Name: electroconvulsive seizures in rats and fractionation of their hippocampi to examine seizure-induced changes in postsynaptic density proteins
Uploaded: 2017-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 7 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins at JoVE.com

저자 분류 및 박사 그레이엄 H. Diering 그의 원심 분리기를 사용 하 여 소규모 프로토콜 PSD 분별에 대 한 제공에 대 한 존스 홉킨스 대학에서 박사 리처드 L. Huganir의 실험실에서 수 박사 에릭 C. 볼 턴 감사 합니다.

동물 주제를 포함 하 여 모든 실험 절차는 기관 동물 관리 및 사용 어바나-샴페인 일리노이의 대학에 위원회에 의해 승인 되었습니다.
1. 쥐 식민지를 유지 하
<ol><li>Sprague Dawley 쥐 ( 재료의 표참조)를 번 식 하 고 12-h 빛 어두운 주기와 음식과 물에 대 한 ad libitum 액세스 표준 조건에서 그들을 유지 하는 것.</li>
	<li>출생 후 하루 (P) 28에 쥐 새끼를 유아와 2-4 남성 또는 여성 littermates의 그룹에서 그들을 집.</li>
	<li>확인을 위해 비 독성 영구 블랙 마커 남성 쥐의 꼬리를 표시 합니다.</li>
	<li>주 당 3 번 남성 쥐 무게와 그들의 bodyweights를 기록.</li>
</ol>2입니다. ECS 시스템의 준비
<ol><li>오전 7 시 30 분, 동물 준비 실에서 벤치를 소독 하 고 벤치에는 ECS 컴퓨터 (펄스 발생기)를 배치 합니다.</li>
	<li>장소는 개별 남성 쥐 새 장에 깨끗 하 고 빈 뚜껑 200-250 g를 무게. 이 모든 남성 쥐 ECS 유도 치료를 반복 합니다. 30 분 동안 길 들 쥐를 보자.</li>
	<li>쥐가 그들의 감 금 소에서 habituating는, ECS 유도 대 한 펄스 발생기 100 펄스/s, 0.5 ms의 펄스 폭, 0.5의 충격 기간의 주파수로 설정 s, 및 55의 전류 (그림 1A).</li>
	<li>"리셋" 버튼을 누르면 하 고 "준비" 버튼이 켜져 확인 하 여 펄스 발생기를 준비 합니다. 귀 클립 펄스 발생기에 연결 되지 않습니다 다음 몇 초 동안 "충격" 버튼을 누릅니다 있는지 확인 합니다. 참고:이 시점에서, 펄스 발생기는 ECS 유도 대 한 준비.</li>
	<li>펄스 발생기에 귀 클립을 연결 합니다.</li>
</ol>3입니다. 급성 ECS의 유도
: 참고 그림 1B, 상단 패널.
<ol><li>멸 균 식 염 수와 귀 클립 젖은 고 그들은 포화 상태를 확인 합니다.</li>
	<li>식 염 수에 젖은 거 즈에서 그들을 포장 하 여 멸 균 식 염 수와 쥐의 귀를 젖은. 일단 그들이 젖은 거 즈를 제거 합니다.</li>
	<li>귀, 주요 연골 밴드 넘어 위치 당 하나의 클립을 연결 합니다.</li>
	<li>그는 진정한 루프 설립; ECS 시스템에서 확인 그렇지 않으면, 오류 메시지 또는 "1"의 컴퓨터에 표시 됩니다.</li>
	<li>두께, 비-금속 장갑 착용. 부드럽게 gloved 손에서 쥐를 잡고, 몇 초 동안 "충격" 버튼을 누르고 천천히 발작을 관찰 하기 위해 쥐에 그립을 풀어. "발작" 가짜 (NS) 제어, 쥐를 동일 하 게 처리 하지만 현재 제공 하지 않습니다.</li>
	<li>Clonus 시작으로 귀 클립을 분리 하 고 (1 단계), "머리를 끄 덕" (2 단계), "forelimb clonus" "입과 얼굴의 움직임"를 포함 하는 개정된 라신의 규모22 에 따라 발작 동작 기록 (3 단계), "양육 forelimb clonus와" (4 단계), 그리고 "양육과 forelimb clonus 떨어지고" (5 단계). 나포 약 10 마지막으로 해야 s; 타이머를 사용 하 여 발작 기간을 기록 합니다.</li>
	<li>나포 종료, 다음 홈 그것의 감 금에 쥐를 반환 합니다. 쥐의 발작에서 회복 되도록 또 다른 5 분 동안 쥐를 모니터링 합니다. 장에 홀로 지 내게 그것을 유지 하 고 회복 실에 감 금 소를 반환.</li>
	<li>다음 쥐에 ECS 유도 반복 합니다.</li>
	<li>나머지 하루 아침에 한 번 이상 있고 그들은 실험에 대 한 안락사는 때까지 다음 날 오후에 한번 걸쳐 쥐를 모니터링 합니다. 참고: ECS 유도 메서드는 부수적 부작용으로, 주의 요하는 임상 증상을 발생할 수 있습니다. 예를 들어, ECS 유도 프로토콜 수 쥐를 15 s 및 원인 불필요 한 고통 보다 더 오래 지속 되는 발작을 유도 하 고 있다. 이 경우에, 다이아 제 팜 (10 mg/kg, i.p.) 또는 pentobarbital (25-30 mg/kg, i.p.)를 사용 하 여 발작을 종료 합니다. 쥐 호흡 곤란 이나 심한 행동 이상 발작 정지 다음 개발, 경우 잘린 뒤 이산화탄소 흡입에 의해 그들을 안락사.</li>
</ol>4입니다. 만성 ECS의 유도
주: 그림 1B, 하단 패널을 참조 하십시오.
<ol><li>7 일 연속, 위의 1-3 단계에 설명 된 대로 아침에 같은 시간에 하루 한 ECS를 유도.</li>
	<li>모니터는 쥐 두 번 하루에 그들은 그들의 가정에 반환 된 후 연습장.</li>
</ol>5. 균질 및 쥐 된의 분류
참고: 그림 2를 참조 하십시오.
<ol><li>자당 320 m m, 5mm 나트륨 파이 인산, 1 mM EDTA, 10 mM HEPES pH 7.4, 포함 하는 신선한 균질 버퍼 (솔루션) 준비 200 nM okadaic 산 및 효소 억제제. 필터-필터를 사용 하 여 진공 여과 0.22 μ m 기 공 크기와 버퍼를 소독 하 고 얼음에 그것을 배치.</li>
	<li>주어진된 시간에 가리킨 다음 ECS 급성 또는 만성 ECS (그림 1), 5-10 분, 잘린은 단두대를 사용 하 여 다음 공동2 흡입에 의해 쥐를 안락사.</li>
	<li>두뇌를 제거 하 고 앞에서 설명한23,24얼음에 배치 하는 금속 격판덮개에 된 해 부.</li>
	<li>30 m m 조직 문화에 한 쥐에서 장소 2 된 접시 하 고가 위를 사용 하 여 작은 조각으로 그들을 말하다.</li>
	<li>1 mL 피 펫을 사용 하 여 수동 유리 균질 화기를 다진된 된 전송 하 고 차가운 균질 버퍼 (솔루션, 단계 5.1)의 1 mL를 추가 합니다. 유리 균질 화기에 둥근 유 봉을 삽입 합니다. 얼음에 유리 균질 화기를 실행 하는 동안 부드럽게 그리고 꾸준히 뇌졸중 위아래로 10-15 시간 1 분, 대 한 유 봉에 hippocampal 조직의 작은 조각을 사라질 때까지.</li>
	<li>1 mL 피 펫을 사용 하 여 1.7 mL microcentrifuge 튜브에는 homogenate를 전송 하 고 불용 성 조직 및 핵 (P1 분수)를 포함 하는 펠 릿에서 homogenate postnuclear 상쾌한 (S1 분수)를 구분을 4 ° C에서 10 분 동안 800 x g에서 원심. 1 mL 피 펫을 사용 하 여 두 개의 별도, 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브를 50 µ L 및 S1 분수의 950 µ L를 전송 및 얼음이 튜브를 저장. 얼음에 P1 분수 펠 릿을 저장 합니다.</li>
	<li>S1 분수 (950 µ L) 13, 800 x g와 상쾌한 (S2 분수), 수용 성 cytosolic 단백질 농축 분리 하 4 ° C에서 10 분 원심 하 고 펠 릿 (P2 분수), 막 바인딩 단백질, synaptosomal 단백질을 포함 한 농축. S2 분수 1 mL 피 펫을 사용 하 여 새로운 1.7 mL microcentrifuge에 전송 하 고 얼음에 저장 합니다.</li>
	<li>얼음 처럼 차가운 물 1 mL 피 펫을 사용 하 여 정화의 498 µ L에서 펠 릿 (P2 분수)를 resuspend. 추가 1 M HEPES (pH 7.4)의 2 µ L 4 mM HEPES (pH 7.4)의 최종 농도 달성 하기 위해 20 µ L 피 펫을 사용 하 여. Resuspended P2 분수 얼음에 30 분이 게에 대 한 동요와 4 ° C에서 품 어.</li>
	<li>BCA 분석 결과 사용 하 여 S1, S2, P2 분수의 단백질 농도 결정 합니다. 1 mg/mL 농도 달성-80 ° C까지 사용, 저장을 각 분수를 50 mM HEPES (pH 7.4)를 추가 하거나 PSD를 분리 하는 P2 분수를 처리 합니다.</li>
</ol>6. 원유 막 단백질 (P2) 분수에서 PSD의 격리
<ol><li>Lysed 상쾌한 (LS2 분수)와 lysed 펠 릿 (LP1 분수)를 분리 하는 P2 분수 (500 µ L) 25000 x g와 4 ° C에서 20 분을 원심. LS2 분수 1 mL 피 펫을 사용 하 여 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브에 전송 하 고 얼음에 저장 합니다.</li>
	<li>250 µ L 1 mL 피 펫을 사용 하 여 PBS 버퍼 x 1에 1% 세제의 혼합 50 mM HEPES (pH 7.4)의 250 µ L에서 LP1 펠 릿을 resuspend. 15 분에 대 한 부드러운 교 반으로 4 ° C에서 품 어.</li>
	<li>25000 x g와 펠 릿 (PSD 분수)에서 상쾌한 (비 PSD 분수)를 분리 하 4 ° C에서 3 h resuspended LP1 펠 렛 원심 상쾌한 1.7 mL microcentrifuge 튜브를 제거 하 고 50 mm HEPES (pH 7.4) 100 µ L에서 PSD 펠 릿 resuspend 200 µ L 피 펫을 사용 하 여.</li>
	<li>LS2, 비-PSD를, 그리고 BCA 분석 결과 사용 하 여 PSD 분수의 단백질 농도 결정 합니다. 1 mg/mL 농도 달성-80 ° C에서 사용까지 저장을 각 분수를 50 mM HEPES (pH 7.4)를 추가 합니다. 참고: 모든 솔루션 (즉, 해결책, HEPES 버퍼, 그리고 PBS 버퍼) 5-6 단계에서 사용 되는 정화 물 이온 및 유기 오염 물질과 입자의 무료 여야 한다.</li>
</ol>7. 서 부 럽
<ol><li>각 단백질 분수 얼음에 녹여 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 새로운 1.7 mL microcentrifuge 튜브 (S2, P2, 그리고 1 mg/mL의 PSD) 각 분수의 12 µ L를 전송 합니다.</li>
	<li>5 x SDS 샘플 버퍼의 3 µ L을 추가 하 고 물 욕조에 30 분 동안 75 ° C에 품 어. 차가운 실내 온도 (RT) 아래로 샘플.</li>
	<li>4-20% 그라데이션 15 잘 빗 SDS polyacrylamide 젤 전기 이동 법 (SDS-PAGE) 젤 20 µ L 피 펫을 사용 하 여 각 우물에 단백질 샘플의 10 µ L를 로드 합니다. SDS 페이지 장치에 버퍼를 실행에 80-100 V에서 젤을 실행 (25mm Tris, 190 m m 글리신, 및 0.1 %SDS; pH 8.3). 참고: 각 젤 NS 쥐와 급성 또는 만성 ECS 다음 다른 시간 지점에서 ECS 쥐에서 단백질 견본을 포함 해야 합니다.</li>
	<li>전송 SDS 페이지에서 단백질 젤 25-30 V에서 전송 장치에 비닐 difluoride (PVDF) 막 (60 mA) 전송 버퍼에 9-12 h (25mm Tris, 190 m m 글리신, 및 20% 메탄올; pH 8.3).</li>
	<li>전송 장치에서 PVDF 멤브레인을 제거 하 고 Tris 버퍼 염 분 (TBS)에서 실시간 다중 목적 회전에 5 분에서 그것을 씻어합니다</li>
	<li>5% 우유에 막 차단 및 0.1% 트윈-20 1 헤에 대 한 TBS에서 품 어 그것 세척 버퍼에 1 차 항 체 (표 1)에서 (1% 우유와 0.1 %TBS 트윈-20) 4 ° C에서 다중 목적 회전에 하룻밤 (희석에 대 한 재료의 표 참조).</li>
	<li>워시 버퍼에서 4 시간 10 분 대 한 멤브레인을 세척 하 고 다음 양 고추냉이 과산화 효소 (HRP)와 그것을 품 어-실시간에 다중 목적 회전에 1 시간에 대 한 버퍼를 세척에 2 차 항 체를 활용</li>
	<li>5 분 4 시간 10 분 대 한 막 워시 버퍼 그리고 TBS로 세척.</li>
	<li>1 분에 대 한 향상 된 chemifluorescence 기판으로 막 품 어 하 고 x 선 필름에 노출. 필름 프로세서와 함께 노출된 영화를 개발할 수 있습니다.</li>
</ol>8입니다. 서 부도 말의 정량화
<ol><li>검색 양과 TIFF 파일로 오 컴퓨터에이 파일을 저장 합니다.</li>
	<li>"파일," "이미지 열기," 오른쪽 화살표 "그레이 스케일" 회색조 이미지로 ImageJ 프로그램에서 서쪽 오 점 파일을 엽니다</li>
	<li>ImageJ 도구 모음에서 사각형 선택 도구를 선택 하 고 관심사의 단백질의 하나의 서양 오 점 밴드를 포함 하는 사각형을 그립니다.</li>
	<li>"분석" 아래 "측정을" 지역 및 선택한 밴드의 평균 밀도를 했다.</li>
	<li>그것의 크기와 모양을 변경 하지 않고 배경 영역에 사각형을 이동 합니다. 및 배경의 밀도 8.4 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>관심사의 단백질의 배경 빼고 밴드 밀도 주는 서쪽 오 점 밴드의 배경 밴드의 밀도 값을 뺍니다.</li>
	<li>관심의 모든 서쪽 오 점 밴드 8.2 8.6 단계를 반복 합니다.</li>
	<li>Α-Tubulin;와 같은 내부 관리 유전자 제품의 배경 빼고 밴드 밀도 의해 관심사의 단백질의 배경 빼고 밴드 밀도를 나눕니다 이 단계는 관심사의 단백질의 정규화 된 값을 생성합니다.</li>
</ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

여기, ECS 유도 하는 방법을 쥐에 그들의 된 신경 활동의 글로벌 자극 elicits 설명 합니다. ECS는 electroconvulsive 치료, 임상 인간1,2,3약물 내 화 우울증 질환을 치료 하는 데 사용 되는 동물 모델입니다. 심한 우울증 치료 electroconvulsive 치료의 사용에도 불구 하 고 정확한 기본 메커니즘 불분명 남아 있습니다. ECS 경우 새로운 조사를 ?...

Electroconvulsive 치료 심한 약물 내성 우울증, 양극성 우울증, 파 킨 슨 병의 질병, 그리고 정신 분열 증1,2를 포함 하 여 주요 우울증 장애 환자 치료에 사용 되었습니다. 이 치료에서 발작 epicranial 전극1,2,3를 통해 마 취 환자의 머리에 전달 하는 전기 자극에 의해 생성 됩니다. ECS의 반복적인 관리 임상 약물 내성 우울증 장애1,2,3에 도움이 되었습니다. 그러나, 인 간에 있는 항우울제 효과의 장기 효 험 기본 정확한 메커니즘은 애매 남아 있다. ECS는 electroconvulsive 치료의 동물 모델 이며 치료 메커니즘을 조사에 널리 사용 됩니다. 설치류, 급성 ECS와 ECS 치료 만성는 된 성체를 촉진 하 고 신경 네트워크4,5, 재구성 인지 유연성에서 향상에 기여할 것입니다. 또한, ECS에 의해 두뇌 활동의 글로벌 상승 같은 두뇌 파생 neurotropic 요소6, 그리고 여러 단백질, N-메 틸-D-aspartate metabotropic 글루타민 산 염 수용 체 17 등 성적 증명서의 풍부 변경 (NMDA) 형식 글루타민 산 염 수용 체 소 단위7. 이러한 변화는 시 냅 스 번호, 구조, 및 해 마7,,89에서 힘의 장기 수정 중재에서 포함 된다.
ECS 모델에 전기 자극 일반화 된 토 닉 clonic 발작10,11연상 stereotaxically 이식된 전극, 막 전극, 또는 귀 전극을 통해 설치류에 전달 됩니다. 전극의 stereotaxic 주입 뇌 수술을 포함 하 고 상해를 최소화 하기 위해 실험의 수술 능력을 개선 하기 위해 상당한 시간이 필요 합니다. 적은 침략 적인 각 막 전극 각 막 찰과상과 건조를 일으킬 수 있고 마 취 필요. 귀 클립 전극의 사용 때문에 수술이 나 마 취 없이 설치류에 사용 될 수 있는 최소한의 부상의 입을 이러한 제한을 무시 합니다. 사실, 우리 귀 클립 전극을 통해 현재 깨어 배달된 쥐 안정적으로 4-5 단계 토 닉 clonic 발작을 유도 및 변경 된10그들의 시 냅 스 단백질 발견.
ECS 유도 풍요의 설치류의 특정 두뇌 지구에서 시 냅 스 단백질을 검사, 그것은 그들의 탐지 및 정량화에 대 한 가장 적합 한 실험 방법을 선택 하는 것이 중요. 두뇌의 subcellular 분별 녹는 cytosolic 단백질;의 원유 격리에 대 한 허용 막 단백질; 세포 기관이 경계 단백질; 그리고 PSD12,,1314같은 특별 한 subcellular 구조에 단백질. PSD는 신경에 시 냅 스 단백질은 매우 집중에서 그리고 postsynaptic 막12,,1315근처에 있는 조밀 하 고 잘 조직 된 subcellular 도메인. PSD의 풍요로 움과 postsynaptic 글루타민 산 염 수용 체, 비 계 단백질, 및 PSD12 신호 변환 단백질의 기능에 동적 변경 이후는 PSD에 농축 하는 시 냅 스 단백질의 연구에 대 한 유용 , 15 , 16 , 17 시 냅 스가 소성 및 여러 가지 신경 장애17,18에서 관찰 하는 synaptopathy와 상관 있다. PSD를 정화 하는 데 사용 하는 이전 subcellular 분류 방법 자당 기온 변화도14, 의 차등 원심 분리에 의해 두뇌의 원유 막 분수에서 세제 불용 성 분수의 참여 19. 많은 양의 설치류 두뇌14,19요구 한다이 전통적인 방법으로 주요 도전 이다. 격리 치료 당 PSD 분수를 10-20 설치류의 준비 광범위 한 비용 및 시간 투자를 요구 하 고 많은 치료 하는 경우에 실제적으로 가능 하지 않습니다.
이 문제를 극복 하기 위해 우리가 직접 PSD 분수 없이 자당 기온 변화도 원심 분리20,21, 격리 하 고 단일 쥐의 된에서 PSD 격리를 적용할 수 있도록 개정 하는 간단한 방법 적응 두뇌입니다. 우리의 소규모 PSD 분류 방법에 대 한 수익률 2 된, immunoprecipitation 및 서쪽에 게 더 럽 히기를 포함 하 여 생 화 확 적인 분석 실험에서 사용 하기 위해 충분 한에서 PSD 단백질의 30-50 µ g. 부 럽 (PSD-95) postsynaptic 밀도 단백질 95의 농축 및 연 접 마커 synaptophysin 및 녹는 세포질 단백질 α-tubulin 배제를 공개 하 여 PSD를 고립 시키기를 위한 우리의 방법의 성공을 보여 줍니다. 우리의 ECS 유도 및 소규모 PSD 분류 방법 다른 설치류 뇌 영역에 쉽게 적응할 수 있으며 PSD 단백질의 표현에 ECS의 효과 평가 하는 비교적 간단 하 고 안정적인 방법을 제공.

<table><tbody><tr><td>Spargue-Dawley rat</td><td>Charles River Laboratories</td><td></td><td>ECS supplies</td></tr><tr><td>A pulse generator</td><td>Ugo Bsile, Comerio, Italy</td><td>57800</td><td>ECS supplies</td></tr><tr><td>MilliQ water purifying system</td><td>EMD Millipore</td><td>Z00Q0VWW</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Em science</td><td>SX 1075-3</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>Na&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;O&lt;sub&gt;7&lt;/sub&gt;P&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>221368</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA)</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>E9884</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>H0527</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>Okadaic acid</td><td>TOCRIS</td><td>1136</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor</td><td>Thermo Scientific</td><td>78429</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>NaVO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>72060</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>EMD Millipore Sterito Sterile Vacuum Bottle-Top Filters</td><td>Fisher Scientific</td><td>SCGPS05RE</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>Iris Scissors</td><td>WPI (World Precision Instruments)</td><td>500216-G</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>30 mm tissue culture dish</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772B</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>Glass homogenizer and a Teflon pestle</td><td>VWR</td><td>89026-384</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>1.7 mL microcentrifuge tube</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&amp;nbsp;</td><td>C2170 (1001002)</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>Sorvall Legend XT/XF Centrifuge&amp;nbsp;</td><td>Thermo Fisher</td><td>75004521</td><td>Subcellular fractionation supplies</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Reagent A, 500 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>#23228</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Pierce BCA Protein Assay Reagent B, 25 mL</td><td>Thermo Fisher</td><td>#1859078</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>SDS-polyacrylamide gel (SDS-PAGE)</td><td>BIO-RAD</td><td>#4561086S</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Running Buffer</td><td>Made in the lab</td><td></td><td>Western blot supplies.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Vertical Electrophorsis Cell for MiniPrecast Gels, 4-gel</td><td>BIO-RAD</td><td>#1658004</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Polyvinyl difluoride (PVDF) membrane&amp;nbsp;</td><td>Milipore</td><td>IPVH00010</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Transfer Buffer</td><td>Made in the lab</td><td></td><td>Western blot supplies.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP152-1</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfate</td><td>SIGMA-ALDRICH</td><td>436143</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Methanol&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>A454-4</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP151-500</td><td>detergent for PSD isolation</td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Module&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>#1703935</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Nonfat instant dry milk</td><td>Great value</td><td></td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Multi-purposee rotator&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>Model-2314</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Hyblot CL Autoradiography Film</td><td>DENVILLE SCIENTIFIC INC.&amp;nbsp;</td><td>E3018 (1001365)</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>Enhanced chemifluorescence substrate&amp;nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>32106</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>a Konica SRX-101A film processor</td><td>KONICA MINOLTA</td><td>SRX-101A</td><td>Western blot supplies</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name of Antibody&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PSD-95</td><td>Cell Signaling</td><td>#2507</td><td>Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &amp;deg;C, Host Species = Rabbit</td></tr><tr><td>Synaptophysin</td><td>Cell Signaling</td><td>#4329</td><td>Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &amp;deg;C, Host Species = Rabbit</td></tr><tr><td>alpha-Tubulin</td><td>Santacruz</td><td>SC-5286</td><td>Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &amp;deg;C, Host Species = Mouse</td></tr><tr><td>GluN2B</td><td>Neuromab</td><td>75-097</td><td>Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &amp;deg;C, Host Species = Mouse</td></tr><tr><td>GluA2</td><td>Sigma-aldrich</td><td>Sab 4501295</td><td>Antibody dilution = 1:500 - 1,000, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &amp;deg;C, Host Species = Rabbit</td></tr><tr><td>STEP</td><td>Santacruz</td><td>SC-23892</td><td>Antibody dilution = 1:200 - 500, time = 9 - 12 h, Reaction Temperature = 4 &amp;deg;C, Host Species = Mouse</td></tr><tr><td>Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoReserch laboratory</td><td>715-035-150</td><td>Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey</td></tr><tr><td>Peroxidas AffiniPure Donkey Anti-Rabbit IgG (H+L)</td><td>Jackson ImmunoReserch laboratory</td><td>711-035-152</td><td>Antibody dilution = 1:2,000-5,000, time = 1 h, Reaction Temperature = RT, Host Species = Donkey</td></tr></tbody></table>

electroconvulsive seizures in rats and fractionation of their hippocampi to examine seizure-induced changes in postsynaptic density proteins

Electroconvulsive 발작 (ECS)는 electroconvulsive 치료, 심한 우울증에 대 한 가장 효과적인 치료의 실험 동물 모델. ECS 낮은 사망률과 신경 죽음으로 일반화 된 토 닉 clonic 발작을 유도 하 고 화면 항 간 질 약에 널리 사용 되는 모델 이다. 여기, 우리는 ECS 유도 방법을 설명 간단한 55-mA 전류 0.5에 대 한 전달 되는에서 남성 s 쥐 귀 클립 전극을 통해 무게에 200-250 g. 이러한 양자 자극 생산 단계 4-5 clonic 발작 지속 약 10 s. 급성 또는 만성 ECS의 정지 후 대부분 쥐 행동 구별 되도록 복구 "발작" 쥐 사기. ECS는 세계적으로 두뇌 활동을 끌어올리고, 때문에 그것 또한 활동 종속 변경 시 냅 스 단백질 및 여러 방법을 사용 하 여 시 냅 스 강도에 미치는 영향의 검토에 사용 되었습니다. 특히, 서 부 럽 함께에서 postsynaptic 밀도 (PSD)의 subcellular 분류 전문된이 시 냅 스 구조에서 시 냅 스 단백질의 풍부의 양적 결정 수 있습니다. 설치류 두뇌의 큰 금액을 필요로 하는 이전 분류 방법, 달리 여기 자당 기온 변화도 원심 분리 하지 않고 하나의 쥐의 된에서 PSD를 분리 하는 소규모 분류 방법을 설명 합니다. 이 방법을 사용 하 여, 우리는 고립 된 PSD 분수 postsynaptic 막 단백질, PSD95, GluA2, GluN2B, 등을 포함 보여줍니다. 연 접 마커 synaptophysin 및 녹는 세포질 단백질 α-tubulin는 성공적인 PSD 격리를 보여주는 PSD 분수에서 제외 했다. 또한, 만성 ECS GluN2B 식 우리의 소규모 PSD 분류 방법, 약리, 유전 또는 기계적 치료 후 단일 쥐에서 hippocampal PSD 단백질에 변화를 감지에 적용할 수 있습니다 나타내는 PSD에 감소 .

상세한 절차를 사용 하 여 여기에 제시 된, 전기 충격 (55 mA, 0.5에 대 한 100 펄스/s s) 쥐 (그림 1A-B)에서 4-5 토 닉 clonic 발작 귀 클립 전극 유도 반복 되지 않는 단계를 통해 전달. 쥐의 총 8 급성 ECS 유도 받은 고 4-5 단계 토 닉 clonic 발작을 표시. 발작 지속 약 10 s, 그리고 모든 쥐 발작 정지의 1-2 분 이내 복구. 가짜 "아니 발작" 쥐 전기 충격을 ...

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Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

Electroconvulsive 발작 (ECS)는 심한 우울증을 위한 electroconvulsive 치료의 실험 동물 모델. 세계적으로 ECS synaptogenesis 및 시 냅 스가 소성 하는 해 마에서 활동을 자극 한다. 여기, 우리가 쥐에 ECS 유도 및 시 냅 스 단백질에 변화 발작 유발 검사 된 그들의 subcellular 분류 방법을 설명 합니다.

쥐와 분류 된 그들의 Postsynaptic 밀도 단백질에 변화 발작 유발 검사 Electroconvulsive 발작

Electroconvulsive seizure (ECS) is an experimental animal model of electroconvulsive therapy, the most effective treatment for severe depression. ECS ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

11.9K 조회수.  University of Illinois at Urbana-Champaign. Electroconvulsive 발작 (ECS)는 심한 우울증을 위한 electroconvulsive 치료의 실험 동물 모델. 세계적으로 ECS synaptogenesis 및 시 냅 스가 소성 하는 해 마에서 활동을 자극 한다. 여기, 우리가 쥐에 ECS 유도 및 시 냅 스 단백질에 변화 발작 유발 검사 된 그들의 subcellular 분류 방법을 설명 합니다.

비디오: Electroconvulsive Seizures in Rats and Fractionation of Their Hippocampi to Examine Seizure-induced Changes in Postsynaptic Density Proteins

Isolation of CA1 Nuclear Enriched Fractions from Hippocampal Slices to Study Activity-dependent Nuclear Import of Synapto-nuclear Messenger Proteins

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular mechanisms of synaptic plasticity. Long-term potentiation (LTP) and long-term depression (LTD) induced in acute hippocampal slices are widely accepted as cellular models of learning and memory. There are numerous studies that use live cell imaging or immunohistochemistry approaches to visualize activity dependent protein dynamics. However these methods rely on the suitability of antibodies for immunocytochemistry or overexpression of fluorescence-tagged proteins in single neurons. Immunoblotting of proteins is an alternative method providing independent confirmation of the findings.&#160;The first limiting factor in preparation of subcellular fractions from individual tetanized hippocampal slices is the low amount of material. Second, the handling procedure is crucial because even very short and minor manipulations of living slices might induce activation of certain signaling cascades. Here we describe an optimized workflow in order to obtain sufficient quantity of nuclear enriched fraction of sufficient purity from the CA1 region of acute hippocampal slices from rat brain. As a representative example we show that the ERK1/2 phosphorylated form of the synapto-nuclear protein messenger Jacob actively translocates to the nucleus upon induction of LTP and can be detected in a nuclear enriched fraction from CA1 neurons.

We provide a detailed protocol for induction of long-term potentiation in the CA1 region of the hippocampus and the subsequent isolation of nuclear enriched fractions from the tetanized area of the slice. This approach can be used to determine activity dependent nuclear protein import in cellular models of learning and memory.

해마 조각에서 CA1 핵 농축 분획의 분리는 Synapto 핵 메신저 단백질의 활동에 의존하는 핵 가져 오기를 공부합니다

Studying activity dependent protein expression, subcellular translocation, or phosphorylation is essential to understand the underlying cellular ...

연구

신경과학

Brain Source Imaging in Preclinical Rat Models of Focal Epilepsy using High-Resolution EEG Recordings

Electroencephalogram (EEG) has been traditionally used to determine which brain regions are the most likely candidates for resection in patients with focal epilepsy. This methodology relies on the assumption that seizures originate from the same regions of the brain from which interictal epileptiform discharges (IEDs) emerge. Preclinical models are very useful to find correlates between IED locations and the actual regions underlying seizure initiation in focal epilepsy. Rats have been commonly used in preclinical studies of epilepsy1; hence, there exist a large variety of models for focal epilepsy in this particular species. However, it is challenging to record multichannel EEG and to perform brain source imaging in such a small animal. To overcome this issue, we combine a patented-technology to obtain 32-channel EEG recordings from rodents2 and an MRI probabilistic atlas for brain anatomical structures in Wistar rats to perform brain source imaging. In this video, we introduce the procedures to acquire multichannel EEG from Wistar rats with focal cortical dysplasia, and describe the steps both to define the volume conductor model from the MRI atlas and to uniquely determine the IEDs. Finally, we validate the whole methodology by obtaining brain source images of IEDs and compare them with those obtained at different time frames during the seizure onset.

This video introduces the preparation, recording, and source analysis procedures of high-resolution EEG on sedated rats with a particular preclinical model of focal epilepsy under noninvasive conditions.

고해상도 뇌파 기록을 사용하여 초점 간질의 전임상 쥐 모델에서 뇌 원본 영상

Electroencephalogram (EEG) has been traditionally used to determine which brain regions are the most likely candidates for resection in patients with ...

의학

Chronic Transcranial Electrical Stimulation and Intracortical Recording in Rats

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a closed-loop event-triggered manner. Although many studies are focusing on the possible benefits and side-effects of TES in healthy and pathologic brains, there are still many fundamental open questions regarding the mechanism of action of the stimulation. Therefore, there is a clear need for a robust and reproducible method to test the acute and the chronic effects of TES in rodents. TES can be combined with regular behavioral, electrophysiological, and imaging techniques to investigate neuronal networks in vivo. The implantation of transcranial stimulation electrodes does not impose extra constraints on the experimental design while it offers a versatile, flexible tool to manipulate brain activity. Here we provide a detailed, step-by-step protocol to fabricate and implant transcranial stimulation electrodes to influence brain activity in a temporally constrained manner for months.

This detailed protocol describes transcranial stimulation electrode placement on the temporal bone in order to investigate the short- and long-term effects of transcranial electrical stimulation in freely moving rats.

만성 Transcranial 전기 자극 및 쥐 Intracortical 녹음

Transcranial electrical stimulation (TES) is a powerful and relatively simple approach to diffusely influence brain activity either randomly or in a ...

Recording and Modulation of Epileptiform Activity in Rodent Brain Slices Coupled to Microelectrode Arrays

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) is a promising approach when pharmacological treatment fails or neurosurgery is not recommended. Acute brain slices coupled to microelectrode arrays (MEAs) represent a valuable tool to study neuronal network interactions and their modulation by electrical stimulation. As compared to conventional extracellular recording techniques, they provide the added advantages of a greater number of observation points and a known inter-electrode distance, which allow studying the propagation path and speed of electrophysiological signals. However, tissue oxygenation may be greatly impaired during MEA recording, requiring a high perfusion rate, which comes at the cost of decreased signal-to-noise ratio and higher oscillations in the experimental temperature. Electrical stimulation further stresses the brain tissue, making it difficult to pursue prolonged recording/stimulation epochs. Moreover, electrical modulation of brain slice activity needs to target specific structures/pathways within the brain slice, requiring that electrode mapping be easily and quickly performed live during the experiment. Here, we illustrate how to perform the recording and electrical modulation of 4-aminopyridine (4AP)-induced epileptiform activity in rodent brain slices using planar MEAs. We show that the brain tissue obtained from mice outperforms rat brain tissue and is thus better suited for MEA experiments. This protocol guarantees the generation and maintenance of a stable epileptiform pattern that faithfully reproduces the electrophysiological features observed with conventional field potential recording, persists for several hours, and outlasts sustained electrical stimulation for prolonged epochs. Tissue viability throughout the experiment is achieved thanks to the use of a small-volume custom recording chamber allowing for laminar flow and quick solution exchange even at low (1 mL/min) perfusion rates. Quick MEA mapping for real-time monitoring and selection of stimulating electrodes is performed by a custom graphic user interface (GUI).

We illustrate how to perform recording and electrical modulation of 4-aminopyridine-induced epileptiform activity in rodent brain slices using microelectrode arrays. A custom recording chamber maintains tissue viability throughout prolonged experimental sessions. Live electrode mapping and selection of stimulating pairs are performed by a custom graphical user interface.

녹음 및 Microelectrode 배열에 결합 하는 설치류 뇌 조각에 Epileptiform 활동의 변조

Temporal lobe epilepsy (TLE) is the most common partial complex epileptic syndrome and the least responsive to medications. Deep brain stimulation (DBS) ...

Generation and On-Demand Initiation of Acute Ictal Activity in Rodent and Human Tissue

Controlling seizures remains a challenging issue for the medical community. To make progress, researchers need a way to extensively study seizure dynamics and investigate its underlying mechanisms. Acute seizure models are convenient, offer the ability to perform electrophysiological recordings, and can generate a large volume of electrographic seizure-like (ictal) events. The promising findings from acute seizure models can then be advanced to chronic epilepsy models and clinical trials. Thus, studying seizures in acute models that faithfully replicate the electrographic and dynamical signatures of a clinical seizure will be essential for making clinically relevant findings. Studying ictal events in acute seizure models prepared from human tissue is also important for making findings that are clinically relevant. The key focus in this paper is on the cortical 4-AP model due to its versatility in generating ictal events in both in vivo and in vitro studies, as well as in both mouse and human tissue. The methods in this paper will also describe an alternative method of seizure induction using the Zero-Mg2+ model and provide a detailed overview of the advantages and limitations of the epileptiform-like activity generated in the different acute seizure models. Moreover, by taking advantage of commercially available optogenetic mouse strains, a brief (30 ms) light pulse can be used to trigger an ictal event identical to those occurring spontaneously. Similarly, 30 - 100 ms puffs of neurotransmitters (Gamma-Amino Butyric Acid or glutamate) can be applied to the human tissue to trigger ictal events that are identical to those occurring spontaneously. The ability to trigger ictal events on-demand in acute seizure models offers the newfound ability to observe the exact sequence of events that underlie seizure initiation dynamics and efficiently evaluate potential anti-seizure therapies.

Acute seizure models are important for studying the mechanisms underlying epileptiform events. Furthermore, the ability to generate epileptiform events on-demand provides a highly efficient method to study the exact sequence of events underlying their initiation. Here, we describe the acute 4-aminopyridine cortical seizure models established in mouse and human tissue.

설치류와 인간의 조직에 급성 Ictal 활동의 생성 및 요청 시 개시

Controlling seizures remains a challenging issue for the medical community. To make progress, researchers need a way to extensively study seizure dynamics ...

Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats

Microdialysis is a well-established neuroscience technique that correlates the changes of neurologically active substances diffusing into the brain interstitial space with the behavior and/or with the specific outcome of a pathology (e.g., seizures for epilepsy). When studying epilepsy, the microdialysis technique is often combined with short-term or even long-term video-electroencephalography (EEG) monitoring to assess spontaneous seizure frequency, severity, progression and clustering. The combined microdialysis-EEG is based on the use of several methods and instruments. Here, we performed in vivo microdialysis and continuous video-EEG recording to monitor glutamate and aspartate outflow over time, in different phases of the natural history of epilepsy in a rat model. This combined approach allows the pairing of changes in the neurotransmitter release with specific stages of the disease development and progression. The amino acid concentration in the dialysate was determined by liquid chromatography. Here, we describe the methods and outline the principal precautionary measures one should take during in vivo microdialysis-EEG, with particular attention to the stereotaxic surgery, basal and high potassium stimulation during microdialysis, depth electrode EEG recording and high-performance liquid chromatography analysis of aspartate and glutamate in the dialysate. This approach may be adapted to test a variety of drug or disease induced changes of the physiological concentrations of aspartate and glutamate in the brain. Depending on the availability of an appropriate analytical assay, it may be further used to test different soluble molecules when employing EEG recording at the same time.

Here, we describe a method for in vivo microdialysis to analyze aspartate and glutamate release in the ventral hippocampus of epileptic and non-epileptic rats, in combination with EEG recordings. Extracellular concentrations of aspartate and glutamate may be correlated with the different phases of the disease.

자유롭게 이동 하는 쥐에서 뇌 파 기록 하는 동안 흥분 성의 아미노산의 Microdialysis

Microdialysis is a well-established neuroscience technique that correlates the changes of neurologically active substances diffusing into the brain ...

Electrophoretic Delivery of &#x3B3;-aminobutyric Acid (GABA) into Epileptic Focus Prevents Seizures in Mice

Epilepsy is a group of neurological disorders which affects millions of people worldwide. Although treatment with medication is helpful in 70% of the cases, serious side effects affect the quality of life of patients. Moreover, a high percentage of epileptic patients are drug resistant; in their case, neurosurgery or neurostimulation are necessary. Therefore, the major goal of epilepsy research is to discover new therapies which are either capable of curing epilepsy without side effects or preventing recurrent seizures in drug-resistant patients. Neuroengineering provides new approaches by using novel strategies and technologies to find better solutions to cure epileptic patients at risk.
As a demonstration of a novel experimental protocol in an acute mouse model of epilepsy, a direct in situ electrophoretic drug delivery system is used. Namely, a neural probe incorporating a microfluidic ion pump (&#181;FIP) for on-demand drug delivery and simultaneous recording of local neural activity is implanted and demonstrated to be capable of controlling 4-aminopyridine-induced (4AP-induced) seizure-like event (SLE) activity. The &#947;-aminobutyric acid (GABA) concentration is kept in the physiological range by the precise control of GABA delivery to reach an antiepileptic effect in the seizure focus but not to cause overinhibition-induced rebound bursts. The method allows both the detection of pathological activity and intervention to stop seizures by delivering inhibitory neurotransmitters directly to the epileptic focus with precise spatiotemporal control.
As a result of the developments to the experimental method, SLEs can be induced in a highly localized manner that allows seizure control by the precisely tuned GABA delivery at the seizure onset.

Electrophoretic Delivery of &#947;-aminobutyric Acid GABA into Epileptic Focus Prevents Seizures in Mice

The challenge of epilepsy research is to develop novel treatments for patients where classical therapy is inadequate. Using a new protocol&#8212;with the help of an implantable drug delivery system&#8212;we are able to control seizures in anesthetized mice by the electrophoretic delivery of GABA into the epileptic focus.

Epilepsy is a group of neurological disorders which affects millions of people worldwide. Although treatment with medication is helpful in 70% of the ...

Preparation of Acute Human Hippocampal Slices for Electrophysiological Recordings

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for sudden death. Despite an abundance of available treatment options, about 30% of patients are drug-resistant. Several novel therapeutics have been developed using animal models, though the rate of drug-resistant patients remains unaltered. One of probable reasons is the lack of translation between rodent models and humans, such as a weak representation of human pharmacoresistance in animal models. Resected human brain tissue as a preclinical evaluation tool has the advantage to bridge this translational gap. Described here is a method for high quality preparation of human hippocampal brain slices and subsequent stable induction of epileptiform activity. The protocol describes the induction of burst activity during application of 8 mM KCl and 4-aminopyridin. This activity is sensitive to established AED lacosamide or novel antiepileptic candidates, such as dimethylethanolamine (DMEA). In addition, the method describes induction of seizure-like events in CA1 of human hippocampal brain slices by reduction of extracellular Mg2+ and application of bicuculline, a GABAA receptor blocker. The experimental set-up can be used to screen potential antiepileptic substances for their effects on epileptiform activity. Furthermore, mechanisms of action postulated for specific compounds can be validated using this approach in human tissue (e.g., using patch-clamp recordings). To conclude, investigation of vital human brain tissue ex vivo (here, resected hippocampus from patients suffering from temporal lobe epilepsy) will improve the current knowledge of physiological and pathological mechanisms in the human brain.

The presented protocol describes the transport and preparation of resected human hippocampal tissue with the ultimate goal to use vital brain slices as a preclinical evaluation tool for potential antiepileptic substances.

전기 생리학적 기록을 위한 급성 인간 해마 슬라이스의 준비

Epilepsy affects about 1% of the world population and leads to a severe decrease in quality of life due to ongoing seizures as well as high risk for ...

Assessment of Excitatory Neurotransmitter Levels in Chronic Epilepsy-Induced Rats

<a href='https://app.jove.com/v/58455/microdialysis-excitatory-amino-acids-during-eeg-recordings-freely'>Source: Soukupov&#225;, M., et al. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. J. Vis. Exp. (2018)</a>This video demonstrates the assessment of extracellular excitatory neurotransmitter levels in rats with chronic epilepsy induction. After implanting a microdialysis probe into the brain and confirming the absence of seizures using electroencephalography (EEG), extracellular fluid is collected to evaluate elevated neurotransmitter levels in epileptic rats. A high-potassium solution is then infused to sustain neuronal excitability and trigger an increased release of neurotransmitters, with samples collected to assess the potassium-induced peak in excitatory neurotransmitters.

Source: Soukupov&#225;, M., et al. Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats. J. Vis. Exp. (2018)This video ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuropathology

Epilepsy and Seizure Disorders

Electroencephalographic Recording of Epileptic Seizures in Epilepsy-Induced Rats

Source: Soukupov&#225;, M., et al. <a href="https://app.jove.com/v/58455">Microdialysis of Excitatory Amino Acids During EEG Recordings in Freely Moving Rats.</a> J. Vis. Exp. (2018)
This video demonstrates electroencephalographic (EEG) recording of epileptic seizures in epilepsy-induced rats. A rat with electrodes implanted in the ventral hippocampus is connected to the EEG recording system and placed in a plexiglass chamber. The rat is allowed to move freely while the brain activity is recorded to monitor the occurrence of seizures.

간질에 의한 쥐의 간질 발작에 대한 뇌파 기록

All procedures involving animal models have been reviewed by the local institutional animal care committee and the JoVE veterinary review board.
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