우리는 GRP 세포의 사용에 그의 통찰력과 의견 박사 데빈 게리 감사하고 싶습니다.

소개 이 프로토콜에서는 E13 마우스 fetuses의 척수에서 glial 제한된 전구체 (GRP) 세포를 추출 선택하고 플레이트하는 방법을 보여줍니다. 이러한 세포는 oligodendrocytic 및 astrocytic 세포 lineages 내에 조기 엽 성의 전구 물질이며, A2B5 자신의 표현에 의해 정의됩니다. FGF-2와 함께 보충 GRP 매체에서 A2B5 이상의 GRPs는 초기 oligodendrocytic 혈통 마커 PDGFαR 및 NG2 1,2을 표현하기 시작합니다. 이러한 oligodendrocyte 혈통 전지는 별개의 phenotypic 단계, 형태학의 변화뿐만 아니라, 특정 발달 단계에 대한 마커의 표현을 특징으로 그들 각각의 일련의 통과. 이러한 전구체 세포는 현재 다중 경화증, leukodystrophies 및 periventricular leukomalacia (PVL) 3,4,5,6를 포함한 중추 신경계 백질의 질환에서 세포 기반 치료 접근 방법에 대한 잠재적인 소스로 연구되고있다 </s&gt;까지. oligodendrocyte 혈통의 엽 성의 전구 물질을 파생 인간의 두뇌를 사용하는 연구 shiverer 마우스 dysmyelination 모델의 두뇌에서뿐만 아니라 demyelinated 척수의 설치류 모델 6,7,8,9에 성공 remyelination를보고했습니다. 이러한 glial 전구체 세포와 같은 척수 손상과 루게릭병 10,11,12,13 등 다른 백질 질환 모델 연구에도 사용되었습니다. 우리 연구실은 우리가 PVL, 뇌성 마비 14,15,16 원인 중 큰 비중의 원기를 회복시키는 방식으로 GRP 세포를 파생 이러한 척수의 효능을 평가하고있는 초기 출생 후의 hypoxia - 국소 빈혈 마우스 모델을 개발했습니다. GRP 세포가 astrocytic 통로 17로 차별화하는 경향을 가지고 있기 때문에 널리 흰색 물질 부상을 연구에 사용되고 있습니다 OPC 모델을 파생 쥐 두뇌도있다. OPC의 표현형 이미 oligodendrocyte 혈통 경로, irreve 보이는 현상을 입력했습니다rsible. 그러나 GRPs 가능성도 E10.5에서 파생된 NEPs 포함한 oligodendrocyte progenitors의 넓은 스펙트럼의 응답을 평가에 관심이 있습니다. 이러한 이유로 우리는 우리의 일에 척수 파생 GRP 모델을 채택했습니다. 전지 교체를위한 GRPs의 사용 이외에 하얀 물질 질환의 야생 유형 및 유전자 변형 쥐 모델에서 이러한 세포의 유도는 체외 환경에서 정상과 질병 상황에서 glial 차별화로 진학이 가능합니다. 이전 간행물은 성숙 의존 글루 탐 산염의 excitotoxicity, 산화 스트레스, 그리고 neuroinflammation 18,19에 연루 선택 요인과 같은 각종 외부 스트레스에 대한 oligodendrocytic 계보 (Lineage) 전구체 세포의 선택적 취약성의 증거를 보여줍니다. 우리의 연구에서 세포의 자화율을 평가,이 흰색 물질 부상의 발전 뒤에 세포와 분자 메커니즘을 이해하는데 초점을 맞추고있다oligodendrocyte 혈통 스펙트럼은 putative 치료 접근법을 분석뿐만 아니라 모욕합니다. 자료 동물과 관련된 모든 절차는 PHS 정책과 JHU IACUC을 따릅니다. 모든 절차는 무균 상태를 유지하기 위해 층류 후드에서 수행해야합니다. 일반적으로 절개는 수평 유동 후드와 수직 흐름 후드의 체외 작업에서 수행됩니다. 모든 미디어는 절개 동안 추위 사용됩니다. 우리의 연구에 사용된 생쥐들은 야생에서 cd​​-1 변형 및 C57/BL6 배경에 유전자 변형 GFP입니다. 하나의 CD-1 마우스 댐은 일반적으로 종자 1-2 T25 flasks 정도로 10 세 이상의 fetuses를 얻을. 일반적으로, 두 댐은 댐 당 1 T25 플라스크에 풀링된와 도금 시간과 태아의 척추 코드에 희생된다. 일단 세포들이 확대 및 후속 연구를위한 체외로 특성화 수있는 파생되었습니다. 1. 미디어 및 Flasks의 작성 <ul type="disc"><li> GRP 주식; N2 (100x, Invitrogen) 건강 보조 식품과 소 혈청 알부민 (BSA, 0.5 % W / V) DMEM / F12 1시 1분 (Invitrogen) + B27 (Invitrogen 50x) : 매체는 해부 매체로 사용됩니다. </li><li> 분리 매체 : 해부 매체와 같은. </li><li> 문화 매체 : GRP 주식 매체 + FGF-2 (10-20 NG / ML, Invitrogen)과 헤파린 (1 μg / ML, 시그마). </li><li> PLL / laminin 코팅 75cm 2 개 25cm 2 flasks (T75 또는 T25). </li><li> 다음 aspirated 1 시간 동안 37 ° C에서 incubated 증류수 H 2 O에서, 조직 문화 flasks (75cm 2, 팔콘)가 15-20μg/ml 폴리-L-라이신 (시그마 PLL)로 코팅했다. Flasks는 PBS 그때 그때 aspirated과 세포 도금이 될 준비가 될 때까지 신선한 PBS 또는 미디어 추가, 1 시간 동안 37 ° C 15-20 μg / PBS에서 ML Laminin (시그마)로 코팅과 함께 1X을 빨기도합니다. 코팅 후, flasks가 건조 허용해서는 안되지만 4에서 PBS 또는 미디어에 보관하실 수 있습니다 사용하기 전에 짧은 기간 동안 ° C에서.에게 </li></ul> 2. 계측기 및 기타 Material <ul type="disc"><li> 배양 접시 : 4 당 댐 : 해부 3 배양 접시 (75 ㎜), 수확 척추 코드를 수집하기위한 20 밀리미터 요리. </li><li> 큰 가위 (43 밀리미터 운영 가위, Roboz) 및 댐의 복부를 열고위한 조직 포셉. </li><li> 자궁을 해부하고 fetuses (15mm 마이크로 분석 해 봅시다 가위, Roboz)을 제거하는 소형 가위. </li><li> 마이크로 분석 해 봅시다 봄 가위 (6mm)는 fetuses의 척수를 해부합니다. </li><li> 미세 수술 동안 댐 및 태아의 몸을 고정하고 나중에 한 번 노출된 척수를 제거하기 위해 직각 집게 분석 해 봅시다. </li><li> 40 도금하기 전에 세포 파편을 제거하기 70 마이크로 미터 셀 스트레이너. </li><li> 0.05 %의 트립신은 37 ° C.에 prewarmed </li><li> 10 100x 주식으로 준비 MG / ML DNAse 1 (시그마), (1 G / ML). </li><li> 동물 사체를위한 바이오 위험 가방. </li><li> 처리 15 및 50 ML의 원심 분리기 튜브는 척추 코드를 추출. </li></ul> 3. 초과 저얼 결정egnancy 임신한 마우스 댐이 중 배아 일 E12 또는 집안에서 결정 태아 발달이나 임신의 E13에 납품을 지정 상용 소스에서 정렬됩니다. 간단히 두 여자는 늦은 오후에 한 남성과 함께 배치되며 함께 하룻밤을 떠났어. 다음날 여자는 vaginally있는 점액 플러그의 존재에 대해 관찰하고 있습니다. 점액 플러그 동물 이후 체중 증가의 속도를 모니터링 매일 무게가되도록 짝짓기가 발생했음을에만 표시입니다. 점액 플러그가 관찰되어 하루 배아 첫날 (E1)로 정의됩니다. 4. 조직 유도 <ol><li> 무균 상태를 유지하는 수평 유동 후드 아래에서 작동합니다. </li><li> 70 % 에탄올로 후드와 작업 공간을 스프레이. </li><li> 압력솥 악기 또는 70 % 에탄올과 후한 스프레이. </li><li> 악기, 미디어, 그리고 사용하기 위해 현미경을 준비합니다. </li><li> 멸균 페트리 디로 차가운 해부 매체 20 ML을 부어쉬. </li><li> 경추 탈구 또는 잘린 뒤에 intraperitoneally를 (IP) 관리 클로랄 하이드 레이트 (500 밀리그램 / ㎏)와 함께 동물을 마취. </li><li> 70~90% 에탄올 (소독)로 댐의 복부 분야를 뿌려서 </li><li> 큰 가위와 집게로 복부를 엽니다. <ol type="a"><li> CD1과 C57/BL6 종자의 경우 : 보통 8-14 fetuses가 자궁 안에있을 것입니다. fetuses의 수는 응력에 의존한다. </li></ol></li><li> 태아의 혈액과 조직 파편을 씻는 깨끗한 페트리 접시에 신선한 차가운 해부 매체의 새끼과 장소를 포함하여 마우스 자궁의 압축을 풉니다. </li><li> 자궁 나팔에서 각각 태아를 추출하고 작은 가위를 사용하여 배아 SAC와 태반에서 분리. 새로운 배양 접시에 신선한 해부 매체로 추출 fetuses을 전송합니다. <ol type="a"><li> 해부 매체 신진 대사 활동을 낮추고 파생된 세포의 생존을 보존하기 위해 낮은 온도에 있어야합니다. </li><li> 이 포셉으로 지금부터 작업과마이크로 봄 - 가위를 해부. </li></ol></li><li> 해부 현미경 하에서 근무, 마이크로 수술 가위와 척수를 노출하기 위해 다시 껍질 피부와 척수를 따라 피부를 잘라. </li><li> 대한 C1에서 microsurgical 가위와 함께 꼬리의 시작 부분에 척수를 가로로 쪼개다. </li><li> 솔직히 포셉와 척수를 제거 모든 뼈 및 연골은 제거됩니다 확인하고 중간을 해부 3 회 배양 접시에 전송할 수 있습니다. </li><li> 이후 세포 배양에 meningeal 조직의 전면에 자라난 것을 방지하기 위해서는 척수에서 가능한 meninges의 정도를 제거하려고합니다. 어렸을때 튀어나와 말초 신경으로 인해이 추출 뇌를에서 meningeal 조직을 제거하는 것보다 더 어렵습니다. </li><li> 일단 meninges가 제거되었으며, 20mm 배양 접시에 척추 코드를 전송 </li><li> 철저하게 70~90% 에탄올로 영역을 분사하여 정리. </li><li> 분리를위한 다음 단계는 유지하기 위해 신속하게 이루어져야파생 척수 조직의 높은 생존 능력. </li></ol> 5. 문화 설립 <ol><li> 트립신은 37 ° CH 2 O-욕조에 적어도 30 분 동안 미리 예열한다. 적절한 나누어지는는 온도 변동에 대한 주식의 노출을 줄이기 위해 주식에서 제거되어야합니다. </li><li> 10ml 사전 예열 트립신 (0.05 %; 품질 체액)이 포함된 50 ML의 원심 관에 수확 척추 코드를 전송 및 100 μl DNAse을 (10 밀리그램 / ML)와 간단히 씹다. </li><li> 37 년에 품어 ° 10 분 CH 2 O - 목욕. </li><li> 씹다 다른 10 분 동안 품어. </li><li> 5 ML GRP 매체 (위에 정의된) 1000 RPM에서 5 분 원심 분리기를 추가합니다. </li><li> 10 ML GRP 매체로 뜨는 및 resuspend 펠렛을 기음과 DNAse-1을 (10 밀리그램 / ML, 시그마) 추가합니다. </li><li> 37 년에 품어 ° 10 분 CH 2 O - 목욕. </li><li> 1,000 rpm으로 5 분 원심 분리기와 뜨는을 기음. </li><li> fre와 Resuspend 펠릿40 쉬 GRP 미디어 다음 필터 파편 - 70 μm의 셀 스트레이너. </li><li> PLL / laminin 코팅 25cm 2 flasks (T25)와 37에서 품어 ° C, 95 % 습도 5 % CO 2의 플레이트. </li><li> 100 % 미디어 하루 다음으로 변경합니다. </li><li> 이 시점에서 GRPs는 첨부 및 프로세스를 확장하기 시작했습니다. </li></ol> 6. GRP 인구를 Immunopanning <ol><li> 플라스크까지 PLL / laminin 코팅 flasks의 플레이트 척수 조직 85~90% 합류하거나 일주일 정도입니다. </li><li> 고무 경찰관이나 0.05 %의 트립신과 플라스크를 위해서 힘든하여 수확 세포는 철저히 씹다하지만 부드럽게, 3 ML GRP 매체로 5 분 철저히 resuspend 펠렛 1,000 rpm으로 원심 분리기. </li><li> 세 T25 flasks 또는 3 ML ~ 1 T75 플라스크를 완전히 세포를 덮어 flasks가 80~90%의 합류점에 도달 수 있도록 매체의 적절한 볼륨을 추가 1 ML 각을 전송합니다. </li><li> 매일 미디어를 변경, 빨리 매체는 신속 depletes 경우. </li><li> 문장 세균 PE4에 하룻밤 트라이 요리 (75 ㎜) ° 방지용 마우스 IgM 항체와 C (남부 생명 공학), 10 μg / PBS에서 ML. </li><li> 여분의 버퍼를 대기음하고 PBS로 3 배 페트리 접시를 씻는다. </li><li> 5 μg / 실내 온도 (RT)에서 1 시간 동안 PBS과 부화에 희석 ML의 농도에서 A2B5 항체 (Millipore)를 추가합니다. </li><li> 그리고 플레이트의 건조 방지하기 위해 GRP 매체의 8 ML을 추가 PBS로 다시 배 접시를 씻으십시오. </li><li> 모든 세포를 분리하기 위해 고무 경찰관과 flasks을 위해서 힘든하여 배양 접시와 수확 GRP 세포에서 GRP 매체의 5 ML 전송 </li><li> 대단히 짧은 시간을 망쳤으니 A2B5 코팅 세균 배양 접시에 5ml 세포 현탁액을 전송하기 위해 간단히 세포 현탁액을 씹다. </li><li> 떨지 않고 상온에서 1 시간을 품어. </li><li> 1 시간 대기음 매체와 PBS와 8X 세차 번호판 후에. </li><li> 부드럽게 그리고 GRP 매체의 적절한 부피와 PLL / laminin 코팅 접시 또는 flasks로 전학이 ML GRP 미디어 고무 경찰관과 함께 세포를 다쳤어요. </lI&gt; </ol> 7. 파생된 세포의 동결 및 저장 <ol><li> 셀은 2 ML 0.05 %의 트립신과 85~90% 합류 T25 또는 T75 플라스크에서 수확된다. </li><li> 트립신은 희석과 inactivated 8ml GRP 주식 매체와 함께 5 분 1,000 rpm으로 centrifuged있다. </li><li> T25 flasks에서 동반한은 1 ML GRP 냉동 매체 (GRP 주식 매체가 10 % (V / V) DMSO와 선택적으로, 20 % FBS과 보완)에 resuspended됩니다. T75 flasks에서 큰 알약은 두 배 희석한다. </li><li> 1.5 세포 현탁액 - 3 × 10 10,11,12,13 세포는 극저온 튜브 (Nalgene)로 전송하며 ° C는 천천히 밤새 얼어 -80에서 이소프로판올를 포함하는 극저온 용기 (Nalgene)에 하룻밤 사이에 저장됩니다. </li><li> 하룻밤 동결 세포를 따라하는 것은 냉장고 박스로 전송하며 -80에서 6 개월 1 년에 저장된 N에서 ° C 또는 장기 (L). 해동 세포는 일반적으로 PLL / laminin 코팅의 품질에 크게 따라 가능한 60-80% 있습니다. </li></ol&gt; 8. 대표 결과 CO 2로 인해 fetuses 궁극적 파생된 세포의 생존 능력에 가능한 하류 효과의 동물을 anesthetizing 사용되지 않습니다. 또한, 너무 파생 과정에서 척수에서 meninges를 제​​거하는 매우 어려운 것입니다하지만, GRP 매체와 immunopanning의 결합이 빠르게 성장하는 세포를 제거합니다. 마찬가지로, 전체 척수은 그 복부 척수에서 발생하고 dorsally 20 마이 그 레이션으로 인해 GRP 인구의 큰 복부 농도에도 불구하고 수확한다. 그러나 GRP 매체 GRP 표현형 위해 선정하고 해당 인구는 A2B5 immunopanning에 의해 극대화된다. 척수 조직을 도금 후의 체외 배양은 두 구절이나 일주일 incubated됩니다. 문화 2 일 후에 다른 morphologies의 세포는 이종을 나타내는 조직 문화 flasks에서 관찰할 수있다인구는하지만 GRP 매체 geneity은 GRP 표현형 위해 선택합니다. 이러한 세포는 A2B5의 조합 + GRP, e-NCAM +의 연결을 제한 엽 성의 전구 물질 (NRP)와 nestin + A2B5-neuroepithelial 세포 그리고 아마도 fibronectin + meningeal 세포입니다. 또한,보다 성숙한 phenotypes가 시작 이기종 수영장 (그림 1A)에서 고도로 GRP 농축 인구를 극대화하기 위해서는 doublecortin와의 연결을 혈통에 대한 Tuj1, astrocytes에 대한 GFAP 및 oligo의 혈통에 대한 PDGFaR 및 GalC 포함한 현재의 표현 마커가 될 수도 셀 수 세포 밀도가 T75 flasks의 confluency 85-90 % 정도로 증가되면 A2B5 위해 선택 다음에 E-NCAM + 셀 + GRP 인구를 선택하고 제거를 두 번 immunopanned 수 있습니다. 이러한 GRP 전지는 후속 A2B5 immunopanning이 매우 풍부 GRP 인구를 유지하는 데 필요한 수 있도록 oligodendrocyte 표현형위한 선택 배지에 임에도 불구하고 astrocytes가 될 수있는 능력을 유지합니다. Immunopanning gener앨리 수확량 최대 95% A2B5 + 셀하지만 더욱 수율을 위해 A2B5 복합 자석 구슬 (Miltenyi Biotec 주식 회사)가 최대 97 % 수율을 제공하는 데 사용할 수 있습니다. 이러한 정기적인 미디어의 변경 등의 유지 보수 GRP 문화에 관심이 아닌 GRP 세포 유형의 확산을 최소화합니다. 비록이없는 상태에서 BMP-4 astrocytes가 여전히 발견 고갈 수 있습니다 특히 미디어 astrocytic 표현형로 ​​분화를 유도하는 것 같습니다. B27 보충제는 트라이 iodothyronine 호르몬을 (T3)가 포함되어 있지만,이 현상이 발생 T3보다 높은 수준이 중간에 추가되는 경우에만, GRP 인구의 oligodendrocytes으로 차별화 할 관찰된 경향도 가본 적이있다. 성숙 oligodendrocytes (그림 1B)에 의한 오염에 대한 우려가있는 경우에는 T3 무료 B27 보충제가 대체하실 수 있습니다. 이러한 GRP 전지는 쉽게 2 ~ 3 짧은 프로세스를 통해 작은 소마들의 형태가 있지만 다른 세포 유형이 존재할 수, IM을위한 화면으로 확인할 수 있습니다munocytochemistry는 이전에 명명된 일반적인 발달 및 세포 유형의 특정 마커에 대해 수행할 수 있습니다. 일반적으로 neuroepithelial (NEP)과 GRP 또는 NRP 중 하나가 될 수 있습니다 A2B5-세포의 작은 영구 인구가 될 것입니다. 다행히 더 이상 세포는 매체가 GRP의 표현형을 선택 것이라는 가능성 GRP 매체에 보관됩니다. <img alt="1 그림." src="/files/ftp_upload/3462/3462fig1.jpg" /> 그림은 1.)는 이기종 형태의 도금 척수 세포는 문화가 2 일 후에 관찰된다. 나) Immunopanning가 시작 이기종 풀에서 높은 GRP 강화 인구 극대화.

<ol>
	<li>Kalyani, A., Hobson, K., Rao, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuroepithelial+stem+cells+from+the+embryonic+spinal+cord:+isolation,+characterization,+and+clonal+analysis.">Neuroepithelial stem cells from the embryonic spinal cord: isolation, characterization, and clonal analysis.</a> Developmental biology. 186, 202-202 (1997).</li><li>Rao, M. S., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glial-restricted+precursors+are+derived+from+multipotent+neuroepithelial+stem+cells.">Glial-restricted precursors are derived from multipotent neuroepithelial stem cells.</a> Developmental biology. 188, 48-48 (1997).</li><li>Goldman, S. A., Lang, J., Roy, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progenitor+cell-based+myelination+as+a+model+for+cell-based+therapy+of+the+central+nervous+system.">Progenitor cell-based myelination as a model for cell-based therapy of the central nervous system.</a> Ernst Schering Research Foundation workshop. (60), 195-195 (2006).</li><li>Goldman, S. A., Schanz, S., Windrem, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+cell-based+strategies+for+treating+pediatric+disorders+of+myelin.">Stem cell-based strategies for treating pediatric disorders of myelin.</a> Human molecular genetics. 17, 76-76 (2008).</li><li>Goldman, S. A., Windrem, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+replacement+therapy+in+neurological+disease.">Cell replacement therapy in neurological disease.</a> Philosophical transactions of the Royal Society of London. 361, 1463-1463 (2006).</li><li>Walczak, P., All, A. H., Rumpal, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+glial-restricted+progenitors+survive,+proliferate,+and+preserve+electrophysiological+function+in+rats+with+focal+inflammatory+spinal+cord+demyelination.">Human glial-restricted progenitors survive, proliferate, and preserve electrophysiological function in rats with focal inflammatory spinal cord demyelination.</a> Glia. 59, 499-499 (2011).</li><li>Liu, S., Qu, Y., Stewart, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Embryonic+stem+cells+differentiate+into+oligodendrocytes+and+myelinate+in+culture+and+after+spinal+cord+transplantation.">Embryonic stem cells differentiate into oligodendrocytes and myelinate in culture and after spinal cord transplantation.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97, 6126-6126 (2000).</li><li>Windrem, M. S., Schanz, S. J., Guo, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neonatal+chimerization+with+human+glial+progenitor+cells+can+both+remyelinate+and+rescue+the+otherwise+lethally+hypomyelinated+shiverer+mouse.">Neonatal chimerization with human glial progenitor cells can both remyelinate and rescue the otherwise lethally hypomyelinated shiverer mouse.</a> Cell stem cell. 2, 553-553 (2008).</li><li>Groves, A. K., Barnett, S. C., Franklin, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+demyelinated+lesions+by+transplantation+of+purified+O-2A+progenitor+cells.">Repair of demyelinated lesions by transplantation of purified O-2A progenitor cells.</a> Nature. 362, 453-453 (1993).</li><li>Back, S. A., Han, B. H., Luo, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Selective+vulnerability+of+late+oligodendrocyte+progenitors+to+hypoxia-ischemia.">Selective vulnerability of late oligodendrocyte progenitors to hypoxia-ischemia.</a> J. Neurosci. 22, 455-45 (2002).</li><li>Johnston, M. V., Trescher, W. H., Ishida, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neurobiology+of+hypoxic-ischemic+injury+in+the+developing+brain.">Neurobiology of hypoxic-ischemic injury in the developing brain.</a> Pediatric research. 49, 735-735 (2001).</li><li>Lepore, A. C., Han, S. S., Tyler-Polsz, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+fate+of+multipotent+and+lineage-restricted+neural+precursors+following+transplantation+into+the+adult+CNS.">Differential fate of multipotent and lineage-restricted neural precursors following transplantation into the adult CNS.</a> Neuron glia biology. 1, 113-113 (2004).</li><li>Rothstein, J. D., Dykes-Hoberg, M., Pardo, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Knockout+of+glutamate+transporters+reveals+a+major+role+for+astroglial+transport+in+excitotoxicity+and+clearance+of+glutamate.">Knockout of glutamate transporters reveals a major role for astroglial transport in excitotoxicity and clearance of glutamate.</a> Neuron. 16, 675-675 (1996).</li><li>Johnston, M. V., Ferriero, D. M., Vannucci, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Models+of+cerebral+palsy:+which+ones+are+best.">Models of cerebral palsy: which ones are best.</a> Journal of child neurology. 20, 984-98 (2005).</li><li>Comi, A. M., Johnston, M. V., Wilson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strain+variability,+injury+distribution,+and+seizure+onset+in+a+mouse+model+of+stroke+in+the+immature+brain.">Strain variability, injury distribution, and seizure onset in a mouse model of stroke in the immature brain.</a> Developmental neuroscience. 27, 127-127 (2005).</li><li>Comi, A. M., Weisz, C. J., Highet, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+model+of+stroke+and+ischemic+seizures+in+the+immature+mouse.">A new model of stroke and ischemic seizures in the immature mouse.</a> Pediatric neurology. 31, 254-254 (2004).</li><li>Dietrich, J., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+A2B5++glial+precursor+cells+from+cryopreserved+human+fetal+brain+progenitor+cells.">Characterization of A2B5+ glial precursor cells from cryopreserved human fetal brain progenitor cells.</a> Glia. 40, (2002).</li><li>Alberdi, E., Sanchez-Gomez, M. V., Marino, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca(2+)+influx+through+AMPA+or+kainate+receptors+alone+is+sufficient+to+initiate+excitotoxicity+in+cultured+oligodendrocytes.">Ca(2+) influx through AMPA or kainate receptors alone is sufficient to initiate excitotoxicity in cultured oligodendrocytes.</a> Neurobiology of disease. 9, 234-234 (2002).</li><li>Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+injury+in+premature+infants:+a+complex+amalgam+of+destructive+and+developmental+disturbances.">Brain injury in premature infants: a complex amalgam of destructive and developmental disturbances.</a> Lancet neurology. 8, 110-110 (2009).</li><li>Warf, B. C., Fok-Seang, J., Miller, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evidence+for+the+ventral+origin+of+oligodendrocyte+precursors+in+the+rat+spinal+cord.">Evidence for the ventral origin of oligodendrocyte precursors in the rat spinal cord.</a> J. Neurosci. 11, 2477-2477 (1991).</li><li>Deng, W., Poretz, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+in+developmental+neurotoxicity.">Oligodendroglia in developmental neurotoxicity.</a> Neurotoxicology. 24, 161-161 (2003).</li><li>Deng, W., Rosenberg, P. A., Volpe, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium-permeable+AMPA/kainate+receptors+mediate+toxicity+and+preconditioning+by+oxygen-glucose+deprivation+in+oligodendrocyte+precursors.">Calcium-permeable AMPA/kainate receptors mediate toxicity and preconditioning by oxygen-glucose deprivation in oligodendrocyte precursors.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 100, 6801-6801 (2003).</li><li>Karadottir, R., Cavelier, P., Bergersen, L. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NMDA+receptors+are+expressed+in+oligodendrocytes+and+activated+in+ischaemia.">NMDA receptors are expressed in oligodendrocytes and activated in ischaemia.</a> Nature. 438, 1162-1162 (2005).</li><li>Pleasure, D., Soulika, A., Singh, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inflammation+in+white+matter:+clinical+and+pathophysiological+aspects.">Inflammation in white matter: clinical and pathophysiological aspects.</a> Mental retardation and developmental disabilities research reviews. 12, 141-141 (2006).</li><li>Gregori, N., Proschel, C., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tripotential+glial-restricted+precursor+(GRP)+cell+and+glial+development+in+the+spinal+cord:+generation+of+bipotential+oligodendrocyte-type-2+astrocyte+progenitor+cells+and+dorsal-ventral+differences+in+GRP+cell+function.">The tripotential glial-restricted precursor (GRP) cell and glial development in the spinal cord: generation of bipotential oligodendrocyte-type-2 astrocyte progenitor cells and dorsal-ventral differences in GRP cell function.</a> J. Neurosci. 22, 248-248 (2002).</li><li>Rao, M. S., Noble, M., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tripotential+glial+precursor+cell+is+present+in+the+developing+spinal+cord.">A tripotential glial precursor cell is present in the developing spinal cord.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95, 3996-3996 (1998).</li><li>Raff, M. C., Miller, R. H., Noble, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+glial+progenitor+cell+that+develops+in+vitro+into+an+astrocyte+or+an+oligodendrocyte+depending+on+culture+medium.">A glial progenitor cell that develops in vitro into an astrocyte or an oligodendrocyte depending on culture medium.</a> Nature. 303, 390-390 (1983).</li><li>Strathmann, F. G., Wang, X., Mayer-Proschel, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+two+novel+glial-restricted+cell+populations+in+the+embryonic+telencephalon+arising+from+unique+origins.">Identification of two novel glial-restricted cell populations in the embryonic telencephalon arising from unique origins.</a> BMC developmental biology. 7, 33-33 (2007).</li><li>Nunes, M. C., Roy, N. S., Keyoung, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+isolation+of+multipotential+neural+progenitor+cells+from+the+subcortical+white+matter+of+the+adult+human+brain.">Identification and isolation of multipotential neural progenitor cells from the subcortical white matter of the adult human brain.</a> Nature. 9, 439-439 (2003).</li><li>Roy, N. S., Wang, S., Harrison-Restelli, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification,+isolation,+and+promoter-defined+separation+of+mitotic+oligodendrocyte+progenitor+cells+from+the+adult+human+subcortical+white+matter.">Identification, isolation, and promoter-defined separation of mitotic oligodendrocyte progenitor cells from the adult human subcortical white matter.</a> J. Neurosci. 19, 9986-9986 (1999).</li><li>Chen, Y., Balasubramaniyan, V., Peng, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+rat+and+mouse+oligodendrocyte+precursor+cells.">Isolation and culture of rat and mouse oligodendrocyte precursor cells.</a> Nature protocols. 2, 1044-1044 (2007).</li></ol>

이 연구는 국립 건강 연구소 [NICHD P30HD024061 (AWP), NINDS K08NS063956 (AF) 및 R01NS028208 (MVJ)] 및 아동 신경과 재단에 의해 후원되었다. 이 보고서의 내용은 전적으로 저자의 책임이며 반드시 건강의 국립 연구소, DHHS의 공식 견해를 대변하지 않습니다. 저자들은 본 연구와 관련된 관심 아무런 충돌이 없습니다.

<p class="jove_content"중추 신경계 백질의&gt; 장애는 유전, 염증 허혈성 및 독성 원인 포함한 etiologies 다수를 포함<sup&gt; 19,21,22,23,24</sup&gt;. 다중 경화증 및 vasculopathies 성인의 흰색 물질 질병의 주요 원인 반면, 조산과 관련된 periventricular leukomalacia는 유년기 인구의 흰색 물질 손상의 가장 흔한 원인입니다. 더 이상 질병 메커니즘에게 크게 perinatal 모욕의 영향을받는 세포 ofoligodendrocytic 혈통의 진학을 윤곽을 그리다하기 위해서 필요합니다. GRPs는 쥐 배아 척수로부터 격리되고 oligodendrocytes과 별개의 두 astrocyte 인구에게 상승을주는, 자연 tripotential로 표시하지만 뉴런으로 차별화하지되었다<sup&gt; 2,25,26</sup&gt;. 마찬가지로, 쥐의 시신경과 늦은 배아 또는 초기 출생 후의 쥐의 두뇌에서 파생된 oligodendrocyte 전구체 세포 (OPC)을 적절한 미디어 조건에서 작동 oligodendrocytes으로 성숙하기 위해 입증되었습니다<sup&gt; 27,28</sup&gt;. 또한 태아 또는 성인 파생 인간 OPC는 더욱 더 성숙한 oligodendrocyte phenotypes으로 조작되었습니다<sup&gt; 29,30</sup&gt;.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; GRP 세포는 척수 E13.5 쥐의 코드와 생쥐의 E12-13.5 양쪽으로부터 격리되었습니다. 쥐 차이에서 복부 파생 GRPs가 더욱 성숙 phenotypes으로 차별화하는 데 큰 성향을 전시와 함께 oligodendrocytes, 또는 astrocytes의 생성을 촉진 조건에 대한 그들의 반응에 지느러미와 복부 파생 GRP 세포 사이에보고되었습니다<sup&gt; 25,26,28</sup&gt;. 이것은 차별의 단서에 덜 받아들이는 될 수 어렸을때 GRP 세포의 지느러미 마이 그 레이션에 복부가 원인일 수 있습니다 것입니다. Immunopanning은 고립과 문화의 유지 보수를 위해 수집하는 A2B5을 표현 subpopulation을 허용합니다.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; 저희 마우스 GRP 문화는 GRP 세포가 화학 물질 (중간) 및 항체 기반 기술에 의해 선택되어있는 셀의 이기종, 풀링된 인구를 얻을 총 척수 조직에서 파생됩니다. 우리의 연구는 척수 파생 마우스 GRP 세포를 활용했지만, 그것은 최근에도 성숙 oligodendrocytes로 발전 할 수있는 두뇌 파생 마우스 oligodendrocyte 전구 세포 유도에보고되었습니다<sup&gt; 31</sup&gt;. 여기에서 파생된 세포는 초기에 적절한 배지를 사용하는 것은 풍부한 PDGFαR + OPC 인구로 조작하는 oligospheres로 배양해 있습니다<sup&gt; 31</sup&gt;. 우리의 연구는 A2B5에서 +, PDGFαR-GRP의 엽 성의 전구 물질 myelin 기본 단백질 (MBP +) 성숙 oligodendrocytes 표현에 oligodendrocyte 혈통 스펙트럼의 세포에 hypoxic - 허혈성 모욕 우리의 모델의 효과에 초점을했습니다. 사실 우리<em&gt; 체외에서</em&gt; 특성화는 monocultures이나 대뇌 피질의 신경 세포와 공동 배양에 중 MBP 표현 세포에 이러한 미숙 GRP 세포에게 성숙을 보이지 않고있다. 이러한 전지는 perinatal 흰색 물질 부상에 관련된 메커니즘을 연구에 대한 구체적인 차별 경로로 문화에 조작할 수 있습니다. oligodendrocyte 혈통이 인구의 가용성 세포와 관련된 백질 질환의 여러 마우스 모델은 상해뿐만 아니라 가능한 세포 치료 옵션의 유용성을 탐구하는 원인이 메커니즘에 대한 철저한 조사를 허용하고 있습니다.</p

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> DMEM / F12 1시 1분 </td><td> Invitrogen </td><td> 11320033 </td></tr><tr><td> B27 </td><td> Invitrogen </td><td> 17504044 </td></tr><tr><td> N2 </td><td> Invitrogen </td><td> 17502048 </td></tr><tr><td> RH-FGF-기초 </td><td> Invitrogen </td><td> PHG0026 </td></tr><tr><td> 트립신 (0.05 %) EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) </td><td> 품질 생물 주식 회사 </td><td> 118-087-721 </td></tr><tr><td> 폴리-L-라이신 HBR </td><td> 시그마 </td><td> P1274-25MG </td></tr><tr><td> Laminin </td><td> 시그마 </td><td> L2020-1MG </td></tr><tr><td> Dnase 일 </td><td> 시그마 </td><td> DN25 </td></tr></tbody></table>

derivation of glial restricted precursors from e13 mice

이것은 E13 마우스 fetuses의 척수에서 glial 제한된 전구체 (GRP) 세포의 유도를위한 프로토콜입니다. 이러한 세포는 oligodendrocytic 세포 혈통 내에서 초기 엽 성의 전구 물질입니다. 최근 이러한 세포 백질 질환에서 회복 치료를위한 잠재적인 소스로 연구되었습니다. Periventricular leukomalacia (PVL)은 어린 시절의 비 유전자 흰색 물질 질병의 주요 원인이며, 매우 조기 유아의 50 %까지 영향을 미칩니다. 데이터 hypoxia-국소 빈혈로 개발 뇌, 산화 스트레스와 선택적으로 초기 백색 물질을 대상으로 excitotoxicity의 강한 자화율을 제안한다. Glial 제한된 엽 성의 전구 물질 (GRP), oligodendrocyte 전구 세포 (OPC)와 미숙 oligodendrocytes (preOL)는 PVL의 개발에 핵심 선수가 될 것과 지속적인 연구의 주제입니다. 또한, 이전의 연구로 excitotoxicity를 글루 탐 산염하는 자화율 증가하고있다 CNS 조직의 하위 집합을 확인했습니다이 느끼기 쉬운 상태로 발달 패턴뿐. 저희 연구실은 현재 개발 GRP 단계에서 PVL 및 사용 세포의 oligodendrocyte progenitors의 역할을 조사하고 있습니다. 우리는 PVL과 일치 응력을 선택한 그들의 반응을 테스트하기 위해 여러 가지 실험적인 패러다임에서 이러한 파생 GRP 세포를 활용. GRP 세포는 마우스 PVL 모델 및 hypoxia - 국소 빈혈을 포함하여 PVL과 같은 모욕의 체외 모델에서 이식 실험 OPCs 및 preOL으로 체외에서 조작 할 수 있습니다. 교양 세포를 사용하고 시험 관내 연구에서 데이터의 해석을 용이하게 실험 사이의 다양성을 감소시킬 수있을함으로써. 비 GRP 표현형의 세포 오염의 영향을 최소화하면서 배양해 세포는 또한 GRP 인구의 농축을 허용합니다.

Watch this Scientific Journal Video about Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice at JoVE.com

Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

이 프로토콜은 태아의 척추 코드에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유래를 설명하고 이식이나 oligodendrocytic 혈통의 연구 중 체외 유지.

E13 생쥐에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유도

This is a protocol for derivation of glial restricted precursor (GRP) cells from the spinal cord of E13 mouse fetuses. These cells are early precursors ...

derivation-of-glial-restricted-precursors-from-e13-mice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.2K 조회수.  Johns Hopkins University. 이 프로토콜은 태아의 척추 코드에서 Glial 제한된 엽 성의 전구 물질의 유래를 설명하고 이식이나 oligodendrocytic 혈통의 연구 중 체외 유지.

비디오: Derivation of Glial Restricted Precursors from E13 mice

Efficient Derivation of Human Neuronal Progenitors and Neurons from Pluripotent Human Embryonic Stem Cells with Small Molecule Induction

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system (CNS) structure and circuitry in today's healthcare industry. Cell-based therapies hold great promise to restore the lost nerve tissue and function for CNS disorders. However, cell therapies based on CNS-derived neural stem cells have encountered supply restriction and difficulty to use in the clinical setting due to their limited expansion ability in culture and failing plasticity after extensive passaging1-3. Despite some beneficial outcomes, the CNS-derived human neural stem cells (hNSCs) appear to exert their therapeutic effects primarily by their non-neuronal progenies through producing trophic and neuroprotective molecules to rescue the endogenous cells1-3. Alternatively, pluripotent human embryonic stem cells (hESCs) proffer cures for a wide range of neurological disorders by supplying the diversity of human neuronal cell types in the developing CNS for regeneration1,4-7. However, how to channel the wide differentiation potential of pluripotent hESCs efficiently and predictably to a desired phenotype has been a major challenge for both developmental study and clinical translation. Conventional approaches rely on multi-lineage inclination of pluripotent cells through spontaneous germ layer differentiation, resulting in inefficient and uncontrollable lineage-commitment that is often followed by phenotypic heterogeneity and instability, hence, a high risk of tumorigenicity7-10. In addition, undefined foreign/animal biological supplements and/or feeders that have typically been used for the isolation, expansion, and differentiation of hESCs may make direct use of such cell-specialized grafts in patients problematic11-13. To overcome these obstacles, we have resolved the elements of a defined culture system necessary and sufficient for sustaining the epiblast pluripotence of hESCs, serving as a platform for de novo derivation of clinically-suitable hESCs and effectively directing such hESCs uniformly towards clinically-relevant lineages by small molecules14 (please see a schematic in Fig. 1). Retinoic acid (RA) does not induce neuronal differentiation of undifferentiated hESCs maintained on feeders1, 14. And unlike mouse ESCs, treating hESC-differentiated embryoid bodies (EBs) only slightly increases the low yield of neurons1, 14, 15. However, after screening a variety of small molecules and growth factors, we found that such defined conditions rendered retinoic acid (RA) sufficient to induce the specification of neuroectoderm direct from pluripotent hESCs that further progressed to neuroblasts that generated human neuronal progenitors and neurons in the developing CNS with high efficiency (Fig. 2). We defined conditions for induction of neuroblasts direct from pluripotent hESCs without an intervening multi-lineage embryoid body stage, enabling well-controlled efficient derivation of a large supply of human neuronal cells across the spectrum of developmental stages for cell-based therapeutics.

We have established a protocol for induction of neuroblasts direct from pluripotent human embryonic stem cells maintained under defined conditions with small molecules, which enables derivation of a large supply of human neuronal progenitors and neuronal cell types in the developing CNS for neural repair.

작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

There is a large unfulfilled need for a clinically-suitable human neuronal cell source for repair or regeneration of the damaged central nervous system ...

연구

신경과학

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications for understanding the pathogenesis of demyelinating diseases such as Multiple Sclerosis (MS). Cellular development is commonly studied with primary cell culture models. Primary cell culture facilitates the evaluation of a given cell type by providing a controlled environment, free of the extraneous variables that are present in vivo. While OL cultures derived from rats have provided a vast amount of insight into OL biology, similar efforts at establishing OL cultures from mice has been met with major obstacles. Developing methods to culture murine primary OLs is imperative in order to take advantage of the available transgenic mouse lines. 
Multiple methods for extraction of OPCs from rodent tissue have been described, ranging from neurosphere derivation, differential adhesion purification and immunopurification 1-3. While many methods offer success, most require extensive culture times and/or costly equipment/reagents. To circumvent this, purifying OPCs from murine tissue with an adaptation of the method originally described by McCarthy &amp; 
de Vellis 2 is preferred. This method involves physically separating OPCs from a mixed glial culture derived from neonatal rodent cortices. The result is a purified OPC population that can be differentiated into an OL-enriched culture. This approach is appealing due to its relatively short culture time and the unnecessary requirement for growth factors or immunopanning antibodies. 
While exploring the mechanisms of OL development in a purified culture is informative, it does not provide the most physiologically relevant environment for assessing myelin sheath formation. Co-culturing OLs with neurons would lend insight into the molecular underpinnings regulating OL-mediated myelination of axons. For many OL/neuron co-culture studies, dorsal root ganglion neurons (DRGNs) have proven to be the neuron type of choice. They are ideal for co-culture with OLs due to their ease of extraction, minimal amount of contaminating cells, and formation of dense neurite beds. While studies using rat/mouse myelinating xenocultures have been published 4-6, a method for the derivation of such OL/DRGN myelinating co-cultures from post-natal murine tissue has not been described. Here we present detailed methods on how to effectively produce such cultures, along with examples of expected results. These methods are useful for addressing questions relevant to OL development/myelinating function, and are useful tools in the field of neuroscience.

This article describes methods to derive enriched populations of murine oligodendrocyte precursor cells (OPCs) in primary culture, which differentiate to produce mature oligodendrocytes (OLs). In addition, this report describes techniques to produce murine myelinating co-cultures by seeding mouse OPCs onto a neurite bed of mouse dorsal root ganglion neurons (DRGNs).

포스트 - 나탈 Murine 조직의 공동 문화를 Myelinating 풍부한 Oligodendrocyte 문화와 Oligodendrocyte / 신경 세포의 유도

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Inducing Plasticity of Astrocytic Receptors by Manipulation of Neuronal Firing Rates

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be stimulated by neuronally-released transmitter. However, the ability of astrocytic receptors to exhibit plasticity in response to changes in neuronal activity has received little attention. Here we describe a model system that can be used to globally scale up or down astrocytic group I metabotropic glutamate receptors (mGluRs) in acute brain slices. Included are methods on how to prepare parasagittal hippocampal slices, construct chambers suitable for long-term slice incubation, bidirectionally manipulate neuronal action potential frequency, load astrocytes and astrocyte processes with fluorescent Ca2+ indicator, and measure changes in astrocytic Gq GPCR activity by recording spontaneous and evoked astrocyte Ca2+ events using confocal microscopy. In essence, a &#8220;calcium roadmap&#8221; is provided for how to measure plasticity of astrocytic Gq GPCRs. Applications of the technique for study of astrocytes are discussed. Having an understanding of how astrocytic receptor signaling is affected by changes in neuronal activity has important implications for both normal synaptic function as well as processes underlying neurological disorders and neurodegenerative disease.

Here we describe an adaptation of protocols used to induce homeostatic plasticity in neurons for the study of plasticity of astrocytic G protein-coupled receptors. Recently used to examine changes in astrocytic group I mGluRs in juvenile mice, the method can be applied to measure scaling of various astrocytic GPCRs, in tissue from adult mice in situ and in vivo, and to gain a better appreciation of the sensitivity of astrocytic receptors to changes in neuronal activity.

신경 발사 환율의 조작에 의해 성상 세포 수용체의 가소성을 유도

Close to two decades of research has established that astrocytes in situ and in vivo express numerous G protein-coupled receptors (GPCRs) that can be ...

Feeder-free Derivation of Neural Crest Progenitor Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a source of transplantable cells for regenerative applications after disease or accidents. Neural crest (NC) cells are the precursors for a large variety of adult somatic cells, such as cells from the peripheral nervous system and glia, melanocytes and mesenchymal cells. They are a valuable source of cells to study aspects of human embryonic development, including cell fate specification and migration. Further differentiation of NC progenitor cells into terminally differentiated cell types offers the possibility to model human diseases in vitro, investigate disease mechanisms and generate cells for regenerative medicine. This article presents the adaptation of a currently available in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs. This new protocol requires 18 days of differentiation, is feeder-free, easily scalable and highly reproducible among human embryonic stem cell (hESC) lines as well as human induced pluripotent stem cell (hiPSC) lines. Both old and new protocols yield NC cells of equal identity.

Neural crest (NC) cells derived from human pluripotent stem cells (hPSC) have great potential for modeling human development and disease and for cell replacement therapies. Here, a feeder-free adaptation of the currently widely used in vitro differentiation protocol for the derivation of NC cells from hPSCs is presented.

인간 다 능성에서 신경 능선 세포의 전구 세포의 공급이없는 유도는 줄기 세포

Human pluripotent stem cells (hPSCs) have great potential for studying human embryonic development, for modeling human diseases in the dish and as a ...

Preparation of Primary Mixed Glial Cultures from Adult Mouse Spinal Cord Tissue

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information regarding glial activities at the cellular and molecular levels has been obtained through in vitro cell culture systems. The in vitro systems utilized, mainly include primary glia derived from neonatal brain cortical tissue and immortalized cell lines. However, these systems may not reflect the characteristics of spinal cord glial cells in vivo. In order to further investigate the roles of spinal cord glial cells in the development of peripheral nerve injury-induced neuropathic pain using a culture system that better reflects the in vivo condition, our laboratory has developed a method to establish primary spinal cord mixed glial cultures from adult mice. Briefly, spinal cords are collected from adult mice and processed through papain digestion followed by myelin removal with a density-gradient medium. Single cell suspensions are cultured in complete Dulbecco&#39;s modified Eagle media (cDMEM) supplemented with 2-mercaptoethanol (2-ME) at 35.9 oC. These culture conditions were optimized specifically for the growth of mixed glial cells. Under these conditions, cells are ready to be used for experimentation between 12 - 14 d&#160;(cells are usually in log phase during this time) after the establishment of the culture (D 0) and can be kept in culture conditions up to D 21. This culture system can be used to investigate the responses of spinal cord glial cells upon stimulation with various substances and agents. Besides neuropathic pain, this system can be used to study glial responses in other diseases that involve pathological changes of spinal cord glial cells.

The development of neuropathic pain involves pathological changes of spinal cord glial cells. A reliable glial culture system derived from adult spinal cord tissue and designed for studying these cells in vitro is lacking. Therefore, we show here how&#160;to establish primary mixed glial cultures from adult mouse spinal cord tissue.

성인 마우스 척수 조직에서 차 혼합 폐해 문화의 준비

It has been well-accepted that spinal cord glial responses contribute significantly to the development of neuropathic pain. Tremendous information ...

Derivation of Leptomeninges Explant Cultures from Postmortem Human Brain Donors

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of Parkinson&#39;s disease is not pathologically confirmed in up to 25% of clinically diagnosed Parkinson&#39;s disease. Therefore, tissue collected from clinically diagnosed patients with idiopathic Parkinson&#39;s disease can have a high rate of misdiagnosis; hence in vitro studies from such tissues to study Parkinson&#39;s disease as a preclinical model can become futile.
By collecting postmortem human leptomeninges with a confirmed neuropathological diagnosis of Parkinson&#39;s disease and characterized by nigrostriatal cell loss and intracellular protein inclusions called Lewy bodies, one can be certain that clinically observed parkinsonism is not caused by another underlying disease process (e.g. tumor, arteriosclerosis).
This protocol presents the dissection and preparation of postmortem human leptomeninges for derivation of a meningeal fibroblast culture. This procedure is robust and has a high success rate. The challenge of the culture is sterility as the brain procurement is generally not performed under sterile conditions. Therefore, it is important to supplement the culture media with a cocktail of penicillin, streptomycin, and amphotericin B.
The derivation of meningeal fibroblasts from autopsy-confirmed cases with Parkinson&#39;s disease provides the foundation for in vitro modeling of Parkinson&#39;s disease. Meningeal fibroblasts appear 3-9 days after sample preparation and about 20-30 million cells can be cryopreserved in 6-8 weeks. The meningeal fibroblast culture is homogenous and the cells express fibronectin, a commonly used marker to identify meninges.

The leptomeninges explant culture protocol from human postmortem brain is a technically robust and simple way to derive fibronectin-positive meningeal fibroblasts within 6-8 weeks and cryopreserve approximately 20-30 million cells.

사후 인간의 두뇌 기증자로부터 Leptomeninges 이식편 문화의 유도

Even though great progress has been made in the clinical characterization of Parkinson&#39;s disease, several studies report that the diagnosis of ...

Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells into Cortical Interneuron Precursors

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons as well as synchronizing the outputs of pyramidal neuron ensembles. Deficits in interneuron function have been implicated in a variety of neuropsychiatric disorders, including schizophrenia, autism, and epilepsy. The derivation of cortical interneurons from embryonic stem cells not only allows for the study of their development and function, but provides insight into the molecular mechanisms underlying the pathogenesis of cortical interneuron-related disorders. Interneurons also have the remarkable capacity to survive, migrate, and integrate into host cortical circuitry post-transplantation, making them ideal candidates for use in cell-based therapies. Here, we present a scalable, highly efficient, modified embryoid body-to-monolayer method for the derivation of Nkx2.1-expressing interneuron progenitors and their progeny from mouse embryonic stem cells (mESCs). Using a Nkx2.1::mCherry:Lhx6::GFP dual reporter mESC line, Nkx2.1 progenitors or their Lhx6-expressing post-mitotic progeny can be isolated via fluorescence-activated cell sorting (FACS) and subsequently used in a number of downstream applications. We also provide methods to enrich for parvalbumin (PV) or somatostatin (SST) interneuron subgroups, which may be helpful for studying aspects of fate determination or for use in therapeutic applications that would benefit from interneuron subgroup-enriched transplantations.

This protocol describes a method for generating cortical interneuron progenitors and post-mitotic interneuron precursors from mouse embryonic stem cells using a modified embryoid body-to-monolayer method. These progenitors/precursors can be used in vitro or fluorescently sorted and transplanted into neonatal neocortex for studying fate determination, or used in therapeutic applications.

대뇌 피 질의 Interneuron 선구자로 마우스 배아 줄기 세포의 분화

GABAergic cortical interneurons are a heterogeneous population of cells that play critical roles in regulating the output of excitatory pyramidal neurons ...

Cannula Implantation into the Cisterna Magna of Rodents

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to the skull or the brain parenchyma. In anesthetized rodents, the exposure of the dura mater by blunt dissection of the neck muscles allows the insertion of a cannula into the cisterna magna (CM). The cannula, composed either by a fine beveled needle or borosilicate capillary, is attached via a polyethylene (PE) tube to a syringe. Using a syringe pump, molecules can then be injected at controlled rates directly into the CM, which is continuous with the subarachnoid space. From the subarachnoid space, we can trace CSF fluxes by convective flow into the perivascular space around penetrating arterioles, where solute exchange with the interstitial fluid (ISF) occurs. CMc can be performed for acute injections immediately following the surgery, or for chronic implantation, with later injection in anesthetized or awake, freely moving rodents. Quantitation of tracer distribution in the brain parenchyma can be performed by epifluorescence, 2-photon microscopy, and magnetic resonance imaging (MRI), depending on the physico-chemical properties of the injected molecules. Thus, CMc in conjunction with various imaging techniques offers a powerful tool for assessment of the glymphatic system and CSF dynamics and function. Furthermore, CMc can be utilized as a conduit for fast, brain-wide delivery of signaling molecules and metabolic substrates that could not otherwise cross the blood brain barrier (BBB).

Here we describe a protocol to perform cisterna magna cannulation (CMc), a minimally invasive way to deliver tracers, substrates and signaling molecules into the cerebrospinal fluid (CSF). Combined with different imaging modalities, CMc enables glymphatic system and CSF dynamics assessment, as well as brain-wide delivery of various compounds.

설치류의 시스테 마그나에 정 맥 주입

Cisterna magna cannulation (CMc) is a straightforward procedure that enables direct access to the cerebrospinal fluid (CSF) without operative damage to ...

Recording Spatially Restricted Oscillations in the Hippocampus of Behaving Mice

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed electrical field of a large volume of brain tissue, extracting information about local activity is challenging. Studying neuronal microcircuits, however, requires a reliable distinction between truly local events and volume-conducted signals originating in distant brain areas. Current source density (CSD) analysis offers a solution for this problem by providing information about current sinks and sources in the vicinity of the electrodes. In brain areas with laminar cytoarchitecture such as the hippocampus, one-dimensional CSD can be obtained by estimating the second spatial derivative of the LFP. Here, we describe a method to record multilaminar LFPs using linear silicon probes implanted into the dorsal hippocampus. CSD traces are computed along individual shanks of the probe. This protocol thus describes a procedure to resolve spatially restricted neuronal network oscillations in the hippocampus of freely moving mice.

This protocol describes the recording of local field potentials with multi-shank linear silicon probes. Conversion of the signals using current source density analysis allows the reconstruction of local electrical activity in the mouse hippocampus. With this technique, spatially restricted brain oscillations can be studied in freely moving mice.

행동 하는 쥐의 해 마에서 진동 제한 공간 기록

The local field potential (LFP) emerges from ion movements across neural membranes. Since the voltage recorded by LFP electrodes reflects the summed ...

Homochronic Transplantation of Interneuron Precursors into Early Postnatal Mouse Brains

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the roles of intrinsic vs. extrinsic mechanisms that regulate this differentiation process is a conundrum for all developmental neurobiologists. This issue is magnified for GABAergic interneurons, an incredibly heterogeneous cell population that is born from transient embryonic structures and undergo a protracted migratory phase to disperse throughout the telencephalon. To explore how different brain environments affect interneuron fate and maturation, we developed a protocol for harvesting fluorescently labeled immature interneuron precursors from specific brain regions in newborn mice (P0-P2). At this age, interneuron migration is nearly complete and these cells are residing in their final resting environments with relatively little synaptic integration. Following collection of single cell solutions via flow cytometry, these interneuron precursors are transplanted into P0-P2 wildtype postnatal pups. By performing both homotopic (e.g., cortex-to-cortex) or heterotopic (e.g., cortex-to-hippocampus) transplantations, one can assess how challenging immature interneurons in new brain environments affects their fate, maturation, and circuit integration. Brains can be harvested in adult mice and assayed with a wide variety of posthoc analysis on grafted cells, including immunohistochemical, electrophysiological and transcriptional profiling. This general approach provides investigators with a strategy to assay how distinct brain environments can influence numerous aspects of neuron development and identify if specific neuronal characteristics are primarily driven by hardwired genetic programs or environmental cues.

Challenging young neurons in new brain regions can reveal important insights into how the environment sculpts neuronal fate and maturation. This protocol describes a procedure to harvest interneuron precursors from specific brain regions and transplant them either homotopically or heterotopically into the brain of postnatal pups.

이른 출생 후 마우스 두뇌로 Interneuron 선구자의 Homochronic 이식

Neuronal fate determination and maturation requires an intricate interplay between genetic programs and environmental signals. However, disentangling the ...