LPE는 스코틀랜드의 수석 임상 연구원이며, 최고 과학자 사무소 (SCD/03)의 지원을 인정합니다. 이 작품은 LPE​​ (089930)에 웰컴 트러스트 프로젝트 기금의 지원을받는되었다. NARG은 웰컴 트러스트 프로그램 기금 (080088)과 장비 부여 (075470) (DeltaVision 용), 의해 FP7 - 2007-2013 기금 (건강-F2-2010-260338 - ALLFUN)에 의해 재정 지원되었다. 우리는 도움 지원과 조언을 특정 케빈 맥켄지의 애버딘 (Aberdeen) 영상 시설의 대학, 감사드립니다.

1. C. 알비 칸스 성장과 조건 <ol><li> 1 ML 1 M NaOH, 10 ML 1퍼센트 (w / V) 아데닌 hemisulphate의 소금과 20g 기술 한천 (이전 11에 자세히 설명), 아미노산없이 6.9 g 효모 질소베이스를 추가하여 SC-우라 한천 플레이트를 준비합니다. 소주 H 2 O.으로 900 ML에 볼륨을 확인 압력솥, 한천은 냉각 할 수 있지만, 고체화 한 후 무균 조건 하에서 50 ML 멸균 40 % D-포도당 50 ML 멸균 4% SC-우라 중퇴를 추가하는 것만으로는 충분하지. 믹스, 페트리 접시에 부어과 시원하고 더욱 강화하기 위해 한천 플레이트를 두십시오. 저장 한천 플레이트 5시 ° C 사용까지. </li><li> 승리 C. 알비 칸스 혈청 형 변형 CAI4 + CIp10 글리세롤 주식에서 -80에 저장 ° C SC-우라 한천 플레이트로. </li><li> 30에서 판을 길러 ° C까지 5시에 식민지 양식 및 매장 ° C. </li><li> 문화 단일 C. 알비 칸스 5 ML SC-우라 미디어 (1.1에서와 같이하지만, 기술적 인 한천이없는 제조법)에서 식민지와 30에서 하루 아침에 품다고정 단계 C.를 생성하는 ° C, 200 RPM 알비 칸스. </li></ol> 2. C. Fluorescein의 Isothiocyanate을 사용하여 알비 칸스의 착색 (FITC) <ol><li> 10 μl C. 추가하기 알비 칸스 하루 아침에 990 μl PBS (산도 7.4)에 대한 문화와는 혈구를 사용하여 셀 카운트를 수행합니다. </li><li> C.의 시각화를 돕기 위해 phagocytosis의 assays 중 알비 칸스은 1 얼룩 × 10 8 C.를 어둠 속에서 실온에서 10 분 동안 0.05 M 탄산 - 중탄산염 버퍼 (산도 9.6)에 1 MG / ML FITC를 사용하여 알비 칸스. </li><li> 언 바운드 FITC를 제거하려면, C.을 씻어 5 분 3,000 1 ML 1 개 PBS, 원심 분리기 × g에서 알비 칸스, 1 ML 1 개 PBS에서 표면에 뜨는 및 resuspend 펠렛을 제거합니다. 3 회 반복합니다. </li><li> 1에 Resuspend 펠릿 × 10 6 세포 / 1 개 PBS에서 μl. </li></ol> 3. J774.1 마우스 대 식세포 셀 라인의 작성 <ol><li> 75cm 두 조직의 J774.1 대 식세포를 유지DMEM 매체의 문화 플라스크이 10 %로 보충 (V / V) 태아 송아지 혈청 (FCS), 200 U / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신과 2 37 ° C와 5 % CO 2에서 MM L-글루타민. 주요 식세포의 준비는 세부 12, 13의 다른 곳에서 설명되어 있습니다. </li><li> 조직 배양 플라스크에서 J774.1 세포를 긁어 50 ML 팔콘 튜브에 전송할 수 있습니다. 세포 펠렛을 구하는 5 분에 600 × g에서 원심 분리기. </li><li> 10 ML 미리 따뜻하게 보충 DMEM 매체에 표면에 뜨는 및 resuspend 펠렛을 제거합니다. 35mm 유리 기반의 영상 접시에 DMEM 매체 보충이 ML에 혈구와 플레이트 1 × 10 6 J774.1 대 식세포를 사용하여 셀을 계산합니다. 37 박 품다 ° C, 5 % CO 2. </li><li> 이전 이미지에와 보충 DMEM 매체를 대체이 ML CO 2 독립적 인 매체 (10 % (V / V) 태아 송아지 혈청 (FCS), 200 U / ML 페니실린 / 스트렙토 마이신, 2 MM L-글루타민 포함) 보충 사전 따뜻하게 1 μM LysoTracker 레드 DND-99을 포함.</li></ol> 4. 라이브 셀 비디오 현미경 Phagocytosis 분석 <ol><li> 현미경의 선택은 로컬 사용할 수있는 의존되지만, 현미경 설치가 역 단계, 37에 가​​열 환경 챔버를 포함해야합니다 ° C와 선택한 얼룩에 여기 / 방출 필터 (FITC와 TRITC). </li><li> 실험하기 전에 현미경 히터의 전원을 켜고 37 따뜻하게 환경 제어 챔버에 대한 충분한 시간을 허용 ° C. 안정화하기 위해 챔버 온도에 대한 촬영 시간은 다른 현미경 설정에 따라 다를 수 있습니다. </li><li> 현미경과 컴퓨터를 켠 이미징 소프트웨어를로드합니다. 현미경 무대에서 이미징 요리를 탑재하고 J774.1 대 식세포를 찾아 초점을 조정합니다. 전송 빛과 노출 시간의 비율을 조정하여 TRITC 및 DIC 이미지의 모양을 최적화 할 수 있습니다. </li><li> 이미징 요리를 제거하고 추가 3 × 10 6 FITC-스테인드 C. t에 알비 칸스그는 요리. 시간을 녹화하는 것이 C. 알비 칸스는 요리에 추가됩니다. 무대에 요리를 반환하고 FITC 이미지의 모양 필요한 경우를 최적화 할 수 있습니다. 필요한 경우 포인트 목록을 설정합니다. </li><li> 모든 점에 초점에 있고 채널을 최적화 할 때 이미지 하십시요. FITC, TRITC 및 DIC 이미지를 6 시간에 대한 분마다 캡처합니다. </li></ol>

<ol>
	<li>McKenzie, C. G. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contribution+of+Candida+albicans+cell+wall+components+to+recognition+by+and+escape+from+murine+macrophages.">Contribution of Candida albicans cell wall components to recognition by and escape from murine macrophages.</a> Infect. Immun. 78, 1650-1658 (2010).</li><li>Mora-Montes, H. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recognition+and+blocking+of+innate+immunity+cells+by+Candida+albicans+chitin.">Recognition and blocking of innate immunity cells by Candida albicans chitin.</a> Infect. 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Cell Biol. , (2012).</li><li>Seider, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+facultative+intracellular+pathogen+Candida+glabrata+subverts+macrophage+cytokine+production+and+phagolysosome+maturation.">The facultative intracellular pathogen Candida glabrata subverts macrophage cytokine production and phagolysosome maturation.</a> J. Immunol. 187, 3072-3086 (2011).</li><li>Sheth, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycosylation+status+of+the+C.+albicans+cell+wall+affects+the+efficiency+of+neutrophil+phagocytosis+and+killing+but+not+cytokine+signalling.">Glycosylation status of the C. albicans cell wall affects the efficiency of neutrophil phagocytosis and killing but not cytokine signalling.</a> Med. Mycol. (5), 513-524 (2011).</li><li>Lewis, L. 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P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+regulation+of+phagosome+maturation+in+macrophages+and+dendritic+cells+mediated+by+Rho+GTPases+and+ezrin-radixin-moesin+(ERM)+proteins.">Differential regulation of phagosome maturation in macrophages and dendritic cells mediated by Rho GTPases and ezrin-radixin-moesin (ERM) proteins.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103 (34), 12825-12830 (2006).</li></ol>

저자는 공개 할 수 없어요. NG는 길르앗 과학의 기초 연구에 대한 제한 기금 지원받는 것입니다. LE는 초기 약물 개발에 GSK의 컨설턴트로 작동합니다.

다음은 대 식세포의 phagocytosis를 공부하는 라이브 세포의 비디오 현미경의 사용에 대한 방법을 설명합니다. 비디오 현미경 분석에 대한 정보의 여러 추가 레이어를 제공합니다. 하나의 기본 장점은 이해 데이터가 6 시간 관찰 기간 동안 어떤 시점에 (하나의 실험에서) 생성 할 수 있다는 것입니다. 더 중요한 것은, 설명 방법은 phagocytosis의 각 단계의 차등 분석을 할 수 있습니다. 우리는 예를 들어, 표시 한 그 C.의 전반적인 이해의 변화 대 식세포 세포 라인과 기본 식세포에 의한 알비 칸스의 글리코 실화와 morphogenesis의 돌연변이는 세포 세포 접촉 한 대상 셀 또는 engulfment의 속도에 대한 대 식세포의 이동의 변화 7 설립 중 결과가 될 수 있습니다. 이러한 실험을 실시 할 때 피해야 할 함정에는 여러가지가 있습니다. 첫째, 실험 proce에 걸쳐 안정된 환경 조건을 보장하기 위해 매우 중요합니다dure. 이것은 가장 몇 시간 실험을 시작하기 전에 실험 조건으로 설정되어 환경 챔버에 달성된다. 비디오 품질은 Z-위치에 관계없이 따라서 수동 초점 수정에 대한 필요성을 제거 기계적 또는 열 변경 자동으로 샘플을 유지하기 위해 적외선 레이저를 사용하여 정교한 모듈에 크게 의존합니다. 실험의 확장 특성을 감안할 때, 그것은 낮은 노출 시간을 용이하게 높은 형광 마커를 채용하여 최소화 할 수 있습니다 레이저 빛에 노출과 관련 photobleaching과 photoconversion 효과를 제한하는 것이 중요합니다. 여기에 설명 된 FITC 염색 프로토콜은 빠르고 신뢰할 수 있습니다. FITC는 바와 같이 매우 밝고 안정적​​인 얼룩, 낮은 노출 시간이 필요하며이 오랜 시간 경과 영화에 대한 FITC 이상적입니다. 그러나, 우리는 정기적으로 Calcofluor 화이트와 PKH 염료뿐만 아니라 태그 생물을 포함하여 다른 대상 얼룩의 다양한 사용합니다. 본 연구 동안 이미지는 6 시간의 phagocytosis 분석 이상 1 분 간격으로 촬영되었다. 이미지 사이의 간격은 조사중인 프로세스에 따라 조정할 수 있습니다. 이러한 기공을 갖는 인신 매매와 같은 빠른 프로세스를 조사 할 때 예를 들어, 간격이 감소 될 수있다. 최소 시간 간격은 현미경과 카메라 사양에 의해 제한됩니다. 타이밍을 조정하면 명심 몇 가지 고려 사항이 있습니다. 첫째, 스냅 샷 사이의 간격을 조절하면 적은 포인트가 이미징 될 수 있으며, 파일 크기가 상당히 증가 할 것이라는 것을 의미합니다. 반대로, 너무 많은 이미지 간격을 증가하면 동영상이 연속성을 잃게 할 것입니다. 이 접근 방식은 적용 할 수 있습니다원칙적으로 다른 병원체와 호스트 세포를 죽음의 이해를 공부합니다. 예를 들어, 최근 sialoadhesin - 결핍 생쥐에서 뼈 골수 유래 대 식세포이 크게 sialylated 캄 필로 박터 속 jejuni 8 구속력과 phagocytosis 감소 전시 것으로 나타났습니다. 이미지 분석 대상 셀 크기의 감소와 점점 더 어려워진다 그러나 대상 크기는 가능성의 중요한 결정자입니다. 정교한 이미지 분석 소프트웨어는 빠른 비디오 현미경 분석을 위해 필수적이며,이은 7 개별 셀 및 전체 세포 인구의 이주를 공부하는 알고리즘의 생성을 촉진하기 위해 적절한 생물 정보학 지원과 결합해야합니다. 마이그레이션 및 개인 대 식세포 - C.albicans 상호 작용의 분 별 분 분석을위한 정교한 이미지 분석 소프트웨어와 함께 라이브 셀 비디오 현미경은 C.의 복잡성에 독특한 통찰력을 제공합니다 macrophag로 알비 칸스 phagocytosis에스. 다른 병원체와 phagocytes을 (수지상 세포, 호중구) 공부하고, 더 자세하게 또는 상피 및 내피 세포 레이어와 같은 더 많은 생리 표면에 이미지 셀 셀의 상호 작용에 3D 비디오 현미경을 개발하기 위해이 방법을 확장 할 무한한 잠재력이 있습니다. 이 기술은 호스트 병원체 상호 작용의 연구에서 도구의 다음 세대의 일부입니다 및 동적 프로세스의 광범위한에 대한 자세한 공간과 측두엽 정보를 생성하는 데 도움이됩니다.

<table border="1"><tbody><tr><td> 시약의 이름 </td><td> 회사 </td><td> 카탈로그 번호 </td></tr><tr><td> 아미노산이없는 효모 질소 기지 </td><td> Formedium </td><td> CYN0402 </td></tr><tr><td> NaOH </td><td> 시그마 </td><td> S5881-500G </td></tr><tr><td> 아데닌 hemisulphate 소금 </td><td> 시그마 </td><td> A3159-25g까지 </td></tr><tr><td> 한천 기술 (제 3) </td><td> Oxoid </td><td> LP0013 </td></tr><tr><td> D-글루코오스 </td><td> 시그마 </td><td> G7021-1KG </td></tr><tr><td> SC-우라 중퇴 </td><td> Formedium </td><td> DSCK102 </td></tr><tr><td> FITC </td><td> 시그마 </td><td> F7250-1G </td></tr><tr><td> 나트륨 탄산 </td><td> BDH </td><td> 301215M </td></tr><tr><td> 나트륨 중탄산염 </td><td> BDH </td><td> 102475W </td></tr><tr><td> PBS </TD&gt; <td> Gibco </td><td> 18912-014 </td></tr><tr><td> DMEM </td><td> Lonza </td><td> BE12-614F </td></tr><tr><td> FCS </td><td> 생명 기술 </td><td> 10106169 </td></tr><tr><td> 페니실린 / 스트렙토 마이신 </td><td> PAA </td><td> P11-010 </td></tr><tr><td> L-글루타민 </td><td> Lonza </td><td> BE17-605E </td></tr><tr><td> LysoTracker 레드 DND-99 </td><td> Invitrogen </td><td> L7528 </td></tr><tr><td> 35mm 유리 요리 </td><td> PAA </td><td> PAA12305160X </td></tr></tbody></table>

live-cell video microscopy of fungal pathogen phagocytosis

곰팡이 병원균 등 일반적으로 미생물의 Phagocytic 간격은 4 개의 독특한 스테이지로 구성되어 고려 될 수있다 : 병원균이있는 사이트에 phagocytes의은 (i) 이전, 패턴을 통해 병원체 - 관련 분자 패턴 (PAMPs)의 (II) 인식 인식 수용체 (PRRs), 식세포 세포막에 바인딩 된 미생물의 (III) engulfment, 그리고 성숙 phagosomes 및 섭취 입자의 소화에서 빨아 세포 (IV) 처리. 전체 phagocytosis를 평가 연구 1, 2, 3, 4, 5 유익한이다, 그러나 일반적으로 differentially에 영향을 줄 수 있습니다 마이그레이션, engulfment 및 phagosome 성숙로 과정을 파괴하지 않는 점에서 제한됩니다. 또한, 이러한 연구는 단일 이벤트로,보다 지속적으로 동적 과정으로 이해를 신고 할 수 있습니다. 우리는 최근 고급 라이브 세포 이미징 기술을 개발하고, 모두의 유전자 기능 분석과 이들을 통합 한병원체와 호스트 세포는 타고난 면역 세포 기능과 곰팡이 pathogenesis의 분석을위한 크로스 징계 플랫폼을 만들 수 있습니다. 이 연구는 인간의 phagocytes과 곰팡이 병원균에 더 일반적으로 전염성 미생물의 분자와 세포의 상호 작용 체계 시간적 분석을 사용하여 관찰 할 수 phagocytosis의 소설 측면을 공개했습니다. 예를 들어, 우리는 다음을 정의하기 시작했습니다 (A) 세포 표면의 구성 요소는 인식, engulfment 및 곰팡이 세포 1, 6, 7, 8, 9, 10의 살해 과정의 각 단계에 필요한, (b)는 얼마나 표면 형상 대 식세포의 이해와 효모와 hyphal 세포 7 살해의 효율성에 영향을 미친다, 그리고 (c) engulfment는 세포주기와 대 식세포 9, 10의 행동의 변화로 연결하는 방법. 하나의 시점 스냅 샷 대조적으로, 라이브 셀 비디오 현미경은 공동으로 연구 할 호스트 세포와 병원균의 다양한 수셀 마이그레이션, 복제 및 기공을 갖는 거래 등의 동적 프로세스의 넓은 범위에 공간과 시간적 정보를 제공 긴 기간 동안 ntinuous 시퀀스. 여기 호스트 및 곰팡이 세포를 준비하는, 비디오 현미경 실험을 수행하는 방법에 대해 자세히 설명합니다. 이 방법은 다른 phagocytes 및 미생물과 미래 연구를위한 사용자 가이드를 제공 할 수 있습니다.

여기 C.에 대한 대표적인 결과를 보여 6 시간 라이브 셀 비디오 현미경 실험 동안 손쥐 대 식세포 세포 라인 J774.1로 알비 칸스의 이해. 그림 1은 C.의 phagocytosis를 보여주는 대표적인 라이브 셀 비디오 현미경 영화입니다 손쥐 J774.1 대 식세포에 의한 알비 칸스. 라이브 셀 비디오 현미경은 C.의 내면화 수 외부 칸디다을 착색 할 필요없이 보여 질 수있는 알비 칸스. 그러나, 이러한 실험 중, C. 알비 칸스은 대 식세포의 phagosome의 산성화 동안 침묵하는 산도에 민감한 염료 FITC (녹색)를 사용하여 얼룩이, 그리고 칸디다는 (그림 1) internalized되었음을 확인을 용이하게했다. 섭취 C.의 추가 원조 시각화에 알비 칸스, 대 식세포는 붉은 색 형광 염료 LysoTracker 붉은 DND-99, 얼룩 산성 격실과 phagosome 성숙의 비 특정 마커 역할을 사용하여 얼룩 져 있었다.그림 2는 라이브 셀 비디오 현미경 실험에서 스틸 이미지이며, C.의 수에 변화를 보여줍니다 알비 칸스 개별 J774.1 대 식세포에 의해 섭취. 이 실험에서 J774.1 대 식세포의 82 %가 적어도 하나의 C.을 빨아 6 시간의 phagocytosis 분석의 끝에 알비 칸스 셀. 그림 3, internalized C.의 수가 대 식세포 당 알비 칸스 세포가보고됩니다. C.의 평균 수 대 식세포 당 최대 촬영 알비 칸스는 3.4이지만, 흥미로운 식세포는 16 곰팡이 세포까지 처리 할 수 있습니다. 그림 4 대 식세포 phagocytosing C.를 보여주는 대표적인 라이브 셀 비디오 현미경 실험에서 스틸 이미지의 순서입니다 알비 칸스 세포, 대 식세포, 그리고 궁극적으로 대 식세포 용해와 hypha 성장. 그림 4 그 비디오 현미경 타겟 세포의 engulfment에 따라 이벤트의 분석을 가능하게 보여줍니다, 즉 데이터는 기가를 생성 할 수 있습니다C.에 의해 대 식세포의 lling 섭취 대상 세포의 수와 morphogenesis와 관련하여 알비 칸스 균사 방법 및 대 식세포의 살인은 실시간으로 공부를 할 수 phagosome 성숙에 관한 것이다. 그림 1. C.의 phagocytosis를 보여주는 라이브 셀 비디오 현미경 영화 손쥐 J774.1 대 식세포에 의한 알비 칸스. 대 식세포는 붉은 색 형광 염료 LysoTracker 붉은 DND-99 및 C를 사용하여 묻은 알비 칸스는 FITC (녹색)를 사용하여 얼룩 져 있습니다. 대 식세포와 C. 알비 칸스 2 독립적 인 매체 전체 CO에서 37 ° C에서 6 시간의 기간 동안 공동 배양 하였다. 이미지는 6 시간 1 분 간격으로 촬영되었다. 대 식세포는 C.와 함께 세포 세포 접촉을 수립 볼 수 있습니다 그리고 C.의 이해가옵니다 알비 칸스, 대 식세포의 phagosomes에 알비 칸스. 화살표 C.를 가리 킵니다 알비 칸스 전에 J774.1 대 식세포에 의해 engulfment합니다. 이 동영상은 또한 FITC의 형광이 quenc입니다 보여줍니다C.의 쓰인 다음과 engulfment 알비 칸스. 규모 바, 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50196/50196fig1.avi" target="_blank">동영상을 보려면 여기를 클릭하십시오</a> . <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig2.jpg" /> 개인 대 식세포에 의해 빨아 C.albicans의 수가 그림 2. 대표 라이브 셀 비디오 현미경 스틸 이미지 표시 변화. 대 식세포 (스테인드 LysoTracker 붉은 색 사용 DND를 99) FITC-스테인드 C.와 공동 배양 한 알비 칸스 (녹색). 변화는 C.의 수에있다 알비 칸스은 (화살표 옆에 숫자가 C. 알비 칸스의 수는 빨아 나타냅니다) 빨아, 그리고 C.에 알비 칸스 형태 (예 : 효모 구절 hypha). 스케일 바, 20 μm. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig3.jpg" /> 그림 3. C.의 수를 보여주는 그래프 알비 칸스 6 시간의 phagocytosis의 assays의 끝에서 J774.1 손쥐 대 식세포 당 섭취. 데이터는 2 독립적 인 실험을 나타냅니다. 100 대 식세포의 총 600 개인 대 식세포의 총을 제공, 각 실험에서 3 분야에서 인정되었다. <img alt="그림 4" src="/files/ftp_upload/50196/50196fig4.jpg" /> 그림 4. 대표 라이브 셀 비디오 현미경 대 식세포를 보여주는 실험 (M)와 C.에서 이미지의 일련의 알비 칸스 (C) 이전과 인식 (A, B) 동안, 그리고 (C, D). C.에게 동안과 이해 후 알비 칸스 균사가 대 식세포의 용해 (G) 될 수있는 대 식세포 (E, F), 내 성장을 계속한다. 다른 대 식세포가 파열 및 출시 C.를 처리하기 위해 시도의 사이트로 모집 알비 칸스 (H). 대 식세포는 붉은 색 형광 염료 LysoTrac를 사용 묻은ker 붉은 DND-99, 그리고 C. 알비 칸스는 FITC (녹색)를 사용하여 얼룩 져 있습니다. FITC 염색은 C.에 따라 침묵이 오니, 이용에 참고하여 J774.1 대 식세포 (C)에 의해 알비 칸스 이해. 스케일 바, 10 μm.

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Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

우리는 라이브 세포 영상 현미경에 대한 방법을 설명<em&gt; 칸디다 알비 칸스</em대 식세포에 의해&gt; phagocytosis. 이 방법은 대 식세포 마이그레이션, 인식, engulfment과 phagosome 성숙의 단계 별 분석을 사용하고 phagocytosis의 소설 측면을 알 수있다.

곰팡이 병원체 Phagocytosis의 라이브 셀 비디오 현미경

Phagocytic clearance of fungal pathogens, and microorganisms more generally, may be considered to consist of four distinct stages: (i) migration of ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

38.8K 조회수.  University of Aberdeen. 우리는 라이브 세포 영상 현미경에 대한 방법을 설명 칸디다 알비 칸스 phagocytosis. 이 방법은 대 식세포 마이그레이션, 인식, engulfment과 phagosome 성숙의 단계 별 분석을 사용하고 phagocytosis의 소설 측면을 알 수있다.

비디오: Live-cell Video Microscopy of Fungal Pathogen Phagocytosis

Direct Observation of Phagocytosis and NET-formation by Neutrophils in Infected Lungs using 2-photon Microscopy

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an effective gas exchange must be maintained, while at the same time avoiding infection by the multiple pathogens that are inhaled 
during normal breathing. To achieve this, a superb set of defense strategies combining humoral and cellular immune mechanisms exists. One of the most 
effective measures for acute defense of the lung is the recruitment of neutrophils, which either phagocytose the inhaled pathogens or kill them by 
releasing cytotoxic chemicals. A recent addition to the arsenal of neutrophils is their explosive release of extracellular DNA-NETs by which bacteria 
or fungi can be caught or inactivated even after the NET releasing cells have died. We present here a method that allows one to directly observe neutrophils, 
migrating within a recently infected lung, phagocytosing fungal pathogens as well as visualize the extensive NETs that they have produced throughout the 
infected tissue. The method describes the preparation of thick viable lung slices 7 hours after intratracheal infection of mice with conidia of the mold 
Aspergillus fumigatus and their examination by multicolor time-lapse 2-photon microscopy. This approach allows one to directly investigate antifungal 
defense in native lung tissue and thus opens a new avenue for the detailed investigation of pulmonary immunity.

We show, how to use 2-photon microscopy for the observation of the dynamics of neutrophil granulocytes in infected lungs while they phagocytose pathogens or produce neutrophil extracellular traps (NETs).

2 광자 현미경을 사용하여 감염된 폐의 Neutrophils에 의해 Phagocytosis와 NET - 형성의 직접 관측

After the gastrointestinal tract, the lung is the second largest surface for interaction between the vertebrate body and the 
environment. Here, an ...

연구

면역학 및 감염병학

Use of an Optical Trap for Study of Host-Pathogen Interactions for Dynamic Live Cell Imaging

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and temporal control between the phagocytic cell and microbe has rendered focused observations into the initial interactions of host response to pathogens difficult. Historically, intercellular contact events such as phagocytosis3 have been imaged by mixing two cell types, and then continuously scanning the field-of-view to find serendipitous intercellular contacts at the appropriate stage of interaction. The stochastic nature of these events renders this process tedious, and it is difficult to observe early or fleeting events in cell-cell contact by this approach. This method requires finding cell pairs that are on the verge of contact, and observing them until they consummate their contact, or do not. To address these limitations, we use optical trapping as a non-invasive, non-destructive, but fast and effective method to position cells in culture.
Optical traps, or optical tweezers, are increasingly utilized in biological research to capture and physically manipulate cells and other micron-sized particles in three dimensions4. Radiation pressure was first observed and applied to optical tweezer systems in 19705, 6, and was first used to control biological specimens in 19877. Since then, optical tweezers have matured into a technology to probe a variety of biological phenomena8-13.
We describe a method14 that advances live cell imaging by integrating an optical trap with spinning disk confocal microscopy with temperature and humidity control to provide exquisite spatial and temporal control of pathogenic organisms in a physiological environment to facilitate interactions with host cells, as determined by the operator. Live, pathogenic organisms like Candida albicans and Aspergillus fumigatus, which can cause potentially lethal, invasive infections in immunocompromised individuals15, 16 (e.g. AIDS, chemotherapy, and organ transplantation patients), were optically trapped using non-destructive laser intensities and moved adjacent to macrophages, which can phagocytose the pathogen. High resolution, transmitted light and fluorescence-based movies established the ability to observe early events of phagocytosis in living cells. To demonstrate the broad applicability in immunology, primary T-cells were also trapped and manipulated to form synapses with anti-CD3 coated microspheres in vivo, and time-lapse imaging of synapse formation was also obtained. By providing a method to exert fine spatial control of live pathogens with respect to immune cells, cellular interactions can be captured by fluorescence microscopy with minimal perturbation to cells and can yield powerful insight into early responses of innate and adaptive immunity.

A method is described to individually select, manipulate, and image live pathogens using an optical trap coupled to a spinning disk microscope. The optical trap provides spatial and temporal control of organisms and places them adjacent to host cells. Fluorescence microscopy captures dynamic intercellular interactions with minimal perturbation to cells.

동적 라이브 셀 이미징에 대한 호스트 병원체 상호 작용 연구를위한 광학 트랩의 사용

Dynamic live cell imaging allows direct visualization of real-time interactions between cells of the immune system1, 2; however, the lack of spatial and ...

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not representative of the behavior, status or phenotype of single cells. Due to this new insight the number of single cell studies rises continuously (for recent reviews see 1,2,3). However, many of the single cell techniques applied do not allow monitoring the development and behavior of one specific single cell in time (e.g. flow cytometry or standard microscopy).
Here, we provide a detailed description of a microscopy method used in several recent studies 4, 5, 6, 7, which allows following and recording (fluorescence of) individual bacterial cells of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae through growth and division for many generations. The resulting movies can be used to construct phylogenetic lineage trees by tracing back the history of a single cell within a population that originated from one common ancestor. This time-lapse fluorescence microscopy method cannot only be used to investigate growth, division and differentiation of individual cells, but also to analyze the effect of cell history and ancestry on specific cellular behavior. Furthermore, time-lapse microscopy is ideally suited to examine gene expression dynamics and protein localization during the bacterial cell cycle. The method explains how to prepare the bacterial cells and construct the microscope slide to enable the outgrowth of single cells into a microcolony. In short, single cells are spotted on a semi-solid surface consisting of growth medium supplemented with agarose on which they grow and divide under a fluorescence microscope within a temperature controlled environmental chamber. Images are captured at specific intervals and are later analyzed using the open source software ImageJ.

Live Cell Imaging of Bacillus subtilis and Streptococcus pneumoniae using Automated Time-lapse Microscopy

This protocol provides a step-by-step procedure to monitor single cell behavior of different bacteria in time using automated fluorescence time-lapse microscopy. Furthermore, we provide guidelines how to analyze the microscopy images.

라이브 셀 이미징 바실러스 subtilis과 연쇄상 구균 pneumoniae 자동 시간 저속 현미경을 사용하여

During the last few years scientists became increasingly aware that average data obtained from microbial population based experiments are not ...

Visualization of Bacterial Toxin Induced Responses Using Live Cell Fluorescence Microscopy

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external environment. The cell can either recover from this insult, which requires active membrane repair processes, or else die depending on the amount of toxin exposure and cell type1. In addition, these toxins induce strong inflammatory responses in infected hosts through activation of immune cells, including macrophages, which produce an array of pro-inflammatory cytokines2. Many Gram positive bacteria produce cholesterol binding toxins which have been shown to contribute to their virulence through largely uncharacterized mechanisms.
Morphologic changes in the plasma membrane of cells exposed to these toxins include their sequestration into cholesterol-enriched surface protrusions, which can be shed into the extracellular space, suggesting an intrinsic cellular defense mechanism3,4. This process occurs on all cells in the absence of metabolic activity, and can be visualized using EM after chemical fixation4. In immune cells such as macrophages that mediate inflammation in response to toxin exposure, induced membrane vesicles are suggested to contain cytokines of the IL-1 family and may be responsible both for shedding toxin and disseminating these pro-inflammatory cytokines5,6,7. A link between IL-1&beta; release and a specific type of cell death, termed pyroptosis has been suggested, as both are caspase-1 dependent processes8. To sort out the complexities of this macrophage response, which includes toxin binding, shedding of membrane vesicles, cytokine release, and potentially cell death, we have developed labeling techniques and fluorescence microscopy methods that allow for real time visualization of toxin-cell interactions, including measurements of dysfunction and death (Figure 1). Use of live cell imaging is necessary due to limitations in other techniques. Biochemical approaches cannot resolve effects occurring in individual cells, while flow cytometry does not offer high resolution, real-time visualization of individual cells. The methods described here can be applied to kinetic analysis of responses induced by other stimuli involving complex phenotypic changes in cells.

Methods for purifying the cholesterol binding toxin streptolysin O from recombinant E. coli and visualization of toxin binding to live eukaryotic cells are described. Localized delivery of toxin induces rapid and complex changes in targeted cells revealing novel aspects of toxin biology.

라이브 세포 형광 현미경을 사용하여 박테리아 독소 유도 응답의 시각화

Bacterial toxins bind to cholesterol in membranes, forming pores that allow for leakage of cellular contents and influx of materials from the external ...

Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or pathogenic effects depending on the inflammatory milieu. Nonetheless, despite the indispensable role of neutrophils in immunity, detailed understanding of the molecular factors that mediate neutrophils' effector and immunopathogenic effects in different infectious diseases and inflammatory conditions is still lacking, partly because of their short half life, the difficulties with handling of these cells and the lack of reliable experimental protocols for obtaining sufficient numbers of neutrophils for downstream functional studies and adoptive transfer experiments. Therefore, simple, fast, economical and reliable methods are highly desirable for harvesting sufficient numbers of mouse neutrophils for assessing functions such as phagocytosis, killing, cytokine production, degranulation and trafficking. To that end, we present a reproducible density gradient centrifugation-based protocol, which can be adapted in any laboratory to isolate large numbers of neutrophils from the bone marrow of mice with high purity and viability. Moreover, we present a simple protocol that uses CellTracker dyes to label the isolated neutrophils, which can then be adoptively transferred into recipient mice and tracked in several tissues for at least 4 hr post-transfer using flow cytometry. Using this approach, differential labeling of neutrophils from wild-type and gene-deficient mice with different CellTracker dyes can be successfully employed to perform competitive repopulation studies for evaluating the direct role of specific genes in trafficking of neutrophils from the blood into target tissues in vivo.

We describe a protocol for isolation and purification of neutrophils from mouse bone marrow by density gradient centrifugation and for neutrophil labeling using CellTracker dyes. This represents a simple, fast, reproducible and economical method for obtaining large numbers of neutrophils for downstream functional studies or adoptive transfer and tracking experiments.

분리, 정제 및 기능 연구 및 입양 전송 실험 쥐의 골수 호중구의 라벨링

Neutrophils are critical effector cells of the innate immune system. They are rapidly recruited at sites of acute inflammation and exert protective or ...

Live Cell Imaging of Alphaherpes Virus Anterograde Transport and Spread

Advances in live cell fluorescence microscopy techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that express fluorescent fusion proteins have enabled real-time visualization of transport and spread of alphaherpes virus infection of neurons. The utility of novel fluorescent fusion proteins to viral membrane, tegument, and capsids, in conjunction with live cell imaging, identified viral particle assemblies undergoing transport within axons. Similar tools have been successfully employed for analyses of cell-cell spread of viral particles to quantify the number and diversity of virions transmitted between cells. Importantly, the techniques of live cell imaging of anterograde transport and spread produce a wealth of information including particle transport velocities, distributions of particles, and temporal analyses of protein localization. Alongside classical viral genetic techniques, these methodologies have provided critical insights into important mechanistic questions. In this article we describe in detail the imaging methods that were developed to answer basic questions of alphaherpes virus transport and spread.

Live cell imaging of alphaherpes virus infections enables analysis of the dynamic events of directed transport and intercellular spread. Here, we present methodologies that utilize recombinant viral strains expressing fluorescent fusion proteins to facilitate visualization of viral assemblies during infection of primary neurons.

Alphaherpes 바이러스 선행 성 전송 및 확산의 라이브 셀 이미징

Advances in live cell fluorescence microscopy  techniques, as well as the construction of recombinant viral strains that  express fluorescent fusion ...

Assessing Anti-fungal Activity of Isolated Alveolar Macrophages by Confocal Microscopy

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic cells that encounter inhaled fungi and other microbes. Macrophages and other immune cells recognize Aspergillus motifs by pathogen recognition receptors and initiate downstream inflammatory responses. The phagocyte NADPH oxidase generates reactive oxygen intermediates (ROIs) and is critical for host defense. Although NADPH oxidase is critical for neutrophil-mediated host defense1-3, the importance of NADPH oxidase in macrophages is not well defined. The goal of this study was to delineate the specific role of NADPH oxidase in macrophages in mediating host defense against A. fumigatus. We found that NADPH oxidase in alveolar macrophages controls the growth of phagocytosed A. fumigatus spores4. Here, we describe a method for assessing the ability of mouse alveolar macrophages (AMs) to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores (conidia). Alveolar macrophages are stained in vivo and ten days later isolated from mice by bronchoalveolar lavage (BAL). Macrophages are plated onto glass coverslips, then seeded with green fluorescent protein (GFP)-expressing A. fumigatus spores. At specified times, cells are fixed and the number of intact macrophages with phagocytosed spores is assessed by confocal microscopy.

A method to evaluate the ability of isolated mouse alveolar macrophages to control the growth of phagocytosed Aspergillus spores by confocal microscopy.

공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가

The lung is an interface where host cells are routinely exposed to microbes and microbial products. Alveolar macrophages are the first-line phagocytic ...

Loop-mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the absence of effective control clinical coccidiosis can be devastating. Resistance to the chemoprophylactics frequently used to control Eimeria is common and sub-clinical infection is widespread, influencing feed conversion ratios and susceptibility to other pathogens such as Clostridium perfringens. Despite the availability of polymerase chain reaction (PCR)-based tools, diagnosis of Eimeria infection still relies almost entirely on traditional approaches such as lesion scoring and oocyst morphology, but neither is straightforward. Limitations of the existing molecular tools include the requirement for specialist equipment and difficulties accessing DNA as template. In response a simple field DNA preparation protocol and a panel of species-specific loop-mediated isothermal amplification (LAMP) assays have been developed for the seven Eimeria recognised to infect the chicken. We now provide a detailed protocol describing the preparation of genomic DNA from intestinal tissue collected post-mortem, followed by setup and readout of the LAMP assays. Eimeria species-specific LAMP can be used to monitor parasite occurrence, assessing the efficacy of a farm&#8217;s anticoccidial strategy, and to diagnose sub-clinical infection or clinical disease with particular value when expert surveillance is unavailable.

Loop-mediated Isothermal Amplification LAMP Assays for the Species-specific Detection of Eimeria that Infect Chickens

Diagnosis of Eimeria infection in chickens remains demanding. Parasite morphology- and host pathology-led approaches are commonly inconclusive, while molecular approaches based on PCR have proven demanding in cost and expertise. The aim of this protocol is to establish loop-mediated isothermal amplification (LAMP) as a straightforward molecular diagnostic for eimerian infection.

의 종 특이 검출을위한 루프 - 매개 등온 증폭 (LAMP) 분석 실험<em&gt; 에이 메리아</em&gt; 닭을 감염이

Eimeria species parasites, protozoa which cause the enteric disease coccidiosis, pose a serious threat to the production and welfare of chickens. In the ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

편의적 곰팡이 병원균에 형광 태그 유전자의과 유전자 변형<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic cooperation, competition, or predation. The study of biofilms is important in many biological fields, including environmental science, food production, and medicine. However, few studies have focused on such bacterial biofilms, partially due to the difficulty of investigating them. Most of the methods for qualitative and quantitative biofilm analyses described in the literature are only suitable for biofilms forming on abiotic surfaces or on homogeneous and thin biotic surfaces, such as a monolayer of epithelial cells.
While laser scanning confocal microscopy (LSCM) is often used to analyze in situ and in vivo biofilms, this technology becomes very challenging when applied to bacterial biofilms on fungal hyphae, due to the thickness and the three dimensions of the hyphal networks. To overcome this shortcoming, we developed a protocol combining microscopy with a method to limit the accumulation of hyphal layers in fungal colonies. Using this method, we were able to investigate the development of bacterial biofilms on fungal hyphae at multiple scales using both LSCM and scanning electron microscopy (SEM). This report describes the protocol, including microorganism cultures, bacterial biofilm formation conditions, biofilm staining, and LSCM and SEM visualizations.

This protocol describes a new method to grow and qualitatively analyze bacterial biofilms on fungal hyphae by confocal and electron microscopy.