Wir danken allen Mitgliedern des AI-Labors für ihre hilfreichen Kommentare und Anregungen. Wir danken Prof. Mark Hipp (Max-Planck-Institut für Biochemie) für die Bereitstellung des Shuttle-GFP-Vektors. Diese Arbeit wurde unterstützt durch Stipendien der israelischen Wissenschaftsstiftung (ISF # 124/14), der Binational Science Foundation (BSF # 2013325), FP7 Marie Curie Karriere Integration Grant (CIG # 333794) und dem Nationalen Institut für Psychobiologie in Israel ( NIPI # b133-14 / 15).

1. Zelllinienvorbereitung <ol><li> Tauen Sie etwa 1.000.000 Maus-Neuroblastom-Rückenmarkszellen (NSC-34-Zellen), die in einem flüssigen Stickstoffbehälter aufbewahrt wurden. Verwenden Sie einen 37 ° C Wasserinkubator, bis die Zellen vollständig aufgetaut sind. </li><li> Füge frisches, warmes Medium hinzu (DMEM-Medium mit 10% fötalem Rinderserum (FBS), 1% L-Glutamin und 1% Pen-Strep-Antibiotika). </li><li> Zentrifugen aufgetaute Zellen (SL16R) bei 500 xg für 5 min zentrifugieren und ein Zellpellet bilden. Verwerfe das Medium und füge 1 ml neues Medium für die Zellresuspension hinzu. </li><li> Legen Sie die resuspendierten Zellen in einen 15-ml-Kolben und fügen Sie zusätzliche 5 ml Medium hinzu. Inkubieren Sie die Zellen über Nacht in einem sterilen Inkubator mit 5% CO 2 bei 37 ° C. </li><li> Parallel dazu Platz 8 unbeschichtete Deckgläser (Deckglas: 12 mm, 0,13-0,17 mm dick) in einer 60-mm-Kulturschale und sterilisieren mit 70% Ethanol und ca. 30 min UV-Licht bis zum Trocknen. Fügen Sie Medium zu jeder Schale hinzu und entsorgen Sie, um das restliche Ethanol zu waschen.</li><li> Fügen Sie Trypsin-Puffer (2,5 g Trypsin und 0,2 g EDTA in 1 l Hanks &#39;Balanced Salt Solution) zu den Zellen hinzu, nachdem sie etwa 90% Konfluenz erreicht haben (etwa 6 Millionen Zellen pro Kolben), um adhärenten Zellen zu dissoziieren. HINWEIS: NSC-34-Zellen sind empfindlich und benötigen nur 15 s Trypsin-Puffer-Inkubation und 1 zusätzliche Min-Inkubation frei von Trypsin vor der Dissoziation mit dem Medium. </li><li> Die Zellen auf die 60 mm Kulturschalen legen, die bereits die Deckgläser mit 3 ml Medium enthalten, ca. 350.000 pro Schale. Lassen Sie sie in den Inkubator für 24 h, um die Zellbefestigung auf die Deckgläser zu ermöglichen. </li></ol> 2. Zelltransfektion ANMERKUNG: Nach ca. 24 h erreichen die NSC-34-Zellen 40% Konfluenz (ca. 800.000 Zellen) und sind zur Transfektion bereit. <ol><li> Bereiten Sie reines DMEM-Medium (300 &amp; mgr; l DMEM-Medium für jede 60 mm Kulturschale) in einer sterilen Mikrozentrifugenwanne vorEs </li><li> Addieren Sie 2 μg jedes Plasmids, das für die Transfektion benötigt wird, zu jedem DMEM-haltigen Mikrozentrifugenröhrchen. HINWEIS: Das Shuttle-GFP-Plasmid ist bei allen Zelltransfektionen obligatorisch. </li><li> Fügen Sie Transfektionsreagenz zu allen Mikrozentrifugenröhrchen hinzu, die ihre erforderlichen Plasmide enthalten. Hierbei werden 4 μl des handelsüblichen Transfektionsreagens für jeweils 2 μg DNA zugegeben. </li><li> Vortex die Mikrozentrifugenröhrchen, die DMEM, Plasmide und das Transfektionsreagenz enthalten und diese bei Raumtemperatur für 25 min inkubieren. </li><li> Fügen Sie jedes Mikrozentrifugenröhrchen zu einer Kulturschale hinzu und rühren Sie die Schale vorsichtig zu einer homogenen Lösung. Legen Sie das Gericht für 48 Stunden in den Inkubator. ANMERKUNG: Da Shuttle-GFP in allen Zellen exprimiert werden sollte, kann die Shuttle-GFP-Transfektionseffizienz partiell untersucht und mit einer Fluoreszenzmikroskopie nach der Transfektion über Nacht getestet werden. Eine vollständige Untersuchung von nicht-fluoreszierenden exprimierten Proteinen kann unter Verwendung eines Immunoblot-Analysen durchgeführt werdenIst. </li></ol> 3. Mikroskopie <ol><li> Befestigen Sie die Deckblätter, die transfizierte NSC-34-Zellen enthalten, an einen Deckglashalter und waschen Sie vorsichtig mit phosphatgepufferter Kochsalzlösung (PBS), um die abgetrennten toten Zellen zu entfernen. </li><li> Identifizieren Sie einen geeigneten Zellflecken mit einem grünen Fluoreszenzfilter mit einem invertierten Mikroskop. HINWEIS: Ein geeigneter Zellfleck ist definiert als ein Mikroskop-Sichtfeld, das eine große Anzahl von Zellen (20-30 Zellen in einem Feld) zeigt und in der die Kerne in den Zellen klar definiert sind. Zellkerne innerhalb des Zellflecks werden zuerst mit dem Auge identifiziert und manuell durch die Imaging-Software markiert. </li><li> Füge 200 μl eines Exportin-1-Inhibitors Leptomycin B (LMB) -Puffer mit 10 ng / mL LMB in PBS zu den Deckgläsern hinzu, indem man den Puffer auf die Deckgläser unter dem Mikroskop tropft. HINWEIS: Dieser Zeitpunkt wird als Intervall Null gesetzt. </li><li> Quantifizierung der Fluoreszenzintensität der markierten Kerne in 3 s Intervallen für ca. 400-500 s. </li><li&gt; Test zwischen 3 und 5 Deckblättern für jede Transfektionsgruppe in jedem einzelnen Experiment. </li></ol> 4. Analyse HINWEIS: Da verschiedene Zellen unterschiedliche Ebenen von fluoreszierendem Shuttle-GFP exprimieren, ist es wichtig, die nukleare Fluoreszenzintensität jeder Zelle auf ihre eigene initiale Fluoreszenzintensität zu normalisieren. <ol><li> Normalisieren Sie die Fluoreszenzintensität der markierten Kerne, indem Sie das 3-s-Fluoreszenzintervall jedes Kerns mit dem Durchschnitt der anfänglichen sechs Intervalle dieses Kerns teilen. </li><li> Nach der Normalisierung jedes Kerns ergibt sich eine Fluoreszenzintensitätskurve, die die Veränderung der Kernfluoreszenz als Funktion der Zeit für jeden Zellflecken darstellt. Um dies zu erreichen, berechnen Sie den Durchschnitt aller Zellen in jedem Zell-Patch (bestehend aus etwa 20-30 Zellen in jedem Patch). HINWEIS: Die Nuklei-Fluoreszenz-Intensitätskurve ähnelt einer Michaelis-Menten-Sättigungskurve, die bei erhöhten Ti besser beobachtet wirdIch Perioden. Dies ist auf eine Verringerung der zytosolischen Mengen an Shuttle-GFP mit der Zeit aufgrund des Atomtransports zurückzuführen. Diese Abnahme verringert statistisch die Wahrscheinlichkeit eines Shuttle-GFP, um in den Zellkern zu transportieren, wodurch die Sättigung in der Kernfluoreszenz erreicht wird. Die von der linearen Anfangsrate der Kurve abgeleitete Steigung ergibt die V max Eintrittsrate in den Kern. </li><li> Analysieren Sie die V max- Pisten jedes Zell-Patches, die von drei bis fünf unabhängigen Experimenten abgeleitet wurden, wobei die Grafik-Software verwendet wird, um eine Steilheit zu erzeugen, die jede experimentelle Gruppe repräsentiert. Führen Sie die Quantifizierung mit einer einseitigen ANOVA statistischen Analyse durch. </li></ol> 5. Protein Expression Validierung <ol><li> Legen Sie 60 mm Kulturschalen mit den restlichen Zellen (nicht in der oben genannten Experiment) aus jeder experimentellen Gruppe auf Eis. </li><li> Das Medium entsorgen und die Zellen zweimal mit PBS waschen, um das verbleibende Medium zu verdünnen und zu waschen. </li><li> Behandle die Zellen mit 200-400ΜL Lysepuffer, enthaltend PBS, 0,5% Triton und Protease-Inhibitor-Cocktail-Tablette (PI). Kratzen mit einem Zellschaber. </li><li> Sammeln Sie die Zellen in Lysepuffer in einem Mikrozentrifugenröhrchen und homogenisieren Sie mit einem Homogenisator bei 4.000 U / min für 1 min unter Eis. </li><li> Zentrifugieren der homogenisierten Zellen bei 2500 xg für 10 min. Sammeln Sie den Überstand, quantifizieren Sie die Proteinkonzentration unter Verwendung eines Bradford-Assays und lagern bis zur Verwendung bei -20 ° C. </li><li> Sammle zwischen 30 und 70 μg Gesamtprotein (abhängig vom Protein) und lade es in ein SDS-PAGE-Gel, um die Proteinexpression unter Verwendung eines Immunoblot-Assays zu testen. </li></ol>

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	<li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular biology of the cell. , (2002).</li><li>Freitas, N., Cunha, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+and+signals+for+the+nuclear+import+of+proteins.">Mechanisms and signals for the nuclear import of proteins.</a> Curr Genomics. 10, 550-557 (2009).</li><li>Kalderon, D., Roberts, B. L., Richardson, W. D., Smith, A. 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D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GGGGCC+repeat+expansion+in+C9orf72+compromises+nucleocytoplasmic+transport.">GGGGCC repeat expansion in C9orf72 compromises nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 129-133 (2015).</li><li>Jovicic, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modifiers+of+C9orf72+dipeptide+repeat+toxicity+connect+nucleocytoplasmic+transport+defects+to+FTD/ALS.">Modifiers of C9orf72 dipeptide repeat toxicity connect nucleocytoplasmic transport defects to FTD/ALS.</a> Nat Neurosci. 18, 1226-1229 (2015).</li><li>Kwon, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeats+bind+nucleoli,+impede+RNA+biogenesis,+and+kill+cells.">Poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeats bind nucleoli, impede RNA biogenesis, and kill cells.</a> Science. 345, 1139-1145 (2014).</li><li>Rossi, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+accumulation+of+mRNAs+underlies+G4C2-repeat-induced+translational+repression+in+a+cellular+model+of+C9orf72+ALS.">Nuclear accumulation of mRNAs underlies G4C2-repeat-induced translational repression in a cellular model of C9orf72 ALS.</a> J Cell Sci. 128, 1787-1799 (2015).</li><li>Shi, K. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toxic+PRn+poly-dipeptides+encoded+by+the+C9orf72+repeat+expansion+block+nuclear+import+and+export.">Toxic PRn poly-dipeptides encoded by the C9orf72 repeat expansion block nuclear import and export.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. , (2017).</li><li>Zhang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+C9orf72+repeat+expansion+disrupts+nucleocytoplasmic+transport.">The C9orf72 repeat expansion disrupts nucleocytoplasmic transport.</a> Nature. 525, 56-61 (2015).</li><li>Zhang, Y. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=C9ORF72+poly(GA)+aggregates+sequester+and+impair+HR23+and+nucleocytoplasmic+transport+proteins.">C9ORF72 poly(GA) aggregates sequester and impair HR23 and nucleocytoplasmic transport proteins.</a> Nat Neurosci. 19, 668-677 (2016).</li><li>Cleveland, D. W., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=From+Charcot+to+Lou+Gehrig:+deciphering+selective+motor+neuron+death+in+ALS.">From Charcot to Lou Gehrig: deciphering selective motor neuron death in ALS.</a> Nat Rev Neurosci. 2, 806-819 (2001).</li><li>DeJesus-Hernandez, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expanded+GGGGCC+hexanucleotide+repeat+in+noncoding+region+of+C9ORF72+causes+chromosome+9p-linked+FTD+and+ALS.">Expanded GGGGCC hexanucleotide repeat in noncoding region of C9ORF72 causes chromosome 9p-linked FTD and ALS.</a> Neuron. 72, 245-256 (2011).</li><li>Renton, A. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+hexanucleotide+repeat+expansion+in+C9ORF72+is+the+cause+of+chromosome+9p21-linked+ALS-FTD.">A hexanucleotide repeat expansion in C9ORF72 is the cause of chromosome 9p21-linked ALS-FTD.</a> Neuron. 72, 257-268 (2011).</li><li>Boeve, B. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+frontotemporal+dementia+and/or+amyotrophic+lateral+sclerosis+associated+with+the+GGGGCC+repeat+expansion+in+C9ORF72.">Characterization of frontotemporal dementia and/or amyotrophic lateral sclerosis associated with the GGGGCC repeat expansion in C9ORF72.</a> Brain. 135, 765-783 (2012).</li><li>Haeusler, A. R., Donnelly, C. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+expanding+biology+of+the+C9orf72+nucleotide+repeat+expansion+in+neurodegenerative+disease.">The expanding biology of the C9orf72 nucleotide repeat expansion in neurodegenerative disease.</a> Nat Rev Neurosci. 17, 383-395 (2016).</li><li>Woerner, A. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoplasmic+protein+aggregates+interfere+with+nucleocytoplasmic+transport+of+protein+and+RNA.">Cytoplasmic protein aggregates interfere with nucleocytoplasmic transport of protein and RNA.</a> Science. 351, 173-176 (2016).</li><li>Tao, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nucleolar+stress+and+impaired+stress+granule+formation+contribute+to+C9orf72+RAN+translation-induced+cytotoxicity.">Nucleolar stress and impaired stress granule formation contribute to C9orf72 RAN translation-induced cytotoxicity.</a> Hum Mol Genet. 24, 2426-2441 (2015).</li><li>Wen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisense+proline-arginine+RAN+dipeptides+linked+to+C9ORF72-ALS/FTD+form+toxic+nuclear+aggregates+that+initiate+in+vitro+and+in+vivo+neuronal+death.">Antisense proline-arginine RAN dipeptides linked to C9ORF72-ALS/FTD form toxic nuclear aggregates that initiate in vitro and in vivo neuronal death.</a> Neuron. 84, 1213-1225 (2014).</li></ol>

Autoren haben nichts zu offenbaren.

Dieses Protokoll zeigt einen hochempfindlichen und quantitativen neuen Assay, um winzige Veränderungen im nucleozytoplasmatischen Transport zu bewerten. Mit diesem System ist es möglich, den nucleozytoplasmatischen Transport und seine Dysfunktion in Echtzeit zu beobachten und zu messen, nicht nur große Defekte, die zu dramatischen Veränderungen der Proteinverteilung führen. Dieser Assay hat nicht nur einen Sensitivitätsvorteil, sondern erfordert auch wenig Vorbereitung, ist preiswert und ist ein sehr einfacher und...

Der nukleare Porenkomplex (NPC) kontrolliert den Import und Export von großen Molekülen in und aus dem Zellkern. Im Gegensatz zu kleinen Molekülen, die ohne Regulation 1 in den Kern eindringen können, wird der Transport größerer Moleküle stark vom NPC kontrolliert. Diese großen Moleküle, wie Proteine ​​und RNA, assoziieren mit Transportfaktoren, einschließlich Importins und Exportins, importiert und exportiert aus dem Kern 2 . Um importiert zu werden, müssen Proteine ​​ein kleines Peptidmotiv enthalten, das im Allgemeinen als nukleares Lokalisierungssignal (NLS) bezeichnet wird, das durch Importine 2 gebunden ist. Diese Sequenzen von Aminosäuren wirken als Tag und sind in der Zusammensetzung 3 , 4 verschieden. Proteine ​​können aus dem Kern in das Zytoplasma aufgrund ihrer Assoziation mit Exportin exportiert werdenS, die eine Signalsequenz binden, die allgemein als nukleares Exportsignal (NES) bezeichnet wird 2 . Sowohl Importins als auch Exportins sind in der Lage, ihre Ladung aufgrund der Regulierung des kleinen Ras-verwandten Nuklearproteins GTPase (Ran) 2 zu transportieren. Es wurde gezeigt, dass Ran in verschiedenen Konformationszuständen existiert, je nachdem, ob es an GTP oder BIP gebunden ist. Wenn an GTP gebunden, kann Ran an importins oder exportins binden. Nach der Bindung an RanGTP veröffentlichen die Importine ihre Fracht, während die Exportine RanGTP binden müssen, um einen Komplex mit ihrer Exportfracht zu bilden. Der dominante Nukleotidbindungszustand von Ran hängt von seinem Standort im Kern (RanGTP) oder dem Cytoplasma (RanGDP) ab. In jüngster Zeit haben eine Reihe von Studien eine Verbindung zwischen Beeinträchtigungen im nukleozytoplasmatischen Weg und sowohl der amyotrophischen Lateralsklerose (ALS) als auch der frontotemporalen Demenz (FTD) 5 , 6 gezeigt </sup&gt; , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . ALS ist eine fortschreitende und tödliche neurodegenerative Erkrankung, die sowohl die oberen als auch die unteren motorischen Neuronen (MNs) 13 beeinflusst und zu einer Lähmung und letztlich zum Tode führt, innerhalb von 2-5 Jahren im Durchschnitt. Die meisten Fälle von ALS werden als sporadische (SALS) eingestuft, ohne jede offensichtliche genetische Verknüpfung, aber 10% werden dominant vererbt (familiäres ALS, FALS). Kürzlich wurden Hexanukleotid-Wiederholungserweiterungen (HREs) im Chromosom 9 offenen Leserahmen 72 (C9orf72) Gen 14 , 15 als genetische Ursache von ALS und FTD identifiziert. Diese Mutanten machen 30-40% der FALS-Fälle aus, und verschiedene Studien haben behauptetDass sie eine Toxizität durch Beeinträchtigung des nucleozytoplasmatischen Transports verursachen 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 . Diese Studien haben zumeist die endgültigen Ergebnisse und Manifestationen von HREs auf den nucleozytoplasmatischen Transport gezeigt, aber sie zeigen keine nukleocytoplasmatische Störung in Echtzeit. Infolgedessen wurde nur ein schwerer nukleozytoplasmatischer Transportmangel 11 , 17 , 18 untersucht. Dieses Protokoll beschreibt eine neue und veRy-sensitiven Assay zur Bewertung und Quantifizierung der nukleozytoplasmatischen Transportdysfunktion in Echtzeit. Die Importrate eines NLS-NES-GFP-Proteins (Shuttle-GFP) kann in Echtzeit mittels Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert werden. Dies geschieht unter Verwendung eines Exportin-Inhibitors, wie zuvor beschrieben, so daß der Shuttle-GFP nur in den Kern gelangen kann. Mit der Fluoreszenzmikroskopie und einer Software, die in der Lage ist, Fluoreszenzveränderungen in Echtzeit zu quantifizieren, ist es möglich, allmähliche Änderungen der Fluoreszenzintensität des im Zellkern befindlichen Shuttle-GFP zu quantifizieren. Als Ergebnis kann eine Michaelis-Menten-ähnliche Sättigungskurve der Fluoreszenz-zu-Zeit-Achse, die die Menge an nuklearem Shuttle-GFP zu irgendeiner gegebenen Zeit darstellt, hergestellt werden. Durch die Verwendung der anfänglichen linearen Geschwindigkeit der Kurven ist es möglich, eine Steigung zu erzeugen, die die Eintrittsrate in den Kern vor der Fluoreszenzsättigung darstellt. Um den Test zu validieren, das übersetzenD C9orf72 Dipeptidwiederholungen, Poly (GR) und Poly (PR), die bisher berichtet wurden, um den nucleozytoplasmatischen Transport zu stören, wurden 5 , 7 , 8 , 10 , 12 verwendet. Unter Verwendung dieses Assays wurde eine 50% ige Abnahme der nuklearen Einfuhrrate im Vergleich zur Kontrolle beobachtet. Mit diesem System können winzige Veränderungen im nucleozytoplasmatischen Transport untersucht werden. Darüber hinaus kann die Fähigkeit verschiedener Faktoren, einen nukleozytoplasmatischen Transportdefekt zu retten, bestimmt werden.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Mouse Motor Neuron-Like hybrid Cell Line (NSC-34)</td>
			<td>tebu-bio</td>
			<td>CLU140-A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DMEM 4.5g/L L-glucose</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>01-055-1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FBS European Grade</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>04-007-1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SL 16R Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75004030</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Thermo Forma Series ii Water Jacketed CO2 Incubator</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>3111</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cover glass 12mm dia. thick 0.13-0.17mm</td>
			<td>Bar Naor LTD</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531">TurboFect Transfection Reagent</a></td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td><a href="https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/R0531">R0531</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Axiovert 100 inverted microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>IMAGING WORKBENCH 2&#160;</td>
			<td>Axon Instruments</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Leptomycin B</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2913</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PBS</td>
			<td>Biological Industries</td>
			<td>02-023-1A</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Homogenizer motor/control/chuck/90-degree clamp</td>
			<td>Glas-Col</td>
			<td>099C K5424CE</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MicroCL 17R Centrifuge, Refrigerated</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>75002455</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assay to measure nucleocytoplasmic transport in real time within motor neuron-like nsc-34 cells

Der nukleozytoplasmatische Transport bezieht sich auf den Import und Export von großen Molekülen aus dem Zellkern. In jüngster Zeit haben eine Reihe von Studien eine Verbindung zwischen der amyotrophischen Lateralsklerose (ALS) und den Beeinträchtigungen im nukleocytoplasmatischen Weg gezeigt. ALS ist eine neurodegenerative Erkrankung, die die motorischen Neuronen beeinflusst und zu einer Lähmung und letztlich im Tode führt, innerhalb von 2-5 Jahren im Durchschnitt. Die meisten Fälle von ALS sind sporadisch, ohne irgendeine offensichtliche genetische Verknüpfung, aber 10% werden in einer dominanten Weise vererbt. Kürzlich wurden Hexanucleotid-Repeat-Expansionen (HREs) im Chromosom 9 offenen Leserahmen 72 (C9orf72) Gen als genetische Ursache von ALS und frontotemporaler Demenz (FTD) identifiziert. Wichtig ist, dass verschiedene Gruppen vor kurzem vorgeschlagen haben, dass diese Mutanten den nucleozytoplasmatischen Transport beeinflussen. Diese Studien haben zumeist das endgültige Ergebnis und die Manifestationen, die durch HREs auf den nucleozytoplasmatischen Transport verursacht wurden, gezeigt, aber sie zeigen keine nukleare Transportdysfunktion inEchtzeit. Als Ergebnis kann nur ein schwerer nukleozytoplasmatischer Transportmangel bestimmt werden, was hauptsächlich auf eine hohe Überexpression oder exogene Proteineinfügung zurückzuführen ist. Dieses Protokoll beschreibt einen neuen und sehr empfindlichen Assay zur Bewertung und Quantifizierung der nukleozytoplasmatischen Transportdysfunktion in Echtzeit. Die Importrate eines NLS-NES-GFP-Proteins (Shuttle-GFP) kann in Echtzeit mittels Fluoreszenzmikroskopie quantifiziert werden. Dies wird durch die Verwendung eines Exportin-Inhibitors durchgeführt, so dass der Shuttle-GFP nur in den Kern eindringen kann. Zur Validierung des Assays wurden die C9orf72 HRE translatierten Dipeptidwiederholungen, Poly (GR) und Poly (PR), die bisher gezeigt wurden, um den nucleozytoplasmatischen Transport zu stören, verwendet. Unter Verwendung des beschriebenen Assays wurde im Vergleich zur Kontrolle eine 50% ige Abnahme der nuklearen Importrate beobachtet. Mit diesem System können winzige Veränderungen des nucleozytoplasmatischen Transports untersucht und die Fähigkeit verschiedener Faktoren zur Rettung (auch nur teilweise) einer nukleozytoplasmatischen trAnsport-Defekt kann bestimmt werden.

Unter Verwendung des hier vorgestellten Verfahrens wurden motorneuronartige NSC-34-Zellen mit einem NLS-NES-GFP (Shuttle-GFP) -Protein transfiziert. Dieses Protein, das NLS- und NES-Signalsequenzen aufweist (Abbildung 1 ), kann zwischen dem Zellkern und dem Cytoplasma pendeln. Generisches GFP kann den Kern in Abwesenheit eines Lokalisierungssignal-Tags nur durch Diffusion eintreten oder verlassen und ist daher gleichmäßig zwischen dem Kern und dem Cytoplasma verteilt (...

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Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur sensitiven Messung der nukleozytoplasmatischen Transportrate in motorischen neuronähnlichen NSC-34-Zellen durch Quantifizierung der Echtzeitveränderung des nuklearen Importes eines NLS-NES-GFP-Proteins.

Assay zur Messung des nukleozytoplasmatischen Transports in Echtzeit in motorischen Neuronen-ähnlichen NSC-34-Zellen

Nucleocytoplasmic transport refers to the import and export of large molecules from the cell nucleus. Recently, a number of studies have shown a ...

assay-to-measure-nucleocytoplasmic-transport-real-time-within-motor

Research

JoVE Journal

Neuroscience

8.6K Aufrufe.  Ben-Gurion University of the Negev.  Dieses Protokoll beschreibt ein Verfahren zur sensitiven Messung der nukleozytoplasmatischen Transportrate in motorischen neuronähnlichen NSC-34-Zellen durch Quantifizierung der Echtzeitveränderung des nuklearen Importes eines NLS-NES-GFP-Proteins. 

Serie: Assay to Measure Nucleocytoplasmic Transport in Real Time within Motor Neuron-like NSC-34 Cells

Time-lapse Live Imaging of Clonally Related Neural Progenitor Cells in the Developing Zebrafish Forebrain

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To understand the behavior of neural progenitor cells in the complex in vivo environment, time-lapse live imaging of neural progenitor cells in an intact brain is critically required. In this video, we exploit the unique features of zebrafish embryos to visualize the development of forebrain neural progenitor cells in vivo. We use electroporation to genetically and sparsely label individual neural progenitor cells. Briefly, DNA constructs coding for fluorescent markers were injected into the forebrain ventricle of 22 hours post fertilization (hpf) zebrafish embryos and electric pulses were delivered immediately. Six hours later, the electroporated zebrafish embryos were mounted with low melting point agarose in glass bottom culture dishes. Fluorescently labeled neural progenitor cells were then imaged for 36hours with fixed intervals under a confocal microscope using water dipping objective lens. The present method provides a way to gain insights into the in vivo development of forebrain neural progenitor cells and can be applied to other parts of the central nervous system of the zebrafish embryo.

The present video demonstrates a method which takes advantage of the combination of electroporation and confocal microscopy to perform live imaging on individual neural progenitor cells in the developing zebrafish forebrain. In vivo analysis of the development of forebrain neural progenitor cells at a clonal level can be achieved in this way.

Zeitraffer-Live-Imaging von klonal verbundenen neuronalen Vorläuferzellen in der Entwicklung von Zebrafisch Vorderhirnneuronen

Precise patterns of division, migration and differentiation of neural progenitor cells are crucial for proper brain development and function1,2. To ...

Forschung

Neurowissenschaften

Motor Nerve Transection and Time-lapse Imaging of Glial Cell Behaviors in Live Zebrafish

The nervous system is often described as a hard-wired component of the body even though it is a considerably fluid organ system that reacts to external stimuli in a consistent, stereotyped manner, while maintaining incredible flexibility and plasticity. Unlike the central nervous system (CNS), the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair, but we have only just begun to understand the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using zebrafish as a model system, we have the unprecedented opportunity to couple regenerative studies with in vivo imaging and genetic manipulation. Peripheral nerves are composed of axons surrounded by layers of glia and connective tissue. Axons are ensheathed by myelinating or non-myelinating Schwann cells, which are in turn wrapped into a fascicle by a cellular sheath called the perineurium. Following an injury, adult peripheral nerves have the remarkable capacity to remove damaged axonal debris and re-innervate targets. To investigate the roles of all peripheral glia in PNS regeneration, we describe here an axon transection assay that uses a commercially available nitrogen-pumped dye laser to axotomize motor nerves in live transgenic zebrafish. We further describe the methods to couple these experiments to time-lapse imaging of injured and control nerves. This experimental paradigm can be used to not only assess the role that glia play in nerve regeneration, but can also be the platform for elucidating the molecular mechanisms that govern nervous system repair.

Although the peripheral nervous system (PNS) is capable of significant repair after injury, little is known about the cellular and molecular mechanisms that govern this phenomenon. Using live, transgenic zebrafish and a reproducible nerve transection assay, we can study dynamic glial cell behaviors during nerve degeneration and regeneration.

Motor Nervendurchtrennung und Zeitraffer-Imaging von Gliazellen Verhalten im Live Zebrafisch

The  nervous system is often described as a hard-wired component of the body even  though it is a considerably fluid organ system that reacts to external ...

Using Informational Connectivity to Measure the Synchronous Emergence of fMRI Multi-voxel Information Across Time

It is now appreciated that condition-relevant information can be present within distributed patterns of functional magnetic resonance imaging (fMRI) brain activity, even for conditions with similar levels of univariate activation. Multi-voxel pattern (MVP) analysis has been used to decode this information with great success. FMRI investigators also often seek to understand how brain regions interact in interconnected networks, and use functional connectivity (FC) to identify regions that have correlated responses over time. Just as univariate analyses can be insensitive to information in MVPs, FC may not fully characterize the brain networks that process conditions with characteristic MVP signatures. The method described here, informational connectivity (IC), can identify regions with correlated changes in MVP-discriminability across time, revealing connectivity that is not accessible to FC. The method can be exploratory, using searchlights to identify seed-connected areas, or planned, between pre-selected regions-of-interest. The results can elucidate networks of regions that process MVP-related conditions, can breakdown MVPA searchlight maps into separate networks, or can be compared across tasks and patient groups.

Informational connectivity measures the correspondence between time courses of multi-voxel information across different brain regions. Multi-voxel pattern discriminability time series are extracted from regions and compared, revealing networks that are not identified in a typical functional connectivity approach.

Mit Informations Konnektivität, um das synchrone Entstehung von fMRI Multi-Voxel-Informationen Auf Zeit messen

It is now appreciated that condition-relevant information can be present within distributed patterns of functional magnetic resonance imaging (fMRI) brain ...

Real-time Imaging of Axonal Transport of Quantum Dot-labeled BDNF in Primary Neurons

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are increasingly viewed as an early feature of neurodegenerative diseases, including Alzheimer&#8217;s disease (AD) and Huntington&#8217;s disease (HD). As yet unclear is the mechanism(s) by which axonal injury is induced. We reported the development of a novel technique to produce biologically active, monobiotinylated BDNF (mBtBDNF) that can be used to trace axonal transport of BDNF. Quantum dot-labeled BDNF (QD-BDNF) was produced by conjugating quantum dot 655 to mBtBDNF. A microfluidic device was used to isolate axons from neuron cell bodies. Addition of QD-BDNF to the axonal compartment allowed live imaging of BDNF transport in axons. We demonstrated that QD-BDNF moved essentially exclusively retrogradely, with very few pauses, at a moving velocity of around 1.06 &#956;m/sec. This system can be used to investigate mechanisms of disrupted axonal function in AD or HD, as well as other degenerative disorders.

Axonal transport of BDNF, a neurotrophic factor, is critical for the survival and function of several neuronal populations. Some degenerative disorders are marked by disruption of axonal structure and function. We demonstrated the techniques used to examine live trafficking of QD-BDNF in microfluidic chambers using primary neurons.

Echtzeit-Bildgebung des axonalen Transport von Quantum Dot-markierten BDNF in primären Neuronen

BDNF plays an important role in several facets of neuronal survival, differentiation, and function. Structural and functional deficits in axons are ...

Real-time Electrophysiology: Using Closed-loop Protocols to Probe Neuronal Dynamics and Beyond

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where the stimulus applied depends in real-time on the response of the system. Recent applications range from the implementation of virtual reality systems for studying motor responses both in mice1 and in zebrafish2, to control of seizures following cortical stroke using optogenetics3. A key advantage of closed-loop techniques resides in the capability of probing higher dimensional properties that are not directly accessible or that depend on multiple variables, such as neuronal excitability4 and reliability, while at the same time maximizing the experimental throughput. In this contribution and in the context of cellular electrophysiology, we describe how to apply a variety of closed-loop protocols to the study of the response properties of pyramidal cortical neurons, recorded intracellularly with the patch clamp technique in acute brain slices from the somatosensory cortex of juvenile rats. As no commercially available or open source software provides all the features required for efficiently performing the experiments described here, a new software toolbox called LCG5 was developed, whose modular structure maximizes reuse of computer code and facilitates the implementation of novel experimental paradigms. Stimulation waveforms are specified using a compact meta-description and full experimental protocols are described in text-based configuration files. Additionally, LCG has a command-line interface that is suited for repetition of trials and automation of experimental protocols.

Closed-loop protocols are becoming increasingly widespread in modern day electrophysiology. We present a simple, versatile and inexpensive way to perform complex electrophysiological protocols in cortical pyramidal neurons in vitro, using a desktop computer and a digital acquisition board.

Echtzeit-Elektrophysiologie: Mit Closed-loop Protokolle Probe neuronaler Dynamik und darüber hinaus

Experimental neuroscience is witnessing an increased interest in the development and application of novel and often complex, closed-loop protocols, where ...

Real-time Iontophoresis with Tetramethylammonium to Quantify Volume Fraction and Tortuosity of Brain Extracellular Space

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the extracellular space (ECS) of the living brain. The ECS surrounds all brain cells and contains both interstitial fluid and extracellular matrix. The transport of many substances required for brain activity, including neurotransmitters, hormones, and nutrients, occurs by diffusion through the ECS. Changes in the volume and geometry of this space occur during normal brain processes, like sleep, and pathological conditions, like ischemia. However, the structure and regulation of brain ECS, particularly in diseased states, remains largely unexplored. The RTI method measures two physical parameters of living brain: volume fraction and tortuosity. Volume fraction is the proportion of tissue volume occupied by ECS. Tortuosity is a measure of the relative hindrance a substance encounters when diffusing through a brain region as compared to a medium with no obstructions. In RTI, an inert molecule is pulsed from a source microelectrode into the brain ECS. As molecules diffuse away from this source, the changing concentration of the ion is measured over time using an ion-selective microelectrode positioned roughly 100 &#181;m away. From the resulting diffusion curve, both volume fraction and tortuosity can be calculated. This technique has been used in brain slices from multiple species (including humans) and in vivo to study acute and chronic changes to ECS. Unlike other methods, RTI can be used to examine both reversible and irreversible changes to the brain ECS in real time.

This protocol describes real-time iontophoresis, a method that measures physical parameters of the extracellular space (ECS) of living brains. The diffusion of an inert molecule released into the ECS is used to calculate the ECS volume fraction and tortuosity. It is ideal for studying acute reversible changes to brain ECS.

Echtzeit-Iontophorese mit Tetramethylammonium zur Quantifizierung der Volumenfraktion und Tortuosität des Gehirns extrazellulären Raumes

This review describes the basic concepts and protocol to perform the real-time iontophoresis (RTI) method, the gold-standard to explore and quantify the ...

Live-cell Measurement of Odorant Receptor Activation Using a Real-time cAMP Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. To efficiently and accurately deorphanize ORs, we combine the use of a heterologous cell line to express mammalian ORs and a genetically modified biosensor plasmid to measure cAMP production downstream of OR activation in real time. This assay can be used to screen odorants against ORs and vice versa. Positive odorant-receptor interactions from the screens can be subsequently confirmed by testing against various odor concentrations, generating concentration-response curves. Here we used this method to perform a high-throughput screening of an odorous compound against a human OR library expressed in Hana3A cells and confirmed that the positively-responding receptor is the cognate receptor for the compound of interest. We found this high-throughput detection method to be efficient and reliable in assessing OR activation and our data provide an example of its potential use in OR functional studies.

Characterizing the function of odorant receptors serves an indispensable part in the deorphanization process. We describe a method to measure the activation of odorant receptors in real time using a cAMP assay.

Leben-Zelle Messung der Geruchsstoff Rezeptor Aktivierung mit einem Echtzeit-cAMP-Assay

The enormous sizes of the mammalian odorant receptor (OR) families present difficulties to find their cognate ligands among numerous volatile chemicals. ...

Assay Development for High Content Quantification of Sod1 Mutant Protein Aggregate Formation in Living Cells

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc superoxide dismutase 1 (SOD1). The structural instability of SOD1 and the detection of SOD1-positive inclusions in familial-ALS patients supports a potential causal role for misfolded and/or aggregated SOD1 in ALS pathology. In this study, we describe the development of a cell-based assay designed to quantify the dynamics of SOD1 aggregation in living cells by high content screening approaches. Using lentiviral vectors, we generated stable cell lines expressing wild-type and mutant A4V SOD1 tagged with yellow fluorescent protein and found that both proteins were expressed in the cytosol without any sign of aggregation. Interestingly, only SOD1 A4V stably expressed in HEK-293, but not in U2OS or SH-SY5Y cell lines, formed aggregates upon proteasome inhibitor treatment. We show that it is possible to quantify aggregation based on dose-response analysis of various proteasome inhibitors, and to track aggregate-formation kinetics by time-lapse microscopy. Our approach introduces the possibility of quantifying the effect of ALS mutations on the role of SOD1 in aggregate formation as well as screening for small molecules that prevent SOD1 A4V aggregation.

We describe a method to quantify the aggregation of misfolded proteins. Our protocol details lentiviral induced stable cell line generation, automated confocal imaging, and image analysis of protein aggregates. As an illustrative application, we studied the effect of small molecules in promoting SOD1 aggregation in a time- and dose-dependent manner.

Assay-Entwicklung für hohe Content Quantifizierung der Sod1 mutierten Proteins Aggregatbildung in lebenden Zellen

Amyotrophic lateral sclerosis (ALS) is a fatal neurodegenerative disease that can be caused by inherited mutations in the gene encoding copper-zinc ...

Axonal Transport of Organelles in Motor Neuron Cultures using Microfluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal growth, development, and survival. We describe a detailed method for the use of microfluidic chambers (MFCs) for tracking axonal transport of fluorescently labeled organelles in MN axons. This method is rapid, relatively inexpensive, and allows for the monitoring of intracellular cues in space and time. We describe a step by step protocol for: 1) Fabrication of polydimethylsiloxane (PDMS) MFCs; 2) Plating of ventral spinal cord explants and MN dissociated culture in MFCs; 3) Labeling of mitochondria and acidic compartments followed by live confocal imagining; 4) Manual and semiautomated axonal transport analysis. Lastly, we demonstrate a difference in the transport of mitochondria and acidic compartments of HB9::GFP ventral spinal cord explant axons as a proof of the system validity. Altogether, this protocol provides an efficient tool for studying the axonal transport of various axonal components, as well as a simplified manual for MFC usage to help discover spatial experimental possibilities.

Axonal transport is a crucial mechanism for motor neuron health. In this protocol we provide a detailed method for tracking the axonal transport of acidic compartments and mitochondria in motor neuron axons using microfluidic chambers.

Axonaler Transport von Organellen in Motorneuronenkulturen mit Mikrofluidic Chambers System

Motor neurons (MNs) are highly polarized cells with very long axons. Axonal transport is a crucial mechanism for MN health, contributing to neuronal ...

Real-Time fMRI Brain Mapping in Animals

Dynamic fMRI responses vary largely according to the physiological conditions of animals either under anesthesia or in awake states. We developed a real-time fMRI platform to guide experimenters to monitor fMRI responses instantaneously during acquisition, which can be used to modify the physiology of animals to achieve desired hemodynamic responses in animal brains. The real-time fMRI set-up is based on a 14.1T preclinical MRI system, enabling the real-time mapping of dynamic fMRI responses in the primary forepaw somatosensory cortex (FP-S1) of anesthetized rats. Instead of a retrospective analysis to investigate confounding sources leading to the variability of fMRI signals, the real-time fMRI platform provides a more effective scheme to identify dynamic fMRI responses using customized macro-functions and a common neuroimage analysis software in the MRI system. Also, it provides immediate troubleshooting feasibility and a real-time biofeedback stimulation paradigm for brain functional studies in animals.

Animal brain functional mapping can benefit from the real-time functional magnetic resonance imaging (fMRI) experimental set-up. Using the latest software implemented in the animal MRI system, we established a real-time monitoring platform for small animal fMRI.

Echtzeit-fMRT-Kartierung des Gehirns bei Tieren

Dynamic fMRI responses vary largely according to the physiological conditions of animals either under anesthesia or in awake states. We developed a ...