우리 박사 R. 하 워드 베 르 그, 도널드 댄 포트 식물 과학 센터, 그의 지도에 통합 현미경 시설의 감독 감사 하 고 도움이 confocal 현미경 검사 법. 저자는 선언에 충돌의 관심 있다.

1. 라벨 Defensins Fluorophores와의
<ol>
	<li>살아있는 세포 내부에 항균 성 속성으로 이해 및 지역화 defensin의 최소 효과가 fluorophore를 선택 합니다. 참고: 최적의 fluorophore 선택 특정 실험 목적에 따라 달라 집니다. 스펙트럼 및 화학 속성, photostability, 크기와는 fluorophore의 충전도 고려해 야 합니다.</li>
	<li>라벨 라벨 키트 상업용 공급 업체에서 제공 하는 적절 한 펩 티 드를 사용 하 여 선택한 fluorophore와 defensin. 또는, 화학적 fluorophore 표시 defensins 음성 합성. 이 연구에서는 DyLight550와 MtDef5 defensin 라벨 상업 라벨을 사용 하 여 제조 업체의 프로토콜 및 tetramethyl rhodamine (TAMRA)에 따르면 키트-화학적으로 상업적으로 합성 되었다 레이블 MtDef4 defensin. 참고: 것이 좋습니다는 fluorophore에 최소 효과 보장 하기 위해 펩 티 드의 N 또는 C 맨끝 잔류물을 연결할 수 있기 때문에 화학적 합성된 fluorophore 태그 펩 티 드 (특히에 대 한 짧은 펩 티 드 아미노산 50 이하로) 사용할 수는 항균 성 활동입니다. 3 개 이상의 이황화 채권 긴 펩 티 드의 종합 도전 이다. 이 경우에 펩 티 드 적합 한 상용 펩 티 드 라벨 키트를 사용 하 여 최적의 fluorophore와 함께 표시 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>레이블이 defensin의 생체 외에서 항균 성 활동을 테스트 하 고 조사를 곰 팡이 대 한 최소 억제 농도 (MIC)을 결정. 참고:이 연구에서 DyLight550 MtDef5 및 TMR MtDef4 마이크 Neurospora crassa Fusarium graminearum에 대 한 결정 되었다.</li>
</ol>
2. 곰 팡이 문화 및 성장 매체
<ol>
	<li>경사 관 보 글의 한 천 매체21 를 포함 하 고 5 일 동안 빛에서 실 온에서 품 어 N. crassa 주식 문화에서 conidia를 전송 합니다.</li>
	<li>5 일에 대 한 완벽 한 중간 (CM)22 28 º C에서를 포함 하는 접시에 F. graminearum PH-1 변형 문화. Conidia의 생산에 대 한 접종 F. graminearum PH 1의 5 일 오래 된 문화 4 (10 m m 직경) 플러그 carboxymethyl 셀 루 로스 (CMC) 매체 (15 g carboxymethyl 셀 루 로스, 효 모 추출 물, 0.5 g MgSO4.7 H2O, 1 g NH 1g의 50 mL에 4 아니3, 고 1 g KH2포4) 180 rpm 회전 통에 28 º C에서 4-7 일에 대 한 문화.</li>
</ol>
3. 준비의 Conidial 서 스 펜 션
<ol>
	<li>F. graminearum conidial 서 스 펜 션
	<ol>
		<li>소용돌이 F. graminearum 액체 문화 및 수집 conidia 2 mL microcentrifuge 관으로 여과 재료 (예: Miracloth)의 2 개의 층을 통해 1.5 mL 곰 팡이 문화를 필터링 하 여. 2 분 동안 microcentrifuge에 g 속도 x 13,226에서 conidial 정지 원심</li>
		<li>상쾌한, 삭제 하 고 펠 릿을 세척 살 균 물의 1 mL를 추가 합니다.</li>
		<li>원심 2 분 삭제에 대 한 microcentrifuge에 g 속도 x 13,226에서 conidial 정지는 상쾌한 고 2 X SFM (합성 균 미디어)23의 1 mL에 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>Conidia는 가벼운 현미경 hemocytometer를 사용 하 여 계산 합니다.</li>
		<li>2 X SFM 함께 105 conidia/ml conidial 서 스 펜 션을 조정 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>N. crassa conidial 서 스 펜 션
	<ol>
		<li>적은 양의 성장 문화 (5 일 이전) N. crassa 보 글의 액체 매체의 2 개 mL를 포함 하는 microcentrifuge 관을 접종 루프를 사용 하 여 전송 합니다.</li>
		<li>소용돌이 conidial 정지 하 고 새로운 microcentrifuge 관으로 여과 소재를 통해 필터.</li>
		<li>원심 2 분 삭제에 대 한 microcentrifuge에서 최대 속도로 conidial 정지는 상쾌한 고 보 글의 액체 매체의 1 mL에 conidial 펠 릿 resuspend.</li>
		<li>Conidia는 가벼운 현미경 hemocytometer를 사용 하 여 계산 합니다.</li>
		<li>보 글의 액체 매체와 105 conidia/ml conidial 서 스 펜 션을 조정 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. 샘플 준비와 Confocal 현미경 검사 법
<ol>
	<li>MtDef4 곰 팡이 세포로 defensin의 subcellular 지 방화
	<ol>
		<li>각 conidial 서 스 펜 션 (105 conidia/mL)의 50 µ L 35 m m 유리 하단 microwell 요리 10 m m microwell에 플라스틱. Conidia의 관찰, 직접 다음 단계로 또는 germlings 준비, N. crassa F. graminearum 의 피 펫 50 µ L 35mm 문화 요리에 conidia 진행이 고 실 온에서 3-6 h에 대 한 발 아 하 게.</li>
		<li>각 microwell 접시를 마이크에 붙일 레이블 defensin의 50 µ L을 추가 하 고 2.5 h에 대 한 품 어. 마이크는 fluorophore 표시 defensins 여기 사용 (1.3 단계)의 N. crassa 및 F. graminearum 3 µ M 이며 N. crassa 및 F. graminearum TMR-MtDef4의 마이크는 1 µ M 및 12 µ M, 각각.</li>
		<li>막 선택의 2 µ L 염색 FM4-64를 추가 (최종 농도: 5 µ M) 문화에 요리 하 고 30 분 동안 품 어 이미징 confocal 현미경에 즉시 탑재.</li>
		<li>화이트 빛 레이저 (WLL)을 선택 합니다. 두 개의 레이저 소스 488 nm을 사용 하 여 550 nm 각각 TMR MtDef4 그리고 FM4-64 염료를 흥분 시키기 위해. 580-700 nm에서 TMR MtDef4의 형광을 검출 하 고 690-800 nm FM4-64 염료 검출. 참고: 어두운 방에 있는 confocal 현미경 검사 법을 수행 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>MtDef5 defensin의 국제화의 시간 경과 영상
	<ol>
		<li>N. crassa F. graminearum conidial 정지 (105 conidia/mL)의 50 µ L 35 m m 유리 하단 microwell 요리 10 m m microwell로 플라스틱. 10 m m microwell 코팅 이며 하단에 제 1.5 커버 유리를 있다. Conidia의 관찰에 대 한 직접 다음 단계로 진행 합니다. Germlings의 관찰, 현미경 검사 법으로 진행 하기 전에 실 온에서 3-6 h conidia를 품 어.</li>
		<li>WLL을 켭니다. 550 레이저 라인 선택 fluorophore 표시 defensins 여기 사용 (1.3 단계) 그리고 FM4-64 1.00% 강도의 자극을 활성화 하 고 해당 감지기 nm. fluorophore 표시 defensins 여기 사용 (1.3 단계) 560-600 nm에서 검색 되었습니다 그리고 FM4-64dye 690-800 nm에서 검색 되었습니다. 참고: 높은 레이저 강도 라이브 곰 팡이 세포에 손상을 일으킬 수 있습니다 라이브 셀 이미징에 대 한 낮은 레이저 강도 사용 합니다.</li>
		<li>현미경에 microwell 접시를 탑재 합니다. 100 x로 전환 후 처음 10 x 목표를 사용 하 여 셀 찾기 / 1.44 높은 확대에 대 한 석유 목표. 참고: 스캔 모드를 설정 합니다 xyzt (Z-스택 및 시간 경과 모드의 조합), Z 위치, 줌, 이미지 캡처, 등의 주파수.</li></ol></li></ol>전에 다음 단계로 하는 절차
		<li>각 microwell 접시, 3 µ M의 마이크와 선택적 막 염료 FM4-64 (최종 농도 5 µ M)의 2 µ L에는 fluorophore 표시 defensins 여기 사용 (1.3 단계)의 50 µ L을 추가 하 고 시간 경과 영상 시작. 증발을 방지 하기 위해 microwell 요리에 젖은 필터 종이의 작은 조각을 놓으십시오. 이미지 캡처의 주파수는 3 분 30 s 그리고 총 기간 2 h 30 분 이었다. 참고: 추가 defensin 고 fluorophore 현미경에 장착 microwell 요리 관심 영역 defocus 수 있습니다 후. 따라서, 추가 defensin fluorophore는 microwell를, 후 관심 영역 필요가 refocused 수 이미지 수집 시간이 지연 될 수 있습니다.</li>
		<li>모든 confocal 이미징 confocal 현미경을 사용 하 고 어두운 방에 실 온에서 현미경을 수행.</li>

<ol>
	<li>Jones, J. D. G., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plant+immune+system.">The plant immune system.</a> Nature. 444 (7117), 323-329 (2006).</li><li>Tavormina, P., De Coninck, B., Nikonorova, N., De Smet, I., Cammue, B. P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Plant+Peptidome:+An+expanding+repertoire+of+structural+features+and+biological+functions.">The Plant Peptidome: An expanding repertoire of structural features and biological functions.</a> Plant cell. 27 (8), 2095-2118 (2015).</li><li>Van Der Weerden, N. L., Bleackley, M. R., Anderson, M. 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저자는 공개 없다.

이 연구에 붙일 레이블된 항진균 defensins 사용 하 여 신뢰할 수 있는 라이브 셀 이미징 방법론 곰 팡이 세포에 이러한 펩 티이 드의 국제화의 속도 론을 공부 하 고 그들의 subcellular 목표를 결정 하는 설명 했다. 이 방법은 일시적으로 그리고 공간 defensins와 곰 팡이 세포 사이 상호 작용의 역동성을 시각화 하는 강력한 도구입니다.
다양 한 방법은 국제화 식물 defensins 곰 팡이 세?...

식물 미생물 식물 병원 체1에 대 한 방어에 대 한 정교한 타고 난 면역 체계를 진화 했다. 그들은 수많은 유전자 인코딩 호스트 방어 펩 putative 항균 활동2익스프레스. 실제로, 많은 이러한 펩 티이 드의 항균 활동 생체 외에서3표시합니다. Defensins 식물 왕국4호스트 방어 펩 티 드의 가장 큰 그룹 중 구성 됩니다. 이 시스테인-부자, 양이온 펩 티 드 곰 팡이 대 한 강력한 성장 억제 활동 전시 및 micromolar 농도 및 이러한 병원 균5,6에 대 한 방어의 첫 번째 라인 중 하나에서 oomycete 병원 체. 그들의 강력한 항진균 활동 때문에 defensins agribiotechnological 저항 하는 질병 작물을 생성 하기 위해 응용 프로그램에 악용 될 수 있습니다. 여러 식물 defensins의 제정 overexpression 유전자 변형 작물6온실 및 필드 테스트에 질병 저항을 향상 시키기 위해 표시 되었습니다. 그것은 완전히 작물 보호를 위한 효과적인 도구로 서 자신의 잠재력을 활용 하기 위해서는 이러한 항진균 펩 티 드의 행동 (MOA)의 메커니즘을 해명 하는 것이 중요. 그러나, 이러한 식물 defensins MOA 제대로 이해 하 고. 현재 증거 그들이 다른 MOA5,6,,78전시 제안 합니다. 일부 defensins extracellularly 버섯에 행동 하 고 특정 세포 벽/플라즈마 막 주민 sphingolipids 대상, 막 무결성 고 세포 독성 경로9,,1011활성화 됩니다. 그러나 최근에,, 곰 팡이 세포로 이동 하는 항진균 defensins 발견된12,,1314있다. 일부 이러한 defensins 바인딩할 막 상주 생리 인지질, oligomeric 단지를 형성 하 고 플라즈마 막15,,1617permeabilize. 따라서, 식물 defensins의 MOA의 몇 가지 측면 해명 되어 있다. 그러나, 식물 defensins 가능성이의 MOA 아직 식별 및 포괄적인 모델에 통합 이벤트의 복잡 한 세트를 포함 한다. 특히, 이러한 펩 티이 드의 셀룰러 목표의 우리의 이해에 큰 간격이 남아 있습니다.
진보와 함께 최근 현미경 검사 법 기술 및 새로운 형광 프로브 개발, 라이브 세포 이미징 기술은 지금 자주 사용 된다 항균 성 펩 티 드 (암페어)의 모아 공부 하. 이러한 기술을 보완 형태에 항진균 펩타이드의 효과 분석 하는 주로 고용 immunolocalization, 전자 현미경, 원자 힘 현미경 또는 x 선 단층 촬영18등 널리 사용 되는 방법 및 세포 벽 무결성, 원형질 막 permeabilization로 셀 성장/분기 패턴 변경의 연구를 포함 하 여 고 죽이 곰 팡이 세포의 성장. 그럼에도 불구 하 고, 이러한 연구는 특정 시간 시점에서 셀 defensin 도전 하 응답 그들의 동적 변화를 모니터링 하는 같은 셀에 이미징 시간 경과 수행 하는 대신 펩 티 드와 치료 후 이미징에 국한 되었습니다. 최근 몇 년 동안, 라이브 셀 이미징 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 함께에서 붙일 레이블된 펩 티 드의 사용은 앰프-미생물 상호 작용의 역동성의 실시간 시각화를 활성화 하 고. 둘 다 자연스럽 게 정화 하 고 화학적으로 합성된 항진균 펩 티 드 형광 라벨 태그 될 수 있습니다 (예를 들어, DyLight, rhodamine, BODIPY, 또는 알 렉 사 Fluor 기반 염료) 직접 세포와의 상호 작용 하는 동안 시간 경과 의해 관찰 하 고 라이브 셀 이미지입니다. 이러한 펩 티 드를 표시의 사용은 크게 모드 항목, subcellular 지 방화, 세포내 매매, 및 살아있는 곰 팡이 세포 내 항진균 작업의 사이트를 포함 하 여 그들의 MOA의 다양 한 측면의 우리의 이해를 증가 18.
최근, 여러 연구 공장 defensins 포함 하는 다양 한 항진균 펩 티 드는 살고 곰 팡이 세포12,14,,1920내 면 나타났습니다. 이러한 defensins 가능성이의 MOA 세포내 목표와 상호 작용을 포함 한다. 우리 최근 두 ascomycete 버섯, Neurospora crassa 과 Fusarium graminearum에 MtDef4 defensin 식물의 항진균 액션을 보고 있다. MtDef4 곰 팡이 셀 항목 및이 균14subcellular 지 방화에 대 한 다른 경로 사용 하 여 표시 했다. 화학적으로 사용이 연구 합성 tetramethyl rhodamine (TAMRA)-중요 한 형광 염료 (막 선택적 염료, FM4-64; 막 permeant 염료, SYTOX 그린 셀 죽음 기자 염료, 요오드 화물 propidium)와 함께에서 MtDef4를 표시 하 고 신진 대사 억제제입니다. 이러한 분석의 MtDef4, 세포내 수송의 그것의 기계 장치 및 그것의 subcellular 대상14의 국제화 활동을 보여주었다.
여기, confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 라이브 셀 이미징에 대 한 프로토콜 제공 됩니다. 프로토콜 공장 defensin 곰 팡이 상호 작용, 특히 공부를 중요 한 형광 염료, 전 좌의 경로와 defensins 곰 팡이 세포에서의 세포내 표적 조합에 붙일 레이블된 펩 티 드를 이용 한다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>FM4-64 Dye</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>T13320</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DyLight 550 Antibody Labeling Kit</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>84530</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass Bottom Microwell Dishes</td>
			<td>Mat TeK</td>
			<td>P35G-1.5-10-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mira cloth</td>
			<td>EMD Millipore Corp</td>
			<td>475855-1R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SP8-X confocal microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ software</td>
			<td>FiJi</td>
			<td></td>
			<td>For Image analysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaris software</td>
			<td>Bitplane</td>
			<td></td>
			<td>For Image analysis</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

live-cell imaging of fungal cells to investigate modes of entry and subcellular localization of antifungal plant defensins

작은 시스테인-부자 defensins 모든 식물에 호스트 방어 펩 티 드의 가장 큰 그룹 중 하나입니다. 많은 식물 defensins 곰 팡이 병원 균의 넓 스펙트럼에 대 한 강력한 생체 외에서 항진균 성 활동을 전시 하 고 따라서 유전자 변형 작물에 항진균 성 대리인으로 사용 될 가능성이 있다. 질병 제어를 위한 식물 defensins의 잠재력을 활용 하기 위해 그들의 행동 (MOA)의 메커니즘을 명료 하 게 결정적 이다. 고급 현미경 검사 법 기술의 도래와 함께 라이브 셀 이미징 식물 defensins의 항진균 MOA의 역학을 이해 하기 위한 강력한 도구가 되고있다. 여기, confocal 현미경 검사 법 기반 라이브 세포 이미징 방법 중요 한 형광 염료와 함께에서 두 붙일 레이블된 공장 defensins (MtDef4 및 MtDef5)를 사용 하 여 설명 합니다. 이 기술은 실시간 시각화 및 곰 팡이 세포에 MtDef4 및 MtDef5 국제화의 동적 이벤트의 분석을 수 있습니다. 중요 한 것은,이 분석 결과 다양 한 국제화 활동, 항목의 모드와 이러한 펩 티이 드의 subcellular 지 방화를 포함 하 여 정보를 생성 합니다. 다른 셀 생물 학적 도구를 이러한 방법 역학과 이러한 펩 티이 드의 MOA의 복잡성에 대 한 중요 한 통찰력 제공. 이러한 도구는 또한 다른 버섯에 대 한 이러한 펩 티이 드의 MOA 비교 하 사용할 수 있습니다.

라이브 셀 이미징 추적 하 고 국제화 및 두 defensins, MtDef4 및 MtDef5, 개자리속 truncatula;에서 subcellular 지 방화 비교 실시 되었다 버섯 모양 세포. TMR MtDef4 MtDef5 Dylight550으로 표시 했습니다 동안 합성 화학적으로 되었다 (Dylight550-MtDef5). Conidia 막 선택적 염료 FM4-64와 함께에서 어느 defensin 함께 알을 품을 했다. 그림 1 TMR MtDef4가 다른 밀매 경로 N. cra...

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Live-cell Imaging of Fungal Cells to Investigate Modes of Entry and Subcellular Localization of Antifungal Plant Defensins

식물 defensins 병원 균에 대 한 식물 방어에 중요 한 역할을 재생. 대 한 항진균 요원, 액션 (MOA)의 그들의 모드를 이해로 이러한 항진균 펩 티 드의 효과적인 사용이 중요 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 방법 공부 이러한 펩 티이 드의 MOA의 중요 한 측면을 설명 합니다.

조사 항목의 모드와 항진균 공장 Defensins의 Subcellular 지 방화 하는 곰 팡이 세포의 라이브 셀 이미징

Small cysteine-rich defensins are one of the largest groups of host defense peptides present in all plants. Many plant defensins exhibit potent in vitro ...

live-cell-imaging-fungal-cells-to-investigate-modes-entry-subcellular

Research

JoVE Journal

Biology

6.6K 조회수.  Donald Danforth Plant Science Center. 식물 defensins 병원 균에 대 한 식물 방어에 중요 한 역할을 재생. 대 한 항진균 요원, 액션 (MOA)의 그들의 모드를 이해로 이러한 항진균 펩 티 드의 효과적인 사용이 중요 합니다. 여기, 라이브 세포 이미징 방법 공부 이러한 펩 티이 드의 MOA의 중요 한 측면을 설명 합니다.

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Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes in cell surface area and cell height, and where cells undergo mitosis and migrate. Furthermore, epithelial cells can also regulate morphogenetic movements in adjacent tissues1. A traditional method to study epithelial cells and tissues involve chemical fixation and histological methods to determine cell morphology or localization of particular proteins of interest. These approaches continue to be useful and provide "snapshots" of cell shapes and tissue architecture, however, much remains to be understood about how cells acquire specific shapes, how various proteins move or localize to specific positions, and what paths cells follow toward their final differentiated fate. High resolution live imaging complements traditional methods and also allows more direct investigation into the dynamic cellular processes involved in the formation, maintenance, and morphogenesis of multicellular epithelial sheets. Here we demonstrate experimental methods from the isolation of animal cap tissues from Xenopus laevis embryos to confocal imaging of epithelial cells and simple measurement approaches that together can augment molecular and cellular studies of epithelial morphogenesis.

Live-cell Imaging and Quantitative Analysis of Embryonic Epithelial Cells in Xenopus laevis

Xenopus embryonic epithelia are an ideal model system to study cell behaviors such as polarity development and shape change during epithelial morphogenesis. Traditional histology of fixed samples is increasingly being complemented by live-cell confocal imaging. Here we demonstrate methods to isolate frog tissues and visualize live epithelial cells and their cytoskeleton using live-cell confocal microscopy.

라이브 셀 이미징 및 배아 상피 세포의 정량 분석 Xenopus laevis</em

Embryonic epithelial cells serve as an ideal model to study morphogenesis where multi-cellular tissues undergo changes in their geometry, such as changes ...

연구

생물학

Fluorescence-based Measurement of Store-operated Calcium Entry in Live Cells: from Cultured Cancer Cell to Skeletal Muscle Fiber

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to replenish depleted endoplasmic reticulum (ER) or sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ stores1,2. Since Ca2+ is a ubiquitous second messenger, it is not surprising to see that SOCE plays important roles in a variety of cellular processes, including proliferation, apoptosis, gene transcription and motility. Due to its wide occurrence in nearly all cell types, including epithelial cells and skeletal muscles, this pathway has received great interest3,4. However, the heterogeneity of SOCE characteristics in different cell types and the physiological function are still not clear5-7.
The functional channel properties of SOCE can be revealed by patch-clamp studies, whereas a large body of knowledge about this pathway has been gained by fluorescence-based intracellular Ca2+ measurements because of its convenience and feasibility for high-throughput screening. The objective of this report is to summarize a few fluorescence-based methods to measure the activation of SOCE in monolayer cells, suspended cells and muscle fibers5,8-10. The most commonly used of these fluorescence methods is to directly monitor the dynamics of intracellular Ca2+ using the ratio of F340nm and F380nm (510 nm for emission wavelength) of the ratiometric Ca2+ indicator Fura-2. To isolate the activity of unidirectional SOCE from intracellular Ca2+ release and Ca2+ extrusion, a Mn2+ quenching assay is frequently used. Mn2+ is known to be able to permeate into cells via SOCE while it is impervious to the surface membrane extrusion processes or to ER uptake by Ca2+ pumps due to its very high affinity with Fura-2. As a result, the quenching of Fura-2 fluorescence induced by the entry of extracellular Mn2+ into the cells represents a measurement of activity of SOCE9. Ratiometric measurement and the Mn+2 quenching assays can be performed on a cuvette-based spectrofluorometer in a cell population mode or in a microscope-based system to visualize single cells. The advantage of single cell measurements is that individual cells subjected to gene manipulations can be selected using GFP or RFP reporters, allowing studies in genetically modified or mutated cells. The spatiotemporal characteristics of SOCE in structurally specialized skeletal muscle can be achieved in skinned muscle fibers by simultaneously monitoring the fluorescence of two low affinity Ca2+ indicators targeted to specific compartments of the muscle fiber, such as Fluo-5N in the SR and Rhod-5N in the transverse tubules9,11,12.

The extent of store-operated Ca2+ entry (SOCE) can be monitored using fluorescent Ca2+ indicators. Mn2+ quenching of such indicators assays SOCE in cultured cells and skeletal muscle fibers. A technique allowing spatial and temporal resolution of SOCE by confocal imaging of mechanically skinned muscle fibers is also described.

라이브 세포의 저장소로 작동하는 칼슘 항목의 형광 기반의 측정 : 교양 암 세포에서 골격근 섬유에

Store operated Ca2+ entry (SOCE), earlier termed capacitative Ca2+ entry, is a tightly regulated mechanism for influx of extracellular Ca2+ into cells to ...

Two- and Three-Dimensional Live Cell Imaging of DNA Damage Response Proteins

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate mutations and chromosomal aberrations1. To prevent this trauma from catalyzing genomic instability, it is crucial for cells to detect DSBs, activate the DNA damage response (DDR), and repair the DNA. When stimulated, the DDR works to preserve genomic integrity by triggering cell cycle arrest to allow for repair to take place or force the cell to undergo apoptosis. The predominant mechanisms of DSB repair occur through nonhomologous end-joining (NHEJ) and homologous recombination repair (HRR) (reviewed in2). There are many proteins whose activities must be precisely orchestrated for the DDR to function properly. Herein, we describe a method for 2- and 3-dimensional (D) visualization of one of these proteins, 53BP1.
The p53-binding protein 1 (53BP1) localizes to areas of DSBs by binding to modified histones3,4, forming foci within 5-15 minutes5. The histone modifications and recruitment of 53BP1 and other DDR proteins to DSB sites are believed to facilitate the structural rearrangement of chromatin around areas of damage and contribute to DNA repair6. Beyond direct participation in repair, additional roles have been described for 53BP1 in the DDR, such as regulating an intra-S checkpoint, a G2/M checkpoint, and activating downstream DDR proteins7-9. Recently, it was discovered that 53BP1 does not form foci in response to DNA damage induced during mitosis, instead waiting for cells to enter G1 before localizing to the vicinity of DSBs6. DDR proteins such as 53BP1 have been found to associate with mitotic structures (such as kinetochores) during the progression through mitosis10.
In this protocol we describe the use of 2- and 3-D live cell imaging to visualize the formation of 53BP1 foci in response to the DNA damaging agent camptothecin (CPT), as well as 53BP1's behavior during mitosis. Camptothecin is a topoisomerase I inhibitor that primarily causes DSBs during DNA replication. To accomplish this, we used a previously described 53BP1-mCherry fluorescent fusion protein construct consisting of a 53BP1 protein domain able to bind DSBs11. In addition, we used a histone H2B-GFP fluorescent fusion protein construct able to monitor chromatin dynamics throughout the cell cycle but in particular during mitosis12. Live cell imaging in multiple dimensions is an excellent tool to deepen our understanding of the function of DDR proteins in eukaryotic cells.

This protocol describes a method for visualizing a DNA double-strand break signaling protein activated in response to DNA damage as well as its localization during mitosis.

DNA의 손상 응답 단백질의 2와 3 차원 라이브 셀 이미징

Double-strand breaks (DSBs) are the most deleterious DNA lesions a cell can encounter. If left unrepaired, DSBs harbor great potential to generate ...

Induction and Analysis of Epithelial to Mesenchymal Transition

Epithelial to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during development. Misregulation of this process has been implicated as a key event in fibrosis and the progression of carcinomas to a metastatic state. Understanding the processes that underlie EMT is imperative for the early diagnosis and clinical control of these disease states. Reliable induction of EMT in vitro is a useful tool for drug discovery as well as to identify common gene expression signatures for diagnostic purposes. Here we demonstrate a straightforward method for the induction of EMT in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells pre- and post-EMT induction by immunocytochemistry are also included. Additionally, we demonstrate the effectiveness of this method through antibody-based array analysis and migration/invasion assays.

A straightforward method is described for the induction of epithelial to mesenchymal transition (EMT) in a variety of cell types. Methods for the analysis of cells in EMT states by immunocytochemistry are included.

간엽 전환을 유도하고 상피의 분석

Epithelial  to mesenchymal transition (EMT) is essential for proper morphogenesis during  development. Misregulation of this  process has been implicated ...

Live Cell Imaging of Early Autophagy Events: Omegasomes and Beyond

Autophagy is a cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of amino acids. Autophagy is defined by the formation of double membrane structures, called autophagosomes, that sequester cytoplasm, long-lived proteins and protein aggregates, defective organelles, and even viruses or bacteria. Autophagosomes eventually fuse with lysosomes leading to bulk degradation of their content, with the produced nutrients being recycled back to the cytoplasm. Therefore, autophagy is crucial for cell homeostasis, and dysregulation of autophagy can lead to disease, most notably neurodegeneration, ageing and cancer.	
	Autophagosome formation is a very elaborate process, for which cells have allocated a specific group of proteins, called the core autophagy machinery. The core autophagy machinery is functionally complemented by additional proteins involved in diverse cellular processes, e.g. in membrane trafficking, in mitochondrial and lysosomal biology. Coordination of these proteins for the formation and degradation of autophagosomes constitutes the highly dynamic and sophisticated response of autophagy. Live cell imaging allows one to follow the molecular contribution of each autophagy-related protein down to the level of a single autophagosome formation event and in real time, therefore this technique offers a high temporal and spatial resolution.	
	Here we use a cell line stably expressing GFP-DFCP1, to establish a spatial and temporal context for our analysis. DFCP1 marks omegasomes, which are precursor structures leading to autophagosomes formation. A protein of interest (POI) can be marked with either a red or cyan fluorescent tag. Different organelles, like the ER, mitochondria and lysosomes, are all involved in different steps of autophagosome formation, and can be marked using a specific tracker dye. Time-lapse microscopy of autophagy in this experimental set up, allows information to be extracted about the fourth dimension, i.e. time. Hence we can follow the contribution of the POI to autophagy in space and time.

Time-lapse microscopy of fluorescently labeled autophagy markers allows monitoring of the dynamic autophagy response with high temporal resolution. Using specific autophagy and organelle markers in a combination of 3 different colors, we can follow the contribution of a protein to autophagosome formation in a robust spatial and temporal context.

초기 자식 작용 이벤트의 셀 이미징 라이브 : Omegasomes을 넘어

Autophagy is a  cellular response triggered by the lack of nutrients, especially the absence of  amino acids. Autophagy is defined by the formation of ...

Scanning Electron Microscopy (SEM) Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Using young floral tissues, oomycete cysts, and fungi spores (Agaricales) as examples, specific protocols to process delicate samples are described here that overcome some of the main challenges in sample treatment for image capture under the SEM.
Floral meristems fixed with FAA (Formalin-Acetic-Alcohol) and processed with the Critical Point Dryer (CPD) did not display collapsed cellular walls or distorted organs. These results are crucial for the reconstruction of floral development. A similar CPD-based treatment of samples from wet microenvironments, such as the glutaraldehyde-fixed oomycete cysts, is optimal to test the differential growth of diagnostic characteristics (e.g., the cyst spines) on different types of substrates. Destruction of nurse cells attached to fungi spores was avoided after rehydration, dehydration, and the CPD treatment, an important step for further functional studies of these cells.
The protocols detailed here represent low-cost and rapid alternatives for the acquisition of good-quality images to reconstruct growth processes and to study diagnostic characteristics.

Scanning Electron Microscopy SEM Protocols for Problematic Plant, Oomycete, and Fungal Samples

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

문제있는 공장, 난균 강 및 곰팡이 샘플에 대한 전자 현미경 (SEM) 프로토콜을 스캔

Common problems in the processing of biological samples for observations with the scanning electron microscope (SEM) include cell collapse, treatment of ...

Utilizing pHluorin-tagged Receptors to Monitor Subcellular Localization and Trafficking

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular organelles and those localized on the plasma membrane. Traditional fluorescence-based measurements lack the capability to distinguish membrane proteins residing in different organelles. Cutting edge methodologies transcend traditional methods by coupling pH-sensitive fluorophores with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM). TIRF illumination excites the sample up to approximately 150 nm from the glass-sample interface, thus decreasing background, increasing the signal to noise ratio, and enhancing resolution. The excitation volume in TIRFM encompasses the plasma membrane and nearby organelles such as the peripheral ER. Superecliptic pHluorin (SEP) is a pH sensitive version of GFP. Genetically encoding SEP into the extracellular domain of a membrane protein of interest positions the fluorophore on the luminal side of the ER and in the extracellular region of the cell. SEP is fluorescent when the pH is greater than 6, but remains in an off state at lower pH values. Therefore, receptors tagged with SEP fluoresce when residing in the endoplasmic reticulum (ER) or upon insertion in the plasma membrane (PM) but not when confined to a trafficking vesicle or other organelles such as the Golgi. The extracellular pH can be adjusted to dictate the fluorescence of receptors on the plasma membrane. The difference in fluorescence between TIRF images at neutral and acidic extracellular pH for the same cell corresponds to a relative number of receptors on the plasma membrane. This allows a simultaneous measurement of intracellular and plasma membrane resident receptors. Single vesicle insertion events can also be measured when the extracellular pH is neutral, corresponding to a low pH trafficking vesicle fusing with the plasma membrane and transitioning into a fluorescent state. This versatile technique can be exploited to study localization, expression, and trafficking of membrane proteins.

Labeling the extracellular domain of a membrane protein with a pH sensitive fluorophore, superecliptic pHluorin (SEP), allows subcellular localization, expression, and trafficking to be determined. Imaging SEP-labeled proteins with total internal reflection fluorescence microscopy (TIRFM) enables the quantification of protein levels in the peripheral ER and plasma membrane.

pHluorin 태그가 수용체를 활용하여하는 세포 현지화 및 인신 매매를 모니터링하기

Understanding membrane protein trafficking, assembly, and expression requires an approach that differentiates between those residing in intracellular ...

Live-cell Imaging of Platelet Degranulation and Secretion Under Flow

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the formation of thrombi that occlude the vasculature and injure organs, with life-threatening consequences. This motivates scientific research on platelet function and the development of methods to track cell-biological processes as they occur under flow conditions.
A variety of flow models are available for the study of platelet adhesion and aggregation, two key phenomena in platelet biology. This work describes a method to study real-time platelet degranulation under flow during activation. The method makes use of a flow chamber coupled to a syringe-pump setup that is placed under a wide-field, inverted, LED-based fluorescence microscope. The setup described here allows for the simultaneous excitation of multiple fluorophores that are delivered by fluorescently labeled antibodies or fluorescent dyes. After live-cell imaging experiments, the cover glasses can be further processed and analyzed using static microscopy (i.e., confocal microscopy or scanning electron microscopy).

This work describes a fluorescence microscopy-based method for the study of platelet adhesion, spreading, and secretion under flow. This versatile platform enables the investigation of platelet function for mechanistic research on thrombosis and hemostasis.

흐름하에있는 혈소판 탈식 및 분비의 라이브 셀 이미징

Blood platelets are essential players in hemostasis, the formation of thrombi to seal vascular breaches. They are also involved in thrombosis, the ...

Super-Resolution Live Cell Imaging of Subcellular Structures

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally been restricted to be used only on fixed samples or live cells outside of tissue labeled with strong fluorescent signal. Current super-resolution live cell imaging techniques require the use of special fluorescence probes, high illumination, multiple image acquisitions with post-acquisition processing, or often a combination of these processes. These prerequisites significantly limit the biological samples and contexts that this technique can be applied to.
Here we describe a method to perform super-resolution (~140 nm XY-resolution) time-lapse fluorescence live cell imaging in situ. This technique is also compatible with low fluorescent intensity, for example, EGFP or mCherry endogenously tagged at lowly expressed genes. As a proof-of-principle, we have used this method to visualize multiple subcellular structures in the Drosophila testis. During tissue preparation, both the cellular structure and tissue morphology are maintained within the dissected testis. Here, we use this technique to image microtubule dynamics, the interactions between microtubules and the nuclear membrane, as well as the attachment of microtubules to centromeres.
This technique requires special procedures in sample preparation, sample mounting and immobilizing of specimens. Additionally, the specimens must be maintained for several hours after dissection without compromising cellular function and activity. While we have optimized the conditions for live super-resolution imaging specifically in Drosophila male germline stem cells (GSCs) and progenitor germ cells in dissected testis tissue, this technique is broadly applicable to a variety of different cell types. The ability to observe cells under their physiological conditions without sacrificing either spatial or temporal resolution will serve as an invaluable tool to researchers seeking to address crucial questions in cell biology.

Presented here is a protocol for super-resolution live-cell imaging in intact tissue. We have standardized the conditions for imaging a highly sensitive adult stem cell population in its native tissue environment. This technique involves balancing temporal and spatial resolution to allow for the direct observation of biological phenomena in live tissue.

세포 전 형 구조의 슈퍼 해상도 라이브 세포 이미징

There has long been a crucial tradeoff between spatial and temporal resolution in imaging. Imaging beyond the diffraction limit of light has traditionally ...

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) is a versatile method to collect time courses of fluorescence signals from individual cells in high throughput. In general, the acquisition of single-cell time courses from cultured cells is hampered by cell motility and diversity of cell shapes. Adhesive micro-arrays standardize single-cell conditions and facilitate image analysis. LISCA combines single-cell microarrays with scanning time-lapse microscopy and automated image processing. Here, we describe the experimental steps of taking single-cell fluorescence time courses in a LISCA format. We transfect cells adherent to a micropatterned array using mRNA encoding for enhanced green fluorescent protein (eGFP) and monitor the eGFP expression kinetics of hundreds of cells in parallel via scanning time-lapse microscopy. The image data stacks are automatically processed by newly developed software that integrates fluorescence intensity over selected cell contours to generate single-cell fluorescence time courses. We demonstrate that eGFP expression time courses after mRNA transfection are well described by a simple kinetic translation model that reveals expression and degradation rates of mRNA. Further applications of LISCA for event time correlations of multiple markers in the context of signaling apoptosis are discussed.

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays LISCA - a Versatile Technique to Quantify Cellular Kinetics

We present a method for the acquisition of fluorescence reporter time courses from single cells using micropatterned arrays. The protocol describes the preparation of single-cell arrays, the setup and operation of live-cell scanning time-lapse microscopy and an open-source image analysis tool for automated preselection, visual control and tracking of cell-integrated fluorescence time courses per adhesion site.

세포 역학을 정량화하는 다목적 기술인 단세포 어레이(LISCA)의 라이브 셀 이미징

Live-cell Imaging of Single-Cell Arrays (LISCA) is a versatile method to collect time courses of fluorescence signals from individual cells in high ...