이 기술은 귀중한 환자 샘플을 마우스에 경구 내 안전하게 주입 및 이식한 다음 골수 흡인을 통해 골수에서 정상 조혈 및 질병의 생물학을 더 잘 이해하는 데 도움이 되는 것을 목표로 합니다. 정맥 주사로 수행되는 실험을 위해 소량의 귀중한 샘플을 쥐의 골수에 직접 이식하는 것이 더 효율적이라는 것은 오래 전부터 알려져 있습니다. 다만, 실제 테크니컬 영상이 없기 때문에 일반적으로 높은 허들 기법으로 여겨졌습니다.
당사의 프로토콜은 귀중한 샘플을 적은 수의 세포가 있는 마우스에 쉽고 안전하게 이식할 수 있도록 합니다. 이 기술에 대한 수요가 높으며 이 비디오의 도움으로 누구나 빠르게 배울 수 있습니다. 우리는 모든 사람이 이 기술을 습득하고 과학 발전에 크게 기여할 수 있기를 바랍니다.
먼저 20마이크로리터의 FACS 완충액 또는 해동 배지를 사용하여 최대 300만 개의 샘플 셀로 세포 현탁액을 준비합니다. 주사하기 전에 얼음 위에 보관하십시오. 포비돈 요오드 또는 클로르헥시딘 스크럽과 70% 에탄올에 적신 거즈 스펀지를 사용하여 3세트의 교대로 주사할 대퇴골이 있는 다리를 소독합니다.
엄지와 검지로 대퇴골을 꼬집어 다리를 안정시킵니다. 반지 또는 다섯 번째 손가락으로 경골을 밀어 경골이 대퇴골에서 구부러지지 않도록 합니다. 성공적인 주입을 위해 적절한 위치를 확인하십시오.
빈 멸균 27G 바늘의 가장자리를 사용하여 대퇴골 상단의 슬개건을 쪼습니다. 최상의 삽입 지점을 확보하려면 주사기가 부착된 27G 바늘을 슬개골 힘줄 바로 아래에 삽입합니다. 대퇴골의 두 과두 사이에 단단히 고정하고 바늘을 바깥쪽과 위쪽으로 돌려 대퇴골 축과 평행하게 정렬합니다.
바늘을 원을 그리며 회전하면서 대퇴골수 강으로 전진시킵니다. 저항이 눈에 띄게 감소할 때까지 바늘을 삽입하십시오. 측면 이동으로 올바른 바늘 위치를 확인합니다.
바늘 플런저를 뒤로 당기면서 바늘을 골수강 내에서 움직여 음압을 생성합니다. 주사기에 혈액이나 골수가 있는지 확인하여 바늘이 골수강에 있는지 확인합니다. 바늘이 올바르게 배치되었는지 확인한 후 천천히 제거하고 주사기가 들어있는 세포를 같은 뿌리에 삽입합니다.
새 바늘로 전환할 때 첫 번째 주입의 뿌리와 각도를 기억하는 것이 중요합니다. 세포가 대퇴골에 성공적으로 주입되면 주사기에 대한 압력을 유지하면서 바늘과 주사기를 조심스럽게 제거합니다. 그런 다음 콧방울에서 마우스를 제거하고 깨끗한 종이 타월 위에 올려 침구의 흡인을 방지합니다.
복구를 위해 마우스를 가열 패드 또는 기타 통제된 표면에 보관하십시오. 마우스 랙에 다시 놓기 전에 마취에서 회복되었는지 확인하십시오. 다음 24시간 동안 쥐에게 고통이나 감염의 징후가 있는지 관찰합니다.
골수를 흡인하기 전에 먼저 0.5ml 27G 주사기에 CSM을 2-3회 채우고 배출하여 시술을 준비하는 것으로 시작합니다. 그런 다음 마취된 마우스에서 골수를 부드럽게 흡인하여 20-50마이크로리터의 골수를 산출합니다. 그런 다음 대퇴골에서 바늘을 완전히 제거하고 흡인된 샘플을 500마이크로리터의 CSM에 매달아 놓습니다.
콧방울에서 마우스를 제거하고 깨끗한 종이 타월 위에 올려 놓아 회복 중 침구가 흡인되는 것을 방지합니다. 마우스 랙 뒤쪽에 놓기 전에 모든 마우스를 모니터링하여 마취 후 회복 상태를 확인합니다. 골수에서 추출한 펠릿 세포를 섭씨 4도에서 300G에서 5분 동안 회전시킵니다.
상등액을 흡입하고 각 튜브에 ACK 용해 완충액을 추가합니다. 세포를 소용돌이쳐 다시 부유시키고 5-10분 동안 얼음 위에 놓습니다. 나일론 메쉬를 통해 셀 현탁액을 새 튜브로 필터링합니다.
원래 튜브를 FACS 버퍼로 헹구고 나일론 메쉬, 펠릿 셀을 통해 섭씨 4도에서 300G로 5분 동안 회전하여 다시 펠릿 셀을 통과시킵니다. 펠릿화된 세포에서 상등액을 흡인하고 원하는 항체를 함유한 염색 용액을 추가합니다. 튜브를 얼음 위에 20분 동안 두십시오.
세포를 세척하고 실험 설정에 따라 분석을 진행합니다. 이식 기술은 생물 발광 이미지를 사용하여 최소한의 마우스 침입으로 쉽게 평가할 수 있습니다. 여기서 Acalook을 사용한 인간 유래 K562 세포주의 이식은 주입된 대퇴골 측면의 이종이식 마우스 모델에서 관찰되었습니다.
CD34 양성 HSPC의 이식은 이식 후 8주에 인간 세포 생착의 10-20% 이상을 초래했습니다. 유사하게, 제대혈 유래 HSC를 이식하면 이식 후 8주에 최대 10%의 인간 생착이 이루어졌습니다. 이 절차를 사용하여 성인 골수 유래 HSPC, 백혈병 줄기 세포, CRISPR Cas9 편집 제대혈 유래 HSPC 및 환자 유래 AML iPSC의 추가 성공적인 이식이 달성되었습니다.
