우리는 절차의 그림 디자인 및 데모와 지원을 Roxann Hétu - 아버에 감사하고 있습니다. 실험실에서 연구가 콜 재단에서 전환 수상에 의해 지원되었다, 검색없이 부여합니다. 자연 과학 및 캐나다 (NSERC)의 공학 연구 협의회 및 혁신에 대한 캐나다 재단 (CFI 지도자 기금 없음. 31377 부여) 419226-2012. 상테 (FRQS) - KMH는 퐁 드 공들인 뒤 퀘벡에 대한 Chercheur - Boursier 주니어입니다.

이 프로토콜에 설명 된 모든 절차는 기관의 동물 윤리위원회의 승인 및 동물 관리 지침에 캐나다 협의회를 수행하고있다. 주 : 멸균 / 무균 하우징 상태를 유지하기 위해 생물학적 안전 캐비넷 또는 층류 후드 안쪽 살아있는 쥐의 직접 처리를 포함하는 모든 절차를 수행. 청소 또는 소독 케이지, 억제 장치, 주택 자재, 적절하게 동물에 제공 차우와 물. 주사를위한 혈액 채취에 대해서만 멸균, 일회용 바늘을 사용합니다. 무균 기법 그래프트의 제조시 매우 중요하다. 받는 사람 마우스 1. 준비 <ol><li> 시간이 지남에 말초 혈액 및 골수 재구성의 개별 추시 수 있도록 귀 노치 (또는 지역 동물 윤리위원회 (8)에 의해 승인 된 다른 방법)와받는 사람 마우스를 식별합니다. 이식 후 추적 관찰을 위해 마우스의 무게를. 우리(이하 25g) 7 내지 12 주 오래 된 전자받는 사람 마우스. 참고 : 제공된 예에서, CD45.1 + CD45.2 +받는 사람 마우스 congenic B6.SJL 마우스와 C57BL / 6 마우스를 건너 집에서 사육 하였다. </li><li> 조혈 활동을 파괴하는 450 방사선의 두 가지 용량으로받는 사람 쥐를 조사. 첫 번째 투여 량을 이식 전날과 이식 전에 두 번째 1-2 시간을 제공합니다. 주 : X 선 또는 감마선 모두 해당 시설의 이용에 따라 이용 될 수있다. </li></ol> 도너와 경쟁 골수 세포의 제조 2 <ol><li> 기증자 (테스트 및 제어, CD45.2의 +) 안락사와 경쟁 (CD45.1 +; B6.SJL) 자궁 경부 전위 또는 로컬 동물 윤리위원회의 승인 방법을 사용하여 다음 CO 2 질식하여 마우스. </li><li> 빈 페트리 접시 또는 멸균 거즈에 활짝 열려 그 뒤로, 다리에 마우스를 놓고 난 (청소 작업 표면을 유지)생물 안전 캐비닛을 nside. 70 % 에탄올 / 30 % H와 모피 젖은 2 O (v / v)로. </li><li> 수술 날 또는 날카로운 가위로 발을 잘라. 다리를 따라 피부를 열고 톱니 모양의 집게를 사용하여 피부를 멀리 당겨 잘라. 여분의 근육을 버려야. </li><li> 다리 뼈 당기고 반력와 골반 뼈에 대해 가위의 블레이드를 이용하여 대퇴골 탈구. 경골을 분리하고, 슬개골에서 대퇴골과 근육과 힘줄의 나머지 비트를 제거합니다. 6 웰 조직 배양 플레이트에 2-3 ml의 무균 인산염 완충 식염수 (PBS)에 뼈를 놓는다. </li><li> 멸균 PBS 5 mL로 세척하여 뼈 골수 세포를 수집한다. <ol><li> 집게로 부드럽게 뼈를 잡고 뼈의 한쪽 끝으로 채워진 1 ML의 주사기에 부착 된 25 G 바늘을 삽입합니다. 플런저를 누르고 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 수집합니다. 뼈의 중심이 흰색이 될 때까지 필요에 따라 반복합니다. </li></ol></li><li> 바늘로 통과 반복하여 세포를 해리단일 세포 현탁액을 얻었다. 거품과 과잉 힘을 피하십시오. 참고 :이 단계에서 세포 생존을 개선하기 위해 약간 더 큰 바늘 (22 G)를 사용합니다. </li><li> 균일 한 세포 현탁액을 보장하고 파편과 덩어리를 제거하기 위해 70 μm의 나일론 스트레이너를 통해 세포를 전달합니다. </li><li> 혈구를 사용하여 세포 계수에 대한 나누어지는을 제거합니다. 4 ℃에서 5 분 동안 200 XG에서 나머지 세포 현탁액을 원심 분리기. 멸균 PBS (108 세포 / ml)에 필요한 세포 밀도를 재조정. 얼음에 세포를 유지합니다. </li></ol> 3. 기증자 세포 HSC의 등가물 구축 <ol><li> 염색 유동 세포 계측법에 대한 바닥 폴리스티렌 튜브 라운드 5 ml의에 3 × 10 6 세포 (30 μL)의 등가을 전송합니다. (2.5 μg / ML의 최종 농도를 위해 (PBS, 0.1 % 소 혈청 알부민 (BSA) 및 1 mM의 EDTA로 보충) 염색 완충액에 희석), 비특이적 염색을 차단 CD16 / CD32에 대해 표지 된 항체의 동일 부피를 추가한다. RT에서 5 분을 품어. </li><li> 염색 버퍼에 준비 90 μL의 형광 색소 - 복합 항체 마스터 믹스를 추가 바이오틴 리니지 칵테일 (B220, CD3e, CD11b를, GR1, Ter119), SCA1, CD117, CD135, CD150. 빛으로부터 보호 된 30 분 동안 빙상에서 인큐베이션. 참고 : 적절한 희석 항체의 각 로트에 대해 결정해야한다. 본 연구에 사용 된 희석에 대한 재료의 표를 참조하십시오. </li><li> 결합되지 않은 항체를 제거하기 위해 4 ° C에서 5 분 동안 200 XG에서 세포, 소용돌이와 원심 분리기에 2 ml의 얼룩 버퍼를 추가합니다. 쓸어 넘겨 뜨는에 resuspend 펠렛을 가만히 따르다. </li><li> 염색 버퍼에 희석하여 10 μL의 형광 색소 접합 된 스트렙 타비 딘 추가 (재료 표 참조). 빛으로부터 보호 된 20 분 동안 빙상에서 인큐베이션. 언 바운드 스트렙 타비 딘을 제거하는 단계 3.3로 씻으십시오. </li><li> 적어도 6 검출기 (9) 플로우 사이토 미터를 이용하여 세포 샘플을 수집. 린의 주파수를 결정 - SCA1 + CD117 + CD135 - CD150 <su분석 템플릿을 사용하여 각 샘플에 P&gt; + 세포 (조혈 모세포 추정) 그림 2와 같이 이전에 10, 11를보고했다. 참고 : 그 인구 내에서 기능 조혈 모세포의 주파수가 1/3과 1/5 2,12 사이에서 추정 할 수있다. </li><li> (일반적으로,이 예에서 경쟁, B6.SJL CD45.1 +) 기준으로 아래의 그림 2에 설명 된대로 하나의 샘플을 사용하여, 모든 샘플 (11)에 대해 추정 HSC 등가물을 설정합니다. <ol><li> 다음 식을 사용하여 필요한 세포의 수를 계산한다 : #transplanted 조혈 모세포 /받는 사람 = 5 × 10 5 세포의 X 추정 HSC 주파수 (기준 샘플의 결정에 따라,이 수는 야생형 C57BL / 6 마우스에 대해 일반적으로 75 내지 125이다) 10-12. 참고 :도 2에서, 샘플 A의 결과는 조혈 모세포 (139)이다. (다른 샘플도 2의 예를 들어 샘플 B) 총 # 이식 된 세포 = # 트랜스심은 조혈 모세포 / HSC 주파수. 참고 :도 2에서의 샘플 B에 대해, 결과는 197,826 (또는 대략 2 × 10 5) 전체 골수 세포이다. </li></ol></li><li> 상기에서 얻어진 결과를 사용하여 각 시료에 대하여 그래프트 수신자 당 필요한 세포의 총 수를 계산한다. 참고 :이 숫자는 기준 시료 (경쟁) 5 × 10 5해야한다. <ol><li> 받는 사람 마우스의 숫자로 단계 3.7에서 얻은 수를 곱과 주사기에 죽은 볼륨을 보상하기 위해 적어도 두 개의 추가 마우스에 대한 충분한 세포를 추가합니다. </li></ol></li><li> 단계 3.6에서 계산 및 멸균 PBS를 사용하여 주입 당 200 μL의 최종 볼륨을 조정으로 1 HSC 동등한 비율 (예를 들어, CD45.1 +) 선수와 1 시험 셀 (CD45.2의 +)를 섞는다. 주 : 다섯받는 마우스의 그룹 제안 볼륨 따라서 3.5 × 106 경쟁 골수 세포를 포함하는 적어도 1.4 ㎖, 수 (또는 것이기도 2의 973 샘플 A)에 대한 추정 된 조혈 모세포 및 시험 셀의 등가 수는 (도 2에서의 샘플 B에 대한 당량) 197826 365 = 1,384,782 골수 세포 일 것이다. </li></ol> 4. 골수 이식 <ol><li> 혈관의 팽창을 보장하고 측면 꼬리 정맥 자세히 볼 수 있도록 적색 가열 램프와 단계 1.2 조사받는 마우스 워밍업. </li><li> 27 G 바늘 (이하)가 장착 된 1 ML의 투베르쿨린 주사기를 준비합니다. 대기음 (3받는 마우스 대) 준비한 세포 현탁액 750 μL. 주사기에 기포가 없는지 확인합니다. </li><li> 금지 장치에 마우스를 넣습니다. 꼬리를 검사하고 꼬리의 양쪽에 명확하게 볼 수 있어야 측면 꼬리 정맥을 찾습니다. 에탄올 주사 부위를 닦아주십시오. 최대 베벨 바늘을 삽입 피부에 평행 부드럽게 플런저를 누릅니다. 주입이 용이해야한다. 힘 재이면quired는, 바늘이 혈관에 있지 않습니다. 참고 : 이전 마우스는 정맥을 더욱 어렵게 발견 할 수 있습니다 두꺼운 피부를 가지고있다. 바늘이 혈관에없는 경우, 초기 주입 부위에 바늘을 다시 삽입 근위. </li><li> 바늘을 제거하고 출혈을 멈추게하기 위해 몇 초간 멸균 거즈로 주사 부위를 누르십시오. 깨끗한 케이지에 마우스를 전송합니다. 참고 : 바늘이 너무 무딘 될 수있는 후 3 주사, 동일한 주사기와 바늘을 사용합니다. </li><li> 이식 후 후속 처리를 위해, 제 5 일 동안 마우스를 재수 멸균 PBS 1 ml를 피하 주사. (; 옵션 필요한 경우) 감염을 방지하기 위해 마시는 물에 항생제를 추가합니다. 제 3 주 동안 매 2 ~ 3 일 마우스 체중 이상 15~20% 그들의 미리 이식 체중 손실 (또는 로컬 동물 윤리위원회에 의해 결정) 한 마우스를 안락사. </li></ol> 주변 혈액 5. 분석 <ol><li> 혈액 한 방울을 수집 (Approx. EDTA 튜브에 50 ~ 100 μL). <ol><li> 하악 정맥에서 혈액을 수집하려면, 턱뼈 아래에있는 털이 지점 근처에 얼굴 피부를 관통하고 피 (13)의 드롭을받을 수집 관을 배치 란셋 또는 22 G 바늘을 사용합니다. 멀티 혈통의 재구성을 따라 이식 후 4, 8, 12, 16 주에 혈액을 수집합니다. </li></ol></li><li> 단계 5.1.1에서 수집 된 혈액의 드롭에 1 ml의 갓 준비 RT 적혈구 용해 버퍼 (9 부 0.16 M NH 4 CL + 1 일부 0.17 M 트리스 - 염산의 pH 7.65)를 추가합니다. 5 ml의 유동 세포 계측법에 적합한 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브를 혼합 및 전송 샘플. 실온에서 4 분 동안 서 보자. </li><li> 얼음처럼 차가운 PBS의 4 볼륨을 추가합니다. 엔드 - 투 - 엔드를 돌려 혼합하고 얼음에 즉시 전송합니다. 4 ° C에서 200 XG에 원심 분리기 10 분. </li><li> 쓸어 넘겨 뜨는에 resuspend 펠렛을 가만히 따르다. 상층 액을 명확하고 빨간색이어야한다. 간단히 버퍼와 소용돌이를 염색 2 ML을 추가합니다. 200 XGA 원심 분리기 5 분t 4 ° C를. </li><li> 쓸어 넘겨 뜨는에 resuspend 펠렛을 가만히 따르다. </li><li> CD45.1, CD45.2, CD3e, CD19, GR1 : 단계 3.3-3.1에 ​​설명 된 일반 프로토콜을 사용하여 염색 유동 세포 계측법 다음과 같은 마스터 믹스에 대한 항체를 진행합니다. </li><li> 적어도 6 검출기 (9) 플로우 사이토 미터를 이용하여 세포 샘플을 수집. 그림 3에서 제공하는 분석 템플릿을 사용하여 각 샘플의 각 계통 (CD19 + B 림프구, CD3e + T 림프구, GR1 밝은 과립구) 및 10, 11을 발표 같은 기증자 유래 세포의 주파수를 결정합니다. </li></ol> 골수에서 재구성 6. 분석 <ol><li> 섹션 2. 얼룩의 마스터 믹스 단계 3.3-3.1에 ​​설명 된 일반 프로토콜을 사용하여 유동 세포 계측법 분석을위한 세포 다음과 같은 항체를 설명하는대로 골수 세포를 수집 리니지 칵테일, SCA1, CD117, CD135, CD150, CD45.1 , CD45.2. 린 감지단계 3.4에 기술 된 바와 같이, 형광 접합 된 스트렙 타비 딘을 사용하여 eage 칵테일 항체. </li><li> 적어도 8 검출기 (9) 플로우 사이토 미터를 이용하여 세포 샘플을 수집. 여섯 명 밖에 사용할 수있는 경우 CD135 + 세포가 제외되는 바와 같이, 혈통 패널과 동일한 채널에 CD135을 추가합니다. 기증자 파생 린의 주파수를 결정 - SCA1 + CD117 + CD135 - 그림 4와 10을 발표 제공 분석 템플릿을 사용하여 각 샘플에서 CD150 + 조혈 모세포. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

여기에 설명 된 프로토콜은 알려진 경쟁 조혈 모세포에 대한 기증자 (테스트) 조혈 모세포의 상대적 적합성을 평가하기 위해 설계되었습니다. 경쟁 상황 (줄기 세포 니스 완만 저하를 검출 할 가능성) 분석의 상대 감도를 높이고 조사 주입의 효능에 대한 내부 기술적 인 제어를 제공한다. 그러나, HSC 적당의 절대 측정으로서 사용되어서는 안된다; 경쟁 재구성 감소 자동 조혈 경쟁의 부재 하에서도...

조혈 부상 방사선 및 세포 사멸을 통해 손실 된 혈액 세포의 보충을 보장하는 재생 방법이다. 이 과정은 주로 성인 골수에있는 조혈 줄기 세포 (HSC)에 의해 보장된다. 또한, 조혈 줄기 세포는자가 면역 질환, 혈액 학적 악성 종양과 immunodeficiencies 1 치료 목적을 위해 사용될 수있다. 더 잘 증식 팽창 도달 이식 후 수신자 골수 생착 할 수있는 능력을 포함하여, HSC 기능을 조절하는 메카니즘을 이해하기위한 요구가있다. 최근의 연구는 전향 적으로 약 50 % 순도 2-4로 성인 조혈 모세포와 태아의 조혈 모세포를 풍부하게 할 수있는 SLAM의 가족 CD150과 CD48 등 여러 가지 세포 표면 마커를보고 있지만, 기능 조혈 모세포의 황금 표준 측정에 대한 생체 다시 채우기 분석 유지 혈액 C를 재 구축하는 능력을 결정조사 된 호스트 (5)의 엘 생산. 생체 내 클론을 다시 채우는 분석은 처음 틸과 맥 컬록 (6)에 의해 개발 된 이후 세련되고 확장되었습니다. 원래 정의 된 조혈 모세포는자가 재생과 분화를 통해 평생 혈액 세포의 생산을 보장합니다. 조사 된받는 사람에 조혈 모세포의 전송 따라서 우리가 평가할 수 있습니다 : 다른 혈액 세포 계통의 분석을 통해 (T 림프구, B 림프구, 과립구, 단구) 및 직렬 이식을 통해 자기 갱신 능력을 차별화 할 수있는 능력. 상기 분석은 일반적으로 조혈 두 집단의 기능 및 / 또는 양의 비교를 포함하는 것, 예를 들어, 치료 또는 조혈 모세포의 유지 또는 확장에 영향을 줄 수있는 다른 요인들과 미처리 된 다른 유전자형 또는 셀 개의 마우스로부터 오는 세포 문화입니다. 기증자 키메라, 또는 전송 기증자의 조혈 모세포의 t의 기여O 혈액 세포 생산 후 세포 표면 마커 또는 수신자 또는 호스트에서 공여 세포를 구별 할 다른 방법을 이용하여 말초 혈액의 유동 세포 계측법 분석 골수에 의해 결정될 수있다. 가장 널리 사용되는 마커는 확실히 우리가 아래의 예에 대해 선택한 유전자 Ptprc 또는 CD45 백혈구 항원 (7)의 두 대립 유전자이다. 클론 다시 채우기 분석은 경쟁 또는 비 경쟁이 될 수 있습니다. 비경쟁 설정에서, 제어 및 테스트 조혈 별도받는 마우스에 전달되고, 각각의 셀 유형의 결과는 서로 독립적 일 ​​것이다. 경쟁 설정에서 테스트 및 제어 모두 조혈 모세포의 기능은 경쟁 조혈 모세포의 인구에 대해 측정된다. 여기에 설명 된 프로토콜 경쟁 설정을 사용뿐만 아니라 비경쟁 상황에 적응 될 수있다. 두 방법은 자신의 장점과 한계를 가지고, 우리는에서 자세히를 비교합니다토론. 우리는 또한 이식 된 조혈 모세포의 수의 주식을 보장하기 위해 다른 방법을 설명, 희석 분석 (LDA)을 제한함으로써 조혈 모세포의 정량 분석​​을 적용, 결과의 해석에 대한 성공 및 실패 이식 모두의 예제를 제공하는 방법에 대해 설명합니다.

<table><tbody><tr><td>Microtainer tubes with K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;EDTA</td><td>BD Biosciences</td><td>365974</td><td></td></tr><tr><td>20 G needle</td><td>BD Syringe</td><td></td><td>For blood sampling from the mandibular vein</td></tr><tr><td>LabQuake Shaker rotisserie</td><td>Thermo&amp;nbsp; Scientific</td><td>C415110</td><td></td></tr><tr><td>Purified anti-mouse CD16/CD32 (clone 2.4G2, Fc Block)</td><td>BD Biosciences</td><td>553142</td><td>2.50 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Pe-Cy7-conjugated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11)</td><td>eBioscience</td><td>25-0031</td><td>0.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>PE-conjugated anti-mouse CD19 (clone 1D3)</td><td>eBioscience</td><td>12-0193</td><td>0.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>APC-eFluor780 (APC-Cy7 equivalent)-conjugated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5)</td><td>eBioscience</td><td>47-5931</td><td>0.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>FITC-conjugate anti-mouse CD45.1 (clone A20)</td><td>eBioscience</td><td>11-0453</td><td>2.50 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>eFluor450-conjugated anti-mouse CD45.2 (clone 104)</td><td>eBioscience</td><td>48-0454</td><td>1.00 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-human/mouse CD45R (B220) (clone RA3-6B2)</td><td>eBioscience</td><td>13-0452</td><td>1.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse CD3e (clone 145-2C11)</td><td>eBioscience</td><td>13-0031</td><td>1.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse CD11b (clone M1/70)</td><td>eBioscience</td><td>13-0112</td><td>1.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse GR1 (clone RB6-8C5)</td><td>eBioscience</td><td>13-5931</td><td>1.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Biotinylated anti-mouse TER119 (clone TER119)</td><td>eBioscience</td><td>13-5921</td><td>0.625 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>V500 streptavidin</td><td>BD Biosciences</td><td>56149</td><td>0.5 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>PE-conjugated anti-mouse CD117 (clone 2B8)</td><td>BD Biosciences</td><td>553355</td><td>0.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>PE-Cy7-conjugated anti-mouse Ly6A/E (Sca1) (clone D7)</td><td>BD Biosciences</td><td>558162</td><td>0.25 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>PerCP-eFluor710-conjugated anti-mouse CD135 (clone A2F10)</td><td>eBioscience</td><td>46-1351</td><td>0.5 &amp;mu;g/ml</td></tr><tr><td>Alexa fluor 647-conjugated anti-mouse CD150 (clone TC15-12F12.2)</td><td>Biolegend</td><td>115918</td><td>0.625 &amp;mu;g/ml
BD Biosciences and eBioscience do not carry the same clone</td></tr><tr><td>1 ml tuberculin syringe with 27 G needle</td><td>BD Syringe</td><td>309623</td><td></td></tr><tr><td>1 ml tuberculin syringe with 25 G needle</td><td>BD Syringe</td><td>309626</td><td></td></tr><tr><td>70 &amp;mu;m cell strainer</td><td>BD Falcon</td><td>352350</td><td></td></tr></tbody></table>

competitive transplants to evaluate hematopoietic stem cell fitness

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to reestablish blood cell production for the lifespan of the recipient. This protocol explains how to set up a functional assay to compare the HSC capacities of two different populations of cells, such as bone marrow from mice of two different genotypes, and how to analyze the recipient mice by flow cytometry. The protocol uses HSC equivalents rather than cell sorting for standardization and discusses the advantages and disadvantages of both approaches. We further discuss different variations to the basic protocol, including serial transplants, limiting dilution assays, homing assays and non-competitive transplants, including the advantages and preferred uses of these varied approaches. These assays are central for the study of HSC function and could be used not only for the investigation of fundamental HSC intrinsic aspects of biology but also for the development of preclinical assays for bone marrow transplant and HSC expansion in culture.

(이하에서 논의 됨) 이차 이식을 포함하는 경쟁 이식 환경의 일반적인 설명은도 1에서 볼 수있다. 이식 전 골수 조혈하는 대표적인 분석은도 2에서 확인할 수있다.보다 상세한 정보를 이중선의 배제와 죽은 세포는 다른 9 찾을 수있다. 도 3 및도 4는 각각?...

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Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting.

경쟁 이식은 조혈 줄기 세포의 체력을 평가하는

The gold standard definition of a hematopoietic stem cell (HSC) is a cell that when transferred into an irradiated recipient will have the ability to ...

competitive-transplants-to-evaluate-hematopoietic-stem-cell-fitness

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

15.2K 조회수.  Institut National de la Recherche Scientifique. This protocol provides step-by-step guidelines for setting up competitive mouse bone marrow transplant experiments to study hematopoietic stem/progenitor cell function without prior purification of stem cells by cell sorting. 

비디오: Competitive Transplants to Evaluate Hematopoietic Stem Cell Fitness

Transduction-Transplantation Mouse Model of Myeloproliferative Neoplasm

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the gene of interest in hematopoietic cells and can be used to study the gene's role in normal and/or malignant hematopoiesis. This protocol provides a detailed description on how to perform transduction-transplantation using calreticulin (CALR) mutations recently identified in myeloproliferative neoplasm (MPN) as an example. In this protocol whole bone marrow cells from 5-flurouracil (5-FU) treated donor mice are transduced with a retrovirus encoding mutant CALR and transplanted into lethally irradiated syngeneic hosts. Donor cells expressing mutant CALR are marked with green fluorescent protein (GFP). Transplanted mice develop an MPN phenotype including elevated platelets in the peripheral blood, expansion of megakaryocytes in the bone marrow, and bone marrow fibrosis. We provide a step-by-step account of how to generate retrovirus, calculate viral titer, transduce whole bone marrow cells, and transplant into irradiated recipient mice.

This manuscript provides a description of the methodology used to establish transduction-transplantation mouse models. A detailed account is given of technical errors to avoid when performing bone marrow transplants. A clear understanding should be gained of the importance of high viral titer, transfection/transduction, and irradiation.

골수 증식 종양의 전달-이식 마우스 모델

Transduction-transplantation is a quick and efficient way to model human hematologic malignancies in mice. This technique results in expression of the ...

연구

암 연구학

Using Quantitative Real-time PCR to Determine Donor Cell Engraftment in a Competitive Murine Bone Marrow Transplantation Model

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules that regulate HSCs. In these transplant model systems, the function of HSCs is determined by the ability of these cells to engraft and reconstitute lethally irradiated recipient mice. Commonly, the donor cell contribution/engraftment is measured by antibodies to donor- specific cell surface proteins using flow cytometry. However, this method heavily depends on the specificity and the ability of the cell surface marker to differentiate donor-derived cells from recipient-originated cells, which may not be available for all mouse strains. Considering the various backgrounds of genetically modified mouse strains in the market, this cell surface/ flow cytometry-based method has significant limitations especially in mouse strains that lack well-defined surface markers to separate donor cells from congenic recipient cells. Here, we reported a PCR-based technique to determine donor cell engraftment/contribution in transplant recipient mice. We transplanted male donor bone marrow HSCs to lethally irradiated congenic female mice. Peripheral blood samples were collected at different time points post transplantation. Bone marrow samples were obtained at the end of the experiments. Genomic DNA was isolated and the Y chromosome specific gene, Zfy1, was amplified using quantitative Real time PCR. The engraftment of male donor-derived cells in the female recipient mice was calculated against standard curve with known percentage of male vs. female DNAs. Bcl2 was used as a reference gene to normalize the total DNA amount. Our data suggested that this approach reliably determines donor cell engraftment and provides a useful, yet simple method in measuring hematopoietic cell reconstitution in murine bone marrow transplantation models. Our method can be routinely performed in most laboratories because no costly equipment such as flow cytometry is required.

Determining donor cell engraftment presents a challenge in mouse bone marrow transplant models that lack well-defined phenotypical markers. We described a methodology to quantify male donor cell engraftment in female transplant recipient mice. This method can be used in all mouse strains for the study of HSC functions.

경쟁 손쥐 골수 이식 모델에서 기증자 세포 Engraftment를 확인하려면 수량 실시간 PCR을 사용하여

Murine bone marrow transplantation models provide an important tool in measuring hematopoietic stem cell (HSC) functions and determining genes/molecules ...

의학

Clonal Analysis of Embryonic Hematopoietic Stem Cell Precursors Using Single Cell Index Sorting Combined with Endothelial Cell Niche Co-culture

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early embryo and the lack of assays that functionally identify the long-term multilineage engraftment potential of individual putative HSC precursors. Here, we describe methodology that enables the isolation and characterization of functionally validated HSC precursors at the single cell level. First, we utilize index sorting to catalog the precise phenotypic parameter of each individually sorted cell, using a combination of phenotypic markers to enrich for HSC precursors with additional markers for experimental analysis. Second, each index-sorted cell is co-cultured with vascular niche stroma from the aorta-gonad-mesonephros (AGM) region, which supports the maturation of non-engrafting HSC precursors to functional HSC with multilineage, long-term engraftment potential in transplantation assays. This methodology enables correlation of phenotypic properties of clonal hemogenic precursors with their functional engraftment potential or other properties such as transcriptional profile, providing a means for the detailed analysis of HSC precursor development at the single cell level.

Here we present methodology for the clonal analysis of hematopoietic stem cell precursors during murine embryonic development. We combine index sorting of single cells from the embryonic aorta-gonad-mesonephros region with endothelial cell co-culture and transplantation to characterize the phenotypic properties and engraftment potential of single hematopoietic precursors.

단일 셀 인덱스 정렬 내 피 세포 틈새 공동 문화 결합을 사용 하 여 배아 조 혈 줄기 세포 선구자의 클론 분석

The ability to study hematopoietic stem cell (HSC) genesis during embryonic development has been limited by the rarity of HSC precursors in the early ...

발생학

Use of Hematopoietic Stem Cell Transplantation to Assess the Origin of Myelodysplastic Syndrome

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood cytopenias, dysplasia, and a propensity for transformation to acute leukemia. NUP98-HOXD13 (NHD13) transgenic mice recapitulate human MDS in terms of peripheral blood cytopenias, dysplasia, and transformation to acute leukemia. We previously demonstrated that MDS could be transferred from a genetically engineered mouse with MDS to wild-type recipients by transplanting MDS bone marrow nucleated cells (BMNC). To more clearly understand the MDS cell of origin, we have developed approaches to transplant specific, immunophenotypically defined hematopoietic subsets. In this article, we describe the process of isolating and transplanting specific populations of hematopoietic stem and progenitor cells. Following transplantation, we describe approaches to assess the efficiency of transplantation and persistence of the donor MDS cells.

We describe the use of hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) to assess the malignant potential of genetically engineered hematopoietic cells. HSCT is useful for evaluating various malignant hematopoietic cells in vivo as well as generating a large cohort of mice with myelodysplastic syndromes (MDS) or leukemia to evaluate novel therapies.

조 혈 줄기 세포 이식 Myelodysplastic 증후군의 평가에 사용

Myelodysplastic syndromes (MDS) are a diverse group of hematopoietic stem cell disorders that are defined by ineffective hematopoiesis, peripheral blood ...

Engineering Oncogenic Heterozygous Gain-of-Function Mutations in Human Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional properties such as proliferation and differentiation, thereby promoting the development of hematologic malignancies. Efficient and precise genetic manipulation of HSPCs is required to model, characterize, and better understand the functional consequences of recurrent somatic mutations. Mutations can have a deleterious effect on a gene and result in loss-of-function (LOF) or, in stark contrast, may enhance function or even lead to novel characteristics of a particular gene, termed gain-of-function (GOF). In contrast to LOF mutations, GOF mutations almost exclusively occur in a heterozygous fashion. Current genome-editing protocols do not allow for the selective targeting of individual alleles, hampering the ability to model heterozygous GOF mutations. Here, we provide a detailed protocol on how to engineer heterozygous GOF hotspot mutations in human HSPCs by combining CRISPR/Cas9-mediated homology-directed repair and recombinant AAV6 technology for efficient DNA donor template transfer. Importantly, this strategy makes use of a dual fluorescent reporter system to allow for the tracking and purification of successfully heterozygously edited HSPCs. This strategy can be employed to precisely investigate how GOF mutations affect HSPC function and their progression toward hematological malignancies.

Novel strategies to faithfully model somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) are necessary to better study hematopoietic stem cell biology and hematological malignancies. Here, a protocol to model heterozygous gain-of-function mutations in HSPCs by combining the use of CRISPR/Cas9 and dual rAAV donor transduction is described.

인간 조혈 줄기 및 전구 세포에서 발암성 이형접합체 기능 획득 돌연변이 공학

Throughout their lifetime, hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) acquire somatic mutations. Some of these mutations alter HSPC functional ...

Evaluation of Abnormal Growth-related Genes of Hematopoietic Stem and Progenitor Cells by Combining CRISPR/Cas9 Technology with Cell Counting

Hematopoietic stem cells possess the ability for long-term self-renewal and the potential to differentiate into various types of mature blood cells. However, the accumulation of cancerous mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) can block normal differentiation, induce aberrant proliferation, and ultimately lead to leukemogenesis. To identify and/or evaluate the cancerous mutations, we integrated CRISPR/Cas9 technology with the Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay to investigate a model gene Trp53, that is essential for abnormal proliferative ability of HSPCs. Specifically, bone marrow cells enriched for HSPCs from Cas9 mice were harvested and then subjected to viral transfection with single-guide RNAs (sgRNAs) targeting one or several candidate genes to introduce genetic alterations in HSPCs. Then, a CCK-8 assay was performed to investigate the proliferative capacity of transfected HSPCs. The sgRNA targeting efficiency was confirmed by a Tracking of Indels by Decomposition assay. These identified genes may play crucial roles in leukemogenesis and could serve as potential therapeutic targets.

Here, we present a protocol that integrates CRISPR/Cas9 technology with the Cell Counting Kit-8 (CCK-8) assay to identify candidate genes that are crucial for the abnormal proliferative capacity of hematopoietic stem and progenitor cells.

CRISPR/Cas9 기술과 세포 계수를 결합한 조혈 줄기 및 전구 세포의 비정상 성장 관련 유전자 평가

Hematopoietic stem cells possess the ability for long-term self-renewal and the potential to differentiate into various types of mature blood cells. ...

Lentiviral CRISPR/Cas9-Mediated Genome Editing for the Study of Hematopoietic Cells in Disease Models

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting from advances in genome editing technology and lentivirus-mediated transgene delivery systems, an efficient and economical method is described here that establishes mice in which genes are manipulated specifically in hematopoietic stem cells. Lentiviruses are used to transduce Cas9-expressing lineage-negative bone marrow cells with a guide RNA (gRNA) targeting specific genes and a red fluorescence reporter gene (RFP), then these cells are transplanted into lethally-irradiated C57BL/6 mice. Mice transplanted with lentivirus expressing non-targeting gRNA are used as controls. Engraftment of transduced hematopoietic stem cells are evaluated by flow cytometric analysis of RFP-positive leukocytes of peripheral blood. Using this method, ~90% transduction of myeloid cells and ~70% of lymphoid cells at 4 weeks after transplantation can be achieved. Genomic DNA is isolated from RFP-positive blood cells, and portions of the targeted site DNA are amplified by PCR to validate the genome editing. This protocol provides a high-throughput evaluation of hematopoiesis-regulatory genes and can be extended to a variety of mouse disease models with hematopoietic cell involvement.

Described are protocols for the highly efficient genome editing of murine hematopoietic stem and progenitor cells (HSPC) by the CRISPR/Cas9 system to rapidly develop mouse model systems with hematopoietic system-specific gene modifications.

질병 모델에서 조혈 세포의 연구를 위한 렌티바이러스 CRISPR/Cas9 매개 게놈 편집

Manipulating genes in hematopoietic stem cells using conventional transgenesis approaches can be time-consuming, expensive, and challenging. Benefiting ...

면역학 및 감염병학

Bone Marrow Transplantation Procedures in Mice to Study Clonal Hematopoiesis

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs). Mutations in driver genes, that confer cellular fitness, can lead to the development of expanding HSPC clones that increasingly give rise to progeny leukocytes harboring the somatic mutation. Because clonal hematopoiesis has been associated with heart disease, stroke, and mortality, the development of experimental systems that model these processes is key to understanding the mechanisms that underly this new risk factor. Bone marrow transplantation procedures involving myeloablative conditioning in mice, such as total-body irradiation (TBI), are commonly employed to study the role of immune cells in cardiovascular diseases. However, simultaneous damage to the bone marrow niche and other sites of interest, such as the heart and brain, is unavoidable with these procedures. Thus, our lab has developed two alternative methods to minimize or avoid possible side effects caused by TBI: 1) bone marrow transplantation with irradiation shielding and 2) adoptive BMT to non-conditioned mice. In shielded organs, the local environment is preserved allowing for the analysis of clonal hematopoiesis while the function of resident immune cells is unperturbed. In contrast, the adoptive BMT to non-conditioned mice has the additional advantage that both the local environments of the organs and the hematopoietic niche are preserved. Here, we compare three different hematopoietic cell reconstitution approaches and discuss their strengths and limitations for studies of clonal hematopoiesis in cardiovascular disease.

We describe three methods of bone marrow transplantation (BMT): BMT with total-body irradiation, BMT with shielded irradiation, and BMT method with no pre-conditioning (adoptive BMT) for the study of clonal hematopoiesis in mouse models.

Clonal hematopoiesis is a prevalent age-associated condition that results from the accumulation of somatic mutations in hematopoietic stem and progenitor ...

Measurement of Mitochondrial Mass and Membrane Potential in Hematopoietic Stem Cells and T-cells by Flow Cytometry

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production of all mature blood cells. In recent years cellular metabolism has emerged as a crucial regulator of HSC function and fate. We have previously demonstrated that modulation of mitochondrial metabolism influences HSC fate. Specifically, by chemically uncoupling the electron transport chain we were able to maintain HSC function in culture conditions that normally induce rapid differentiation. However, limiting HSC numbers often precludes the use of standard assays to measure HSC metabolism and therefore predict their function. Here, we report a simple flow cytometry assay that allows reliable measurement of mitochondrial membrane potential and mitochondrial mass in scarce cells such as HSCs. We discuss the isolation of HSCs from mouse bone marrow and measurement of mitochondrial mass and membrane potential post ex vivo culture. As an example, we show the modulation of these parameters in HSCs via treatment with a metabolic modulator. Moreover, we extend the application of this methodology on human peripheral blood-derived T cells and human tumor infiltrating lymphocytes (TILs), showing dramatic differences in their mitochondrial profiles, possibly reflecting different T cell functionality. We believe this assay can be employed in screenings to identify modulators of mitochondrial metabolism in various cell types in different contexts.

Here we describe a reliable method to measure mitochondrial mass and membrane potential in ex vivo cultured hematopoietic stem cells and T cells.

유세포측정에 의한 조혈줄기세포 및 T세포의 미토콘드리아 질량 및 막 전위 측정

A fine balance of quiescence, self-renewal, and differentiation is key to preserve the hematopoietic stem cell (HSC) pool and maintain lifelong production ...

생물학

Ex Vivo Expansion and Genetic Manipulation of Mouse Hematopoietic Stem Cells in Polyvinyl Alcohol-Based Cultures

Self-renewing&#160;multipotent&#160;hematopoietic stem cells (HSCs) are an important cell type due to their abilities to support hematopoiesis throughout life and reconstitute the entire blood system following transplantation. HSCs are used clinically in stem cell transplantation therapies, which represent curative treatment for a range of blood diseases. There is substantial interest in both understanding the mechanisms that regulate HSC activity and hematopoiesis, and developing new HSC-based therapies. However, the stable culture and expansion of HSCs ex vivo has been a major barrier in studying these stem cells in a tractable ex vivo system. We recently developed a polyvinyl alcohol-based culture system that can support the long-term and large-scale expansion of transplantable mouse HSCs and methods to genetically edit them. This protocol describes methods to culture and genetically manipulate mouse HSCs via electroporation and lentiviral transduction. This protocol is expected to be useful to a wide range of experimental hematologists interested in HSC biology and hematopoiesis.