우리 게놈 캐나다와 게놈 브리티시 컬럼비아 (204PRO) 운영 및 기술 개발 (214PRO)에 대 한 재정 지원을 게놈 혁신 네트워크 (진)을 통해 감사합니다. 우리는 촬영 MALDI TOF 악기의 사용에 대 한 맥 길 대학 건강 센터의 연구소에서 약물 검색 플랫폼을 감사합니다. H.L. 국가 과학 및 캐나다 엔지니어링 연구 위원회 (NSERC)에서 박사 후 친목에서 지원에 대 한 감사입니다. C.H.B 감사 지원을 위해 앞 가장자리 기부금 펀드 (LEEF)에서 이다. C.H.B. 맥 길 대학 (몬트리올, 퀘 백, 캐나다)에서 분자 종양학 시걸 맥 길의 자에서 지원에 대 한 감사입니다. M.X.C.와 C.H.B.는 유태인 종합 병원 (몬트리올, 퀘 백, 캐나다)에 워렌 Y. Soper 자선 신탁 및 앨빈 시걸 가족 재단에서 지원에 대 한 감사.

아래에 설명 된 시 약의 양을 20 환자 혈장 샘플의 측정 기준. 프로토콜 다음과 아래 빅토리아 대학교의 가이드라인 제시 &#39; s 인간 연구 윤리 위원회.
 1. 세대의 중앙 인간 플라스마에서 나 <ol><li>녹여 플라즈마 샘플 (&#8805; 200 µ L) 방에 온도 물 5 분, 목욕 하 고 완전히 해 동 때까지 얼음에 샘플을 넣어 다음.</li>
	<li>1.1 mL 깊은 잘 격판덮개 (샘플 접시)의 웰 스를 분리 하 고 접시 2 ° C와 1278 x g.에서 10 분 원심 분리기에 원심을 수동으로 각 플라즈마 샘플의 전송 200 µ l</li>
	<li>는 자동된 액체 처리 시스템을 사용 하 여 직렬로 6 교정기 솔루션 치킨 난 백 알 부 민을 준비 500 fmol / µ L 중앙 나 NAT 표준 솔루션을 희석 (0.1, 0.2, 0.6, 1.9, 5.7, 17.2 fmol / µ L).</li>
	<li>피펫은 200 µ L의 세대의 잘, 그리고 125 µ L 각 교정기 버퍼 샘플 접시. 
	참고: 버퍼링 된 식 염 수 (PBS) 버퍼 갓 실험 당일에 준비 해야 하는 인산 염에 CEWA.</li>
	<li>는 자동된 액체 처리 시스템을 사용 하 여, 새로운 접시에 섞어 표면에 뜨는 플라즈마의 125 µ L 또는 PBS에 CEWA의 125 µ L 중앙의 25 µ L 나 세대 버퍼, 0.2 m m ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA), 트리 스 1 M, 1 mM 포함 phenylmethylsulfonyl 불 (PMSF). 
	참고: 준비는 중앙 난 1 M Tris/0.2 mM EDTA 수성 버퍼를 혼합 하 여 세대 버퍼 (pH 5.5에 조정 초 산을 사용 하 여) PMSF 솔루션 메탄올 (100 mM). 두 솔루션 모두 실험의 날에 4 ° C. 믹스 두 솔루션에서 1 개월을 저장할 수 있습니다.</li>
	<li>자동으로 96 잘 접시, 3 복제 솔루션 당, 잘 당 34 µ L로 솔루션을 전송합니다. 3 h. 위해 37 ° C에서 접시를 품 어</li>
</ol> 2. 중앙의 면역-농축 나 사용 하 여 항 체 코팅 구슬 <ol><li>자기 단백질 G 구슬에 항 체의 활용 참고: 구슬와 항 체의 활용은 중앙 3 h 동안 수동으로 수행 나 생성 기간에는 실험의 하루입니다. 다른 analytes에 대 한 활용된 구슬 속성 및 항 체의 안정성에 따라 3 개월 이상, 4 ° C에서 동작 하는 0.015% 챕 (PBSC)를 포함 하는 PBS 버퍼에 저장할 수 있습니다.
	<ol><li>전송 110 µ L (충분히 20 샘플을 측정 하 고 6-포인트 표준 곡선을 만들기 위한) 구슬 슬러리의 1.5 mL 튜브에. 구슬 7 번의 25% 이기/PBSC, 1 mL와 함께 세 번 PBSC의 1 mL 씻으십시오. 마그네틱 스탠드를 사용 하 여 작은 각 세척 단계 사이 구슬. 후에 마지막 워시 워시 버퍼를 제거 
		참고: 25 %7 번 세척 이기/PBSC은 트윈-20 등 구슬 슬러리에 MS-호환 되지 않는 첨가물 제거 중요 합니다. 이 광범위 한 세척 단계 필요 하지 않을 수 있습니다 선택 된 구슬에 같은 첨가제 경우.</li>
		<li>PBSC의 110 µ L에 구슬 resuspend 및 안티 중앙의 110 µ L 추가 나 항 체 (최종 항 체 농도: 100 µ g/mL). Pipetting, 구슬 및 솔루션을 혼합 하 고 다음 1 시간, 8 rpm에 회전에 대 한 실내 온도에 그들을 품 어.</li>
		<li>구슬 PBSC의 1 mL로 3 번 세척 하 고 PBSC의 1100 µ L에서 resuspend. 
		참고: 경우 어떤 구슬 솔루션은 외피 동안 튜브의 캡으로 흘 렀 다, 스핀 2680 x g.에서 벤치탑 원심 분리기를 사용 하 여 솔루션 다운</li>
		<li>96 잘 접시 (구슬 표준 접시)에 구슬 솔루션을 수동으로 전송합니다. 자동된 액체 처리 시스템을 약 수 같은 96 잘 접시, 당 잘. 120 µ L에 구슬 사용</li></ol></li> <li>구슬에 면역-농축 <ol><li>중앙 3 h 나 생성 기간 배양 접시에 배치 후 리안 나의 세대를 종료 10 분을 위한 아이스</li>
		<li>자동으로 SIS 펩 티 드 재고 솔루션 (10 pmol/μ) 약 희석 PBS를 가진 버퍼, 그리고 자동으로 추가 약 96 잘 PCR 접시에 안정적인 isoptope 표준 펩타이드 희석 수. 외피 격판덮개의 각 음에 1.5 µ L의 안정 동위 원소 표준 (SIS) 펩 티 드 솔루션 (100 fmol 포함)을 전송 하 고 플라즈마 샘플 또는 PBS 버퍼에 CEWA와 함께 섞어.</li>
		<li>자동으로 비드 솔루션 잘 당 10 mL에 외피 격판덮개의 내용을 전송, 혼합.</li>
		<li>8 rpm에 회전 하는 동안 1 시간에 4 ° C에서 접시를 품 어.</li>
		<li>씻어 구슬 세 번 자동으로 5 m m 염화 중 탄산염 (AmBic) 솔루션, 잘 세척 당 당 100 µ L. 마지막 세척 후 5mm 각 잘에서 AmBic 솔루션의 7 µ L에 구슬 resuspend. 자석 마지막 워시 후 하단에 비즈를 사용 하 여</li>
	</ol></li></ol> 3. MALDI 표적 격판덮개 및 추가 매트릭스 솔루션에 구슬의 전송 <li>2600의 점 크기를 자동으로 MALDI 표적 격판덮개에 구슬 슬러리의 전송 7 µ L <ol>µ m. 구슬 밖으로 건조 하자. 
	참고: 작은 USB 전원 팬 비드 건조 과정을 가속 화 하기 위해 사용할 수 있습니다.</li>
	<li>자동으로 α-cyano-4-hydroxycinnamic 산 (HCCA)의 2 µ L 추가-각 샘플 대상 접시에 자리에 잘 매트릭스 매트릭스 솔루션 (3 mg/mL HCCA, 1.8 mg/mL 암모늄 시트르산, 70% 이기, 그리고 0.1 %trifluoroacetic 산 포함) .</li>
</ol> 4. MALDI TOF MS 및 데이터 분석에 의해 인수 신호 긍정적인 반사 모드를 사용 하 여 MALDI TOF 악기와 <ol><li>분석 샘플 명소. 내부 교정, 데이터 스무 딩, 및 공급 업체 특정 소프트웨어와 함께 자동으로 초기 빼기 수행. 
	참고: (긍정/부정, 선형/반사판) 선택한 모드 MALDI TOF 측정 대상 펩 티 드 또는 단백질에 따라.</li>
	<li>상대 응답 비율 (Nat/SIS 강도 비율)를 계산 하 고 각 샘플의 농도 중앙의 결정 하기 위해 표준 곡선에 그것을 비교. PRA 어디 방정식 (1)를 사용 하 여 계산 δ t 중앙 난 세대 중앙 I.의 생성에 사용 된 시간을 나타냅니다 
	PRA = [중앙 난] / δ t 중앙 난 세대 (1)</li></ol>

<ol><li>Aebersold, R., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based proteomics.</a> Nature. 422 (6928), 198-207 (2003).</li>
<li>Nicol, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+an+Immunoaffinity-Mass+Spectrometry-based+Approach+for+the+Quantification+of+Protein+Biomarkers+from+Serum+Samples+of+Lung+Cancer+Patients%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Use of an Immunoaffinity-Mass Spectrometry-based Approach for the Quantification of Protein Biomarkers from Serum Samples of Lung Cancer Patients.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 7 (10), 1974-1982 (2008).</li>
<li>Webster, J., Oxley, D. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWebster%2C+J+%22Chemical+Genomics+and+Proteomics%3A+Reviews+and+Protocols%22">Chemical Genomics and Proteomics: Reviews and Protocols</a>. Zanders, E. D. , Humana Press. 227-240 (2012).</li>
<li>Yergey, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((De+novo+sequencing+of+peptides+using+MALDI%2FTOF-TOF%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">De novo sequencing of peptides using MALDI/TOF-TOF.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 13 (7), 784-791 (2002).</li>
<li>Anderson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Six+decades+searching+for+meaning+in+the+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Six decades searching for meaning in the proteome.</a> J. Proteomics. 107, 24-30 (2014).</li>
<li>Landegren, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opportunities+for+Sensitive+Plasma+Proteome+Analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Opportunities for Sensitive Plasma Proteome Analysis.</a> Anal. Chem. 84 (4), 1824-1830 (2012).</li>
<li>Guo, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunoaffinity+Enrichment+and+Mass+Spectrometry+Analysis+of+Protein+Methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunoaffinity Enrichment and Mass Spectrometry Analysis of Protein Methylation.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 13 (1), 372-387 (2014).</li>
<li>Florentinus-Mefailoski, A., Soosaipillai, A., Dufresne, J., Diamandis, E. P., Marshall, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enzyme-linked+immuno-mass+spectrometric+assay+with+the+substrate+adenosine+monophosphate%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Bioanal.+Chem%22%5BJournal%5D)">An enzyme-linked immuno-mass spectrometric assay with the substrate adenosine monophosphate.</a> Anal. Bioanal. Chem. 407 (4), 1119-1130 (2015).</li>
<li>Fredolini, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunocapture+strategies+in+translational+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Immunocapture strategies in translational proteomics.</a> Expert Rev Proteomics. 13 (1), 83-98 (2016).</li>
<li>Tran, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+Affinity+Capture+and+On-Tip+Digestion+to+Accurately+Quantitate+in+Vivo+Deamidation+of+Therapeutic+Antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">Automated Affinity Capture and On-Tip Digestion to Accurately Quantitate in Vivo Deamidation of Therapeutic Antibodies.</a> Anal. Chem. , (2016).</li>
<li>Razavi, M., Leigh Anderson, N., Pope, M. E., Yip, R., Pearson, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+precision+quantification+of+human+plasma+proteins+using+the+automated+SISCAPA+Immuno-MS+workflow%5BTitle%5D)+AND+%22N.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">High precision quantification of human plasma proteins using the automated SISCAPA Immuno-MS workflow.</a> N. Biotechnol. 33 (5 Part A), 494-502 (2016).</li>
<li>Razavi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+SISCAPA+Quantitation+of+Peptides+from+Human+Plasma+Digests+by+Ultrafast%2C+Liquid+Chromatography-Free+Mass+Spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">High-Throughput SISCAPA Quantitation of Peptides from Human Plasma Digests by Ultrafast, Liquid Chromatography-Free Mass Spectrometry.</a> J. Proteome Res. 11 (12), 5642-5649 (2012).</li>
<li>Anderson, N. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SISCAPA+Peptide+Enrichment+on+Magnetic+Beads+Using+an+In-line+Bead+Trap+Device%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+%26+Cell.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">SISCAPA Peptide Enrichment on Magnetic Beads Using an In-line Bead Trap Device.</a> Mol. & Cell. Proteomics. 8 (5), 995-1005 (2009).</li>
<li>Parker, C. E., Pearson, T. W., Anderson, N. L., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass-spectrometry-based+clinical+proteomics+-+a+review+and+prospective%5BTitle%5D)+AND+%22The+Analyst%22%5BJournal%5D)">Mass-spectrometry-based clinical proteomics - a review and prospective.</a> The Analyst. 135 (8), 1830-1838 (2010).</li>
<li>Reid, J. D., Holmes, D. T., Mason, D. R., Shah, B., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+the+Development+of+an+Immuno+MALDI+%28iMALDI%29+Mass+Spectrometry+Assay+for+the+Diagnosis+of+Hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Soc.+Mass+Spectrom%22%5BJournal%5D)">Towards the Development of an Immuno MALDI (iMALDI) Mass Spectrometry Assay for the Diagnosis of Hypertension.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 21 (10), 1680-1686 (2010).</li>
<li>Mason, D. R., Reid, J. D., Camenzind, A. G., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Duplexed+iMALDI+for+the+detection+of+angiotensin+I+and+angiotensin+II%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Duplexed iMALDI for the detection of angiotensin I and angiotensin II.</a> Methods. 56 (2), 213-222 (2012).</li>
<li>Camenzind, A. G., vander Gugten, J. G., Popp, R., Holmes, D. T., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+evaluation+of+an+immuno-MALDI+%28iMALDI%29+assay+for+angiotensin+I+and+the+diagnosis+of+secondary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Clin.+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Development and evaluation of an immuno-MALDI (iMALDI) assay for angiotensin I and the diagnosis of secondary hypertension.</a> Clin. Proteomics. 10 (1), 20(2013).</li>
<li>Jiang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+immuno+tandem+mass+spectrometry+%28iMALDI%29+assay+for+EGFR+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics+Clin+Appl%22%5BJournal%5D)">Development of an immuno tandem mass spectrometry (iMALDI) assay for EGFR diagnosis.</a> Proteomics Clin Appl. 1, (2007).</li>
<li>Jiang, J., Parker, C. E., Fuller, J. R., Kawula, T. H., Borchers, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Immunoaffinity+Tandem+Mass+Spectrometry+%28iMALDI%29+assay+for+Detection+of+Francisella+tularensis%5BTitle%5D)+AND+%22Analytica+chimica+acta%22%5BJournal%5D)">An Immunoaffinity Tandem Mass Spectrometry (iMALDI) assay for Detection of Francisella tularensis.</a> Analytica chimica acta. 605 (1), 70-79 (2007).</li>
<li>Popp, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+automated+assay+for+the+clinical+measurement+of+plasma+renin+activity+by+immuno-MALDI+%28iMALDI%29%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">An automated assay for the clinical measurement of plasma renin activity by immuno-MALDI (iMALDI).</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1854 (6), 547-558 (2015).</li>
<li>Schoenherr, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Automated+screening+of+monoclonal+antibodies+for+SISCAPA+assays+using+a+magnetic+bead+processor+and+liquid+chromatography-selected+reaction+monitoring-mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Automated screening of monoclonal antibodies for SISCAPA assays using a magnetic bead processor and liquid chromatography-selected reaction monitoring-mass spectrometry.</a> J Immunol Methods. 353 (1-2), 49-61 (2010).</li>
<li>Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. US patent. , US 7846748 B2 (2010).</li>
<li>Borchers, C. H. Methods of quantitation and identification of peptides and proteins. Canadian patent CA. , CA 2507864 C (2011).</li>
<li>Weiß, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Catch+and+measure-mass+spectrometry-based+immunoassays+in+biomarker+research%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta+%28BBA%29+-+Proteins+and+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Catch and measure-mass spectrometry-based immunoassays in biomarker research.</a> Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics. 1844 (5), 927-932 (2014).</li>
<li>Nelson, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibody+fragments%3A+Hope+and+hype%5BTitle%5D)+AND+%22mAbs%22%5BJournal%5D)">Antibody fragments: Hope and hype.</a> mAbs. 2 (1), 77-83 (2010).</li>
<li>Gupta, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evaluation+of+an+aptamer+for+use+as+an+affinity+reagent+with+MS%3A+PCSK9+as+an+example+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">An evaluation of an aptamer for use as an affinity reagent with MS: PCSK9 as an example protein.</a> Bioanalysis. 8 (15), 1557-1564 (2016).</li>
</ol>

C.H.B은 iMALDI 기술에 특허를 보유 하고있다.

기존의 MS 기반 단백질 정량화에 비해, iMALDI는 analytes 풍부 하 고 따라서 단백질 또는 펩 티 드 낮은 농도에서 정할 수 있도록 복잡 한 샘플에서 그들을 정화 하 항 체를 사용 합니다. IMALDI 프로토콜에 중요 한 단계는 대상 펩 티 드의 면역 농축입니다. 이 목적에 대 한 선호도와 높은 특이성 항 체를 선택 합니다. SISCAPA에서 그것은 10-9 M 또는 더 나은에서 항 체 친 화력 낮은 ng/mL21에서 높은 감도 달성 하기 위해 필요한 것 보고 되었습니다. 또한, 높은 항 체 바인딩 용량 구슬 최적의 농축에 대 한 선호 됩니다.
그것은 또한 최소한의 배경 수준 대상 분자에 대 한 비교적 "깨끗 한" 스펙트럼을 생성 하는 것이 중요입니다. 높은 신호 대 잡음 비율 면역 농축 단계 후에 세척 하는 광범위 한 구슬을 통해 얻을 수 있습니다. 또한, 우리 후 추가 및 매트릭스 솔루션 건조 잡음 신호를 크게 줄일 수 있으며 따라서 신호 대 노이즈 비율을 개선 대상에 구슬 명소를 세척 하는 것을 발견 했다.
이 작품에서 iMALDI PRA 분석 결과 베이스 단계를 필요 하지 않습니다 대상 분자 중앙으로 나 펩 티 드 이다. 샘플에서 단백질 분자를 계량, 단백질 포함 하는 epitope 펩 티 드, 대 한 소화 캡처된 단백질22,23에 수행할 수 있지만 일반적으로 펩 티 드 면역-농축, 앞으로 소화 된다. 이 경우에 기존 단백질 소화 프로토콜 iMALDI 작업 흐름에 쉽게 삽입할 수 있습니다.  소화 버퍼에 따라 염 단계 필요할 수 있습니다 전에 구슬에 펩 티 드의 항 체 펩 티 드 바인딩 간섭을 유발 하지 않도록.
다른 면역 MS 메서드와 마찬가지로, 안티 펩 티 드 항 체의 생산 iMALDI 분석 실험의 발달에 있는 주요 도전 이다. 최근, 트리플 X Proteomics 기술 선호도 바인더 바인더24당 여러 개의 펩 티 드를 대상 수를 생산 하기 위해 개발 되었습니다. 이 안티 펩 티 드 항 체의 비용을 줄일 수 있습니다 그리고 단일 외피를 사용 하 여 동시 다중화 분석 실험의 발달을 촉진 것입니다. 또한, 항 체 파편25 또는 합성 aptamers26 그대로 항 체의 사용에 대안 일 수 있고 쉽게 생산의 이점을 있는 것. 합성 aptamers 선호도 농축26사용 하면 그대로 항 체 보다 낮은 배경 수준을 보여주는으로 보고 되었습니다.
iMALDI 기술 MALDI 질량 분석, 높은 감도와 특이성 복잡 한 샘플의 많은 수에 있는 급속 한, 높은 처리량 단백질/펩타이드 분석 활성화 immunoassays의 장점을 결합 합니다. 다른 면역 MS 방법과 달리 면역-캡처, 펩 티 드가 하지 eluted 튜브, 대상 하지만 운반 analytes MS-분석, MALDI 표적 격판덮개에 전송 됩니다 구슬 따라서 피하 플라스틱 그들의 흡착으로 인해 펩 티 드의 손실 튜브입니다. 서쪽 오 점 또는 ELISA 등 널리 proteomic 도구에 비해, 하나의 항 체 분석 결과 개발 시간 및 비용을 크게 줄이는 iMALDI 필요 합니다. 우리 프라 분석 결과에서 얻은 탐지의 하한값은 기존의 ELISA, 하 고 생리 적 범위 내에서 잘. 항 체와 질량-전 비 이중 선정 과정, 분석 결과의 높은 특이성을 보장을 제공 합니다. IMALDI의 안으로 분석에 국한 되지 않습니다 하지만 단백질 식의 정량 및 복잡 한 견본에서 단백질 수정도 정량화에 적용할 수 있습니다. 특히, 자동된 높은 처리량 iMALDI 검색 및 다양 한 질병, 세균에 대 한 클리닉에서 현재 사용 되는 벤치탑 MALDI 계기의 존재 때문에 단백질 바이오 마커의 유효성 검사에 대 한 강력한 임상 도구 수 있습니다. 합니다.

질량 분석 양적 proteomics에 불가 결 한 도구가 되고있다. 질량 분석 대상 단백질 또는 펩 티 드의 질량을 확인할 수 있습니다, 그리고 따라서 취득된 분석 신호 수 있습니다 매우 구체적인 immunoassays에 비해. 2 개의 이온화 방법, 분무 및 MALDI, 가장 일반적으로 단백질 및 펩 티 드1,2,,34를 탐지 하는 데 사용 됩니다. MS 기반 단백질 정량화의 주요 과제는 높은 풍부한 단백질의 ng/mL 또는 pg/mL 농도에서 복잡 한 샘플에 낮은 풍부한 단백질의 검출에 거짓말 그리고 인간 플라스마에서 발견 많은 후보 단백질 바이오 마커 내이 범위5. 이 문제는 대부분 본질적으로 넓은 동적 범위와 인간 프로테옴6의 복잡성에 의해 발생 됩니다.
극복 하기 위해 이러한 탐지 과제, 면역 MS 방법은 대상 단백질 또는 펩 티 드 고체 표면에 샘플 솔루션에서 풍부 하 게 개발 되었다 뒤에 analytes과 MS 측정7,8 의 차입 , 9 , 10. 면역 강화 통해는 analytes 복잡 한 샘플에서 순화 된다 그리고 다른 분자에서 이온 억제 효과 최소화 하는 따라서. 다양 한 고체 지원 중 자석 구슬은 현재 가장 널리 사용으로 높은 항 체 바인딩 용량의 장점 및 취급의 용이성. 마그네틱 구슬 다른 functionalizations와 크기를 개발 하 고 immunoprecipitation 실험에 대 한 상용화 되었습니다. 날짜 하려면, immuno-농축 구슬에는 되었습니다 인터페이싱 분무 이온화 (ESI)과 MALDI MS 단백질 및 펩 티 드 측정에 대 한. 안정 동위 원소 표준 및 안티 펩 티 드 항 체 (SISCAPA) 기술에 의해 캡처, 샘플에서 단백질 소화는, 면역 강화에 대 한 항 체 코팅 구슬 부 화 뒤. "클래식" SISCAPA에서 캡처된 proteotypic 펩 티 드, 구슬에서 eluted 있으며 측정 하 여 액체 착 색 인쇄기-ESI-석사 (LC-석사), 또는 직접적인 주입 ESI-다중 반응 모니터링-석사 (ESI-MRM-석사)11,12. 면역-농축 향상 MRM 분석 결과 감도 3-4 배나 낮은 ng/mL 범위13도달.
분무 MS에 비해, MALDI MS 빠릅니다, 그리고 포함 하지 않는 청소 및 LC 열의 재 평형 carryover 및 오염 문제가 없습니다 그래서 높은 처리량 연구14를 위해 더 적당 한 만들기. 와 결합 하 여 면역-농축 MALDI MS 펩 티 드와 단백질 (proteotypic 펩 티 드의 정량 기준)의 과민 하 고 특정 정량화에 대 한 우리의 실험실에서 면역 MALDI 기술 개발 되었습니다15,16 ,17. 면역-농축 후 구슬 MALDI 표적 격판덮개에 예금 하 고 매트릭스 솔루션 구슬에 추가 하 고 접시 건조 후 MALDI TOF MS 분석에 대 한 준비가 되어. 구슬에서 펩 티 드의 차입 별도 단계로 수행 되지 않습니다 하지만 선호도 바인딩된 analytes는 eluted MALDI 매트릭스 솔루션에 의해 비드 관광 명소, 그로 인하여 시료 준비를 단순화 하 고 샘플 손실 최소화에 추가 되 면. IMALDI 기술 다양 한 애플 리 케이 션18,19에 적용 된 및 최근에 자동화 되었으며 안 측정에 사용 되 나 (중앙 난) 플라즈마 renin 활동 (PRA)20결정. 이 프로토콜은 자동된 iMALDI 분석 결과 수행 하는 데 사용 하는 절차를 시연할 예정 이다. 예를 들어, 10% 미만의 간 날 CVs 프라 분석 결과 복용 하루20당 744 샘플 측정 기능으로 자동화를 통해 달성 되었습니다.
이 원고에서 iMALDI PRA 분석 결과 대상 분자로 단백질 소화를 요구 하지 않는다 (중앙 나) 1295.7 Da의 분자 무게 펩 티 드 이다. 다른 분석 실험 단백질 소화 필요 하 고 펩 티 드 그대로 단백질 대리로 사용 되에서 iMALDI에 대 한 선택 된 펩타이드 독특하고 800 다 그래서 그는 c에서 쉽게 구별 될 수 있다 이상의 질량을 가진 대상 단백질에 특정 해야 MALDI 매트릭스 솔루션에서 hemical 잡음입니다. 안티 펩 티 드 항 체는 면역 강화는 펩 티 드에 대 한 필요 합니다. PRA를 측정 하는 iMALDI 분석 결과 대 한 프로토콜 4 단계로 구성: 1) 중앙의 세대 나 인간의 플라즈마; 2) 중앙의 면역-농축 항 체 코팅 구슬;를 사용 하 여 나 3) 이전 비즈는 MALDI 표적 격판덮개 추가 매트릭스 솔루션; 그리고 4) MALDI TOF MS 및 데이터 분석20수집을 신호.

<table><tbody><tr><td>Healthy control human plasma</td><td>Bioreclamation</td><td>HMPLEDTA2</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium bicarbonate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09830</td><td></td></tr><tr><td>Ammonium citrate dibasic</td><td>Sigma Aldrich</td><td>09833</td><td></td></tr><tr><td>CHAPS (&gt;=98%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C9426</td><td></td></tr><tr><td>Albumin from chicken egg white (&gt;98%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A5503</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>EDS</td><td></td></tr><tr><td>Alpha-cyano-4-hydroxycinnamic acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>70990</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate buffered saline</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4417</td><td></td></tr><tr><td>Phenylmethanesulfonyl fluoride</td><td>Sigma Aldrich</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>85172</td><td>LC-MS grade</td></tr><tr><td>acetonitrile</td><td>Fluka</td><td>34967</td><td>LC-MS grade</td></tr><tr><td>water</td><td>Fluka</td><td>39253</td><td>LC-MS grade</td></tr><tr><td>acetic acid</td><td>Fluka</td><td>320099</td><td>LC-MS grade</td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Roche Diagnostics</td><td>3118169001</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads Protein G magnetic beads</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10003D</td><td>2.8 &lt;span class=&quot;font5&quot;&gt;&amp;mu;m, 30 mg/mL&lt;/span&gt;</td></tr><tr><td>anti-Ang I goat polyclonal antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7419</td><td></td></tr><tr><td>Nat and SIS Ang I</td><td>synthesized at the University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automated liquid handling system</td><td>Agilent</td><td>16050-102</td><td>Agilent Bravo robotic workstation</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td>Invitrogen DynaMag-2 magnet</td></tr><tr><td>Tube rotator</td><td>Theromo Scientific</td><td>400110Q</td><td>Labquake Tube Rotator</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12027</td><td>DynaMag-96 side skirted magnet</td></tr><tr><td>Magnet</td><td>VP Scientific</td><td>771RM-1</td><td>used to pull the beads to the bottom of the well</td></tr><tr><td>MALDI-TOF</td><td>Bruker</td><td></td><td>Bruker Microflex LRF instrument</td></tr></tbody></table>

peptide and protein quantification using automated immuno-maldi (imaldi)

질량 분석 (MS)는 각 대상 분자의 질량 대 전 비의 직접적인 탐지 결과로 우수한 시험으로 복잡 한 견본에서 단백질을 측정에 대 한 가장 일반적으로 사용 되는 기술 중 하나입니다. 그러나, 대부분의 다른 분석 기법 처럼 MS 기반 proteomics, 높은 풍부 analytes 측정으로 편견을가지고, 그래서 그것을 달성 하기 위해 도전 검색 낮은 ng/mL의 제한 또는 복잡 한 예제 및 이것에서 pg/mL은 많은 농도 범위 biofluids 인간 플라스마 등에서 질병 관련 단백질. 낮은 풍부한 analytes의 검색에서을 돕기 위해, 면역 강화에 집중 하 고 순화 MS 측정, 시험 감도 크게 향상 하기 전에 분석 분석 결과 통합 되었습니다. 이 작품에서는, 면역 Matrix-Assisted 레이저 탈 착/이온화 (iMALDI) 기술은 단백질과 펩 티 드 biofluids에의 정량화에 대 한 제시, 구슬에 면역-농축에 따라, 사전 차입 없이 MALDI MS 측정 뒤. 안티 펩 티 드 항 체는 자성 구슬에 기능성 고 샘플 incubated. 세척, 구슬 MALDI 표적 격판덮개에 직접 전송 됩니다 후 신호 매트릭스 솔루션 구슬에 적용 된 후 MALDI 시간의 비행 (TOF MALDI) 악기에 의해 측정 됩니다. 샘플 준비 절차는 다른 면역 MS 분석 실험에 비해 간소화 하 고 MALDI 측정은 빠르다. 전체 샘플 준비 향상 된 분석 결과 재현성 및 높은 처리량 처리 시스템, 액체 자동입니다. 이 문서에서는, iMALDI 분석 결과 펩 티 드 안을 결정 하는 데 사용 되 나 (중앙 나) 기본 aldosteronism (PA)의 심사에 대 한 플라즈마 renin 활동의 판독으로 임상으로 사용 되는 플라즈마에 농도.

중앙을 측정 하기 위한 자동화 된 iMALDI 절차 나 그림 1에 표시 됩니다. 대상 펩 티 드 (내 인 성 펩 티 드 또는 소화 단백질에서 펩 티 드) 안티 펩 티 드 자석 구슬에 풍성 하 게 하 고 구슬 MALDI 측정 대상 접시에 전송 됩니다. 전체 프로시저 추가 펩타이드 차입 단계를 필요로 하는 다른 면역-MS 기술에 비해 간단 합니다. IMALDI 분석 결과의 자동화와 10 20아래 편차 (CV)의 간 날 계수 샘플의 많은 수의 높은 처리량 분석 할 수 있습니다. 중앙을 측정 하 여 얻은 대표적인 스펙트럼 인간의 플라즈마 샘플에 난 그림 2에 표시 됩니다. SIS 펩 티 드는 펩 티 드 정량에 대 한 내부 표준으로 작동합니다. 프라 프라 값 임상 LC-MS/MS 절차17 를 사용 하 여 자동된 iMALDI 분석 결과 얻은 188 환자 샘플 값의 상관 관계는 그림 3에 표시 됩니다. 두 가지 방법을 0.98;의 상관 계수 슬로프의 차이 두 가지 방법에서 다른 내부 표준의 사용에 의해 또는 iMALDI 절차20에서 다른 항 체를 사용 하 여 원인일 수 있습니다. 분석 결과 및 분석 결과 정밀 선형 범위는 그림 4 및 그림 5에 나와 있습니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55933/55933fig1.jpg"> 
그림 1: 자동된 iMALDI PRA 분석 결과의 프로세스 흐름 회로도. 참조20, 허가 적응. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55933/55933fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55933/55933fig2.jpg"> 
그림 2: NAT 및 SIS 중앙의 대표적인 스펙트럼 나 인간의 플라즈마 샘플에서 측정 된 펩 티 드.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55933/55933fig3.jpg"> 
그림 3: 프라의 상관 관계 값은 188 환자 샘플에서 iMALDI와 LC-MS/MS 측정. 참조20, 허가 적응.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55933/55933fig4.jpg"> 
그림 4: 반사 체 (A)와 (B) 선형 모드 iMALDI PRA 분석 결과의 선형 범위. 참조20,. 동의에서 적응 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55933/55933fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55933/55933fig5.jpg"> 
그림 5: 장 중 정밀 (A) 고 프라 값이 낮은, 중간, 및 높은 플라즈마 풀 iMALDI PRA 분석 실험의 interday 정밀 (B). 참조20, 허가 적응. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/55933/55933fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI

자동된 면역-MALDI (iMALDI) 기술을 사용 하 여 복잡 한 생물 학적 체액에서 단백질 정량화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

펩 티 드 및 단백질 정량화를 사용 하 여 자동 면역-MALDI (iMALDI)

Mass spectrometry (MS) is one of the most commonly used technologies for quantifying proteins in complex samples, with excellent assay specificity as a ...

peptide-and-protein-quantification-using-automated-immuno-maldi-imaldi

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Chemistry

Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI (iMALDI)

7.9K 조회수.  University of Victoria-Genome BC Proteomics Centre. 자동된 면역-MALDI (iMALDI) 기술을 사용 하 여 복잡 한 생물 학적 체액에서 단백질 정량화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

비디오: Peptide and Protein Quantification Using Automated Immuno-MALDI iMALDI

Quantitative Proteomics Using Reductive Dimethylation for Stable Isotope Labeling

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between samples using mass spectrometry. ReDi labeling is performed using either regular (light) or deuterated (heavy) forms of formaldehyde and sodium cyanoborohydride to add two methyl groups to each free amine. Here we demonstrate a robust protocol for ReDi labeling and quantitative comparison of complex protein mixtures. Protein samples for comparison are digested into peptides, labeled to carry either light or heavy methyl tags, mixed, and co-analyzed by LC-MS/MS. Relative protein abundances are quantified by comparing the ion chromatogram peak areas of heavy and light labeled versions of the constituent peptide extracted from the full MS spectra. The method described here includes sample preparation by reversed-phase solid phase extraction, on-column ReDi labeling of peptides, peptide fractionation by basic pH reversed-phase (BPRP) chromatography, and StageTip peptide purification. We discuss advantages and limitations of ReDi labeling with respect to other methods for stable isotope incorporation. We highlight novel applications using ReDi labeling as a fast, inexpensive, and accurate method to compare protein abundances in nearly any type of sample.

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a rapid, inexpensive strategy for accurate mass spectrometry-based quantitative proteomics. Here we demonstrate a robust method for preparation and analysis of protein mixtures using the ReDi approach that can be applied to nearly any sample type.

안정 동위 원소 라벨링 환원성 디메틸 화를 사용하여 정량 프로테오믹스

Stable isotope labeling of peptides by reductive dimethylation (ReDi labeling) is a method to accurately quantify protein expression differences between ...

연구

화학

Low Molecular Weight Protein Enrichment on Mesoporous Silica Thin Films for Biomarker Discovery

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the monitoring of therapeutic efficiency.1-3 The circulating low molecular weight proteome (LMWP) composed of small proteins shed from tissues and cells or peptide fragments derived from the proteolytic degradation of larger proteins, has been associated with the pathological condition in patients and likely reflects the state of disease.4,5 Despite these potential clinical applications, the use of Mass Spectrometry (MS) to profile the LMWP from biological fluids has proven to be very challenging due to the large dynamic range of protein and peptide concentrations in serum.6 Without sample pre-treatment, some of the more highly abundant proteins obscure the detection of low-abundance species in serum/plasma. Current proteomic-based approaches, such as two-dimensional polyacrylamide gel-electrophoresis (2D-PAGE) and shotgun proteomics methods are labor-intensive, low throughput and offer limited suitability for clinical applications.7-9 Therefore, a more effective strategy is needed to isolate LMWP from blood and allow the high throughput screening of clinical samples. 
Here, we present a fast, efficient and reliable multi-fractionation system based on mesoporous silica chips to specifically target and enrich LMWP.10,11 Mesoporous silica (MPS) thin films with tunable features at the nanoscale were fabricated using the triblock copolymer template pathway. Using different polymer templates and polymer concentrations in the precursor solution, various pore size distributions, pore structures, connectivity and surface properties were determined and applied for selective recovery of low mass proteins. The selective parsing of the enriched peptides into different subclasses according to their physicochemical properties will enhance the efficiency of recovery and detection of low abundance species. In combination with mass spectrometry and statistic analysis, we demonstrated the correlation between the nanophase characteristics of the mesoporous silica thin films and the specificity and efficacy of low mass proteome harvesting. The results presented herein reveal the potential of the nanotechnology-based technology to provide a powerful alternative to conventional methods for LMWP harvesting from complex biological fluids. Because of the ability to tune the material properties, the capability for low-cost production, the simplicity and rapidity of sample collection, and the greatly reduced sample requirements for analysis, this novel nanotechnology will substantially impact the field of proteomic biomarker research and clinical proteomic assessment.

We developed a technology based on mesoporous silica thin film for the selective recovery of low molecular weight proteins and peptides from human serum. The physico-chemical properties of our mesoporous chips were finely tuned to provide substantial control in peptide enrichment and consequently profile the serum proteome for diagnostic purposes.

Biomarker 디스커버리를위한 Mesoporous 실리카 박막의 낮은 분자량의 단백질 농축

The identification of circulating biomarkers holds great potential for non invasive approaches in early diagnosis and prognosis, as well as for the ...

생체공학

Optimal Preparation of Formalin Fixed Samples for Peptide Based Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry Imaging Workflows

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host of biomolecules from drugs and lipids to N-glycans. Although various sample preparation techniques exist, detecting peptides from formaldehyde preserved tissues remains one of the most difficult challenges for this type of mass spectrometric analysis. For this reason, we have created and optimized a robust methodology that preserves the spatial information contained within the sample, while eliciting the greatest number of ionizable peptides. We have also aimed to achieve this in a cost effective and simple way, thereby eliminating potential bias or preparation error, which can occur when using automated instrumentation. The end result is a reproducible and inexpensive protocol.

This protocol describes a reproducible and reliable method for the sublimation-based preparation of formalin fixed tissue destined for imaging mass spectrometry.

펩타이드 기반 매트릭스 샘플을 고정 하는 포 르 말린의 최적의 준비 지원 레이저 탈 착/이온화 질량 분석 이미징 워크플로

The use of matrix-assisted laser desorption/ionization, mass spectrometry imaging (MALDI MSI) has rapidly expanded, since this technique analyzes a host ...

생화학

MALDI Imaging Mass Spectrometry of Neuropeptides in Parkinson's Disease

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 (Fig.1). A 12 &mu;m thin tissue section is covered with a MALDI matrix, which facilitates desorption and ionization of intact peptides and proteins that can be detected with a mass analyzer, typically using a MALDI TOF/TOF mass spectrometer. Generally hundreds of peaks can be assessed in a single rat brain tissue section. In contrast to commonly used imaging techniques, this approach does not require prior knowledge of the molecules of interest and allows for unsupervised and comprehensive analysis of multiple molecular species while maintaining high molecular specificity and sensitivity2. Here we describe a MALDI IMS based approach for elucidating region-specific distribution profiles of neuropeptides in the rat brain of an animal model Parkinson's disease (PD). 
PD is a common neurodegenerative disease with a prevalence of 1% for people over 65 of age3,4. The most common symptomatic treatment is based on dopamine replacement using L-DOPA5. However this is accompanied by severe side effects including involuntary abnormal movements, termed L-DOPA-induced dyskinesias (LID)1,3,6. One of the most prominent molecular change in LID is an upregulation of the opioid precursor prodynorphin mRNA7. The dynorphin peptides modulate neurotransmission in brain areas that are essentially involved in movement control7,8. However, to date the exact opioid peptides that originate from processing of the neuropeptide precursor have not been characterized. Therefore, we utilized MALDI IMS in an animal model of experimental Parkinson's disease and L-DOPA induced dyskinesia. 
MALDI imaging mass spectrometry proved to be particularly advantageous with respect to neuropeptide characterization, since commonly used antibody based approaches targets known peptide sequences and previously observed post-translational modifications. By contrast MALDI IMS can unravel novel peptide processing products and thus reveal new molecular mechanisms of neuropeptide modulation of neuronal transmission. While the absolute amount of neuropeptides cannot be determined by MALDI IMS, the relative abundance of peptide ions can be delineated from the mass spectra, giving insights about changing levels in health and disease. In the examples presented here, the peak intensities of dynorphin B, alpha-neoendorphin and substance P were found to be significantly increased in the dorsolateral, but not the dorsomedial, striatum of animals with severe dyskinesia involving facial, trunk and orolingual muscles (Fig. 5). Furthermore, MALDI IMS revealed a correlation between dyskinesia severity and levels of des-tyrosine alpha-neoendorphin, representing a previously unknown mechanism of functional inactivation of dynorphins in the striatum as the removal of N-terminal tyrosine reduces the dynorphin's opioid-receptor binding capacity9. This is the first study on neuropeptide characterization in LID using MALDI IMS and the results highlight the potential of the technique for application in all fields of biomedical research.

Dopamine replacement pharmacotherapy using L-DOPA is the most commonly used symptomatic treatment of Parkinson&#x2019;s disease, but is accompanied by side effects including involuntary abnormal movements, termed dyskinesia 1. Here, a protocol for MALDI imaging mass spectrometry is presented that detects changes in rat brain neuropeptide levels related to dyskinesia.

파킨슨병의 Neuropeptides의 든 이미징 질량 분광법

MALDI imaging mass spectrometry (IMS) is a powerful approach that facilitates the spatial analysis of molecular species in biological tissue samples2 ...

의학

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging (cPILOT)

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of multiplexing up to 22 or 24 samples with tandem mass tags or isobaric N,N-dimethyl leucine isobaric tags, respectively, in a single experiment. This enhanced sample multiplexing considerably reduces mass spectrometry acquisition times and increases the utility of the expensive commercial isobaric reagents. However, the manual process of sample handling and pipetting steps in the strategy can be labor intensive, time consuming, and introduce sample loss and quantitative error. These limitations can be overcome through the incorporation of automation. Here we transferred the manual cPILOT protocol to an automated liquid handling device that can prepare large sample numbers (i.e., 96 samples) in parallel. Overall, automation increases feasibility and reproducibility of cPILOT and allows for broad usage by other researchers with comparable automation devices.

Automated Sample Multiplexing by using Combined Precursor Isotopic Labeling and Isobaric Tagging cPILOT

Combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) is an enhanced sample multiplexing strategy that is capable of increasing the number of samples that can be analyzed simultaneously with available isobaric tags. Incorporation of a robotic platform has greatly increased experimental throughput, reproducibility, and quantitative accuracy.

결합된 전구체 이소토픽 라벨링 및 동서성 태그(cPILOT)를 사용하여 자동화된 샘플 멀티플렉스

We have introduced a high throughput quantitative proteomics workflow, combined precursor isotopic labeling and isobaric tagging (cPILOT) capable of ...

Immunopeptidomics: Isolation of Mouse and Human MHC Class I- and II-Associated Peptides for Mass Spectrometry Analysis

Immunopeptidomics is an emerging field that fuels and guides the development of vaccines and immunotherapies. More specifically, it refers to the science of investigating the composition of peptides presented by major histocompatibility complex (MHC) class I and class II molecules using mass spectrometry (MS) technology platforms. Among all the steps in an MS-based immunopeptidomics workflow, sample preparation is critically important for capturing high-quality data of therapeutic relevance. Here, step-by-step instructions are described to isolate MHC class I and II-associated peptides by immunoaffinity purification from quality control samples, from mouse (EL4 and A20), and human (JY) cell lines more specifically. The various reagents and specific antibodies are thoroughly described to isolate MHC-associated peptides from these cell lines, including the steps to verify the beads-binding efficiency of the antibody and the elution efficiency of the MHC-peptide complexes from the beads. The protocol can be used to establish and standardize an immunopeptidomics workflow, as well as to benchmark new protocols. Moreover, the protocol represents a great starting point for any non-experts in addition to foster the intra- and inter-laboratory reproducibility of the sample preparation procedure in immunopeptidomics.

Here, we present a protocol for the purification of MHC class I and class II peptide complexes from mouse and human cell lines providing high-quality immunopeptidomics data. The protocol focuses on sample preparation using commercially available antibodies.

면역 펩티도믹스: 질량 분광분석 분석을 위한 마우스 및 인간 MHC 급 I-및 II 관련 펩타이드의 격리

Immunopeptidomics is an emerging field that fuels and guides the development of vaccines and immunotherapies. More specifically, it refers to the science ...

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and response to external stressors. Yet, the biochemical mechanisms and full complement of neuropeptides and their functional roles remain poorly understood. Characterization of these endogenous peptides is hindered by the immense diversity within this class of signaling molecules. Additionally, neuropeptides are bioactive at concentrations 100x - 1000x lower than that of neurotransmitters and are prone to enzymatic degradation after synaptic release. Mass spectrometry (MS) is a highly sensitive analytical tool that can identify, quantify, and localize analytes without comprehensive a priori knowledge. It is well-suited for globally profiling neuropeptides and aiding in the discovery of novel peptides. Due to the low abundance and high chemical diversity of this class of peptides, several sample preparation methods, MS acquisition parameters, and data analysis strategies have been adapted from proteomics techniques to allow optimal neuropeptide characterization. Here, methods are described for isolating neuropeptides from complex biological tissues for sequence characterization, quantitation, and localization using liquid chromatography (LC)-MS and matrix-assisted laser desorption/ionization (MALDI)-MS. A protocol for preparing a neuropeptide database from the blue crab, Callinectes sapidus, an organism without comprehensive genomic information, is included. These workflows can be adapted to study other classes of endogenous peptides in different species using a variety of instruments.

Multi-Faceted Mass Spectrometric Investigation of Neuropeptides in Callinectes sapidus

Mass spectrometric characterization of neuropeptides provides sequence, quantitation, and localization information. This optimized workflow is not only useful for neuropeptide studies, but also other endogenous peptides. The protocols provided here describe sample preparation, MS acquisition, MS analysis, and database generation of neuropeptides using LC-ESI-MS, MALDI-MS spotting, and MALDI-MS imaging.

Callinectes sapidus의 신경 펩티드에 대한 다각적 질량 분광 조사

Neuropeptides are signaling molecules that regulate almost all physiological and behavioral processes, such as development, reproduction, food intake, and ...

"Cell Surface Capture" Workflow for Label-Free Quantification of the Cell Surface Proteome

Over the past decade, mass spectrometry-based proteomics has enabled an in-depth characterization of biological systems across a broad array of applications. The cell surface proteome ("surfaceome") in human disease is of significant interest, as plasma membrane proteins are the primary target of most clinically approved therapeutics, as well as a key feature by which to diagnostically distinguish diseased cells from healthy tissues. However, focused characterization of membrane and surface proteins of the cell has remained challenging, primarily due to the complexity of cellular lysates, which mask proteins of interest by other high-abundance proteins. To overcome this technical barrier and accurately define the cell surface proteome of various cell types using mass spectrometry proteomics, it is necessary to enrich the cell lysate for cell surface proteins prior to analysis on the mass spectrometer. This paper presents a detailed workflow for labeling cell surface proteins from cancer cells, enriching these proteins out of the cell lysate, and subsequent sample preparation for mass spectrometry analysis.

Here, we describe a proteomics workflow for characterization of the cell surface proteome of various cell types. This workflow includes cell surface protein enrichment, subsequent sample preparation, analysis using an LC-MS/MS platform, and data processing with specialized software.

Over the past decade, mass spectrometry-based proteomics has enabled an in-depth characterization of biological systems across a broad array of ...

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.