작은 단백질 유비퀴틴에 의한 단백질의 번역 후 변형은 세포내의 많은 사건에 관여한다. 이 연구는 단백질 유비쿼터티화 분석을 위한 툴박스에 원래 추가된 것을 제시합니다. 우리는 깊은 유비쿼터티노메를 밝히기 위해 농축 기술과 질량 분광법을 사용합니다.
우리는 유비쿼터티 단백질에서 유래하는 diGly 펩티드의 분석에 몇몇 개선을 했습니다. 이들은 농축하기 전에 조질 펩티드 분획을 포함하고, Orbitrap에서 더 진보된 펩티드 단편화 설정의 적용. 전부이 유비 쿼터 티노메의 더 큰 범위 결과.
프로토콜의 여러 측면을 단어로 설명하기가 어렵습니다. 일부 주요 단계의 시각화는 다른 랩의 다른 작업자가 이러한 분석을 반복할 수 있어야 합니다. 절차는 내 실험실에서 수석 기술자 인 Karel Bezstarosti에 의해 입증될 것입니다.
실험을 위한 배양된 세포 또는 마우스 두뇌 조직을 준비하는 것으로 시작합니다. 세포와 함께 작동하는 경우, 얼음 감기의 두 밀리리터에 하나의 150 센티미터 제곱 배양 플레이트에서 세포 펠릿을 lyse, 50 0.5 %의 탈옥 나트륨 과 트리S HCL. 용액을 섭씨 95도에서 5분간 끓입니다.
그런 다음 섭씨 4도에서 10 분 동안 초음파 처리하십시오. 생체 내 마우스 뇌 조직을 사용하는 경우, 100 밀리머 트리스 HCL, 12 밀리머 나트륨 deoxycholate 및 12 밀리머 나트륨 N-lauroylsarcosinate를 포함하는 얼음 차가운 버퍼에 lyse. 섭씨 4도에서 10분 동안 용사를 음초음파 처리합니다.
그런 다음 섭씨 95도에서 5 분간 끓입니다. 다음으로, 칼로리 흡광도 BCA 단백질 분석 키트를 사용하여 총 단백질 양을 양량화하며, 이는 성공적인 diGly 펩티드 면역 침전을 위해 적어도 몇 밀리그램이어야 한다. SILAC 실험의 경우, 총 단백질 량에 따라 빛과 무거운 라벨단백질을 1 대 1 비율로 혼합한다.
섭씨 50도에서 30분 동안 5밀리몰러 DTT로 모든 단백질을 줄입니다. 그리고 그 후 어둠 속에서 15 분 동안 10 밀리마일라 요오도아세타미드로 그들을 알킬 수 있습니다. 그런 다음 Lys-C로 4 시간 동안 단백질 소화를 수행합니다.
그리고 트립신 소화는 섭씨 30도, 또는 실온에서 하룻밤. 다음 날, 샘플을 2밀리리터 Eppendorf 튜브 2개로 나누고 TFA를 소화된 시료에 0.5%의 최종 농도로 10, 000배 G에서 10분간 침전하고 제거합니다. 후속 분획을 위해 상체가 함유된 펩티드를 수집합니다.
고pH 역상 C18 크로마토그래피를 사용하여 트립틱 펩티드를 분별하십시오. 단백질 다이제스트의 대략 10 밀리그램을 위한 고정상 물질의 0.5 그램으로 채워진 빈 6 밀리리터 컬럼 카트리지를 준비합니다. 펩티드를 준비된 컬럼에 적재하고 약 10권의 0.1%TFA로 세척한 다음 10권의 물로 세척합니다.
펩티드를 10개의 컬럼 부피를 사용하여 각각 7, 13.5 및 50%의 아세토나이트를 함유하고 있습니다. 그런 다음, 모든 분수 를 litholyse. 단백질 A 아가로즈 비드 슬러리에 컨쥬게이트된 유비퀴틴 잔재 모티프 항체의 1배치는 6개의 동등한 분획으로 나뉩니다.
원고 방향에 따라 세 개의 펩티드 분획을 녹이고 이물질을 회전시합니다. 얼음에 다른 세 분획을 유지하면서 비드 슬러리에 세 분획의 슈퍼 네이트인을 추가합니다. 그리고 회전기 단위에 섭씨 4도에서 2 시간 동안 그들을 배양.
그런 다음 구슬을 회전시합니다. 상체를 신선한 구슬 배치로 옮기습니다. 그리고 나머지 세 개의 비드 슬러리 분획으로 인큐베이션을 반복합니다.
후속 글로벌 프로테오메 분석을 위해 수퍼네티어를 저장합니다. 그리고 구슬을 GFF 필터 플러그가 장착된 200 마이크로리터 파이펫 팁으로 전송합니다. 원심분리기 팁 어댑터가 장착된 1.5 밀리리터 튜브에 팁을 넣고 얼음 차가운 IAP 버퍼 200 마이크로리터로 구슬을 세 번 씻은 다음 얼음 냉간 정제수로 세 번 세척합니다.
열을 200회 G로 회전시켜 세서즈 사이에 2분간 회전하여 컬럼을 건조하게 만들지 않도록 합니다. 마지막 세척 후, 0.15%TFA의 50 마이크로리터에서 2사이클로 펩티드를 엘테. C18 단계 끝으로 펩티드를 탈염하고 진공 원심 분리로 건조시합니다.
나노플로우 LC 시스템에 결합된 민감한 질량 분광계에서 LC-MS/MS 실험을 수행합니다. 이 열은 원고의 지시에 따라 설정되어 섭씨 50도에 유지됩니다. 데이터 종속 획득 모드에서 질량 분광계를 작동합니다.
4E5의 자동 게인 제어 대상 설정과 최대 주입 시간 50 밀리초로 MS1 질량 스펙트럼을 고해상도로 수집합니다. 총 사이클 시간이 3초인 최고 속도 방법을 사용하여 가장 강렬한 첫 번째 모드에서 질량 분광법 분석을 수행합니다. 그런 다음 낮은 풍부 펩티드의 최적의 검출을 보장합니다 가장 강렬한 첫 번째 모드에서 DDA MS 분석의 두 번째 라운드를 수행합니다.
전구체 이온을 충전 상태 및 단일화 피크 할당에 따라 필터링합니다. 그리고 이전에 심문된 전구체를 60초 동안 동적으로 제외합니다. 1.6 Thomson의 폭으로 설정된 쿼드러폴 질량 필터로 펩티드 전구체를 분리합니다.
그런 다음 최대 주입 시간 50밀리초와 HCD 충돌 에너지 30%의 자동 게인 제어에서 이온 트랩에서 MS2 스펙트럼을 수집하여 안드로메다 검색 엔진을 기반으로 자유롭게 사용할 수 있는 MaxQuant 소프트웨어 제품군과 같은 적절한 검색 엔진을 사용하여 질량 분석 원시 파일을 분석합니다. MaxQuant를 열고 적절한 원시 데이터 파일을 선택합니다. 프로세서 수를 설정하고 그룹 특정 매개 변수 탭을 클릭합니다.
소화를 선택하고 세 개의 누락된 골짜기를 허용합니다. 그런 다음 수정 사항을 선택하고 변수 수정에 diGly를 추가합니다. 전역 매개 변수 탭을 선택하고 올바른 단백질 서열 데이터베이스를 추가합니다.
다른 설정을 기본값으로 두고 데이터베이스 검색을 수행하기 위해 누릅니다. SILAC 실험 파일의 정량적 분석을 위해 복합성을 2개로 설정하고 중아미노산 라벨을 선택합니다. 검색이 완료되면 텍스트 파일을 Perseus로 가져옵니다.
이 프로토콜은 나노플로우 LC-MS/MS를 이용한 디글리 펩티드를 검출함으로써 배양된 세포 및 생체 내 물질의 단백질에서 유비쿼터티닝 부위를 식별하는 데 사용되었다. 검출된 디글리 펩티드의 수가 더 많은 기존 프로토콜에 대한 몇 가지 개선이 이루어졌다. 면역 침전 전에 3개의 분획으로 조분획을 수행했습니다.
분수 중 하나는 LC 크로마토그램의 넓은 피크를 특징으로하는 유비퀴틴의 자체 K48 변형 된 트립틱 디그 펩티드를 함유하고 있습니다. 더욱이, 펩티드 단편화 정권은 LC-MS 실행을 데이터 분석 절차에서 가장 높은 첫 번째 및 최저 제1 단편화 요법과 결합하도록 조정되었으며, 이는 4, 000 개 이상의 고유 디글리 펩티드를 생산했다. 23개 이상의, 000 디글리 펩타이드는 프로테좀 억제제로 처리된 HeLa 세포의 단일 샘플에서 일상적으로 식별될 수 있다.
3개의 생물학적 복제 스크린을 통해 확인된 모든 diGly 펩티드의, 9, 000 이상은 3개의 복제중 적어도 2개에서 존재한 반면, 3개 모두에 존재했습니다. 펩티드 식별의 수는 입력 재료의 양에 매우 우발적이다. 확인된 디글리 펩타이드의 대략적인 수는 시작 물질에 따라 예상될 수 있지만, 이러한 숫자는 추정일 뿐이며 사용되는 질량 분광계의 종류에 따라 달라집니다.
이 프로토콜을 수행할 때 질량 분석 기반 프로테오믹스 방법과 미세 샘플 양을 처리하고 분석한 이전 경험은 확실히 유리할 것입니다. MaxQuant 소프트웨어는 다른 데이터베이스 검색 알고리즘으로 대체될 수 있습니다. 또한 다른 유형의 질량 분광계가 사용될 수 있다.
펩티드 식별의 관점에서 결과는 약간 다를 수 있습니다, 그러나 이것은 어떤 질량 분광계 기지를 둔 proteomics 분석에 대 한 일반적이다. 유비퀴틴은 중재된 단백질 분해의 진행에 중요하지만, 또한 세포내의 많은 다른 프로세스에서 역할을 한다. 번역 후 수정으로 유비퀴틴에 대한 깊은 지식은 그 기능을 더 잘 이해하는 데 중요합니다.
