이 작품은 Kinderkrebshilfe의 무지개 Südtirol에 의해 지원 되었다.

1. 절연의 조 혈 골 수 세포 다중 매개 변수 형광 활성화 된 세포 분류에 의해 <ol><li><ol><li>샘플 얼룩이 지는 프로세스를 시작 하기 전에, 다음 항목 수집 필요가 준비: <ol><li>12 x 75 m m 흐름 관 얼룩 세포</li> <li>단의 준비에 대 한 그라데이션 미디어 (GM), 50 mL 원뿔 튜브 셀</li> <li>얼룩 버퍼: 인산 염 (PBS) + 3% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 버퍼링</li> <li>펫 < /l 난 > <li>FC 블록 및 항 체 (CD34 APC, CD36 FITC, CD45 V450 BD Biosciences) 얼룩. 이 형광 색소 조합으로 다른 채널에 무시할 일 좀 하지만 다른 적합 한 형광 색소 결합도 가능 하다.</li>
			<li>보상 구슬 (필요한 경우)</li>
			<li>정지 버퍼: 행 크 &#39; s 균형 소금 솔루션 (HBSS) + 25mm HEPES + 3 %FCS</li>
			<li>Trypan 블루와 hemocytometer</li>
			<li>컬렉션 튜브: 정렬된 셀의 컬렉션에 대 한 높은 혈 청 튜브 (1 mL FCS + 25mm HEPES 포함)와 함께 풍부한 매체를 사용할 수 있습니다.</li>
			<li>골 수 샘플: 엉덩이 뼈의 뒤쪽의 장 골도 머리에서 골 수 생 검에 대 한 동의 일반적으로 필요. 골 수 샘플은 보다 얼룩까지 RT에서 heparinized 주사기에 보관. 다음 프로토콜 단계 기관의 지침에 따라 수행 됩니다 &#39; 인간의 복지에 대 한 s 인간 연구 윤리 위원회.</li>
		</ol></li> <li>골 수 샘플의 단일 세포 현 탁 액을 생성. 원심 분리기 튜브에 GM의 3 mL를 추가 합니다. 조심 스럽게 GM 솔루션에 단일 세포 현 탁 액 4 mL 레이어. 20 ° 섭씨 (C)에서 30 분 550 g에서 원심 분리기 (브레이크 해제). 플라즈마 및 인터페이스에서 단 셀 레이어를 그대로 두고 살 균 피 펫을 사용 하 여 혈소판을 포함 하는 상위 계층의 그립니다. 살 균 피 펫을 사용 하 여 메 마른 분리기 관에 단 세포의 레이어를 전송.</li>
		<li>버퍼 얼룩 5 mL로 세척 후 resuspend 2 mL 정지 버퍼에서 셀 및 셀 농도 결정. 나사 모자 테스트 튜브에 세포 현 탁 액의 장소 5 µ L. 0.2 %Trypan 푸른 얼룩의 95 µ L를 추가 합니다. 철저 하 게 혼합. 실 온에서 5 분 동안 서 서 허용. 셀 계산 서 hemocytometer를 입력 합니다. 현미경으로 관찰 가능한 아닌 경우는 얼룩이 지 고 가능한 셀.</li>
		<li>20 ° C에서 10 분 동안 250 g에서 세포를 원심, 삭제는 상쾌한 고 100 µ L 당 최대 1 x 10 6의 농도에 버퍼를 얼룩에 셀 resuspend.</li>
		<li>블록 FcR 2.5 µ g 당 10-15 분에 대 한 얼음에 1 x 10 6 셀 Fc 블록 사용 하 여</li>
		<li>1 x 10 6 세포 얼룩을 어둠 속에서, 4 ° C에서 20 분 동안 품 어 추가 10 µ g mAb의 적절 한 조합 3 mL 버퍼 얼룩 세척 단계 옵니다. 정확한 보상에 대 한 셀 (또는 선호 보상 구슬)의 작은 aliquots는 물 들일 단일 항 체를 각; 흠 없는 남은 한 약 수.</li>
		<li>20 x 10 6 셀/ml 농도 조정.</li>
		<li>세트 고 셀 정렬 최적화. 교류 cytometer 및 소프트웨어를 설정 하는 프로세스는 회사에서 제공 하는 상세한 지침을 표준화 하 고 적절 하 게 훈련 된 직원에 의해 수행 되어야 할.</li>
	</ol></li> <li>정렬 셀 정렬 <ol><li>단계의 1.1.1.9 컬렉션 튜브 준비.</li>
		<li>이항 음모 앞으로 분산형 (FSC) 및 측면 살포 (SSC) 표시를 포함 하는 서식 파일 설정.</li>
		<li>셀을 실행 하 고 금감위/SSC 규모의 인구를 조정</li>
		<li>부정적인 제어 튜브 기록.</li>
		<li>실행 하는 단일 긍정적인 통제 관, 각 관에 대 한 데이터를 기록.</li>
		<li>수집 소프트웨어에서 제공 하는 기능으로 수동 또는 자동으로 보상을 계산.</li>
		<li>실험 샘플을 확보 하 고에 이항 FSC/SSC 점 ( 그림 1A) 림프 및 골수성 세포를 포함 하도록 게이트. FSC (즉, 높이, 너비, 및 지역)의 다른 신호를 비교 하 여 남자와 집계 제외 ( 그림 1B). CD45 및 CD36 표시 이항 도트에 내의 셀을 시각화 ( 그림 1C). CD45에 대 한 긍정적인 이벤트는 백혈구 (를 포함 하 여 그들의 창시자), 그 CD45에 대 한 부정적인 CD36에 대 한 긍정적인 erythroid 창시자는. CD45 + 세포 제어 도구 정의 CD36 + (해당 되는 경우,이 세포 분할 될 수 있다 더 높은 CD36에 및 셀 낮은 표현)를 사용 하 여. CD45 + 이벤트 CD34 및 SSC 매개 변수를 표시 하는 또 다른 점 음모에서를 시각화 합니다. 게이팅 CD34 + 세포 (백혈구 창시자) 및 SSC 높은 세포 (골수성 세포 감 별 법의 다양 한 단계에서) 정의 하는 도구를 사용 하 여.</li>
		<li>게이츠 결정 되었습니다, 일단 성문 외부 컬렉션 튜브에 정렬 선택할 수 있습니다.</li>
		<li>셀의 필요한 수를 얻을 때까지 4 ° C에서 정렬 진행</li>
		<li>정렬된 세포 인구 ( 그림 1E, 1F)의 순도 결정 하는 정렬 후 분석을 수행.</li>
	</ol></li></ol> 2. Clonogenic 분석 결과 <ol><li>시 약의 준비 다음 항목을 수집 하 고 준비 해야 하는 프로세스를 시작 하기 전에: <ol><li>펫, 100 mm 접시</li> <li>Trypan 블루와 hemocytometer</li> <li>다시 구성 0.1% 이상 포함 하는 메 마른 PBS 500ml U에서 인간 재조합 형 erythropoietin (EPO) 인간 혈 청 알 부 민. 작은 aliquots에이 솔루션을 분할 하 고 반복된 동결-해 동을 피하기 위해-20 ° C에서 유지.</li>
		<li>준비 완료 Iscove &#39; s 수정 Dulbecco &#39; 5 %FCS, 2mm 글루타민, 100 단위/mL 페니실린/스 (PS)의 최종 농도와 매체 (IMDM) s. 완전 한 IMDM 매체에 별도 우물에 다른 농도에서 재조합 인간 erythropoietin (EPO) 추가: 3 단위 6 단위 EPO/잘 12 EPO 단위/잘 EPO/잘 (1 배속, 2 배속, 4 x EPO 각각).</li>
	</ol></li> <li>골 수 세포의 준비 <ol><li>20 mL PBS에 희석 골 수 샘플의 10 mL은 천천히 두 단계 사이 명확한 인터페이스를 유지 하는 50 mL 원뿔 튜브에 15 mL 밀도 그라데이션 매체 위에 층이 nder 멸 균 조건입니다. 다음 9로 설정 하는 가속 및 감속 0 (또는 브레이크 해제)으로 설정 실 온 (RT)에서 30 분 동안 550 x g에서 15 mL 원뿔 튜브 원심.</li>
		<li>원심, 후 새로운 50 mL 튜브에 인터페이스를 제거 하 고 최종 볼륨 50 mL의 PBS를 추가.</li>
		<li>250 g 10 ° C에서 10 분 동안 원심 분리 후에 상쾌한을 제거 하 고 약 0.5 x 10 6 셀/mL에서 완전 한 IMDM 매체에 셀 resuspend. 세포 현 탁 액의 10 µ L를 microtube, Trypan 블루 솔루션 (0.4%)의 같은 양으로 혼합 그리고는 hemocytometer를 사용 하 여 계산.</li>
		<li>O선택적: CD34 + 세포 Milteny CD34 구슬 제조에 의해 주어진 지침에 따라 정렬 하는 자기 세포에 의해 풍성 하 게. 이 농축 단계의 주요 장점은 50 ng/mL 줄기 세포 요소 (SCF), 20 ng/mL granulocyte-대 식 세포 콜로 니 자극 인자 (GM-CSF), 20 ng/mL와 추가 반 고체 매트릭스에 재배 되는 조 혈 줄기 세포의 품질을 감지 하는 인터 루 킨-3 (3 일), 20 ng/mL 인터 루 킨-6 (일리노이-6), 20 ng/mL granulocyte 콜로 니 자극 인자 (G-CSF) 및 1.4에서 EPO의 3 다른 농도.</li>
		<li>희석 셀 0.1-0.15 x 10 6 단 셀/mL 또는 2 x 10 3 CD34 + 셀/mL 전체 IMDM 매체를 추가 하 여 보충 3 mL에 EPO 및 전송 300 µ L Methocult H4434 매체. 동요와 5 분 접시 3 짧은 보육 1, 1 시간 후 35 mm 접시에 mL. 2 제 3-물-로 가득 함께 이러한 문화 요리 100 mm 접시에 배치 됩니다.</li>
		<li>셀 5% CO 2 습도 37 ° C 배양 기에서 14 일에 대 한 교양.</li>
	</ol></li> <li>식민지의 분석 <ol><li>식민지는 득점 그리드로 표시 된 문화 접시에 40 배 확대에서 거꾸로 현미경으로 그들의 형태에 따라 주어진 다. 우리의 분석 결과에서는 콜로 니 형성 단위 (CFU) 4 종류로 분류 된다: multipotential 조상 세포 (CFU-GEMM), granulocyte-대 식 세포 조상 세포 (CFU-GM), 버스트 형성 단위-erythroid (BFU-E) 식민지 형성 단위-erythroid (CFU-E)입니다. 제조 업체를 참조 하십시오 &#39; 더 식민지 하위 분류에 대 한 지침 s.</li>
		<li>추가 분석을 위해 셀 CFU 시험 접시에서 복구 별도로 4 범주에 따라 4 mL 실내 온도 2%를 포함 하는 PBS에 일시 중단 하 여 FCS/IMDM. 4 ° C에서 10 분 동안 400 g에서 원심 분리 후 세포는 PBS에 resuspended, 계산, 및 DNA 추출 처리.</li>
	</ol></li></ol> 3. Chimerism의 분석 <ol><li>DNA 고립 <li>10 분 400 g에서 원심 분리 하 여 세포를 작은</li> <ol>
		<li>격리 DNA 혈액 DNA 추출 킷 (QIAmp DNA 혈액 추출 kit)를 사용 하 여. 미리 eluted DNA의 수율을 향상 시키기 위해 37 ° C에서 차입 버퍼 (AE)를 따뜻한.</li>
		<li>는 Nanodrop ND-1000 스펙트럼 photometer와 DNA 농도 측정합니다. 1.8-2.0 사이 OD 260/280 샘플 추가 분석을 위해 사용 됩니다.</li>
		<li>DNAase 무료 H 2 O 50 µ L의 전체 볼륨에 0.1 ng / µ L 희석 DNA.</li>
	</ol></li> <li>STR 분석 <ol><li>반응 혼합, AmplTaq 골드 DNA 중 합 효소 및 프로파일러 플러스 뇌관 세트 20 µ L 게놈 DNA를 혼합 하 여 PCR 반응 설정 (0.1 ng / µ L) 설명서에 따라 (뇌관 키트 포함는 레이블이 없는 뇌관 증폭 STR loci D3S1358, vWA, FGA, D8S1179, D21S11, D18S51, D5S818, D13S317, 및 D7S820, 그리고 성별 마커 amelogenin 버퍼에). 부정적인 통제로 nuclease 무료 물 등 긍정적인 통제로 9947A. 기증자와 받는 사람 모두에서 사전 이식 DNA도 포함 되어 있습니다.</li>
		<li>Eppendorf mastercycler 그라디언트를 사용 하 여 다음 조건으로 수행 PCR 반응: 11 분 동안 95 ° C 1 분, 1 분, 1 분에 72 ° C 59 ° C 95 ° C의 28 증폭 주기 다음 45 분 동안 60 ° C</li>
		<li>세트 조각 최대 분석 반응 12 µ L을 추가 하 여 안녕-디 Formamid 및 0.5 µ L GeneScan 500를 이용한 크기 표준 (모든 적용 농) PCR 제품의 1 µ L를. 첫 번째 및 마지막 위치에 사다리를 유전자 (Genotyper 앰프 플로리다 STR, 녹색 II 파란색과 노란색, 적용 농) 필요 하다.</li>
		<li>전기 악기와 전기 및 수집 시작.</li>
		<li>분석 Loci, 대립, 샘플 및 컨트롤 소프트웨어 13의 피크 높이.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Angelucci, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplantation+in+thalassemia+major+and+sickle+cell+disease:+indications+and+management+recommendations+from+an+international+expert+panel.">Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia major and sickle cell disease: indications and management recommendations from an international expert panel.</a> Haematologica. 99, 811-820 (2014).</li><li>Lucarelli, G., Isgro, A., Sodani, P., Gaziev, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hematopoietic+stem+cell+transplantation+in+thalassemia+and+sickle+cell+anemia.">Hematopoietic stem cell transplantation in thalassemia and sickle cell anemia.</a> Cold Spring Harb Perspect Med. 2, a011825 (2012).</li><li>Andreani, M., Testi, M., Lucarelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mixed+chimerism+in+haemoglobinopathies:+from+risk+of+graft+rejection+to+immune+tolerance.">Mixed chimerism in haemoglobinopathies: from risk of graft rejection to immune tolerance.</a> Tissue Antigens. 83, 137-146 (2014).</li><li>Andreani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistence+of+mixed+chimerism+in+patients+transplanted+for+the+treatment+of+thalassemia.">Persistence of mixed chimerism in patients transplanted for the treatment of thalassemia.</a> Blood. 87, 3494-3499 (1996).</li><li>Andreani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-term+survival+of+ex-thalassemic+patients+with+persistent+mixed+chimerism+after+bone+marrow+transplantation.">Long-term survival of ex-thalassemic patients with persistent mixed chimerism after bone marrow transplantation.</a> Bone Marrow Transplant. 25, 401-404 (2000).</li><li>Kumar, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pilot+study+of+prophylactic+ex+vivo+costimulated+donor+leukocyte+infusion+after+reduced-intensity+conditioned+allogeneic+stem+cell+transplantation.">Pilot study of prophylactic ex vivo costimulated donor leukocyte infusion after reduced-intensity conditioned allogeneic stem cell transplantation.</a> Biol Blood Marrow Transplant. 19, 1094-1101 (2013).</li><li>Lawler, S. D., Harris, H., Millar, J., Barrett, A., Powles, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytogenetic+follow-up+studies+of+recipients+of+T-cell+depleted+allogeneic+bone+marrow.">Cytogenetic follow-up studies of recipients of T-cell depleted allogeneic bone marrow.</a> Br J Haematol. 65, 143-150 (1987).</li><li>McCann, S. R., Crampe, M., Molloy, K., Lawler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hemopoietic+chimerism+following+stem+cell+transplantation.">Hemopoietic chimerism following stem cell transplantation.</a> Transfus Apher Sci. 32, 55-61 (2005).</li><li>Dewald, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+multicenter+investigation+with+interphase+fluorescence+in+situ+hybridization+using+X-+and+Y-chromosome+probes.">A multicenter investigation with interphase fluorescence in situ hybridization using X- and Y-chromosome probes.</a> Am J Med Genet. 76, 318-326 (1998).</li><li>Andreani, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitatively+different+red+cell/nucleated+cell+chimerism+in+patients+with+long-term,+persistent+hematopoietic+mixed+chimerism+after+bone+marrow+transplantation+for+thalassemia+major+or+sickle+cell+disease.">Quantitatively different red cell/nucleated cell chimerism in patients with long-term, persistent hematopoietic mixed chimerism after bone marrow transplantation for thalassemia major or sickle cell disease.</a> Haematologica. 96, 128-133 (2011).</li><li>Andreani, M., Testi, M., Battarra, M., Lucarelli, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Split+chimerism+between+nucleated+and+red+blood+cells+after+bone+marrow+transplantation+for+haemoglobinopathies.">Split chimerism between nucleated and red blood cells after bone marrow transplantation for haemoglobinopathies.</a> Chimerism. 2, 21-22 (2011).</li><li>Kropshofer, G., Sopper, S., Steurer, M., Schwinger, W., Crazzolara, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Successful+management+of+mixed+chimerism+after+bone+marrow+transplant+in+beta-thalassemia+major.">Successful management of mixed chimerism after bone marrow transplant in beta-thalassemia major.</a> Am J Hematol. 91, E357-E358 (2016).</li><li>Kimpton, C. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+DNA+profiling+employing+multiplex+amplification+of+short+tandem+repeat+loci.">Automated DNA profiling employing multiplex amplification of short tandem repeat loci.</a> PCR Methods Appl. 3, 13-22 (1993).</li><li>Centis, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+importance+of+erythroid+expansion+in+determining+the+extent+of+apoptosis+in+erythroid+precursors+in+patients+with+beta-thalassemia+major.">The importance of erythroid expansion in determining the extent of apoptosis in erythroid precursors in patients with beta-thalassemia major.</a> Blood. 96, 3624-3629 (2000).</li><li>Miccio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+selection+of+genetically+modified+erythroblastic+progenitors+leads+to+long-term+correction+of+beta-thalassemia.">In vivo selection of genetically modified erythroblastic progenitors leads to long-term correction of beta-thalassemia.</a> Proc Natl Acad Sci U.S.A. 105, 10547-10552 (2008).</li></ol>

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현재 연구의 목적은 hemoglobinopathies 치료 분석 기증자/받는 사람 chimerism erythroid 창시자 HSCT 환자에서 다음에 대 한 관객에 게 두 가지 방법의 조합을 제공 하는: 1.) 형광 활성화 된 세포 분류 조상 조 혈 모 세포 골 수 샘플 짧은 탠덤 반복 및 2의 분석에 의해 다음에.) 콜로 니 형성 단위 성장, 골 수 세포의 다양 한 시 조 형식에 식민지의 분류 다음 짧은 탠덤 반복의 분석. 이 방법의 참신 개별 식민지?...

수용자 조 혈 줄기 세포 이식 (HSCT)은 매우 손상에 대 한 90%의 질병-무료 생존 율을 달성 조 혈 시스템의 선천적인된 유전 질환의 다양 한 사용 가능한 유일한 치료 접근 및 생활 제한 환자1. 이 중요 한 치료 도구의 효능 중의 독성을 제한 하 여 최적화 된-이후의 regimens2, 이식 하지만 또한 개입 안정적인 이식 기능을 유지 하기 위한, 여는 정량의 가까운 모니터링 하 여 기증자 파생 셀3,,45.
완전 한 chimerism (CC) chimerism (MC) 혼합은 용어에 있을 때 기증자와 받는 사람 파생 셀 동시에 다양 한 반면 기증자 파생 된 세포에 의해 lymphohematopoietic 구획의 전체 교체를 의미 하는 일반적으로 비율입니다. 분할 chimerism (SC) 혼합된 chimerism erythroid 구획에서와 같은 단일 셀 계보에서 관찰의 동시 사용을 나타냅니다. 질병 재발 및 기증자 림프 구 혼합 또는 면역의 감소 등 시작 이후 immunomodulatory 전략 취약 환자를 식별할 수 있습니다 그것으로 chimerism 상태 HSCT 다음의 신속한 결정이 중요, 치료6.
HSCT 후 engraftment를 모니터링 하기 위한 여러 가지 방법이 개발 되었습니다. 면역 글로불린의 Isotyping 및 세포 유전학 분석 가난한 감도 있고 다형성7,8감지 하는 그들의 능력에서 제한 됩니다. 형광 제자리에서 교 잡 (물고기)의 소개 chimerism HSCT, 후 모니터링에서 감도 향상 시킬 수 있습니다 하지만 섹스 불일치 이식9로 제한 됩니다. 현재, 연쇄 반응 (PCR) chimerism를 검색 하는 데 사용 가장 광범위 한 방법 이며 변수 번호 탠덤 반복 (VNTRs)의 전통적인 agarose-아크릴 아 미드 젤 전기 이동 법에 따라 또는 짧은 탠덤 반복 (STRs). 일상적으로 사용 양이 많은 PCR는 HSCT 다음 잔여 기증자 세포의 아주 작은 비율을 감지 수 있습니다. 지금까지 연구의 주요 한계는 MC 탐지 nucleated 세포 보다는 성숙 적혈구의 존재로 거의 독점적으로 제한, 즉 그 환자에 대 한 기능적으로 중요 한 영향을 받는 hemoglobinopathies 세포. 환자에서 다른 혈액 그룹, 그것은 cytofluorometric 분석은 단일 클론 항 체는 적혈구 항 원 ABO와 C, c, D, E 및 e10 으로 이동 하 여 적혈구에서 chimerism를 식별할 수 있게 기억할 만한 가치가 , 11. erythroid 계보에서 chimerism 평가의 서로 다른, 하지만 매우 재미 있는 의미는 흐름 cytometric clonogenic 분석 실험, 배양에 의해 erythroid 창시자 및 다양 한 erythroid 조상 종류의 정렬의 조합 다음 STR12의 분석. 이 방법은 erythroid 구획에서 기증자와 받는 사람 chimerism의 상대 비율을 정할 수 이며 골 수 이식 유지 전략에 활용 될 수 있습니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="980">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Ficoll-Paque</td>
			<td style="width:252px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:215px;">GE17-1440-02&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Remove RBC</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">50 mL conical tubes</td>
			<td style="width:252px;">Falcon</td>
			<td style="width:215px;">14-432-22</td>
			<td style="width:183px;">Sample preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">12 x 75 mm flow tubes</td>
			<td style="width:252px;">Falcon</td>
			<td style="width:215px;">352002</td>
			<td style="width:183px;">FACS sorting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:252px;">Gibco</td>
			<td style="width:215px;">10010023</td>
			<td style="width:183px;">PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Fetal calf serum</td>
			<td style="width:252px;">Invitrogen Inc.</td>
			<td style="width:215px;">16000-044</td>
			<td style="width:183px;">FCS (heat-inactivated)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CD34 APC</td>
			<td style="width:252px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:215px;">561209</td>
			<td style="width:183px;">FACS-Ab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CD36 FITC</td>
			<td style="width:252px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:215px;">555454</td>
			<td style="width:183px;">FACS-Ab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CD45 V450</td>
			<td style="width:252px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:215px;">642275</td>
			<td style="width:183px;">FACS-Ab</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Trypan blue</td>
			<td style="width:252px;">Gibco</td>
			<td style="width:215px;">15250061</td>
			<td style="width:183px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Hemocytometer</td>
			<td style="width:252px;">Invitrogen Inc.</td>
			<td style="width:215px;">C10227</td>
			<td style="width:183px;">Automatic cell counting</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:331px;">Hank&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td style="width:252px;">Gibco</td>
			<td style="width:215px;">14025092</td>
			<td style="width:183px;">Suspension buffer in FACS analysis</td>
		</tr>
		<tr height="35">
			<td height="35" style="height:35px;width:331px;">HEPES</td>
			<td style="width:252px;">Gibco</td>
			<td style="width:215px;">15630080</td>
			<td style="width:183px;">Component of suspension buffer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">FcR</td>
			<td style="width:252px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:215px;">564220</td>
			<td style="width:183px;">Block FCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">FACS Aria I</td>
			<td style="width:252px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:215px;">23-11539-00</td>
			<td style="width:183px;">FACS Sorter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Recombinant&#160; human erythropoietin</td>
			<td style="width:252px;">Affimetrix eBioscience</td>
			<td style="width:215px;">14-8992-80</td>
			<td style="width:183px;">EPO</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Isocove&#8217;s Modified Dulbecco&#8217;s Medium</td>
			<td style="width:252px;">Gibco</td>
			<td style="width:215px;">12440053</td>
			<td style="width:183px;">IMDM</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:252px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:215px;">25030-081</td>
			<td style="width:183px;">Component of Culture Medium</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">CD34+ magnetic beads</td>
			<td style="width:252px;">Milteny Biotech</td>
			<td style="width:215px;">130-046-702</td>
			<td style="width:183px;">CD34+ purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Recombinant&#160; human G-CSF</td>
			<td style="width:252px;">Gibco</td>
			<td style="width:215px;">PHC2031</td>
			<td style="width:183px;">CFU-Assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Recombinant&#160; human SCF</td>
			<td style="width:252px;">Gibco</td>
			<td style="width:215px;">CTP2113</td>
			<td style="width:183px;">CFU-Assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Recombinant&#160; human GM-CSF</td>
			<td style="width:252px;">Gibco</td>
			<td style="width:215px;">PHC2015</td>
			<td style="width:183px;">CFU-Assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Recombinant&#160; human IL-3</td>
			<td style="width:252px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:215px;">554604</td>
			<td style="width:183px;">CFU-Assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Recombinant&#160; human IL-6</td>
			<td style="width:252px;">BD Bioscience</td>
			<td style="width:215px;">550071</td>
			<td style="width:183px;">CFU-Assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Methocult H4434 Medium</td>
			<td style="width:252px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:215px;">4444</td>
			<td style="width:183px;">CFU-Assay</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">QiAmp DNA Blood extraction kit</td>
			<td style="width:252px;">Qiagen</td>
			<td style="width:215px;">51306</td>
			<td style="width:183px;">DNA Isolation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Nanodrop ND-1000 spectra photometer</td>
			<td style="width:252px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:215px;">ND 1000</td>
			<td style="width:183px;">DNA Quantification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">DNAase free H2O</td>
			<td style="width:252px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:215px;">FEREN0521</td>
			<td style="width:183px;">DNA Preparation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">AmplTaq Gold DNA Polymerase</td>
			<td style="width:252px;">Applied Bioscience</td>
			<td style="width:215px;">N8080240</td>
			<td style="width:183px;">PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Eppendorf mastercycler gradient</td>
			<td style="width:252px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:215px;">6321000019</td>
			<td style="width:183px;">PCR&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">Hi-Di Formamid</td>
			<td style="width:252px;">Applied Bioscience</td>
			<td style="width:215px;">4311320</td>
			<td style="width:183px;">PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">GeneScan 500 ROX Size Standard</td>
			<td style="width:252px;">Applied Bioscience</td>
			<td style="width:215px;">4310361</td>
			<td style="width:183px;">PCR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:331px;">3130 Genetic Analyzer</td>
			<td style="width:252px;">Applied Bioscience</td>
			<td style="width:215px;">313001R</td>
			<td style="width:183px;">PCR</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

detection of residual donor erythroid progenitor cells after hematopoietic stem cell transplantation for patients with hemoglobinopathies

불완전 한 chimerism의 존재는 환자 thalassemia 메이저에 대 한 골 수 이식 또는 낫 세포 질병의 큰 비율에 기록 됩니다. 이 관찰으로 후속 치료 immunomodulation 전략 임상 결과 향상 시킬 수 있는 엄청난 의미를 갖는다. 통상, 짧은 탠덤 반복의 중 합 효소 연쇄 반응에 기초를 둔 분석 혈액 세포 기증자 파생 된 chimerism를 식별 하는 데 사용 됩니다. 그러나,이 메서드는 nucleated 세포에 제한 이며 천연된 단 세포 계보를 구분할 수 없습니다. 우리는 짧은 탠덤 반복 조 혈 조상 cytometric 정렬 셀 흐름의 분석을 적용 하 고이 짧은 탠덤 반복 선택 된 버스트 형성 단위-erythroid 식민지에서에서 얻은 두 뼈에서 수집 된의 분석에 비해 수입니다. 이 방법으로 우리는 서로 다른 확산 및 erythroid 구획에 기증자 세포의 수 있습니다. 이 기술은 설정 줄기 세포 이식에서 chimerism의 전류 모니터링 완료 수 이며 따라서 적용된 미래에 임상 연구, 줄기 세포 연구 그리고 유전자 치료 실험의 디자인 수 있습니다.

FACS 셀 정렬 lymphohematopoietic 창시자의 분리
우리 여기에서 다운스트림 STR 분석에 필요한 세포 인구를 정렬 결과 보여 줍니다. 골 수 세포 V450 활용 된 안티-CD45, FITC 활용 된 안티-CD36와 APC 활용 된 안티-CD34 얼룩이 있었다. 관심의 인구는 megakaryocyte erythroid 창시자 (MEP), nucleated 세포 적혈구의 개발에 대 한 책임 이다. 이...

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Detection of Residual Donor Erythroid Progenitor Cells after Hematopoietic Stem Cell Transplantation for Patients with Hemoglobinopathies

기증자에서 파생 된 셀의 정량화는 engraftment hemoglobinopathies 환자에 줄기 세포 이식 후 모니터링 해야 합니다. 교류 cytometry 기반 셀 정렬, 식민지 대형 분석 결과, 및 짧은 탠덤 반복 확산을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다의 후속 분석 및 erythroid 구획에 창시자의 차별화의 조합입니다.

Hemoglobinopathies 환자에 대 한 조 혈 줄기 세포 이식 후 잔여 기증자 Erythroid 조상 세포의 검출

The presence of incomplete chimerism is noted in a large proportion of patients following bone marrow transplant for thalassemia major or sickle cell ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

7.2K 조회수.  Medical University Innsbruck. 기증자에서 파생 된 셀의 정량화는 engraftment hemoglobinopathies 환자에 줄기 세포 이식 후 모니터링 해야 합니다. 교류 cytometry 기반 셀 정렬, 식민지 대형 분석 결과, 및 짧은 탠덤 반복 확산을 평가 하는 데 사용할 수 있습니다의 후속 분석 및 erythroid 구획에 창시자의 차별화의 조합입니다.

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Derivation of Cardiac Progenitor Cells from Embryonic Stem Cells

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great promise in cell therapy against heart disease. Among various methods to isolate CPCs, differentiation of embryonic stem cell (ESC) into CPCs attracts great attention in the field since ESCs can provide unlimited cell source. As a result, numerous strategies have been developed to derive CPCs from ESCs. In this protocol, differentiation and purification of embryonic CPCs from both mouse and human ESCs is described. Due to the difficulty of using cell surface markers to isolate embryonic CPCs, ESCs are engineered with fluorescent reporters activated by CPC-specific cre recombinase expression. Thus, CPCs can be enriched by fluorescence-activated cell sorting (FACS). This protocol illustrates procedures to form embryoid bodies (EBs) from ESCs for CPC specification and enrichment. The isolated CPCs can be subsequently cultured for cardiac lineage differentiation and other biological assays. This protocol is optimized for robust and efficient derivation of CPCs from both mouse and human ESCs.

In this protocol, derivation of cardiac progenitor cells from both mouse and human embryonic stem cells will be illustrated. A major strategy in this protocol is to enrich cardiac progenitor cells with flow cytometry using fluorescent reporters engineered into the embryonic stem cell lines.

배아 줄기 세포에서 심장 전구 세포의 유도

Cardiac progenitor cells (CPCs) have the capacity to differentiate into cardiomyocytes, smooth muscle cells (SMC), and endothelial cells and hold great ...

연구

발생학

Direct Induction of Human Neural Stem Cells from Peripheral Blood Hematopoietic Progenitor Cells

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to primary human adult neural cultures raises unique challenges. Recent developments in induced pluripotent stem cells (iPSC) provides an alternative approach to derive neural cultures from skin fibroblasts through patient specific iPSC, but this process is labor intensive, requires special expertise and large amounts of resources, and can take several months. This prevents the wide application of this technology to the study of neurological diseases. To overcome some of these issues, we have developed a method to derive neural stem cells directly from human adult peripheral blood, bypassing the iPSC derivation process. Hematopoietic progenitor cells enriched from human adult peripheral blood were cultured in vitro and transfected with Sendai virus vectors containing transcriptional factors Sox2, Oct3/4, Klf4, and c-Myc. The transfection results in morphological changes in the cells which are further selected by using human neural progenitor medium containing basic fibroblast growth factor (bFGF) and vascular endothelial growth factor (VEGF). The resulting cells are characterized by the expression for neural stem cell markers, such as nestin and SOX2. These neural stem cells could be further differentiated to neurons, astroglia and oligodendrocytes in specified differentiation media. Using easily accessible human peripheral blood samples, this method could be used to derive neural stem cells for further differentiation to neural cells for in vitro modeling of neurological disorders and may advance studies related to the pathogenesis and treatment of those diseases.

A method was developed to directly derive human neural stem cells from hematopoietic progenitor cells enriched from peripheral blood cells.

말초 혈액 조혈 전구 세포에서 인간 신경 줄기 세포의 직접 유도

Human disease specific neuronal cultures are essential for generating in vitro models for human neurological diseases. However, the lack of access to ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성을 시각화하기위한 유방 팻 패드 이식 기술

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells (HSPCs) in Developing Zebrafish Embryos

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell lineages that comprise mature blood. Isolation and identification of these HSPCs is difficult because they are defined ex post facto; they can only be defined after their differentiation into specific cell lineages. Over the past few decades, the zebrafish (Danio rerio) has become a model organism to study hematopoiesis. Zebrafish embryos develop ex utero, and by 48 h post-fertilization (hpf) have generated definitive HSPCs. Assays to assess HSPC differentiation and proliferation capabilities have been developed, utilizing transplantation and subsequent reconstitution of the hematopoietic system in addition to visualizing specialized transgenic lines with confocal microscopy. However, these assays are cost prohibitive, technically difficult, and time consuming for many laboratories. Development of an in vitro model to assess HSPCs would be cost effective, quicker, and present fewer difficulties compared to previously described methods, allowing laboratories to quickly assess mutagenesis and drug screens that affect HSPC biology. This novel in vitro assay to assess HSPCs is performed by plating dissociated whole zebrafish embryos and adding exogenous factors that promote only HSPC differentiation and proliferation. Embryos are dissociated into single cells and plated with HSPC-supportive colony stimulating factors that cause them to generate colony forming units (CFUs) that arise from a single progenitor cell. These assays should allow more careful examination of the molecular pathways responsible for HSPC proliferation, differentiation, and regulation, which will allow researchers to understand the underpinnings of vertebrate hematopoiesis and its dysregulation during disease.

Development of an In Vitro Assay to Quantitate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells HSPCs in Developing Zebrafish Embryos

Here, we present a simple method to quantitate hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) in embryonic zebrafish. HSPCs from dissociated zebrafish are plated in methylcellulose with supportive factors, differentiating into mature blood. This allows the detection of blood defects and allows drug screening to be easily conducted.

조 혈 줄기와 뿌리를 Quantitate를 생체 외에서 시험의 개발 세포 (HSPCs) Zebrafish 태아를 개발

Hematopoiesis is an essential cellular process in which hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) differentiate into the multitude of different cell ...

Single-cell Photoconversion in Living Intact Zebrafish

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause disease when disrupted. Scientists have developed clever techniques to investigate characteristics and natural dynamics of these cells within intact tissue by expressing fluorescent proteins in subsets of cells. However, at times, experiments require more selected visualization of cells within the tissue, sometimes at the single-cell or population-of-cells manner. To achieve this and visualize single cells within a population of cells, scientists have utilized single-cell photoconversion of fluorescent proteins. To demonstrate this technique, we show here how to direct UV light to an Eos-expressing cell of interest in an intact, living zebrafish. We then image those photoconverted Eos+ cells 24 h later to determine how they changed in the tissue. We describe two techniques: single cell photoconversion and photoconversions of populations of cell. These techniques can be used to visualize cell-cell interactions, cell-fate and differentiation, and cell migrations, making it a technique that is applicable in numerous biological questions.

Here, we present a protocol to show how cell photoconversion is achieved through UV exposure to specific areas expressing the fluorescent protein, Eos, in living animals.

생활 그대로 Zebrafish에 단일 셀 Photoconversion

Animal and plant tissue is composed of distinct populations of cells. These cells interact over time to build and maintain the tissue and can cause ...

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood cytopenias, dysplasia, and a propensity for transformation to acute leukemia. NUP98-HOXD13 (NHD13) transgenic mice recapitulate human MDS in terms of peripheral blood cytopenias, dysplasia, and transformation to acute leukemia. We previously demonstrated that MDS could be transferred from a genetically engineered mouse with MDS to wild-type recipients by transplanting MDS bone marrow nucleated cells (BMNC). To more clearly understand the MDS cell of origin, we have developed approaches to transplant specific, immunophenotypically defined hematopoietic subsets. In this article, we describe the process of isolating and transplanting specific populations of hematopoietic stem and progenitor cells. Following transplantation, we describe approaches to assess the efficiency of transplantation and persistence of the donor MDS cells.

We describe the use of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) to assess the malignant potential of genetically engineered hematopoietic cells. HSCT is useful for evaluating various malignant hematopoietic cells in vivo as well as generating a large cohort of mice with myelodysplastic syndromes (MDS) or leukemia to evaluate novel therapies.

조 혈 줄기 세포 이식 Myelodysplastic 증후군의 평가에 사용

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Efficient Differentiation of Human Pluripotent Stem Cells into Liver Cells

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver failure&#8212;which can be caused by chronic alcohol intake, hepatitis, acute poisoning, or other insults&#8212;is a severe condition that can culminate in bleeding, jaundice, coma, and eventually death. However, approaches to treat liver failure, as well as studies of liver function and disease, have been stymied in part by the lack of a plentiful supply of human liver cells. To this end, this protocol details the efficient differentiation of human pluripotent stem cells (hPSCs) into hepatocyte-like cells, guided by a developmental roadmap that describes how liver fate is specified across six consecutive differentiation steps. By manipulating developmental signaling pathways to promote liver differentiation and to explicitly suppress the formation of unwanted cell fates, this method efficiently generates populations of human liver bud progenitors and hepatocyte-like cells by days 6 and 18 of PSC differentiation, respectively. This is achieved through the temporally-precise control of developmental signaling pathways, exerted by small molecules and growth factors in a serum-free culture medium. Differentiation in this system occurs in monolayers and yields hepatocyte-like cells that express characteristic hepatocyte enzymes and have the ability to engraft a mouse model of chronic liver failure. The ability to efficiently generate large numbers of human liver cells in vitro has ramifications for treatment of liver failure, for drug screening, and for mechanistic studies of liver disease.

This protocol details a monolayer, serum-free method to efficiently generate hepatocyte-like cells from human pluripotent stem cells (hPSCs) in 18 days. This entails six steps as hPSCs sequentially differentiate into intermediate cell-types such as the primitive streak, definitive endoderm, posterior foregut and liver bud progenitors before forming hepatocyte-like cells.

인간 다능성 줄기 세포를 간 세포로 효율적으로 분화

The liver detoxifies harmful substances, secretes vital proteins, and executes key metabolic activities, thus sustaining life. Consequently, liver ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Controlled Cortical Impact Model of Mouse Brain Injury with Therapeutic Transplantation of Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Cells

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical insult to secondary injury processes, including apoptosis and inflammation. Animal modeling has been valuable in the search to unravel injury mechanisms and evaluate potential neuroprotective therapies. This protocol describes the controlled cortical impact (CCI) model of focal, open-head TBI. Specifically, parameters for producing a mild unilateral cortical injury are described. Behavioral consequences of CCI are analyzed using the adhesive tape removal test of bilateral sensorimotor integration. Regarding experimental therapy for TBI pathology, this protocol also illustrates a process for transplanting cultured cells into the brain. Neural cell cultures derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) were chosen for their potential to show superior functional restoration in human TBI patients. Chronic survival of hiPSCs in the host mouse brain tissue is detected using a modified DAB immunohistochemical process.

This protocol demonstrates methodologies for a mouse model of open-skull traumatic brain injury and transplantation of cultured human induced pluripotent stem cell-derived cells into the injury site. Behavioral and histologic tests of outcomes from these procedures are also described in brief.

인간 유도 만능 줄기 세포 유래 신경 세포의 치료 이식으로 마우스 뇌 손상의 제어 피질 영향 모델

Traumatic brain injury (TBI) is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Disease pathology due to TBI progresses from the primary mechanical ...