AIラボのメンバー全員に、有益なご意見とご提案をいただき、ありがとうございます。私たちはシャトル-GFPベクターを提供してくれたMark Hipp教授（Max Planck生化学研究所）に感謝します。この作業は、イスラエル科学財団（ISF＃124/14）、Binational Science Foundation（BSF＃2013325）、FP7 Marie Curie Career Integration Grant（CIG＃333794）、イスラエルの精神生物学研究所NIPI＃b133-14 / 15）。

1.細胞株の調製<ol><li>液体窒素容器に保存されたマウス神経芽細胞腫脊髄細胞（NSC-34細胞）を約1,000,000個解凍。細胞が完全に解凍するまで、37°C​​の水インキュベーターを使用してください。 </li><li>新鮮な暖かい培地（10％ウシ胎仔血清（FBS）、1％L-グルタミン、および1％ペン - ストレプト系抗生物質を含むDMEM培地）を加える。 </li><li>解凍した細胞（SL16R）を500×gで5分間遠心分離し、細胞ペレットを形成する。培地を捨て、細胞再懸濁のために新しい培地1 mLを加える。 </li><li>再懸濁した細胞を15mLフラスコに入れ、培地5mLを追加する。 37℃で5％CO 2を含む無菌インキュベーターで細胞を一晩インキュベートする。 </li><li>平行して、60mmの培養皿に8枚の被覆されていないカバーガラス（カバーガラス：12mm、0.13-0.17mm厚）を置き、70％エタノールを用いて滅菌し、乾燥するまで30分間UV光に暴露する。各ディッシュに培地を加え、処分して残留エタノールを洗い流す。</li><li>接着細胞が解離するのを可能にするために約90％コンフルエンス（約600万細胞/フラスコ）に到達した後、細胞にトリプシン緩衝液（2.5gのトリプシンおよび0.2gのEDTAを1Lのハンクス平衡塩溶液中に加える。 注：NSC-34細胞は高感度であり、培地を使用して解離する前に、トリプシン緩衝液インキュベーション15秒およびトリプシンを含まないインキュベーション1分を必要とするのみである。 </li><li> 1枚のプレートにつき約35万の培地3mLを含むカバースリップを既に含む60mm培養皿上に細胞をプレートする。インキュベーターに24時間放置し、カバースリップ上に細胞を付着させます。 </li></ol> 2.細胞トランスフェクション注：約24時間後、NSC-34細胞は40％コンフルエンシー（約800,000細胞）に達し、トランスフェクションの準備が整うでしょう。 <ol><li>純粋なDMEM培地（各60mm培養皿のための300μLのDMEM培地）を滅菌微量遠心分離槽es。 </li><li>各DMEM含有マイクロ遠心チューブにトランスフェクションに必要な各プラスミド2μgを加えます。 注：シャトル-GFPプラスミドは、すべての細胞トランスフェクションにおいて必須です。 </li><li>必要なプラスミドを含むすべてのマイクロ遠心チューブにトランスフェクション試薬を加えます。ここでは、市販のトランスフェクション試薬4μLを2μgのDNAごとに添加します。 </li><li> DMEM、プラスミド、トランスフェクション試薬を含むマイクロ遠心チューブをボルテックスし、室温で25分間インキュベートする。 </li><li>各微量遠心チューブを培養皿に加え、皿を静かに攪拌して均質な溶液を形成させる。 48時間インキュベーターに皿を戻します。 注：shuttle-GFPはすべての細胞で発現する必要があるため、シャトル-GFPトランスフェクション効率は、一晩のトランスフェクション後に部分的に検査し、蛍光顕微鏡を使用して事前試験することができます。非蛍光発現タンパク質の完全な検査は、イムノブロット分析です。 </li></ol> 3.顕微鏡検査<ol><li>トランスフェクションされたNSC-34細胞を含むカバースリップをカバースリップホルダーに取り付け、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）で穏やかに洗って、剥がれた死細胞を除去する。 </li><li>倒立顕微鏡を備えた緑色蛍光フィルターを使用して、適切な細胞パッチを同定する。 注：適切な細胞パッチは、多数の細胞（野外で20〜30個の細胞）を示し、細胞内で核が明確に定義されている顕微鏡視野と定義されています。細胞パッチ内の細胞核は、最初に目で同定され、イメージングソフトウェアによって手動でマークされる。 </li><li>顕微鏡下でカバーガラス上にバッファーを滴下することによってカバースリップにPBS中10ng / mL LMBを含む200μLのexportin-1阻害剤Leptomycin B（LMB）バッファーを加える。 注：この時点は間隔ゼロとして設定されます。 </li><li>約400〜500秒間、3秒間隔でマークされた核の蛍光強度を定量する。 </li><li&gt;個々の実験において、各トランスフェクショングループについて3〜5枚のカバースリップをテストする。 </li></ol> 4.分析注：異なる細胞は異なるレベルの蛍光シャトル-GFPを発現するので、各細胞の核蛍光強度をそれ自身の初期蛍光強度に正規化することが重要である。 <ol><li>各核の3秒間の蛍光間隔をその核の最初の6回の間隔の平均で割ることによって、マークされた核の蛍光強度を標準化する。 </li><li>各核の正規化の後、各細胞パッチの時間の関数としての核の蛍光の変化を表す蛍光強度曲線を生成する。これを行うには、各細胞パッチ（各パッチで約20〜30個の細胞からなる）のすべての細胞の平均を計算する。 注：核の蛍光強度曲線はミカエリス - メンテン飽和曲線に似ていますが、これは増加したti内でよりよく観察されます私の時代。これは、核輸送による経時的なシャトル-GFPの細胞質ゾル量の減少によるものである。この減少は、シャトル-GFPが核に輸送される確率を統計的に低下させ、したがって核蛍光の飽和に達する。曲線の線形初期速度から導出された勾配は、核へのV max入射速度をもたらす。 </li><li>グラフ作成ソフトウェアを使用して、3〜5回の独立した実験から得られた各細胞パッチのV max勾配を分析して、各実験群を表す1つの勾配を生成する。一元配置ANOVA統計分析を使用して定量を行います。 </li></ol> 5.タンパク質発現の確認<ol><li>氷上で各実験群からの残存細胞（上記の実験では使用されていない）を含む60mm培養皿を置く。 </li><li>培地を廃棄し、細胞をPBSで2回洗浄し、残りの培地を希釈して洗浄する。 </li><li>細胞を200〜400で処理するPBS、0.5％トリトン、およびプロテアーゼ阻害剤カクテル錠剤（PI）を含有する溶解緩衝液μL。セルスクレーパーを使用してスクレーピングする。 </li><li>マイクロ遠心チューブ中で細胞を溶解緩衝液に集め、氷下で4,000rpmで1分間ホモジナイザーでホモジナイズする。 </li><li>ホモジナイズした細胞を2,500 xgで10分間遠心分離する。上清を回収し、Bradfordアッセイを用いてタンパク質濃度を定量し、-20℃で使用するまで保存する。 </li><li> 30〜70μgの全タンパク質（タンパク質に依存する）を収集し、SDS-PAGEゲルにロードして、イムノブロットアッセイを用いてタンパク質発現を試験する。 </li></ol>

<ol>
	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2002).</li><li>Freitas, N., Cunha, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+signals+for+the+nuclear+import+of+proteins.">Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins.</a> Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).</li><li>Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+short+amino+acid+sequence+able+to+specify+nuclear+location.">A short amino acid sequence able to specify nuclear location.</a> Cell. 39, 499-509 (1984).</li><li>la Cour, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+and+prediction+of+leucine-rich+nuclear+export+signals.">Analysis and prediction of leucine-rich nuclear export signals.</a> Protein Eng Des Sel. 17, 527-536 (2004).</li><li>Boeynaems, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+screen+connects+nuclear+transport+genes+to+DPR+pathology+in+c9ALS/FTD.">Drosophila screen connects nuclear transport genes to DPR pathology in c9ALS/FTD.</a> Sci Rep. 6, 20877 (2016).</li><li>Freibaum, B. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GGGGCC+repeat+expansion+in+C9orf72+compromises+nucleocytoplasmic+transport.">GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 129-133 (2015).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).</li><li>Kwon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeats+bind+nucleoli,+impede+RNA+biogenesis,+and+kill+cells.">Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells.</a> Science. 345, 1139-1145 (2014).</li><li>Rossi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+accumulation+of+mRNAs+underlies+G4C2-repeat-induced+translational+repression+in+a+cellular+model+of+C9orf72+ALS.">Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS.</a> J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).</li><li>Shi, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+PRn+poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeat+expansion+block+nuclear+import+and+export.">Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C9orf72+repeat+expansion+disrupts+nucleocytoplasmic+transport.">The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 56-61 (2015).</li><li>Zhang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9ORF72+poly(GA)+aggregates+sequester+and+impair+HR23+and+nucleocytoplasmic+transport+proteins.">C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins.</a> Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).</li><li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Charcot+to+Lou+Gehrig:+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS.">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).</li><li>DeJesus-Hernandez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+GGGGCC+hexanucleotide+repeat+in+noncoding+region+of+C9ORF72+causes+chromosome+9p-linked+FTD+and+ALS.">Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS.</a> Neuron. 72, 245-256 (2011).</li><li>Renton, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hexanucleotide+repeat+expansion+in+C9ORF72+is+the+cause+of+chromosome+9p21-linked+ALS-FTD.">A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD.</a> Neuron. 72, 257-268 (2011).</li><li>Boeve, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+frontotemporal+dementia+and/or+amyotrophic+lateral+sclerosis+associated+with+the+GGGGCC+repeat+expansion+in+C9ORF72.">Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72.</a> Brain. 135, 765-783 (2012).</li><li>Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+biology+of+the+C9orf72+nucleotide+repeat+expansion+in+neurodegenerative+disease.">The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).</li><li>Woerner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+aggregates+interfere+with+nucleocytoplasmic+transport+of+protein+and+RNA.">Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA.</a> Science. 351, 173-176 (2016).</li><li>Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+stress+and+impaired+stress+granule+formation+contribute+to+C9orf72+RAN+translation-induced+cytotoxicity.">Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity.</a> Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).</li><li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+proline-arginine+RAN+dipeptides+linked+to+C9ORF72-ALS/FTD+form+toxic+nuclear+aggregates+that+initiate+in+vitro+and+in+vivo+neuronal+death.">Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death.</a> Neuron. 84, 1213-1225 (2014).</li></ol>

著者は何も開示することはありません。

このプロトコールは、核細胞質輸送における微小変化を評価するための、高感度かつ定量的な新しいアッセイを実証している。このシステムを使用すると、蛋白質の分布に劇的な変化をもたらす大きな欠損だけでなく、リアルタイムで核細胞質輸送およびその機能不全を観察および測定することが可能である。このアッセイは、感度優位性を有するばかりでなく、調製もほとんど必要とせず?...

核細孔複合体（NPC）は、細胞核に出入りする大分子の輸出入を制御する。第1規則なしで核に入ることができる小分子とは対照的に、より大きな分子の輸送はNPCによって強く制御される。タンパク質やRNAなどのこれらの大きな分子は、輸入や輸出を含む輸送要因と関連して核2から輸入され、輸出されます2 。輸入するためには、蛋白質には、一般に核局在化シグナル（NLS）と呼ばれる小さなペプチドモチーフが含まれていなければならない。これらのアミノ酸配列はタグとして作用し、組成物3,4 において多様である。タンパク質は、それらのエクスポージャーとの関連性のために、核から細胞質に輸出することができる一般に核輸出シグナル（NES） 2と呼ばれるシグナル配列に結合する。輸入業者と輸出業者の両方は、小型Ras関連核タンパク質GTPアーゼ（Ran） 2の調節のために貨物を輸送することができる。 Ranは、それがGTPまたはGDPに結合しているかどうかによって、異なる立体構造状態で存在することが示されている。 GTPに結合すると、Ranはimportinまたはexportinにバインドできます。 RanGTPに結合すると、インポートインはそれらの貨物を放出するが、輸出はRanGTPに結合して輸出貨物と複合体を形成しなければならない。 Ranの優勢なヌクレオチド結合状態は、核（RanGTP）または細胞質（RanGDP）におけるその位置に依存する。 最近、いくつかの研究が、核細胞質経路の障害と筋萎縮性側索硬化症（ALS）および前頭側頭型痴呆（FTD）の両方の間の関連を示している5,6 </sup&gt; 、 7、8、9、10、11、12 。 ALSは、上下運動ニューロン（MN） 13に影響を及ぼし、麻痺をもたらし、最終的には死亡し、平均で2〜5年以内に進行する致死的な神経変性疾患である。 ALSのほとんどの症例は散発性（SALS）と分類され、明らかな遺伝的連鎖はないが、10％が優性遺伝（家族性ALS; FALS）で遺伝する。最近、ALSおよびFTDの遺伝的原因として、第9染色体のオープンリーディングフレーム72（C9orf72）遺伝子におけるヘキサヌクレオチド反復増幅（HRE）が14,15であることが同定された。これらの突然変異体は、FALS症例の30〜40％を占め、異なる研究が争われているそれらが核細胞質輸送5,6,7,8,9,10,11,12に影響を及ぼすことによって毒性を引き起こすことを示している。 これらの研究は、核細胞質輸送に関するHREの最終的な結果および発現をほとんど示しているが、リアルタイムで核細胞質崩壊を示さない。その結果、重度の核細胞質輸送の欠損のみが評価された11,17,18。 このプロトコルは、新しいとveリアルタイムで核細胞輸送機能不全を評価および定量するためのry感受性アッセイ。 NLS-NES-GFPタンパク質（シャトル-GFP）の輸入率は、蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムで定量することができる。これは、以前に記載されているように、exportinインヒビターを用いて行われ、シャトル-GFPのみが核に入ることを可能にする。蛍光顕微鏡およびリアルタイムで蛍光変化を定量化することができるソフトウェアを使用して、核内に位置するシャトル-GFPの蛍光強度の段階的変化を定量化することが可能である。結果として、任意の所与の時間における核シャトル-GFPの量を表す、蛍光対時間軸のミカエリス - メンテン様の飽和曲線を作成することができる。曲線の初期線形速度を用いることにより、蛍光飽和前に核への進入速度を表す勾配を生成することが可能である。 アッセイを検証するために、翻訳以前に核細胞質輸送を破壊すると報告されているd C9orf72ジペプチドリピート、ポリ（GR）およびポリ（PR）を5,7,8,10,12で使用した。このアッセイを用いて、対照と比較して核の輸入率の50％の減少が観察された。このシステムを用いて、核細胞質輸送の微小な変化を調べることができる。さらに、核細胞質輸送欠陥を救済する異なる因子の能力を決定することができる。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)</td>
			<td>tebu-bio</td>
			<td>CLU140-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 4.5g/L L-glucose</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS European Grade</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-007-1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3111</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass 12mm dia. thick 0.13-0.17mm</td>
			<td>Bar Naor LTD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531">TurboFect Transfection Reagent</a></td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531">R0531</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 100 inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING WORKBENCH 2&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptomycin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2913</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-023-1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer motor/control/chuck/90-degree clamp</td>
			<td>Glas-Col</td>
			<td>099C K5424CE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002455</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells

核細胞質輸送は、細胞核からの大きな分子の輸入および輸出を指す。最近、多くの研究が、筋萎縮性側索硬化症（ALS）と核細胞質経路における障害との関連を示している。 ALSは、運動ニューロンに影響を及ぼし、麻痺をもたらし、最終的には死亡し、2〜5年以内に平均して起こる神経変性疾患である。 ALSのほとんどの症例は散発的であり、明らかな遺伝的連鎖を欠いているが、10％が優勢に遺伝する。最近、第9染色体のオープンリーディングフレーム72（C9orf72）遺伝子におけるヘキサヌクレオチド反復増幅（HRE）が、ALSおよび前頭側頭型痴呆（FTD）の遺伝的原因として同定された。重要なことに、異なるグループは最近、これらの突然変異体が核細胞質輸送に影響を及ぼすことを提案している。これらの研究は、核細胞質輸送に関するHREによって引き起こされる最終的な結果および徴候をほとんど示しているが、核内輸送機能障害を示さないリアルタイム。結果として、重度の核細胞質輸送の欠損のみが、主に高過剰発現または外因性タンパク質挿入のために決定され得る。 このプロトコルは、リアルタイムでnucleocytoplasmic輸送機能不全を評価し定量化するための新しい非常に敏感なアッセイを記述します。 NLS-NES-GFPタンパク質（シャトル-GFP）の輸入率は、蛍光顕微鏡を用いてリアルタイムで定量することができる。これは、exportinインヒビターを用いて行われ、シャトルGFPのみが核に入ることを可能にする。アッセイを有効にするために、以前に核細胞質輸送を破壊することが示されているC9orf72 HRE翻訳ジペプチドリピート、ポリ（GR）およびポリ（PR）を使用した。記載されたアッセイを用いて、対照と比較して核輸入率の50％の減少が観察された。このシステムを用いて、核細胞質輸送の微小な変化を調べることができ、異なる因子が核細胞質trを（部分的に）救済する能力欠陥を判定することができる。

ここに示した手順を用いて、運動ニューロン様NSC-34細胞を、NLS-NES-GFP（シャトル-GFP）タンパク質でトランスフェクトした。 NLSおよびNESシグナル配列を有するこのタンパク質（ 図1 ）は、核と細胞質との間を行き来することができる。一般的なGFPは、拡散によってのみ局在化シグナルタグが存在しない場合に核に出入りすることができ、従って、核と細胞?...

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Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

このプロトコルは、NLS-NES-GFPタンパク質の核内取り込みにおけるリアルタイム変化を定量化することにより、運動ニューロン様NSC-34細胞内の核細胞質輸送速度を敏感に測定する方法を記載する。

運動ニューロン様NSC-34細胞内のリアルタイムでの核細胞質輸送を測定するアッセイ

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

assay-to-measure-nucleocytoplasmic-transport-real-time-within-motor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.6K ビュー.  Ben-Gurion University of the Negev. このプロトコルは、NLS-NES-GFPタンパク質の核内取り込みにおけるリアルタイム変化を定量化することにより、運動ニューロン様NSC-34細胞内の核細胞質輸送速度を敏感に測定する方法を記載する。 

ビデオ: Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

開発ゼブラフィッシュ前脳におけるクローン関連の神経前駆細胞のタイムラプスライブイメージング

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

神経科学

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

モーター神経切断とライブゼブラフィッシュにおけるグリア細胞の挙動のタイムラプスイメージング

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Using Informational Connectivity to Measure the Synchronous Emergence of fMRI Multi-voxel Information Across Time

It is now appreciated that condition-relevant information can be present within distributed patterns of functional magnetic resonance imaging (fMRI) brain activity, even for conditions with similar levels of univariate activation. Multi-voxel pattern (MVP) analysis has been used to decode this information with great success. FMRI investigators also often seek to understand how brain regions interact in interconnected networks, and use functional connectivity (FC) to identify regions that have correlated responses over time. Just as univariate analyses can be insensitive to information in MVPs, FC may not fully characterize the brain networks that process conditions with characteristic MVP signatures. The method described here, informational connectivity (IC), can identify regions with correlated changes in MVP-discriminability across time, revealing connectivity that is not accessible to FC. The method can be exploratory, using searchlights to identify seed-connected areas, or planned, between pre-selected regions-of-interest. The results can elucidate networks of regions that process MVP-related conditions, can breakdown MVPA searchlight maps into separate networks, or can be compared across tasks and patient groups.

Informational connectivity measures the correspondence between time courses of multi-voxel information across different brain regions. Multi-voxel pattern discriminability time series are extracted from regions and compared, revealing networks that are not identified in a typical functional connectivity approach.

時間を越えてのfMRI多ボクセル情報の同期出現を測定するために情報を使用した接続

It is now appreciated that condition-relevant information can be present within distributed patterns of functional magnetic resonance imaging (fMRI) brain ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are increasingly viewed as an early feature of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD) and Huntington&#8217;s disease (HD). As yet unclear is the mechanism(s) by which axonal injury is induced. We reported the development of a novel technique to produce biologically active, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) that can be used to trace axonal transport of BDNF. Quantum dot-labeled BDNF (QD-BDNF) was produced by conjugating quantum dot 655 to mBtBDNF. A microfluidic device was used to isolate axons from neuron cell bodies. Addition of QD-BDNF to the axonal compartment allowed live imaging of BDNF transport in axons. We demonstrated that QD-BDNF moved essentially exclusively retrogradely, with very few pauses, at a moving velocity of around 1.06 &#956;m/sec. This system can be used to investigate mechanisms of disrupted axonal function in AD or HD, as well as other degenerative disorders.

Axonal transport of BDNF, a neurotrophic factor, is critical for the survival and function of several neuronal populations. Some degenerative disorders are marked by disruption of axonal structure and function. We demonstrated the techniques used to examine live trafficking of QD-BDNF in microfluidic chambers using primary neurons.

一次ニューロンにおける量子ドットで標識されたBDNFの軸索輸送のリアルタイムイメージング

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where the stimulus applied depends in real-time on the response of the system. Recent applications range from the implementation of virtual reality systems for studying motor responses both in mice1 and in zebrafish2, to control of seizures following cortical stroke using optogenetics3. A key advantage of closed-loop techniques resides in the capability of probing higher dimensional properties that are not directly accessible or that depend on multiple variables, such as neuronal excitability4 and reliability, while at the same time maximizing the experimental throughput. In this contribution and in the context of cellular electrophysiology, we describe how to apply a variety of closed-loop protocols to the study of the response properties of pyramidal cortical neurons, recorded intracellularly with the patch clamp technique in acute brain slices from the somatosensory cortex of juvenile rats. As no commercially available or open source software provides all the features required for efficiently performing the experiments described here, a new software toolbox called LCG5 was developed, whose modular structure maximizes reuse of computer code and facilitates the implementation of novel experimental paradigms. Stimulation waveforms are specified using a compact meta-description and full experimental protocols are described in text-based configuration files. Additionally, LCG has a command-line interface that is suited for repetition of trials and automation of experimental protocols.

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

リアルタイム電気生理学：プローブ神経ダイナミクスとその先にクローズド·ループ·プロトコルの使用

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the extracellular space (ECS) of the living brain. The ECS surrounds all brain cells and contains both interstitial fluid and extracellular matrix. The transport of many substances required for brain activity, including neurotransmitters, hormones, and nutrients, occurs by diffusion through the ECS. Changes in the volume and geometry of this space occur during normal brain processes, like sleep, and pathological conditions, like ischemia. However, the structure and regulation of brain ECS, particularly in diseased states, remains largely unexplored. The RTI method measures two physical parameters of living brain: volume fraction and tortuosity. Volume fraction is the proportion of tissue volume occupied by ECS. Tortuosity is a measure of the relative hindrance a substance encounters when diffusing through a brain region as compared to a medium with no obstructions. In RTI, an inert molecule is pulsed from a source microelectrode into the brain ECS. As molecules diffuse away from this source, the changing concentration of the ion is measured over time using an ion-selective microelectrode positioned roughly 100 &#181;m away. From the resulting diffusion curve, both volume fraction and tortuosity can be calculated. This technique has been used in brain slices from multiple species (including humans) and in vivo to study acute and chronic changes to ECS. Unlike other methods, RTI can be used to examine both reversible and irreversible changes to the brain ECS in real time.

This protocol describes real-time iontophoresis, a method that measures physical parameters of the extracellular space (ECS) of living brains. The diffusion of an inert molecule released into the ECS is used to calculate the ECS volume fraction and tortuosity. It is ideal for studying acute reversible changes to brain ECS.

脳の細胞外空間の体積分率とねじれを定量するためのテトラメチルアンモニウムによるリアルタイムイオントフォレシス

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

生細胞測定の嗅覚受容体活性化アッセイを用いた、リアルタイム キャンプ

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

Sod1 突然変異体蛋白質集計における細胞の高いコンテンツ定量化のための分析法の開発

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal growth, development, and survival. We describe a detailed method for the use of microfluidic chambers (MFCs) for tracking axonal transport of fluorescently labeled organelles in MN axons. This method is rapid, relatively inexpensive, and allows for the monitoring of intracellular cues in space and time. We describe a step by step protocol for: 1) Fabrication of polydimethylsiloxane (PDMS) MFCs; 2) Plating of ventral spinal cord explants and MN dissociated culture in MFCs; 3) Labeling of mitochondria and acidic compartments followed by live confocal imagining; 4) Manual and semiautomated axonal transport analysis. Lastly, we demonstrate a difference in the transport of mitochondria and acidic compartments of HB9::GFP ventral spinal cord explant axons as a proof of the system validity. Altogether, this protocol provides an efficient tool for studying the axonal transport of various axonal components, as well as a simplified manual for MFC usage to help discover spatial experimental possibilities.

Axonal transport is a crucial mechanism for motor neuron health. In this protocol we provide a detailed method for tracking the axonal transport of acidic compartments and mitochondria in motor neuron axons using microfluidic chambers.

マイクロ流体室システムを用いた運動ニューロン培養におけるオルガネラの軸索輸送

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Real-Time fMRI Brain Mapping in Animals

Dynamic fMRI responses vary largely according to the physiological conditions of animals either under anesthesia or in awake states. We developed a real-time fMRI platform to guide experimenters to monitor fMRI responses instantaneously during acquisition, which can be used to modify the physiology of animals to achieve desired hemodynamic responses in animal brains. The real-time fMRI set-up is based on a 14.1T preclinical MRI system, enabling the real-time mapping of dynamic fMRI responses in the primary forepaw somatosensory cortex (FP-S1) of anesthetized rats. Instead of a retrospective analysis to investigate confounding sources leading to the variability of fMRI signals, the real-time fMRI platform provides a more effective scheme to identify dynamic fMRI responses using customized macro-functions and a common neuroimage analysis software in the MRI system. Also, it provides immediate troubleshooting feasibility and a real-time biofeedback stimulation paradigm for brain functional studies in animals.

Animal brain functional mapping can benefit from the real-time functional magnetic resonance imaging (fMRI) experimental set-up. Using the latest software implemented in the animal MRI system, we established a real-time monitoring platform for small animal fMRI.

動物におけるリアルタイムfMRI脳マッピング

Dynamic fMRI responses vary largely according to the physiological conditions of animals either under anesthesia or in awake states. We developed a ...