우리는 매사 추세츠 유동세포계측법 코어 감사 : 리차드 Konz, 테드 Giehl, 바바라 고셀린, Yuehua 번지와 태미 Krupoch 있습니다. 이 작품은 NIH / NHLBI RO1 HL084168 (MS)와 NIH CA T32 - 130807 (JRS)에 의해 재정 지원되었다. 당뇨병 내분비학 연구 센터 부여 DK32520 지원의 핵심 자원도 사용되었습니다.

1. 조직의 수확 <ol><li> 2-5 ML 차가운 얼룩 버퍼를 (와 호수 (PBS)가 0.2 % BSA와 5mM 포도당을 추가 인산염 버퍼)이있는 튜브를 준비합니다. 이전 조직 수확 얼음 튜브 보관하십시오. </li><li> 쿨 마우스 적절한 승인 프로토콜에 따라 (예 : CO 2 흡입 자궁 전위 다음). </li><li> 나중에 분석, 혈소판의 예, reticulocyte 백작 CBC 분석을위한 EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 또는 헤파린 혈액 수집 튜브에 심장 바늘로 혈액을 그립니다. </li><li> 1 단계에서 준비를 별도의 튜브에 각각 마우스의 조직을 배치, 비장과 뼈를 수확. 비장에 쉽게 접근할 수는 왼쪽에서 있습니다. 뼈 - 골수, 수확 하나 또는 둘 모두 대퇴골하십시오. 얼음 수확 조직을 유지. </li><li> 원하는 경우, 비장의 무게. erythropoietic 스트레스 반응을받은 마우스는 비장 중량의 상당한 증가를 보여 가능성이 높습니다. </li></ol> 2. 비장 세포의 준비 <ol><li> 사전 moistened 3 ML 주사기 플런저를 사용하여, 부드럽게 40 μm의 살균 셀 스트레이너 (Fisherbrand 카탈로그 번호 22363547 또는 기타)을 통해 비장, 또는 비장의 일부 (이상적으로, 약 10 8 세포에 해당하는 0.1 그램 이하) 푸시 50 ML 원뿔 튜브의 상단에 위치. 이 절차를 수행하는 동안 얼음 튜브 보관하십시오. 2 ML의 얼룩 버퍼의 총 스트레이너를 통해 세포를 씻으십시오. </li><li> 부드럽게 어떤 작은 대단히 짧은 시간을 깰 수있는 긴장 세포 현탁액을 피펫. 필요한 경우, 세포가 다시 변형. </li><li> 원심 분리에 의해 두 번 세포를 씻고 차가운 버퍼에 다시 일시 중지합니다. </li><li> hemocytometer를 사용하여 셀을 계산합니다. 일반적인 수확량은 1-2 X 10 8 셀 / 비장 있습니다. 흐름 cytometry 분석을 위해, aliquote 중 외과의 얼룩 튜브에 샘플 당 1-2000000 세포 (BD 팰컨 폴리스티렌은 왕복 바닥 튜브, 352,008) 또는 U - 96 잘 하단 플레이트 (BD 팰컨 353910). 샘플 얼룩 볼륨은 최종 세포 농도 0.5-1 X 10 7 셀 / ML 또는 1-2로, 200 μl입니다 X 10 6 세포 / 200 μl 샘플. </li></ol> 3. 뼈 - 골수 세포의 준비 <ol><li> 첨부 26G 바늘, 차가운 얼룩 버퍼로 미리 채워진 1 개 또는 3 ML 주사기를 준비합니다. </li><li> 명확하게 뼈 시각화하는만큼 대퇴골에 연결된 근육을 제거합니다. </li><li> 뼈 끝을 가능 날카로운 외과 가위, 대퇴골의 양쪽에서 싹둑, 가까이로 사용합니다. 이것은 대퇴골의 길이를 통해 실행 골수 캐비티로 선두, 각 컷 끝에 작은 구멍을 공개해야합니다. </li><li> 1 단계에서 미리 채워진 주사기를 사용하여 이러한 구멍 중 하나를 통해 바늘을 삽입하고, 부드럽게 튜브로, 다른 끝에있는 구멍을 통해 골수를 플러시. </li><li> 위의 비장에 대해서는 40 μm의의 스트레이너 (섹션 2.1 참조)을 통해 얼굴이 붉어지는 부드러운 pipetting하여 세포와 스트레인을 떼어 놓다. </li><li> 감기 얼룩 버퍼에서 원심 분리하여 세포를 두 번 씻으십시오 </li><li> 세포를 카운트하고 섹션 2.4로 resuspend. 일반적인 수확량은 대퇴골 약 10 7 세포 수 있습니다. </li></ol> 4. 태아 간 세포의 준비 <ol><li> 시간 초과 - 임신 여성 생쥐를 준비하려면 저녁에 짝짓기에 마우스를 설정, 10 다음날 오전하기 전에 질 플러그에 대한 검사, 질 플러그가 감지되는 일은 일 0.5 간주됩니다. 베티 직원들은 임신 여성을 식별이 기술에 익숙하지 않은 수사 도움을 드릴 수 있습니다. 임신도 모니터링 마우스 무게에 의해 결정하실 수 있습니다. </li><li> 시간 초과 - 임신 여성 생쥐는 임신의 14.5에 12.5 일에 학살하고 있습니다. 자궁 뿔은 얼음처럼 차가운 문화 매체 또는 얼룩 버퍼를 포함하는 페트리 - 그릇에 제거됩니다. </li><li> 배아는 각 자궁에서 제거되며 태아 간장을 해부합니다. 해부 현미경은 배아 일 12.5 (E12.5) 이하가 필요합니다. </li><li> 간은는 버퍼 pipetting에 의해 기계적으로 dissociated 수 있으며, 96 잘 접시 개별적으로 처리하거나, 또는 실험적인 요구에 따라, 함께 풀링됩니다. </li><li> E13.5에서 태아의 간은 ~ 10 7 세포를했다. 전지는 버퍼를 염색법으로 두 번 씻어과 흐름 cytometric 분석 1-2 X 10 6 세포 / 200 μl 샘플에서 resuspended 있습니다. </li></ol> 5. 유동세포계측법에 대한 항체 염색법 <ol><li> 다음 사항을 포함, 컨트롤 샘플을 제외하고, 모든 샘플에 사용되는 사전 믹스를 얼룩 차 항체를 준비 : <ul><li> 200μg/ml의 최종 농도 ChromePure 토끼 IgG (잭슨, 015-000-003). 병에서 재고 농도를 (이것은 다를 수 있음) 확인합니다. 이것은 마우스 세포에서 FC 수용체를 차단하는 데 사용되며이에 사용할 수 있습니다 다른 종족은 마우스 IgG 또는 쥐 IgG 수 있습니다. 종 선택은 그 종을 사용할 수없는 경우에는 기본 쥐 / 마우스 / 토끼 항체, 이차 항체에 대한 감독의 얼룩 프로토콜의 잠재적인 존재에 의해 결정됩니다차단 항체로 D. 또는 5 % 토끼 혈청 IgG는 정화의 장소에서도 사용할 수 있습니다. 자세한 대안은 단클론 항체 또는 마우스 FC 수용체에서 감독 팹 조각의 사용이다. 아래의 기본 프로토콜은 이차 항체가 포함되지 않습니다 따라서 세 종류의 중 IgG가 사용할 수 있습니다. </li><li> CD71 - FITC, 희석 1:200 (재고 0.5mg/ml, BD - Biosciences, 553,266) </li><li> Ter119 - PE, 1:200 (재고 0.2mg/ml, BD - Biosciences, 553,673)를 희석 </li><li> 추가 항체가 관심의 표면 epitopes에서 감독, 예를 들어 항체가 파 또는 FasL (1,2 참조)에서 감독. 반전 튜브 2-3 배 부드럽게 항체 솔루션을 섞는다. </li></ul></li><li> 각각의 세포 샘플을 미리 믹스 200 μl를 추가하고 부드럽게 세포를 다시 일시 중지합니다. </li><li> 다음과 같이 제어 세포 샘플을 준비 : <ul><li> &#39;흠​​없는&#39;이 세포가 버퍼를 얼룩의 왼쪽과 세포의 배경 autofluorescence를 제공​​합니다. </li><li> &#39;단일 색상&#39;컨트롤 : 하나의 컨트롤 프로토콜에 사용되는 각각의 항체 / 컬러가 필요합니다. 이러한 컨트롤의 세포는 직접 복합 일차 항체와 중 스테인드 또는 차 항체와 복합 보조 항체 모두 있습니다. 이러한 컨트롤은 채널 사이의 스펙트럼 중복에 대한 해결하기 위해 사용됩니다. </li><li> &#39;형광 빼기 1&#39;(FMO) 컨트롤 : 하나의 제어 프로토콜의 각 항체 / 컬러가 필요합니다 : 세포를 제외하고 프로토콜의 모든 색상 / 항체 물들일 수있는 색상 / 이것은 FMO 컨트롤하는 항체. 특정 채널에 대한 FMO 컨트롤은 해당 채널에 대한 진정한 배경을 제공합니다. 그것은 불특정 같은 isotype의 항체 및 항체 검사 (isotype 제어)와 같은 형광 표시가있는 복합을 포함할 수 있습니다. </li></ul></li><li> 기본 항체에 품어 샘플 및 관련 컨트롤 45 &#39;1 시간 어둠 속에 (아이스 버킷에 알루미늄 호일 커버를 넣어)에 얼음에 얼룩. </li><li> 부화의 끝에, 4 약 400 XG ° C. 3 &#39;5&#39;에 대한 각각의 샘플 튜브와 스핀에 얼룩 버퍼의 3ml를 추가하여 세포를 씻어 96 잘 번호판을 사용하는 경우, 200 μl의 볼륨에있는 세포가 세 번 씻으십시오. </li><li> 관련있다면, 보조 항체가 얼룩 적용됩니다. 적용 및 최초의 항체가 얼룩에 관해서 씻으십시오. </li><li> 관련있다면, Annexin V와 얼룩은 제조 업체의 지침과 같이 hepes 버퍼를 사용하여 부화의 끝 부분에 적용됩니다. 이 얼룩은 룸 온도에서 15 분 동안 적용, 또는 얼음에서 1 시간입니다. </li><li> 세포는 죽은 세포를 제외, 셀 스며들지 DNA의 염료를 포함하는 솔루션을 얼룩에 흐름 cytometry 분석을 위해 다시 중지됩니다. 여러 DNA의 염료가 Propidium 이우 7 - 아미노 actinomycin D ​​(7AAD) 또는 DAPI를 포함하여, 사용할 수 있습니다. 이들 사이에서 선택은 특정 항체 염색법에 촬영한 채널을 제공 가능한 채널, 그리고 흐름 cytometer에서 사용 가능한 채널에 따라 달라집니다. 7AAD는 BD - Biosciences (559925)에서 얻은하고 제조 업체의 지시에 따라 사용됩니다. DAPI의 얼룩 들어, (로체, 고양이 # 236276) 분말에서 dimethylformamide (DMF)에 1mg/ml의 주식을 -20 ° C에서 보관하고, 버퍼를 얼룩의 1:15,000으로 1:10,000를 희석. </li></ol> 6. 흐름 cytometric 정렬 <ol><li> 세포는 CD71에 대한 항체, Ter119, 혈통의 마커와 같은 흐름 cytometric 분석 (섹션 5) 설명 생존의 염료로 분류됩니다. 라벨 동안 세포 농도가 5 증가 수 X 10 7 / ML. </li><li> 혈통 마스터 믹스를 만들기 위해 다음과 항체의 각각의 동일한 음량을 혼합 : <ul><li> FITC 랫 안티 - 마우스 CD41 MWReg30, BD Pharmingen 553,848 </li><li> FITC 랫 안티 - 마우스 CD45R/B220 RA3 - 6B2, BD Pharmingen 553,087 </li><li> FITC 햄스터 방지 마우스 CD3e 145 - 2C11, BD Pharmingen 553,061 </li><li> FITC 쥐 방지 마우스 CD11b/Mac-1 M1/70, BD Pharmingen 557,396 </li><li> FITC 랫 안티 - 마우스 LY - 6G 및 LY - 6C (GR - 1) RB6 - 8C5, BD Pharmingen 553,126 </li><li> (이것은 모든 0.5 MG / ML 각 개별 항체 주식의 1:400 희석하는 것과 동일합니다) 1:80에서 마스터 믹스를 사용합니다. </li></ul></li><li> 저압 정렬 조건과 넓은 노즐을 사용합니다. 아리아에 대한 (BD Biosciences) 우리는 100 μ 노즐, 20 PSI 압력을 사용합니다. </li><li> 수집 버퍼 : PBS는이 20 % 태아 소 혈청을 추가했습니다. </li><li> 정렬 인구의 purities를 확인하려면 (7AAD 또는 이와 유사한 것) 생존의 염료를 포함하는 버퍼의 각 샘플에서 작은 나누어지는을 다시 실행합니다. </li></ol> 7. 대표 결과 : 성인 뼈 - 골수 또는 비장의 CD71/Ter119 얼룩이 표시된 ProE, EryA, EryB 및 EryC (그림 1), 넷 하위 집합의 발달 순서를 식별합니다. Morphologically, 이들은 점점 더 성숙 erythroblasts 일치합니다. 그림 1은 매우 작은 이벤트 (핵, 빨강 전지 포함), 집계 세포와 죽은 세포를 삭제 데이터 분석 단계에서 게이팅 순서를 보여줍니다. 세포 - 표면 단백질의 표현은 Ter119 및 CD71 얼룩 같은 시간에 관련된 항체를 추가하여이 하위 집합 각각에 대해 동시에 측정할 수 있습니다. 그림 1은 죽음 수용체 파 1 셀 표면 표현의 예를 보여줍니다. 이 측정은 EPO와 주입 생쥐에서 실시하거나, 컨트롤 마우스에 식염수에 주입했다. 그것은 EPO는 생체내 1 EryA 인구의 파의 표현을 억제 것이 분명합니다. 세포내 단백질 또는 세포주기 상태를 표현 또한 각 하위 집합에있는 세포에 대해 측정할 수 있습니다. 그림 2는 갓 수확 골수 세포의 대표적인 세포주기 분석을 보여줍니다. 이러한 측정치가 CD71와 Ter119와 함께 세포 표면 얼룩뿐만 아니라, 필요, 세포내 라벨 (토론 섹션을 참조) 세포의 고정과 permeabilization. 태아 간 년 아닌 erythroid 세포는 처음에는 CD41에 대해 아무것도 없습니다 &#39;린 -&#39;세포, 맥 - 1, GR - 1, B220 및 인 경우에는 3 번 CD에 들어 (그림 3)에 게이팅에서 제외됩니다. 나머지 세포은 하위 분할 S0 S5 6 하위 집합로. 태아 간장 세포의 정확한 패턴 (토론 섹션을 참조) 배아 나이에 따라 달라집니다. E13.5 태아 간에 S3의 부분 집합의 대표적인 세포주기 분석 (그림 4) 표시됩니다. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig1.jpg" alt="그림 1"/> 그림 1 마우스 비장의 CD71/Ter119 erythroid의 하위 집합 A.의 게이팅 전략 :.. 비장 세포를 처리하고 CD71, Ter119 및 파에서 감독 항체로 분류되었습니다. 이 그림은 데이터 수집 단계 다음과 같은 분석 전략을 보여줍니다. 히스토그램이 모든 인수 이벤트를 보여줍니다. 대각선 게이트 doublets 또는 더 큰 합산 제외하고 단일 세포 될 가능성이 이벤트를 나타냅니다. 이 게이트에있는 세포는 더 히스토그램 II에서 분석하고 있습니다. 여기에 아주 작은 이벤트 가능성이 핵이나 먼지는 제외됩니다. 문이 세포는 막 - 투과 apoptotic 세포 가능성이 높습니다 DAPI - 긍정적인 세포, 추가 분석에서 제외됩니다 히스토그램 III에 표시됩니다. 히스토그램 IV가 가능한 비장 세포의 결과 인구를 보여줍니다. ProE 게이트는 CD71 높은 Ter119 중간 세포가 포함되어 있습니다. Ter119 높은 세포는 더욱 막대 그래프로 분석 아르 V. 여기 CD71 높은 세포는 덜 성숙, 대형 &#39;EryA&#39;erythroblasts (CD71 높은 Ter119 높은 FSC 높은)와 작은 더 성숙한 &#39;EryB&#39;erythroblasts (CD71 높은 Ter119 높은 FSC 낮은)로 세분화 아르 . 가장 성숙한 erythroblast 부분 집합은 EryC (CD71 낮은 Ter119 높은 FSC 낮은)입니다. 히스토그램 VI는 기저 상태의 생쥐 (식염수에 주입), 그리고 EPO의 단일 복용과 함께 주입 생쥐에 특히 EryA 부분 집합의 셀 표면 파의 표현을 나타냅니다. 파 항체와 얼룩 것은 CD71/Ter119 얼룩과 동시에 진행되었습니다. 표시된 하위 집합의 각 정렬 세포의 B. Cytospin 준비가. 전지는 Giemsa 물들일과 Diaminobenzidine와 후자는 브라운 헤모글로빈과 얼룩이 생성되었습니다. Cytospin 데이터는 원래 리우 외 출판되었습니다., 피가. 2006 7월 1일, 108 (1) :123 - 33. Epub 2006 3월 9일. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig2.jpg" alt="그림 2"/> 그림 2. 마우스 골수에서 CD71 높은 Ter119 높은 erythroblasts의 세포주기 분석. 마우스는 BrdU와 intraperitoneally을 주입했고, 비장이나 뼈가 골수는 30~60분 나중에 수확했다. 세포 고정과 permeabilized과 (고정, permeabilization 및 BrdU - 얼룩 프로토콜 제조 업체의 지시에 따라되었습니다), CD71 및 Ter119에 대한 스테인드 것에 BrdU에 감독 단클론 항체 자신의 복제 DNA에 BrdU의 설립에 대한 스테인드했다 외에 하였다. BrdU 양성 세포주기의 S - 단계에 있습니다. 계면 세포가 BrdU - 부정하며 DNA 염료 7AAD을 사용하여 G1이나 G2 / M 단계로 해결될 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig3.jpg" alt="그림 3"/> 그림 3 마우스 태아의 간장에서 CD71/Ter119 erythroid의 하위 집합 A.의 게이팅 전략 :.. 태아 간 세포는 CD71, Ter119에 대한 라벨이 붙지만, 비 erythroid 혈통 표시 ( &#39;린&#39;)에서 감독 FITC - 라벨 항체의 칵테일. 가능한 세포 (7AAD 음수) 린 표현 분석되었고, 린 - 전지 더욱 S0에 S5 erythroid의 하위 집합으로 세분화됩니다. 영거, E13 태아 간가 성숙 S4/S5 하위 집합에있는 세포의 부재에 의해 표시된 덜 성숙 erythroblasts,로 구성되어 있습니다. 표시된 하위 집합의 각 정렬 세포의 B. Cytospin 준비가. 전지는 Giemsa 물들일과 Diaminobenzidine와 후자는 브라운 헤모글로빈과 얼룩이 생성되었습니다. Cytospin 데이터는 원래 P되었습니다팝 외에 ublished, 플로스 Biol 8 일 (9) :. e1000484가. 도이 : 10.1371/journal.pbio.1000484. <img src="/files/ftp_upload/2809/2809fig4.jpg" alt="그림 4"/> 그림 4. 태아 간 erythroid의 하위 집합의 세포주기 분석. 임신한 생쥐는 BrdU와 함께 주입했고, 태아의 간은는 permeabilized, 고정, 30~60분 나중에 수확하고, CD71, Ter119 및 BrdU에 대한 항체 물들일되었습니다. S3 세포의 세포주기 상태가 표시됩니다.

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	<li>Liu, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+Fas-FasL+coexpression+by+erythropoietin+mediates+erythroblast+expansion+during+the+erythropoietic+stress+response+in.">Suppression of Fas-FasL coexpression by erythropoietin mediates erythroblast expansion during the erythropoietic stress response in.</a> 108, 123-133 (2006).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Negative+Autoregulation+by+FAS+Mediates+Robust+Fetal+Erythropoiesis.">Negative Autoregulation by FAS Mediates Robust Fetal Erythropoiesis.</a> PLoS Biol. 5, e252-e252 (2007).</li><li>Krutzik, P. O., Hale, M. B., Nolan, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+the+murine+immunological+signaling+network+with+phosphospecific+flow+cytometry.">Characterization of the murine immunological signaling network with phosphospecific flow cytometry.</a> J Immunol. 175, 2366-2373 (2005).</li><li>Socolovsky, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ineffective+erythropoiesis+in+Stat5a(-/-)5b(-/-)+mice+due+to+decreased+survival+of+early+erythroblasts.">Ineffective erythropoiesis in Stat5a(-/-)5b(-/-) mice due to decreased survival of early erythroblasts.</a> Blood. 98, 3261-3273 (2001).</li><li>Guihard, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+MAPK+ERK1+is+a+negative+regulator+of+the+adult+steady-state+splenic+erythropoiesis.">The MAPK ERK1 is a negative regulator of the adult steady-state splenic erythropoiesis.</a> Blood. 115, 3686-3694 (2010).</li><li>Yu, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+erythroid+chaperone+that+facilitates+folding+of+alpha-globin+subunits+for+hemoglobin+synthesis.">An erythroid chaperone that facilitates folding of alpha-globin subunits for hemoglobin synthesis.</a> J Clin Invest. 117, 1856-1865 (2007).</li><li>Chen, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Erythroid+dysplasia,+megaloblastic+anemia,+and+impaired+lymphopoiesis+arising+from+mitochondrial+dysfunction.">Erythroid dysplasia, megaloblastic anemia, and impaired lymphopoiesis arising from mitochondrial dysfunction.</a> Blood. 114, 4045-4053 (2009).</li><li>Chen, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Resolving+the+distinct+stages+in+erythroid+differentiation+based+on+dynamic+changes+in+membrane+protein+expression+during+erythropoiesis.">Resolving the distinct stages in erythroid differentiation based on dynamic changes in membrane protein expression during erythropoiesis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 106, 17413-17418 (2009).</li><li>McGrath, K. E., Bushnell, T. P., Palis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multispectral+imaging+of+hematopoietic+cells:+where+flow+meets+morphology.">Multispectral imaging of hematopoietic cells: where flow meets morphology.</a> J Immunol Methods. 336, 91-97 (2008).</li><li>Pop, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+key+commitment+step+in+erythropoiesis+is+synchronized+with+the+cell+cycle+clock+through+mutual+inhibition+between+PU.1+and+S-phase+progression.">A key commitment step in erythropoiesis is synchronized with the cell cycle clock through mutual inhibition between PU.1 and S-phase progression.</a> PLoS Biol. 8, (2010).</li><li>Borsook, H., Lingrel, J. B., Scaro, J. L., Millette, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+haemoglobin+in+relation+to+the+maturation+of+erythroid+cells.">Synthesis of haemoglobin in relation to the maturation of erythroid cells.</a> Nature. 196, 347-350 (1962).</li></ol>

동물 실험은 매사 추세츠 의과 대학 IACUC위원회의 대학에 의해 명시된 지침과 규정에 따라 수행되었다.

흐름 cytometric 방법은 세포 표면 마커, 단백질 발현, 세포 생존, phospho 특정 항체 3 세포주기 상태를 사용하여 세포 신호를 포함하여 형광 - 복합 특정 항체 혹은 리간드와 검색 수있는 세포 기능의 동시 조사 수 있습니다. 이러한 성능은 신선하게 고립 erythropoietic 조직의 맥락에서, 분화 단계 특정 하위 집합의 개수 각 만들 수 있습니다. 이 방법은 따라서 erythropoietic 자극의 다양한 반응이나 ...

<table border="1"><tbody><tr><th> 시약의 이름 </th><th> 회사 </th><th> 카탈로그 번호 </th></tr><tr><td> 파 - 비오틴 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 554256 </td></tr><tr><td> Streptavidin - APC </td><td> 분자 프로브 </td><td> S868 </td></tr><tr><td> 40 μm의 무균 셀 스트레이너 </td><td> Fisherbrand </td><td> 22363547 </td></tr><tr><td> 외과의 얼룩을위한 폴리스티렌 왕복 하단 튜브 </td><td> BD 팰컨 </td><td> 352008 </td></tr><tr><td> U - 96 바닥 잘 플레이트 </td><td> BD 팰컨 </td><td> 353910 </td></tr><tr><td> ChromePure 래빗 IgG </td><td> 잭슨 ImmunoResearch </td><td> 015-000-003 </td></tr><tr><td> CD71 - FITC (재고 0.5mg/ml) </td><td> BD - Biosciences </td><td> 553266 </td></tr><tr><td> Ter119 - PE (재고 0.2mg/ml) </td><td> BD - Biosciences </td><td> 553673 </td></tr><tr><td> 7AAD </td><td> BD - Biosciences </td><td> 559925 </td></tr><tr><td> DAPI 분말 </td><td> 로체 </td><td> 236276 </td></tr><tr><td> FITC 랫 안티 - 마우스 CD41 MWReg30 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553848 </td></tr><tr><td> FITC 랫 안티 - 마우스 CD45R/B220 RA3 - 6B2 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553087 </td></tr><tr><td> FITC 랫 안티 - 마우스 CD411b/Mac-1 M1/70 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557396 </td></tr><tr><td> FITC 랫 안티 - 마우스 LY - 6G 및 LY - 6C (GR - 1) RB6 - 8C5 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553126 </td></tr><tr><td> FITC 햄스터 방지 마우스 CD3e 145 - 2C11 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 553061 </td></tr><tr><td> APC BrdU 흐름 키트 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 557892 </td></tr><tr><td> Annexin V - 비오틴 </td><td> BD Pharmingen </td><td> 556418 </td></tr></tbody></table>

identification and analysis of mouse erythroid progenitors using the cd71/ter119 flow-cytometric assay

적혈구 조혈의 연구는 이전 조혈 및 erythroid progenitors에서 형성하는 방법 빨간색 세포 이해하는 것을 목표로하고있다. 특히, 빨간색 셀 형성 율이 그의 합성 조직 hypoxia에 의해 트리거되는 호르몬 erythropoietin (EPO)에 의해 규제됩니다. EPO의 급속한 증가에 적절한 조직 산소 결과, erythropoietic 속도 증가를 주도하는 위협 erythropoietic 스트레스 반응으로 알려진 과정. 붉은 세포를 순환의 숫자의 증가는 결과 조직 산소 전달을 향상시킵니다. 효율적인 erythropoietic 스트레스 반응 따라서 생존과 같은 높은 고도, 빈혈, 출혈, 화학 요법 또는 줄기 세포 이식과 같은 생리 학적 및 병리 학적 조건에서 회복하는 것이 중요합니다. 마우스 적혈구 조혈 및 스트레스 반응의 연구에 중요한 모델입니다. 마우스 최종 (성인 타입) 적혈구 조혈은 신생아 비장에서 성인 비장 및 골수에서 배아 일 12.5과 15.5 사이의 태아 간에서 이루어진다. 조직에 erythroid progenitors를 식별하는 방법의 클래식 EPO 함유 반 고체 미디어 도금 때 붉은 세포 식민지을 일으키다 이러한 세포의 능력에 의존하고 있습니다. 그들 erythroid 전구체의 자손은 형태학의 기준에 따라 구분됩니다. 나도 이러한 고전적인 방법을 분자 연구를위한 차별화 단계 특정 erythroid 세포의 큰 숫자에 액세스할 수 없습니다. 우리가 직접 갓 절연 마우스 조직의 맥락에서 분화 단계 특정 erythroid progenitors의과 엽 성의 전구 물질을 식별하고 공부의 흐름 cytometric 방법을 제시한다. 분석은 세포 표면 마커 CD71, Ter119에 의존하고, 흐름 cytometric &#39;전달 - 분산형&#39;매개 변수에, 이것은 세포의 크기의 함수입니다. CD71/Ter119 분석은 생체내에 erythropoietic 스트레스를 자신의 응답을하는 동안 erythroid progenitors을 연구하는 데 사용할 수있는 예를 들어, 빈혈 마우스 또는 마우스로 낮은 산소 조건에서 지내게. 또한 적혈구 조혈에 수정된 분자 경로의 구체적인 역할을 평가하기 위해 직접 유전자 변형 성인 마우스 또는 태아의 조직에 erythroid progenitors의 연구를하는 데 사용할 수 있습니다.

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Identification and Analysis of Mouse Erythroid Progenitors using the CD71/TER119 Flow-cytometric Assay

직접 갓 수확 마우스 골수, 비장이나 태아의 간장에서 분화 단계 특정 murine erythroid progenitors의과 엽 성의 전구 물질의 식별 및 분자 분석을 위해 흐름 cytometric 방식입니다. 분석은 세포 표면 마커 CD71, Ter119 및 셀 크기에 의존합니다.

CD71/TER119 흐름 cytometric 어세를 사용하여 마우스 Erythroid Progenitors의 제품 식별 및 분석

The study of erythropoiesis aims to understand how red cells are formed from earlier hematopoietic and erythroid progenitors. Specifically, the rate of ...

identification-analysis-mouse-erythroid-progenitors-using-cd71ter119

Research

JoVE Journal

Biology

31.9K 조회수.  University of Massachusetts Medical School. 직접 갓 수확 마우스 골수, 비장이나 태아의 간장에서 분화 단계 특정 murine erythroid progenitors의과 엽 성의 전구 물질의 식별 및 분자 분석을 위해 흐름 cytometric 방식입니다. 분석은 세포 표면 마커 CD71, Ter119 및 셀 크기에 의존합니다.

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A Quantitative Assay for Insulin-expressing Colony-forming Progenitors

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the analysis of the single cell. Analyses of single progenitors are of critical importance because they provide definitive ways to unequivocally demonstrate the lineage potential of individual progenitors. Although methods have been devised to generate "pancreatospheres" in suspension culture from single cells, several limitations exist. First, it is time-consuming to perform single cell deposition for a large number of cells, which in turn commands large volumes of culture media and space. Second, numeration of the resulting pancreatospheres is labor-intensive, especially when the frequency of the pancreatosphere-initiating progenitors is low. Third, the pancreatosphere assay is not an efficient method to allow both the proliferation and differentiation of pancreatic progenitors in the same culture well, restricting the usefulness of the assay.
To overcome these limitations, a semi-solid media based colony assay for pancreatic progenitors has been developed and is presented in this report. This method takes advantage of an existing concept from the hematopoietic colony assay, in which methylcellulose is used to provide viscosity to the media, allowing the progenitor cells to stay in three-dimensional space as they undergo proliferation as well as differentiation. To enrich insulin-expressing colony-forming progenitors from a heterogeneous population, we utilized cells that express neurogenin (Ngn) 3, a pancreatic endocrine progenitor cell marker. Murine embryonic stem (ES) cell-derived Ngn3 expressing cells tagged with the enhanced green fluorescent protein reporter were sorted and as many as 25,000 cells per well were plated into low-attachment 24-well culture dishes. Each well contained 500 &mu;L of semi-solid media with the following major components: methylcellulose, Matrigel, nicotinamide, exendin-4, activin &beta;B, and conditioned media collected from murine ES cell-derived pancreatic-like cells. After 8 to 12 days of culture, insulin-expressing colonies with distinctive morphology were formed and could be further analyzed for pancreatic gene expression using quantitative RT-PCR and immunoflourescent staining to determine the lineage composition of each colony.
In summary, our colony assay allows easy detection and quantification of functional progenitors within a heterogeneous population of cells. In addition, the semi-solid media format allows uniform presentation of extracellular matrix components and growth factors to cells, enabling progenitors to proliferate and differentiate in vitro. This colony assay provides unique opportunities for mechanistic studies of pancreatic progenitor cells at the single cell level.

A three-dimensional clonogenic assay that allows pancreatic-like progenitors to differentiate into insulin-expressing colonies is described. This method takes advantage of semi-solid media containing methylcellulose, Matrigel and growth factors, in which single progenitors proliferate and differentiate in vitro, permitting quantification of the number of functional progenitors in a population.

인슐린을 표현 콜로니를 형성 Progenitors에 대한 정량 분석

The field of pancreatic stem and progenitor cell biology has been hampered by a lack of in vitro functional and quantitative assays that allow for the ...

연구

생물학

Flow Cytometric Analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation: A High Throughput Quantitative Method to Study Protein-protein Interaction

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC is based on the production of fluorescence using two non-fluorescent fragments of a fluorescent protein (Venus, a Yellow Fluorescent Protein variant, is used here). Non-fluorescent Venus fragments (VN and VC) are fused to two interacting proteins (in this case, AKAP-Lbc and PDE4D3), yielding fluorescence due to VN-AKAP-Lbc-VC-PDE4D3 interaction and the formation of a functional fluorescent protein inside cells.
BiFC provides information on the subcellular localization of protein complexes and the strength of protein interactions based on fluorescence intensity. However, BiFC analysis using microscopy to quantify the strength of protein-protein interaction is time-consuming and somewhat subjective due to heterogeneity in protein expression and interaction. By coupling flow cytometric analysis with BiFC methodology, the fluorescent BiFC protein-protein interaction signal can be accurately measured for a large quantity of cells in a short time. Here, we demonstrate an application of this methodology to map regions in PDE4D3 that are required for the interaction with AKAP-Lbc. This high throughput methodology can be applied to screening factors that regulate protein-protein interaction.

Flow cytometric analysis of Bimolecular Fluorescence Complementation provides a high throughput quantitative method to study protein-protein interaction. This methodology can be applied to mapping protein binding sites and for screening factors that regulate protein-protein interaction.

이분자 형광 보완의 유세포 분석 : 단백질 - 단백질 상호 작용을 연구하는 높은 처리량 정량 방법

Among methods to study protein-protein interaction inside cells, Bimolecular Fluorescence Complementation (BiFC) is relatively simple and sensitive. BiFC ...

SA-&#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell culture, termed senolytics, can reduce the senescent cell burden in vivo and extend healthspan. Multiple classes of senolytics have been identified to date including HSP90 inhibitors, Bcl-2 family inhibitors, piperlongumine, a FOXO4 inhibitory peptide and the combination of Dasatinib/Quercetin. Detection of SA-&#946;-Gal at an increased lysosomal pH is one of the best characterized markers for the detection of senescent cells. Live cell measurements of senescence-associated &#946;-galactosidase (SA-&#946;-Gal) activity using the fluorescent substrate C12FDG in combination with the determination of the total cell number using a DNA intercalating Hoechst dye opens the possibility to screen for senotherapeutic drugs that either reduce overall SA-&#946;-Gal activity by killing of senescent cells (senolytics) or by suppressing SA-&#946;-Gal and other phenotypes of senescent cells (senomorphics). Use of a high content fluorescent image acquisition and analysis platform allows for the rapid, high throughput screening of drug libraries for effects on SA-&#946;-Gal, cell morphology and cell number.

SA-&amp;#946;-Galactosidase-Based Screening Assay for the Identification of Senotherapeutic Drugs

Cellular senescence is the key factor in the development of chronic age-related pathologies. Identification of therapeutics that target senescent cells show promise for extending healthy aging. Here, we present a novel assay to screen for the identification of senotherapeutics based on measurement of senescence associated &#946;-Galactosidase activity in single cells.

SA-β-갈락토시다아제 계 선별 분석법

Cell senescence is one of the hallmarks of aging known to negatively influence a healthy lifespan. Drugs able to kill senescent cells specifically in cell ...

Flow Cytometric Analysis of Extracellular Vesicles from Cell-conditioned Media

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for phenotypic analyses of extracellular vesicles (EV) including exosomes (Exo) in the peripheral blood and other body fluids. The small size of EV mandates the use of dedicated instruments having a detection threshold around 50-100 nm. Alternatively, EV can be bound to latex microbeads that can be detected by FC. Microbeads, conjugated with antibodies that recognize EV-associated markers/Cluster of Differentiation CD63, CD9, and CD81 can be used for EV capture. Exo isolated from CM can be analyzed with or without pre-enrichment by ultracentrifugation. This approach is suitable for EV analyses using conventional FC instruments. Our results demonstrate a linear correlation between Mean Fluorescence Intensity (MFI) values and EV concentration. Disrupting EV through sonication dramatically decreased MFI, indicating that the method does not detect membrane debris. We report an accurate and reliable method for the analysis of EV surface antigens, which can be easily implemented in any laboratory.

The protocol describes a reproducible method designed for use with cell culture supernatants to detect surface epitopes on small extracellular vesicles (EV). It utilizes specific EV immunoprecipitation using beads coupled with antibodies that recognize surface antigen CD9, CD63, and CD81. The method is optimized for downstream flow cytometry analysis.

Extracellular 소포 세포 조절 미디어에서의 Cytometric 분석 흐름

Flow cytometry (FC) is the method of choice for semi-quantitative measurement of cell-surface antigen markers. Recently, this technique has been used for ...

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors (FAPs) and Myogenic Progenitors (MPs) in Skeletal Muscle in the Rat

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in muscle homeostasis, injury, and repair. Current protocols for FAPs identification and isolation use flow cytometry/fluorescence-activated cell sorting (FACS) and studies evaluating their function in vivo to date have been undertaken exclusively in mice. The larger inherent size of the rat allows for a more comprehensive analysis of FAPs in skeletal muscle injury models, especially in severely atrophic muscle or when investigators require substantial tissue mass to conduct multiple downstream assays. The rat additionally provides a larger selection of muscle functional assays that do not require animal sedation or sacrifice, thus minimizing morbidity and animal use by enabling serial assessments. The flow cytometry/FACS protocols optimized for mice are species specific, notably restricted by the characteristics of commercially available antibodies. They have not been optimized for separating FAPs from rat or highly fibrotic muscle. A flow cytometry/FACS protocol for the identification and isolation of FAPs and MPs from both healthy and denervated rat skeletal muscle was developed, relying on the differential expression of surface markers CD31, CD45, Sca-1, and VCAM-1. As rat-specific, flow cytometry-validated primary antibodies are severely limited, in-house conjugation of the antibody targeting Sca-1 was performed. Using this protocol, successful Sca-1 conjugation was confirmed, and flow cytometric identification of FAPs and MPs was validated by cell culture and immunostaining of FACS-isolated FAPs and MPs. Finally, we report a novel FAPs time-course in a prolonged (14 week) rat denervation model. This method provides the investigators the ability to study FAPs in a novel animal model.

Identification, Isolation, and Characterization of Fibro-Adipogenic Progenitors FAPs and Myogenic Progenitors MPs in Skeletal Muscle in the Rat

This protocol outlines a method to isolate Fibro-adipogenic progenitors (FAPs) and myogenic progenitors (MPs) from rat skeletal muscle. Utilization of the rat in muscle injury models provides increased tissue availability from atrophic muscle for the analysis and a larger repertoire of validated methods to assess muscle strength and gait in free-moving animals.

쥐의 골격 근육에서 섬유 선화 (FAP) 및 근생 전구자 (의원)의 식별, 격리 및 특성화

Fibro-adipogenic Progenitors (FAPs) are resident interstitial cells in skeletal muscle that, together with myogenic progenitors (MPs), play a key role in ...

Isolation of Mouse Megakaryocyte Progenitors

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through megakaryopoiesis. The final stages of this process are complex and classically involve the bipotent Megakaryocyte-Erythrocyte Progenitors (MEP) and the unipotent Megakaryocyte Progenitors (MKp). These populations precede the formation of bona fide megakaryocytes and, as such, their isolation and characterization could allow for the robust and unbiased analysis of megakaryocyte formation. This protocol presents in detail the procedure to collect hematopoietic cells from mouse bone marrow, the enrichment of hematopoietic progenitors through magnetic depletion and finally a cell sorting strategy that yield highly purified MEP and MKp populations. First, bone marrow cells are collected from the femur, the tibia, and also the iliac crest, a bone that contains a high number of hematopoietic progenitors. The use of iliac crest bones drastically increases the total cell number obtained per mouse and thus contributes to a more ethical use of animals. A magnetic lineage depletion was optimized using 450 nm magnetic beads allowing a very efficient cell sorting by flow cytometry. Finally, the protocol presents the labeling and gating strategy for the sorting of the two highly purified megakaryocyte progenitor populations: MEP (Lin-Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9dim) and MKp (Lin- Sca-1-c-Kit+CD16/32-CD150+CD9bright). This technique is easy to implement and provides enough cellular material to perform i) molecular characterization for a deeper knowledge of their identity and biology, ii) in vitro differentiation assays, that will provide a better understanding of the mechanisms of maturation of megakaryocytes, or iii) in vitro models of interaction with their microenvironment.

This method describes the purification by flow cytometry of MEP and MKp from mice femurs, tibias, and pelvic bones.

마우스 메가카요시테 전조자의 격리

Bone marrow megakaryocytes are large polyploid cells that ensure the production of blood platelets. They arise from hematopoietic stem cells through ...

쥐 췌장 β세포의 유사분열(Mitophagy)에 대한 정량적 분석

Complementary Approaches to Interrogate Mitophagy Flux in Pancreatic &#946;-Cells

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient insulin release. Advanced quantitative assessments of mitophagy often require the use of genetic reporters. The mt-Keima mouse model, which expresses a mitochondria-targeted pH-sensitive dual-excitation ratiometric probe for quantifying mitophagy via flow cytometry, has been optimized in &#946;-cells. The ratio of acidic-to-neutral mt-Keima wavelength emissions can be used to robustly quantify mitophagy. However, using genetic mitophagy reporters can be challenging when working with complex genetic mouse models or difficult-to-transfect cells, such as primary human islets. This protocol describes a novel complementary dye-based method to quantify &#946;-cell mitophagy in primary islets using MtPhagy. MtPhagy is a pH-sensitive, cell-permeable dye that accumulates in the mitochondria and increases its fluorescence intensity when mitochondria are in low pH environments, such as lysosomes during mitophagy. By combining the MtPhagy dye with Fluozin-3-AM, a Zn2+ indicator that selects for &#946;-cells, and Tetramethylrhodamine, ethyl ester (TMRE) to assess mitochondrial membrane potential, mitophagy flux can be quantified specifically in &#946;-cells via flow cytometry. These two approaches are highly complementary, allowing for flexibility and precision in assessing mitochondrial quality control in numerous &#946;-cell models.

저자 스포트라이트: 효과적이고 강력한 보완적 접근법을 사용한 췌장 β세포의 미토파지 플럭스 평가 

This protocol outlines two methods for the quantitative analysis of mitophagy in pancreatic &#946;-cells: first, a combination of cell-permeable mitochondria-specific dyes, and second, a genetically encoded mitophagy reporter. These two techniques are complementary and can be deployed based on specific needs, allowing for flexibility and precision in quantitatively addressing mitochondrial quality control.

췌장 β세포에서 미토파지 플럭스를 조사하기 위한 보완적 접근법

Mitophagy is a quality control mechanism necessary to maintain optimal mitochondrial function. Dysfunctional &#946;-cell mitophagy results in insufficient ...

Imaging Flow Cytometry를 사용한 미생물 autoaggregation의 정량 분석

Imaging Flow Cytometry to Study Microbial Autoaggregation

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The Lactobacillaceae family consists of Gram-positive bacteria with confirmed probiotic properties. This study utilizes Lactobacillaceae species as a model to demonstrate the effectiveness of single-cell high throughput analysis in studying cellular aggregation. The focus is on analyzing the response of these beneficial species to simple carbohydrates from the diet.
The study showcases how Imaging Flow Cytometry (IFC) can overcome the fundamental differences in the assembly of probiotic bacteria in the presence and absence of carbohydrates. IFC combines the power and speed of conventional flow cytometry with the spatial resolution of microscopy, enabling high-rate complex morphometric measurements in a phenotypically defined manner across a library of beneficial bacterial strains and conditions. This protocol provides insights into the autoaggregation of Lactobacillaceae species and sheds light on their response to dietary carbohydrates, contributing to understanding the mechanisms behind the beneficial effects of these probiotic bacteria.

저자 스포트라이트: Advancing Research in Microbial Autoaggregation Using Imaging Flow Cytometry (이미징 유세포분석을 사용한 미생물 자가응집 연구의 발전)

This protocol describes a quantitative approach to measure microbial autoaggregation using imaging flow cytometry.

미생물 자가응집(microbial autoaggregation)을 연구하기 위한 이미징 유세포분석(Imaging flow cytometry)

Beneficial and probiotic bacteria play essential roles in their hosts, providing various health benefits, including immunity to infectious diseases. The ...