이 연구는 기초 과학 연구 프로그램을 통해 국가 연구 재단의 한국 (NRF) 사역의 과학, ICT 및 향후 계획 (NRF-2018R1A2A1A05019892) dc 및 식물 분자 번 식 센터 (에서 교부 금에 의해 투자에 의해 지원 되었다 PMBC) 에피소드를 농촌 개발 관리 (PJ013201)의 다음 세대 Biogreen 21 프로그램의 우리 confocal 현미경 촬영을 제공 하기 위해 환경 관리에 대 한 국립 계측 센터의 이미징 센터를 감사 합니다.

참고: 모든 단계는 수행 실 온에서 달리 명시 하지 않는 한.
1. 식물 재료 (4 주)의 준비
<ol><li>명. benthamiana 식물에 대 한 준비<ol>
<li>명. benthamiana 의 각 냄비의 토양 표면에 2 씨앗을 뿌리 다, 플라스틱 돔 트레이 커버 및 25 ° C, 16/8-h 명암 photoperiod 사이클 60% 습도 성장 챔버에에서 발 아를 씨를 허용.</li>
		<li>2 주 후, 선택 하 고 각 냄비에 작은 경종을 폐기 단계 1.1.1에서에서 발 아에 대 한 적용 동일한 성장 조건 하에서 식물 성장을 계속. 매 2 일 트레이 당 물 1 리터를 추가 합니다. 참고: 식물의 성장 조건 실험실에서 달라질 수 있습니다. 따라서, 건강 한 상태에 있는 식물을 성장 하는 일반 급수 프로토콜을 따릅니다.</li>
		<li>일주일에 새로운 용지함에 식물을 전송 하 고 추가 성장 위한 충분 한 공간이 그들을 주선. 계속 그들은 나이의 4 주에 침투 될 준비가 될 때까지 단계 1.1.1에서에서 설명한 조건 하에서 식물 성장. 참고: 식물 성장 연구소에서 성장 상태에 따라 달라질 수 있습니다. 일반적으로, 우리는 그 4 주 된 찾을 명. benthamiana 식물 약 6 잎 곰.</li>
	</ol>
</li>
	<li>A. thaliana 유전자 변형 식물에 대 한 준비<ol>
<li>테이블의 자료 를 참조 하 고 유전자 변형 애기 씨앗 주문.</li>
		<li>1 mL의 증류수에 50-100 유전자 변형 애기 씨를 담근 다 고 발 아의 발병을 동기화를 어둠 속에서 3 일 동안 4 ° C에서 그들을 저장 합니다.</li>
		<li>플라스틱 돔 트레이 커버와 플러그 공장 트레이의 토양 표면에 2 ~ 3 씨를 뿌리 다. 23 ° C, 10/14-h 명암 photoperiod 사이클 60% 습도에서 발 아 씨앗을 허용 합니다. 참고: 씨앗 homozygotes 이어야 한다입니다. 그러나, 일괄 처리에 있는 transgene의 존재를 재확인 하는 것이 좋습니다. 이 경우에, 2 분, 표 백제 50% 70% 에탄올으로 세척 하 여 씨앗을 소독 (약 2% 차 아 염소 산) 5-6 시간 살 균 두 배 증류수 (ddH2O)로 세척 하 여 5 분에 대 한 triton X-100 따라 0.05%를 포함 하. 살 균 후 4 ° C에서 3 일 동안 충 하 고 유전자 변형 식물 선택 hygromycin B의 25 µ g/L를 포함 하는 식물 발 아 미디어에 접시.</li>
		<li>주 후에, 플러그 당 하나의 공장 두고 단계 1.2.3 사용 동일한 성장 조건 하에서 식물 성장을 계속. 참고: 4 주 오래 된 식물 P. syringae 감염을 위해 사용 되었다. 물 식물 매일 식물의 건강을 유지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 모나 스 문화 (~ 1 주)의 준비
<ol><li>모나 스 변환에 대 한 플라스 미드의 건설<ol>
<li>테이블의 자료 를 참조 하 고 이펙터 T3SS 기반 배달 시스템 벡터25의 원하는 vector(s)를 주문.</li>
		<li>사이트별 재결합25복제를 사용 하 여 이펙터 배달 벡터에 관심의 이펙터 유전자를 삽입 합니다. 참고: 전체 길이 effector 단백질의 subcellular 지 방화, 모니터링 넣어에 전장 유전자 pBK-GW-1-2 또는 pBG-GW-1-2. 그것은 또한 pBK-GW-1-4를 선택할 수 또는 pBG-GW-1-4 포함 된 2에 대 한 x sfGFP11 증가 형광 신호. 신호 펩 티 드 부족 부분 이펙터, 경우 pBK-GW-2-2 또는 pBK-GW-2-4를 사용 합니다. 공원 외. 이펙터 배달 벡터25에 대 한 자세한 내용은 참조 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
	<li>P. syringae pv sfGFP11 태그를 융합 하는 이펙터를 들고 플라스 미드를 변환. 토마토 (태평양 표준시) CUCPB5500 표준 electroporation29를 사용 하 여. 참고: 필요한 경우 다른 녹 종자를 사용할 수 있습니다. SfGFP11 태그 시스템은 벡터30 의 광범위 한 범위에 대 한 구성 하 고 있는 이펙터의 유전자 발현 비교와 함께, 예를 들어, 슈 도모 나 스 fluorescens (이 단)31AvrRpm1 발기인에 의해 규제 됩니다.</li>
	<li>임금의 B 한 천 배지 100 µ g/mL 리 팜 피신과 25 µ g/mL 대 또는 25 µ g/mL gentamycin 포함의 표면 변형 된 세균성 세포를 부드럽게 확산. 2 일 동안에 28 ° C를 품 어.</li>
	<li>킹의 B 액체 미디어 사용, 벡터에 대 한 적절 한 항생제로 한 식민지를 접종 하 고 200 rpm에서 떨고와 28 ° C에서 하룻밤 세포 성장.</li>
	<li>글리세롤 재고를 확인 합니다. 50%-80 ° c.에 게의 최종 농도에 압력가 글리세롤을 추가</li>
</ol>3. 과도 식 세포 기관이 대상 sfGFP1-10선택 북 아 일 benthamiana (4 일)에서
<ol><li>Agrobacterium 문화의 준비<ol>
<li>주문 sfGFP1-10선택 plasmid(s) 세포 기관이 대상의 원하는 vector(s) ( 테이블의 자료를 참조).</li>
		<li>plasmid(s) Agrobacterium tumefaciens 스트레인 GV3101 셀32변환. 2 일 동안 50 µ g/mL 대와 28 ° C에서 50 µ g/mL 리 팜 피신 보충 Luria Bertani (파운드) 한 천 매체에 세포 성장.</li>
		<li>파운드 한 천 매체에 단 하나 식민지에서 50 µ g/mL 대와 50 µ g/mL 리 팜 피신 보충 액체 LB 미디어의 5 mL로 세포를 접종. 200 rpm에서 떨고와 28 ° C에서 하룻밤 세포 성장.</li>
		<li>10 분에 대 한 3000 x g에서 원심 분리 하 여 세포 표면에 뜨는 미디어에서 부와 갓의 1 mL에 펠 릿을 resuspend 수확이 했다 침투 버퍼를.</li>
		<li>600의 흡 광도에서 광학 밀도 (OD) 값을 얻어서 Agrobacterium 의 수량을 측정 nm (Abs 600 nm). 0.5 침투 버퍼와 함께 박테리아의 세600 조정 합니다. 참고: 서 스 펜 션의 1 mL 두 개의 관광 명소에 침투 하기 충분 하다.</li>
		<li>실 온에서 문화를 침투 하기 전에 1-5 h에 대 한 부드러운 로커에 둡니다.</li>
		<li>10 µ L 팁으로 침투 하는 나뭇잎의 중심에 구멍을 찌른. 1 mL needleless 주사기를 사용 하 여 침투 Agrobacterium 정지. 신중 하 고 천천히 주사 약 500 µ L 주사기를 통해 잎 adaxial 측면에 3.1.5 단계에서 준비 하는 정지의. 실험적인 복제에 대 한 적어도 3 개의 다른 식물에 침투를 반복 합니다. 참고: 건강과 안전 이유를 위해 눈 보호 침투 동안 착용 되어야 한다.</li>
		<li>잎에 남아 있는 세균 현 탁 액 떨어져 닦 고 침투 지역의 경계를 표시.</li>
		<li>2 일 동안 단계 1.1.1 사용 동일한 성장 조건 하에서 침투 식물 유지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 접종의 모나 스 (4 일)
<ol><li>2 일 동안 28 ° C에 적절 한 항생제와 킹의 B 천 미디어에 2.5 단계에서 글리세롤 재고에서 행진 변형된 녹 스트레인. 참고: 녹 의 건강이 매우 중요 합니다. 식민지를 잘 형성 하지 않는다, 세포를 다시 행진 또는 진행 하기 전에 임금의 액체 매체에 있는 셀을 전파.</li>
	<li>마 니 톨 조미료 (MG) 액체 미디어 28 ° C에서 하룻밤을 위해 200 rpm에서 떨고 있는 녹 셀의 loopful 접종</li>
	<li>수확 10 분에 대 한 3000 x g에서 원심 분리에 의해 셀 부 표면에 뜨는 미디어 어 펠 릿 10 mm MgCl2, resuspend 고 명 benthamiana 잎 및 0.002 (1 x 106 세600 0.02 (1 x 107 cfu/mL)을 조정 cfu/mL) 애기 단풍. 에 대 한
</li>
	<li>명. benthamiana에 대 한 녹 서 스 펜 션 sfGFP1-10선택 구문을 들고 Agrobacterium 이전 (3.1.7 단계)에서 2 일을 침투 했다 잎의 영역으로 침투. sfGFP1-10선택 유전자 변형 애기, 대 두 4 주 오래 된 짧은 하루 성장 잎으로 녹 서 스 펜 션에 침투. 참고: 적어도 3 개의 식물 실험 복제 필요 합니다.</li>
</ol>5. sfGFP 신호 Confocal 현미경 검사 법 (1 일)을 통해 관찰
<ol><li>녹에서 잎 디스크 잘라-잎을 주사. 모나 스의 침투 후 특정 시간 점에, 40 X confocal 시스템 스캐닝 레이저를 사용 하 여 단일 공장에서 두 개의 2 cm2 잎 디스크 이미지 / 1.2 나 C-Apochromat 물 침수 목표 또는 63 / 0.8 X 나 C-Apochromat 기름 침수 목적입니다. 부상에 의해 살해 하는 죽은 세포를 방지 하려면 침투 구멍에서 세포를 관찰 합니다.</li>
	<li>488 nm 아르곤 레이저의 저전력 설정에서 관측을 시작 합니다. 레이저 파워 sfGFP 탐지를 증가. 참고: 우리가 일반적으로 형광 신호를 찾으려면를 레이저 강도의 2-15%를 사용 합니다. 그러나, 레이저 파워와 검색 설정을 조정 해야 사용자의 현미경 시스템에 따라. 여기, 방출 필터 520-550 nm로 설정 했다. 죽은 세포는 종종 488 nm 레이저 여기 아래 자동-형광 방출. 따라서, 부정적인 컨트롤 sfGFP11 태그를 하지 않고 같은 이펙터 침투 하 고 동일한 관측 조건 하에서 관찰 될 해야 합니다. 또한, 높은 레이저 여기 엽록소 autofluorescence를 유도할 수 있다. 따라서 엽록소 autofluorescence 유도를 하지 않도록 제어 식물 세포를 사용 하 여 레이저 강도 조정 합니다.<ol>
<li>세포 벽의 counterstaining에 대 한 리프 디스크 관찰 전에 5-10 분에 20 m m propidium 요오드 화물 (PI)을 침투.</li>
		<li>얼룩이 핵에 대 일 분 뒤에 물으로 세척 하 여 0.1 %paraformaldehyde 리프 디스크 잠수함. 그런 다음, 10mm, PI 리프 디스크 현미경 관찰 하기 전에 5-10 분에 침투. 실험 3 번 이상 반복 합니다. 참고:이 단계는 아닙니다 중요 하지만 원형질 막 또는 핵에 이펙터 지역화를 정의 하는 데 도움이. 관심의 이펙터에 특정 세포 기관이 그들의 지역화 면, 주어진된 세포 기관이 대 한 마커를 사용 하 여는 이펙터의 지역화를 확인.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol>
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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Arabidopsis+thaliana+RPM1+disease+resistance+gene+product+is+a+peripheral+plasma+membrane+protein+that+is+degraded+coincident+with+the+hypersensitive+response.">The Arabidopsis thaliana RPM1 disease resistance gene product is a peripheral plasma membrane protein that is degraded coincident with the hypersensitive response.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (26), 15849-15854 (1998).</li><li>Nimchuk, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Eukaryotic+fatty+acylation+drives+plasma+membrane+targeting+and+enhances+function+of+several+type+III+effector+proteins+from+Pseudomonas+syringae.">Eukaryotic fatty acylation drives plasma membrane targeting and enhances function of several type III effector proteins from Pseudomonas syringae.</a> Cell. 101 (4), 353-363 (2000).</li><li>Gao, Z., Chung, E. H., Eitas, T. K., Dangl, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant+intracellular+innate+immune+receptor+Resistance+to+Pseudomonas+syringae+pv.+maculicola+1+(RPM1)+is+activated+at,+and+functions+on,+the+plasma+membrane.">Plant intracellular innate immune receptor Resistance to Pseudomonas syringae pv. maculicola 1 (RPM1) is activated at, and functions on, the plasma membrane.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (18), 7619-7624 (2011).</li><li>Leonetti, M. D., Sekine, S., Kamiyama, D., Weissman, J. S., Huang, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+scalable+strategy+for+high-throughput+GFP+tagging+of+endogenous+human+proteins.">A scalable strategy for high-throughput GFP tagging of endogenous human proteins.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (25), E3501-E3508 (2016).</li><li>Li, X., Yang, Q., Tu, H., Lim, Z., Pan, S. Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+visualization+of+Agrobacterium-delivered+VirE2+in+recipient+cells.">Direct visualization of Agrobacterium-delivered VirE2 in recipient cells.</a> Plant J. 77 (3), 487-495 (2014).</li><li>Tanaka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experimental+approaches+to+investigate+effector+translocation+into+host+cells+in+the+Ustilago+maydis/maize+pathosystem.">Experimental approaches to investigate effector translocation into host cells in the Ustilago maydis/maize pathosystem.</a> Eur J Cell Biol. 94 (7-9), 349-358 (2015).</li></ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

여기에 설명 된 프로토콜 모니터링 호스트 식물 세포 감염 시 세균 T3SS에 의해 주입 하는 effector 단백질의 정확한 지역화에 사용 됩니다. 이전, 분할 GFP 시스템 포유류 단백질23,36의 subcellular 지 방화, 살 모 넬 라 T3E 지역화, Agrobacterium VirE2 납품에 T4SS 통해 공부 하는 도구로 사용 되었다는 식물 세포37. 식물 세포에서이 시스...

식물은 수많은 침입 병원 체 포함 박테리아, 곰 팡이, 바이러스, 곤충 및 nematodes 그들의 수명 주기 동안 발생 하는 착 유기 체. Phytopathogens, 중 녹 종 등 Ralstonia 종, 그램 음성 세균성 병원 체 상처 또는 stomata 및 hydathode 같은 자연 구멍을 통해 입력 하 여 그들의 호스트 식물을 감염1. 성공적으로 호스트 식물 식민지로 세균성 병원 균 독성 요인2의 다양 한 개발을 진화 했다. 박테리아는 기 주 식물을 침공, 그들은 일련의 독성 단백질 주사-이펙터로 알려진-그들의 pathogenicity 홍보를 식물 세포에 직접. 이 이펙터 억제 또는 공장 타고 난 면역을 조절 하 고 세균 생존3결과 호스트 세포 프로세스를 조작.
병원 성 박테리아는 주로 호스트 셀4에 직접 효과 기 단백질을 제공 하는 T3SS를 사용 합니다. T3SS는 호스트 셀5의 사출 사이트 내부와 외부 세균 막 비 계 단백질 구조에서 연결 바늘 같은 채널 분자 주사기를 유사 합니다. 이 이펙터 T3SS 중재 (T3E) 분 비 메커니즘은 인간 뿐만 아니라 식물의 다양 한 그램 음성 세균성 병원 체에 잘 보존. 대표적인 식물 병원 체, P. syringae pv 중 하나입니다. 토마토 DC3000 hrcC 돌연변이 일반적으로 결함이 있는 T3SS 완전히 억제 식물 면역 (effector 단백질을 주입)에 의해6에이 돌연변이의 무 능력으로 인해 식물에 성장을 제한 했다. 호스트 세포로 전, 시 이펙터 대상 다양 한 호스트 단백질 등 식물 방위 응답, 유전자 전사, 세포 죽음, 프로테아좀, 소포 매매, 호르몬 경로7 호스트 셀 시스템에 대 한 중요 한 , 8 , 9 , 10. 따라서, 추적 호스트 셀에 effector 단백질의 세포질 지 방화의 식물 면역의 변조에 관하여 그들의 기능을 이해 하는 매력적인 대상 이다.
T3Es의 지역화 연구의 대부분 Agrobacterium-중재 overexpression 호스트 식물9큰 형광 단백질으로 고용 했다. 그러나, 다른 종에 도입 된 유전자의 분리 식 방법 잘못 지역화 된 또는 때때로 작동 하지11,,1213되도록 표시 되었습니다. 또한, 여러 연구 결과 세균성 이펙터는 호스트 셀14,15,,1617에서 적절 한 대상에 대 한 수정 받을 밝혔다. 따라서, 세포 기능 또는 양적 이펙터 병원 체 감염18시 T3SS에 의해 전달 되는 동일 하지 않을 수 있습니다 식물의 cytosol에서 이펙터 뚜렷이 표현. 또한, 대형 형광 태그 effector 단백질의 융합 적절 한 이펙터 배달 및 시각화18,19중단 될 수 있습니다. 따라서, T3E 함수 분석에이 접근 T3SS 분 비 이펙터의 네이티브 지역화를 완벽 하 게 반영 되지 않을 수 있습니다.
녹색 형광 단백질 (GFP)20발 색 단 포함 하는 중앙 물가 포함 하는 11-배가 좌초 하는 β-배럴의 구성 됩니다. Waldo 외. 작은 부품으로 구성 된 새로운 분할-GFP 시스템을 보고 (GFP β 물가 11; GFP11)와 대형 보완 조각 (GFP β 물가 1-10; GFP1-10)21. 조각을 스스로 형광 하지 않습니다 하지만 두 조각을 서로 가까운 근접에 있을 때 그들의 자기 협회에 형광. 단백질 접히는 효율성의 최적화에 대 한 강력한 접는 변종 GFP, 즉, sfGFP 및 sfGFP선택, 이후에 분할 GFP 시스템20,,2122개발 되었다. 최근, 단일 아미노산 돌연변이 sfGFP1-10선택-sfYFP1-10선택 및 sfCFP1-10선택-을 각각 sfGFP11 조각와 쇼 노란색과 청록색 형광 reconstitute 수, 생성 된23의 변형 . 또한, sfCherry, mCherry의 파생 분열 될 수 있다 sfGFP23와 같은 방식으로 sfCherry11와 sfCherry1-10 조각으로.
이 시스템은 고 살 모 넬 라24. 에서 이펙터를 사용 하 여 감염 동안 추적 하는 HeLa 세포에서 T3SS 이펙터에 맞게 되었습니다. 그러나, 그것은 이전 하지 최적화 호스트 식물 세균성 병원 체 시스템에 대 한. 최근에, 우리는 식물 세포25에 P. syringae 에서 전달 하는 T3Es의 subcellular 지 방화를 모니터링 하는 데 향상 된 sfGFP1-10선택 에 따라 분할 GFP 시스템 최적화. 식물 세포, 유전자 변형 애기 thaliana 집합에에서 다른 subcellular 구획을 T3Es의 지역화 연구를 촉진 하기 위하여 식물 다양 한 subcellular 구획 에서에서 sfGFP1-10OPT 를 표현 하기 위해 생성 된 25. 또한, 다양 한을 운반 하는 플라스 미드 세포 기관이 대상 sfGFP1-10선택 Agrobacterium에 대 한-중재 과도 overexpression 이펙터 T3SS 기반 배달에 대 한 sfGFP11 태그 벡터 또한 생성 했다. 다양 한 유전자 변형 애기 라인과 관심의 T3Es을 표현 하는 플라스 미드의 씨앗 테이블의 자료26,27에서 언급 한 소스에서 얻을 수 있습니다.
다음 프로토콜에서 우리는 분할 sfGFP 시스템을 사용 하 여 호스트 세포에 박테리아에 의해 전달 하는 이펙터의 역학을 모니터링 하는 최적화 된 시스템을 설명 합니다. SfGFP1-10선택 유전자 변형 녹 sfGFP11 재조합 플라스 미드를 들고와 표현 하는 식물의 감염 호스트 셀으로 모나 스 에서 sfGFP11 태그 이펙터의 전달 결과. 따라서, 이러한 단백질 재구성 되 고 특정 이펙터 대상 compartment(s)에 이동. 슈 도모 나 스 syringae pv입니다. 토마토 18 이펙터 삭제 됩니다, CUCPB5500 스트레인이이 스트레인 A. thaliana 및 북 아 일 benthamianas28에 낮은 또는 없음 세포 죽음을 보여주 때문에 사용 되었다. 그러나, 모든 자료와 여기에 설명 된 단계 교체 수 있습니다 또는 다른 생물학 질문 또는 지정 된 실험실 조건에서 최적화의 조사를 위해 분할 sfGFP 시스템에 맞게 수정.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Arabidopsis transgenic lines&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. &amp;amp; Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td></tr><tr><td>CYTO-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69831</td><td></td></tr><tr><td>NU-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69832</td><td></td></tr><tr><td>PT-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69833</td><td></td></tr><tr><td>MT-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69834</td><td></td></tr><tr><td>PX-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69835</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69836</td><td></td></tr><tr><td>GO-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69837</td><td></td></tr><tr><td>PM-sfGFP1-10</td><td>ABRC</td><td>CS69838</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Organelle-targeted sfGFP1-10OPT plasmid&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. &amp;amp; Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td></tr><tr><td>CYTO-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97387</td><td></td></tr><tr><td>NU-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97388</td><td></td></tr><tr><td>PT-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97389</td><td></td></tr><tr><td>MT-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97390</td><td></td></tr><tr><td>PX-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97391</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97392</td><td></td></tr><tr><td>GO-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97393</td><td></td></tr><tr><td>PM-sfGFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97394</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfCherry1-10</td><td>Addgene</td><td>97403</td><td></td></tr><tr><td>ER-sfYFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97404</td><td></td></tr><tr><td>CYTO-sfCFP1-10</td><td>Addgene</td><td>97405</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;sfGFP11-tagged Gateway compatible vector for T3SS-based effector delivery system&lt;/strong&gt;</td><td>Park, E., Lee, H. Y., Woo, J., Choi, D. &amp;amp; Dinesh-Kumar, S. P. Spatiotemporal Monitoring of Pseudomonas syringae Effectors via Type III Secretion Using Split Fluorescent Protein Fragments. Plant Cell. 29 (7), 1571-1584 (2017)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pBK-GW-1-2</td><td>Addgene</td><td>98250</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-1-4</td><td>Addgene</td><td>98251</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-2-2</td><td>Addgene</td><td>98252</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBK-GW-2-4</td><td>Addgene</td><td>98253</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Kanamycin (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-1-2</td><td>Addgene</td><td>98254</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-1-4</td><td>Addgene</td><td>98255</td><td>pAvrRpm1:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-2-2</td><td>Addgene</td><td>98256</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-sfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>pBG-GW-2-4</td><td>Addgene</td><td>98257</td><td>pAvrRpm1:AvrRPM1sp:GW:HA-2xsfGFP11:AvrRpm1t; Resistant to Gentamycin (25 ug/ml)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Bacterial strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Agrobacterium tumefaciens &lt;/em&gt;GV3101</td><td></td><td></td><td>Csaba Koncz and Jeff Schell, The promoter of TL-DNA gene 5 controls the tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel type of Agrobacterium binary vector. Mol Gen Genet. 204,383-396 (1986); Resistant to gentamycin (50 ug/ml) and rifampicin (50 ug/ml)</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;Pseudomonas syringae&lt;/em&gt; pv. &lt;em&gt;Tomato&lt;/em&gt; CUCPB5500</td><td></td><td></td><td>Kvitko, B. H. et al. Deletions in the repertoire of Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 type III secretion effector genes reveal functional overlap among effectors. PLoS Pathog. 5 (4) (2009).; Resistant to rifampicin (100 ug/ml)</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Media components&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Plant germination media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>Add 2.165g/L Murashige &amp;amp; Skoog powder, 10 g/L sucrose to water. Adjust to pH 5.8 and add 2.2 g/L phytagel. Autocalve.</td></tr><tr><td>Murashige &amp;amp; Skoog medium including vitamins</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0222</td><td>Store at 4 &amp;deg;C.</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0809</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;LB media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>Add 10 g/L tryptone, 5 g/L yeast extract, 10 g/L NaCl to water. For solid media, add 15 g/L micro agar. Autoclave.&amp;nbsp; Allow solution to cool to 55 &amp;deg;C, and add antibiotic if needed.</td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>BD Bioscience</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>BD Bioscience</td><td>212750</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>S0520</td><td></td></tr><tr><td>Micro agar</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1002</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;King&#039;s B media&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>10 g/L protease peptone #2, 1.5 g/L anhydrous K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 15 g/L of agar to water. Autoclave. Cool down to 55 &amp;deg;C and add sterile 15 ml/L glycerol, 5 ml/L MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; to the medium. Add antibiotics if needed.</td></tr><tr><td>Proteose peptone</td><td>BD Bioscience</td><td>212120</td><td></td></tr><tr><td>Anhydrous K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>1551128 USP</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G1345</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7506</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>BD Bioscience</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Mannitol-Glutamate (MG) liquid media &lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td>Add 10 g/L of mannitol, 2 g/L of L-glutamic acid, 0.5 g/L of KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;, 0.2 g/L of NaCl, and 0.2 g/L of MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; to water. Adjust to pH 7</td></tr><tr><td>Mannitol</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0803</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamic acid</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>G0707</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>NIST200B</td><td></td></tr><tr><td>Infiltration buffer</td><td></td><td></td><td>10 mM MES (2-(N-morpholino)-ethane sulfonic acid), 10 mM MgCl2, 150 &amp;micro;M acetosyringone. pH 5.6; Prepare a fresh buffer before use.</td></tr><tr><td>MES</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503</td><td>Prepare 100 mM (pH 5.6) stock in water. Filter sterilize.</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Prepare 100 mM stock in water. Autoclave.</td></tr><tr><td>Acetosyringone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D134406</td><td>Prepare 150 mM stock in DMSO.</td></tr><tr><td>Confocal microscope equipments/materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>710 laser scanning confocal system</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Axio observer Z1 inverted microscope</td><td>Carl Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Propidium iodide</td><td>ThermoFisher</td><td>P1304MP</td><td></td></tr></tbody></table>

split green fluorescent protein system to visualize effectors delivered from bacteria during infection

박테리아, 다양 한 식물 질병의 원인이 되는 가장 중요 한 에이전트 중 하나는 호스트 식물 세포 식물 면역 체계를 파괴에 effector 단백질의 집합을 분 비. 감염 시 세포질 이펙터 유형 III 분 비 시스템 (T3SS)를 통해 호스트 cytosol에 전달 됩니다. 식물 세포에 배달, 후에 effector(s) 생존 및 병원 체의 복제에 대 한 호스트 세포 프로세스를 변조 하는 것 특정 compartment(s) 대상. 비록 pathogenicity에 형광 단백질을 사용 하 여 그들의 기능을 이해 하는 호스트 셀에 effector 단백질의 subcellular 지역화의 박테리아에서 직접 주입 하는 이펙터의 역학 조사에서 일부 연구 하고있다 T3SS와 형광 단백질 간의 비 호환성으로 인해 도전 하고있다.
여기, 우리가 호스트 셀에서 세균 T3SS 통해 전달 하는 이펙터의 지역화를 시각화 하기 위해 최적화 된 분할 superfolder 녹색 형광 단백질 시스템 (sfGFPOPT)의 최근 우리의 방법을 설명 합니다. sfGFP11 (11번째 β 물가의 sfGFP)-태그 이펙터는 T3SS을 통해 분 비 사이트에서 형광 방출에 표적으로 하는 특정 세포 기관이 sfGFP1-10선택 (1-10번째 β 물가의 sfGFP) 행간 조립 될 수 있다. 이 프로토콜 애기 Nicotiana benthamiana 식물에 특정 세포 기관이에 슈 도모 나 스 syringae 에서 effector 단백질으로 재구성된 sfGFP 형광 신호를 시각화 하는 절차를 제공 합니다.

GFP의 β 배럴 구조 11 β 물가의 구성 이며, 두 조각, 1-10번째 가닥 (GFP1-10선택)와 11일 (GFP11) 가닥으로 나눌 수 있습니다. 비록 둘 다 2 개의 파편 스스로 형광의 자기 조립된 sfGFP 근접 (그림 1A)에 존재 하는 2 개의 파편 때 형광을 내보낼 수 있습니다. 이 시스템에서는, sfGFP1-10선택-식물 녹 sfGFP11 태그 이펙터를 들고?...

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Split Green Fluorescent Protein System to Visualize Effectors Delivered from Bacteria During Infection

녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

형광 단백질 기반 접근 호스트 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터를 모니터링 하는 도전입니다. 형광 단백질 및 유형 III 분 비 시스템 간의 비 호환성 때문입니다. 여기, 최적화 된 분할 superfolder GFP 시스템 호스트 식물 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터의 시각화 사용 됩니다.

Bacteria, one of the most important causative agents of various plant diseases, secrete a set of effector proteins into the host plant cell to subvert the ...

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Research

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Biology

10.3K 조회수.  Seoul National University. 형광 단백질 기반 접근 호스트 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터를 모니터링 하는 도전입니다. 형광 단백질 및 유형 III 분 비 시스템 간의 비 호환성 때문입니다. 여기, 최적화 된 분할 superfolder GFP 시스템 호스트 식물 세포에 박테리아에 의해 은닉 하는 이펙터의 시각화 사용 됩니다.

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A Fluorescence-based Method to Study Bacterial Gene Regulation in Infected Tissues

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some factors act directly on virulence genes; others control pathogenesis by adjusting the expression of downstream regulators or the accumulation of signals that affect regulator activity. While regulation has been studied extensively during in vitro growth, relatively little is known about how gene expression is adjusted during infection. Such information is important when a particular gene product is a candidate for therapeutic intervention. Transcriptional approaches like quantitative, real-time RT-PCR and RNA-Seq are powerful ways to examine gene expression on a global level but suffer from many technical challenges including low abundance of bacterial RNA compared to host RNA, and sample degradation by RNases. Evaluating regulation using fluorescent reporters is relatively easy and can be multiplexed with fluorescent proteins with unique spectral properties. The method allows for single-cell, spatiotemporal analysis of gene expression in tissues that exhibit complex three-dimensional architecture and physiochemical gradients that affect bacterial regulatory networks. Such information is lost when data are averaged over the bulk population. Herein, we describe a method for quantifying gene expression in bacterial pathogens in situ. The method is based on simple tissue processing and direct observation of fluorescence from reporter proteins. We demonstrate the utility of this system by examining the expression of Staphylococcus aureus thermonuclease (nuc), whose gene product is required for immune evasion and full virulence ex vivo and in vivo. We show that nuc-gfp is strongly expressed in renal abscesses and reveal heterogeneous gene expression due in part to apparent spatial regulation of nuc promoter activity in abscesses fully engaged with the immune response. The method can be applied to any bacterium with a manipulatable genetic system and any infection model, providing valuable information for preclinical studies and drug development.

Described here is a method for analyzing bacterial gene expression in animal tissues at a cellular level. This method provides a resource for studying the phenotypic diversity occurring within a bacterial population in response to the tissue environment during an infection.

감염 된 조직에서 세균 유전자 규칙을 공부 하는 형광 기반 방법

Bacterial virulence genes are often regulated at the transcriptional level by multiple factors that respond to different environmental signals. Some ...

연구

유전학

Electroporation of Functional Bacterial Effectors into Mammalian Cells

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. This information is particularly valuable in the context of host-pathogen interactions. Many pathogen proteins function within host cells in a variety of way such as, enabling evasion of the host immune system and survival within the intracellular environment. To study these pathogen-protein host-cell interactions, several approaches are commonly used, including: in vivo infection with a strain expressing a tagged or mutant protein, or introduction of pathogen genes via transfection or transduction. Each of these approaches has advantages and disadvantages. We sought a means to directly introduce exogenous proteins into cells. Electroporation is commonly used to introduce nucleic acids into cells, but has been more rarely applied to proteins although the biophysical basis is exactly the same. A standard electroporator was used to introduce affinity-tagged bacterial effectors into mammalian cells. Human epithelial and mouse macrophage cells were cultured by traditional methods, detached, and placed in 0.4 cm gap electroporation cuvettes with an exogenous bacterial pathogen protein of interest (e.g. Salmonella Typhimurium GtgE). After electroporation (0.3 kV) and a short (4 hr) recovery period, intracellular protein was verified by fluorescently labeling the protein via its affinity tag and examining spatial and temporal distribution by confocal microscopy. The electroporated protein was also shown to be functional inside the cell and capable of correct subcellular trafficking and protein-protein interaction. While the exogenous proteins tended to accumulate on the surface of the cells, the electroporated samples had large increases in intracellular effector concentration relative to incubation alone. The protocol is simple and fast enough to be done in a parallel fashion, allowing for high-throughput characterization of pathogen proteins in host cells including subcellular targeting and function of virulence proteins.

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

포유 동물 세포에 기능 세균 이펙터의 전기

The study of protein interactions in the context of living cells can generate critical information about localization, dynamics, and interacting partners. ...

면역학 및 감염병학

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target cells. Inside the host cell the effector proteins manipulate cellular functions to the benefit of the bacteria. To better understand the control of type III secretion during host cell interaction, sensitive and accurate assays to measure translocation are required. We here describe the application of an assay based on the fusion of a Yersinia enterocolitica effector protein fragment (Yersinia outer protein; YopE) with TEM-1 beta-lactamase for quantitative analysis of translocation. The assay relies on cleavage of a cell permeant FRET dye (CCF4/AM) by translocated beta-lactamase fusion. After cleavage of the cephalosporin core of CCF4 by the beta-lactamase, FRET from coumarin to fluorescein is disrupted and excitation of the coumarin moiety leads to blue fluorescence emission. Different applications of this method have been described in the literature highlighting its versatility. The method allows for analysis of translocation in vitro and also in in vivo, e.g., in a mouse model. Detection of the fluorescence signals can be performed using plate readers, FACS analysis or fluorescence microscopy. In the setup described here, in vitro translocation of effector fusions into HeLa cells by different Yersinia mutants is monitored by laser scanning microscopy. Recording intracellular conversion of the FRET reporter by the beta-lactamase effector fusion in real-time provides robust quantitative results. We here show exemplary data, demonstrating increased translocation by a Y. enterocolitica YopE mutant compared to the wild type strain.

Analysis of Yersinia enterocolitica Effector Translocation into Host Cells Using Beta-lactamase Effector Fusions

Effector translocation into host cells via a type III secretion system is a common virulence strategy among gram-negative bacteria. A beta-lactamase effector fusion based assay for quantitative analysis of translocation was applied. In Yersinia infected cells, conversion of a FRET reporter by the beta-lactamase is monitored using laser scanning microscopy.

분석<em&gt; 예 르시 니아의 enterocolitica</em숙주 세포 내로&gt; 이펙터 전좌 베타 - 락타 마제 이펙터의 용해 사용

Many gram-negative bacteria including pathogenic Yersinia spp. employ type III secretion systems to translocate effector proteins into eukaryotic target ...

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a replicative niche. A cohort of effectors are translocated through this system into the host cell to manipulate host processes and allow the establishment of a unique lysosome-derived vacuole for replication. The method presented here involves the combination of two well-established techniques: specific gene silencing using siRNA and measurement of effector translocation using a FRET-based substrate that relies on &#946;-lactamase activity. Applying these two approaches, we can begin to understand the role of host factors in bacterial secretion system function and effector translocation. In this study we examined the role of Rab5A and Rab7A, both important regulators of the endocytic trafficking pathway. We demonstrate that silencing the expression of either protein results in a decrease in effector translocation efficiency. These methods can be easily modified to examine other intracellular and extracellular pathogens that also utilize secretion systems. In this way, a global picture of host factors involved in bacterial effector translocation may be revealed.

Applying Fluorescence Resonance Energy Transfer FRET to Examine Effector Translocation Efficiency by Coxiella burnetii during siRNA Silencing

Investigating the interactions between bacterial pathogens and their hosts is an important area of biological research. Here, we describe the necessary techniques to measure effector translocation by Coxiella burnetii during siRNA gene silencing using BlaM substrate.

적용 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을하여 이펙터 전좌 효율을 검사합니다<em&gt; Coxiella burnetii의</em&gt; siRNA를 음소거시

Coxiella burnetii, the causative agent of Q fever, is an intracellular pathogen that relies on a Type IV Dot/Icm Secretion System to establish a ...

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a pET-SUMO-EGFP vector (SUMO = small ubiquitin-like modifier) and expressing enhanced green fluorescence protein (EGFP) in Escherichia coli (BL21DE). EGFP-expressing E. coli is coincubated with macrophages for 1 h at 37 &#176;C; the negative control group is incubated on ice for the same amount of time. Then, the macrophages are ready for assessment. The advantages of this technique include its simple and straightforward steps, and phagocytosis can be measured by both flow cytometer and fluorescence microscope. The EGFP-expressing E. coli are stable and display a strong fluorescence signal even after the macrophages are fixed with paraformaldehyde. This method is not only suitable for the assessment of macrophage cell lines or primary macrophages in vitro but also suitable for the evaluation of granulocyte and monocyte phagocytosis in peripheral blood mononuclear cells. The results show that the phagocytic capability of peritoneal macrophages from young (eight-week-old) mice is higher than that of macrophages from aged (16-month-old) mice. In summary, this method measures macrophage phagocytosis and is suitable for studying the innate immune system function.

Using Enhanced Green Fluorescence Protein-expressing Escherichia Coli to Assess Mouse Peritoneal Macrophage Phagocytosis

Here, we present a protocol to assess mouse peritoneal macrophage phagocytosis using enhanced green fluorescence protein-expressing Escherichia coli.

녹색 형광 단백질 표현 하는 향상 된 사용 하 여 대장균 마우스 복 막 대 식 세포 식 균 작용을 평가 하기 위해

This manuscript describes a simple and reproducible method to perform a phagocytosis assay. The first part of this method involves building a ...

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and mediates the delivery of protein and DNA substrates to target cells, a process generally requiring direct cell-to-cell contact. We have recently solved the structure of the Dot/Icm apparatus by cryo-electron tomography (cryo-ET) and showed that it forms a cell envelope-spanning channel that connects to a cytoplasmic complex. Applying two complementary approaches that preserve the native structure of the specimen, fluorescent microscopy in living cells and cryo-ET, allows in situ visualization of proteins and assimilation of the stoichiometry and timing of production of each machine component relative to other Dot/Icm subunits. To investigate the requirements for polar positioning and to characterize dynamic features associated with T4SS machine biogenesis, we have fused a gene encoding superfolder green fluorescent protein to Dot/Icm ATPase genes at their native positions on the chromosome. The following method integrates quantitative fluorescence microscopy of living cells and cryo-ET to quantify polar localization, dynamics, and structure of these proteins in intact bacterial cells. Applying these approaches for studying the Legionella pneumophila T4SS is useful for characterizing the function of the Dot/Icm system and can be adapted to study a wide variety of bacterial pathogens that utilize the T4SS or other types of bacterial secretion complexes.

Applying Live Cell Imaging and Cryo-Electron Tomography to Resolve Spatiotemporal Features of the Legionella pneumophila Dot/Icm Secretion System

Imaging of bacterial cells is an emerging systems biology approach focused on defining static and dynamic processes that dictate the function of large macromolecular machines. Here, integration of quantitative live cell imaging and cryo-electron tomography is used to study Legionella pneumophila type IV secretion system architecture and functions.

레지오넬라 폐렴 구균 도트/Icm 분비 시스템의 시공간적 특징을 해결하기 위해 라이브 세포 이미징 및 극저온 단층 촬영 적용

The Dot/Icm secretion system of Legionella pneumophila is a complex type IV secretion system (T4SS) nanomachine that localizes at the bacterial pole and ...

Kinetic Visualization of Single-Cell Interspecies Bacterial Interactions

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method has been developed for observing interspecies interactions between two bacterial pathogens. The use of this method to interrogate interactions between a motile Gram-negative pathogen, Pseudomonas aeruginosa and a non-motile Gram-positive pathogen, Staphylococcus aureus is demonstrated here. This protocol consists of co-inoculating each species between a coverslip and an agarose pad, which maintains the cells in a single plane and allows for visualization of bacterial behaviors in both space and time.
Furthermore, the time-lapse microscopy demonstrated here is ideal for visualizing the early interactions that take place between two or more bacterial species, including changes in bacterial species motility in monoculture and in coculture with other species. Due to the nature of the limited sample space in the microscopy setup, this protocol is less applicable for studying later interactions between bacterial species once cell populations are too high. However, there are several different applications of the protocol which include the use of staining for imaging live and dead bacterial cells, quantification of gene or protein expression through fluorescent reporters, and tracking bacterial cell movement in both single species and multispecies experiments.

This live-bacterial cell imaging protocol allows for visualization of interactions between multiple bacterial species at the single-cell level over time. Time-lapse imaging allows for observation of each bacterial species in monoculture or coculture to interrogate interspecies interactions in multispecies bacterial communities, including individual cell motility and viability.

단세포 종 간 세균성 상호 작용의 운동 시각화

Polymicrobial communities are ubiquitous in nature, yet studying their interactions at the single-cell level is difficult. Thus, a microscopy-based method ...

Internalization and Observation of Fluorescent Biomolecules in Living Microorganisms via Electroporation

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing molecules of interest to fluorescent proteins such as GFP to study their expression, localization and function. However, GFP and its derivatives are significantly larger and less photostable than organic fluorophores generally used for in vitro experiments, and this can limit the scope of investigation. 
We recently introduced a straightforward, versatile and high-throughput method based on electroporation, allowing the internalization of biomolecules labeled with organic fluorophores into living microorganisms. Here we describe how to use electroporation to internalize labeled DNA fragments or proteins into Escherichia coli and Saccharomyces cerevisi&#230;, how to quantify the number of internalized molecules using fluorescence microscopy, and how to quantify the viability of electroporated cells. Data can be acquired at the single-cell or single-molecule level using fluorescence or FRET. The possibility of internalizing non-labeled molecules that trigger a physiological observable response in vivo is also presented. Finally, strategies of optimization of the protocol for specific biological systems are discussed.

Studies of biomolecules in vivo are crucial for understanding molecular function in a biological context. Here we describe a novel method allowing the internalization of fluorescent biomolecules, such as DNA or proteins, into living microorganisms. Analysis of in vivo data recorded by fluorescence microscopy is also presented and discussed.

일렉트로을 통해 생활 미생물의 국제화 및 형광 생체 분자의 관측

The ability to study biomolecules in vivo is crucial for understanding their function in a biological context. One powerful approach involves fusing ...

생물학

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and the inherent instability of many membrane proteins once solubilized in detergents. A protocol is described that combines ligation independent cloning of membrane proteins as GFP fusions with expression in Escherichia coli detected by GFP fluorescence. This enables the construction and expression screening of multiple membrane protein/variants to identify candidates suitable for further investment of time and effort. The GFP reporter is used in a primary screen of expression by visualizing GFP fluorescence following SDS polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). Membrane proteins that show both a high expression level with minimum degradation as indicated by the absence of free GFP, are selected for a secondary screen. These constructs are scaled and a total membrane fraction prepared and solubilized in four different detergents. Following ultracentrifugation to remove detergent-insoluble material, lysates are analyzed by fluorescence detection size exclusion chromatography (FSEC). Monitoring the size exclusion profile by GFP fluorescence provides information about the mono-dispersity and integrity of the membrane proteins in different detergents. Protein: detergent combinations that elute with a symmetrical peak with little or no free GFP and minimum aggregation are candidates for subsequent purification. Using the above methodology, the heterologous expression in E. coli of SED (shape, elongation, division, and sporulation) proteins from 47 different species of bacteria was analyzed. These proteins typically have ten transmembrane domains and are essential for cell division. The results show that the production of the SEDs orthologues in E. coli was highly variable with respect to the expression levels and integrity of the GFP fusion proteins. The experiment identified a subset for further investigation.

Green Fluorescent Protein-based Expression Screening of Membrane Proteins in Escherichia coli

A streamlined approach to screening for the expression of recombinant membrane proteins in Escherichia coli based on fusion to green fluorescent protein is presented.

막 단백질의 녹색 형광 단백질 기반의 표현 상영에<em&gt; 대장균</em

The production of recombinant membrane proteins for structural and functional studies remains technically challenging due to low levels of expression and ...

Super-Resolution Imaging of Bacterial Secreted Proteins Using Genetic Code Expansion

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host cells. Upon entry, the injected effector proteins cooperatively modulate eukaryotic signaling pathways and reprogram cellular functions, enabling bacterial entry and survival. Monitoring and localizing these secreted effector proteins in the context of infections provides a footprint for defining the dynamic interface of host-pathogen interactions. However, labeling and imaging bacterial proteins in host cells without disrupting their structure/function is technically challenging. 
Constructing fluorescent fusion proteins does not resolve this problem, because the fusion proteins jam the secretory apparatus and thus are not secreted. To overcome these obstacles, we recently employed a method for site-specific fluorescent labeling of bacterial secreted effectors, as well as other difficult-to-label proteins, using genetic code expansion (GCE). This paper provides a complete step-by-step protocol to label Salmonella secreted effectors using GCE site-specifically, followed by directions for imaging the subcellular localization of secreted proteins in HeLa cells using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM) 
Recent findings suggest that the incorporation of non-canonical amino acids (ncAAs) via GCE, followed by bio-orthogonal labeling with tetrazine-containing dyes, is a viable technique for selective labeling and visualization of bacterial secreted proteins and subsequent image analysis in the host. The goal of this article is to provide a straightforward and clear protocol that can be employed by investigators interested in conducting super-resolution imaging using GCE to study various biological processes in bacteria and viruses, as well as host-pathogen interactions.

This article provides a straightforward and clear protocol to label Salmonella secreted effectors using genetic code expansion (GCE) site-specifically and image the subcellular localization of secreted proteins in HeLa cells using direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM)

유전자 코드 확장을 이용한 박테리아 분비 단백질의 초고해상도 이미징

Type three secretion systems (T3SSs) enable gram-negative bacteria to inject a battery of effector proteins directly into the cytosol of eukaryotic host ...

녹색 형광 단백질 박테리아에서 감염 하는 동안 전달 하는 이펙터를 시각화 하기 위해 시스템을 분하시오

요약

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