터링하는 데 사용할 수 있습니다.
이 시각적 데모를 통해 연구자들은 실험 출력에 대한 명확한 기대와 함께 기술의 상세한 지시를 관찰 할 수 있습니다. 37°C에서 2YT 배지의 6밀리리터에서 단일 TG1 전기포이션 유능한 세포 식민지를 성장시켜 매 라운드마다 시작하여 분당 250개의 회전을 약 0.5의 600나노미터 흡수로 시작한다. 최적의 광학 밀도에 도달하면 세포를 얼음 위에 놓습니다.
음의 선택 구슬을 준비하려면, 300 마이크로리터의 스트렙타비딘 코팅 마그네틱 비즈를 05%PBS+ Tween 버퍼 1밀리리터로 세 번, 2회는 자기 분리 랙에 세척당 PBS 1밀리리터로 세척합니다. PBS에서 1밀리리터1%의 카제인으로 구슬을 재차 질주하고 비틴으로 구슬을 비슬의 5배에 달하는 비드를 포화시한다. 실온에서 1시간 후, PBS 플러스 트위엔으로 구슬을 5회, PBS로 3회 세척합니다.
마지막 세척 후, 13개의 파지 입자에 약 10배, PBS에 1%소 세럼 알부민을 1시간 동안 구슬에 넣고 회전시 실온에서 1시간 동안 배양한다. 인큐베이션이 끝나면 상체관을 1.5밀리리터 튜브로 옮기십시오. 바이오티니드 리간드 바운드 스트렙타비딘 구슬을 사용한 긍정적인 선택을 위해, 수동에 따라 계산된 전체 결합 용량의 5배에 달하는 선택된 생체작 리간드에서 음의 선택에 사용되는 구슬의 부피의 절반을 포화시켰다.
실온에서 1시간 동안 배양한 후 PBS+ 트위엔으로 5회, PBS를 단독으로 3회 세척하고, 1밀리리터 1밀리리터, 1%소 세럼 알부민으로 1시간 동안 구슬을 회전시 1시간 동안 차단한다. 인큐베이션이 끝나면 PBS 플러스 트위엔에서 3회, PBS에서 단독으로 1회, 비바운드 파지를 사용하여 스트렙타비딘 코팅 마그네틱 비즈를 재차 리펜합니다. 구슬을 방해하지 않고 언바운드 파지 함유 슈퍼나탄을 추출하고 샘플을 입력으로 사용할 수 있도록 따로 설정합니다.
그런 다음 PBS 플러스 트위엔으로 구슬을 10회 세척하고 PBS로 5회 세척하여 3회 세척 후 구슬을 새로운 튜브로 전송하여 경계 파지의 비특이적 결합을 피하기 위해 튜브 벽으로 옮겨냅니다. 바운드 파지를 경쟁적으로 단정하기 위해 비생체화 리간드의 마이크로몰라 농도 450마이크로리터를 양성 선택 구슬에 추가하고 구슬을 30분 동안 회전시 놓습니다. 인큐베이션이 끝나면 상체를 출력으로 사용할 새 튜브로 옮습니다.
입력 적정의 경우 입력 파지로 10회까지 PBS에서 10개의 직렬 희석제를 10회 까지 준비합니다. 10 마이크로리터의 입력 파지 10을 1회에서 7-10으로 7-10으로 9개의 희석제에서 70 마이크로리터 알리쿼트로 전송하여 제조된 TG1 세포의 70 마이크로리터 알리쿼트로 옮긴다. 섭씨 37도에서 45분 후, 감염된 TG1 세포를 암피실린 밀리리터당 100마이크로그램, 섭씨 37도에서 하룻밤 잠복시 2%의 포도당을 함유한 개별 90mm 2YT 한천 요리에 접시를 놓습니다.
다음 아침, 식기를 사용하여 파지 입력을 계산합니다. 출력 감염 및 적정의 경우 37도 섭씨 수조에서 45분 간 배양하기 위해 TG1 세포의 3밀리리터에 용출된 파지를 추가합니다. 그런 다음 감염된 세포의 10개의 직렬 희석을 신선한 2YT 배지에서 10배에서 3농도까지 1회까지 준비하고, 37°C에서 1박 배양용 90mm 2YT 천지 접시에 각 희석을 플레이트한다.
다음 아침, 수식에 따라 파지 출력을 계산합니다. 농축 된 서브 라이브러리에서 개별 클론을 분리하기 위해, 하룻밤 배양, 파지 감염 TG1 세포 판에서 단일 콜로니를 2YT 배지의 250 마이크로 리터로 전송하여 멸균 심층 플레이트당 37도에서 멸균 된 심연 플레이트로 보충합니다. 세포가 약 0.5의 600 나노미터 밀도에 도달하면 CM13 도우미 파지의 밀리리터 당 9개의 플라크 형성 유닛에 5배 10을 추가하고 분당 250회전에서 섭씨 37도에서 45분 동안 세포를 배양한다.
인큐베이션이 끝나면 암피실린으로 보충된 2YT 배지 500마이크로리터와 카나마이신 밀리리터당 50마이크로그램을 각 웰에 추가하고, 플레이트를 하룻밤 사이에 섭씨 25도, 분당 250회 회전에 배치합니다. 다음 아침, 파지 입자의 수집을 허용하기 위해 원심 분리에 의해 세포를 퇴적. ELISA에 의해 바인딩앵커 바인딩을 확인하려면, 코팅 버퍼에서 밀리리터 스트렙타비딘 당 5 마이크로 그램의 100 마이크로 리터와 96 잘 ELISA 플레이트를 코팅 하룻밤 섭씨 4섭씨.
다음 날 아침, PBS 플러스 트위엔의 300마이크로리터에서 플레이트를 세 번 세척한 후 1마이크로몰라 바이오티너 100마이크로리터를 대상 우물에 추가하고 1마이크로몰라 비오틴 또는 표적 형모로그를 적절한 대조유에 첨가한다. 실온에서 1시간 후, PBS와 워시당 Tween으로 플레이트를 5회 세척하고 실온에서 1시간 동안 웰당 1%카제인 300마이크로리터로 비특이적 결합을 차단합니다. 인큐베이션이 끝나면, 세척당 신선한 PBS 플러스 트웬으로 플레이트를 세 번 씻고 정제 된 파지 상수체를 추가합니다.
실온에서 1 시간 후, 신선한 PBS 플러스 워시 당 Tween로 접시를 10 번 세척하십시오. 100 마이크로리터의 고추냉이 과록시다제 M13 주요 코트 단백질 항체를 각 웰에 넣고 실온에서 1시간 배양에 대고 있습니다. 그런 다음 입증된 대로 플레이트를 세 번 세척하고 실온에서 또는 눈에 보이는 색 변화가 관찰될 때까지 10분 간 각 웰에 100마이크로리터의 TMB 기판을 추가합니다.
그런 다음 100 마이크로리터의 1-mm-염산으로 반응을 멈추고 분광계에서 450 나노미터에서 플레이트를 읽습니다. 앵커 바인더 검증 후, 앵커 바인더-리간드 복합체를 대상으로 동일한 단백질 라이브러리를 사용하여 이머제이징 바인더 스크리닝을 수행해야 한다. 4~6라운드 선발 후 의전한 보강 결과는 하위 라이브러리에서 잠재적 타격 비율이 높다는 것을 나타내는 좋은 지표이며, 이 경우 추가 선발 라운드가 필요하지 않을 수 있습니다.
단일 클론 ELISA는 앵커 및 이머제이싱 바인더의 상대적 결합 친화성 및 선택성을 분석하는 데 적합하며 클론 간의 결합 선택도 비교를 용이하게 합니다. 마찬가지로, 이질형 바인더 선택은 리간드 유무에 관계없이 고정된 앵커 바인더로 이성구를 형성하는 클론을 식별할 수 있게 한다. 이러한 리간드 농도 의존형 결합 데이터는 테스트된 나노체가 대조군 샘플에 의해 입증된 불량 한 결합에 비해 화학적으로 유도된 이질 시스템을 구성하는 데 적합하다는 것을 시사한다.
또한, 분석 크기 배제 크로마토그래피는 리간드의 존재시 앵커와 이질화 바인더 사이의 이성구형성을 확인하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 실험에서는 앵커와 이압 바인더 및 칸나비디올이 혼합되었을 때 이머제이화 피크가 관찰되었다. 반면 칸나비디올이 없거나 각 바인더가 컬럼에만 로드되었을 때 이산화 피크가 감지되지 않았습니다.
단백질 이량제 시스템은 생체 내 응용 분야에서 개발하기 위한 선택된 바이오 센서의 추가 검증을 허용하기 위해 효모 또는 포유류 세포에서 유전적으로 인코딩되어야 한다. 우리는 이 방법이 다른 연구자에게 중요한 대사 산물, 신호 분자 또는 높은 현면적 해결을 가진 생체 내의 약물을 검출하는 데 효과적이고 필요한 도구를 제공할 것으로 기대합니다.
