우리의 기술을 사용하여, 우리는 측두엽 간질에 대한 약물 개발에 도움이 인간의 뇌 샘플 내에서 잠재적 인 항 간질 물질을 테스트 할 수 있습니다. 인간의 뇌 조직은 기본 연구와 임상 응용 프로그램 사이의 번역 캡을 위반의 장점이있다. 시술 당일 또는 전날 가능한 한 늦게, 섭씨 37도의 수조에서 10x 콜린 aCSF 용액의 50 밀리리터를 해동하고 해동 용액 50 밀리리터를 2~약 300밀리리터의 이중 증류수로 추가합니다.
포도당과 염화 칼슘의 최종 농도를 혼합물에 넣고 용해 될 때까지 저어줍니다. 그런 다음 500 밀리리터의 최종 부피에 이중 증류수를 추가합니다. 진동을 측정합니다.
그리고 1x 콜린 aCSF의 약 100 밀리리터로 병을 채웁니다. 시술 당일, 얼음에 1x 콜린 aCSF를 냉각하고 카보겐 가스에 연결된 유리 가스 디스펜서를 사용하여 최소 10~15분 동안 용액을 카보레네이트합니다. 시술 10~15분 전에 저장 aCSF, 높은 칼륨 플러스 4-아미노피리딘 aCSF, 낮은 마그네슘 플러스 비큐컬린에서 35도까지 카보게네이션을 사용한다.
인터페이스 챔버를 준비하려면 각 슬라이스 홀딩 컴파트먼트에 대해 4-2센티미터 크기의 필터 용지 두 개를 자르고 조각을 서로 겹치게 합니다. 그런 다음 얇은 면 끈을 구획 내부에 필터 용지 주위에 놓고 용액의 장력을 깨고 균일한 흐름을 보장합니다. 그리고 각 구획에 있는 더 큰 필터 용지 위에 필터 용지 3~4개를 놓습니다.
조직 조각을 획득하기 전에 70 %의 에탄올을 사용하여 준비 영역을 닦고 부위에 덮개를 놓습니다. 슈퍼 접착제, 두 개의 날카로운 핀셋, 주걱, 블레이드가있는 메스, 진동기 근처의 뇌 조직의 거친 절단을위한 블레이드를 놓습니다. 진동의 완충 트레이와 표본 판을 70%에탄올로 닦아냅니다.
완충 용지함이 완전히 건조하면 알루미늄 호일로 덮고 트레이를 얼음 욕조에 놓습니다. 얼음 목욕을 분쇄 된 얼음으로 채우고 준비까지 영하 20도의 욕조를 유지하십시오. 그런 다음 진동과 면도날을 70%에탄올로 닦고 진동을 보정하여 슬라이스 시술 시술 중 수직 진동 및 조직 손상을 최소화합니다.
조직 샘플을 획득 한 직후, 수송 콜린 aCSF에서 조직을 제거하고 조직의 연소 된 부분을 잘라. 균일한 표면을 절단하여 시편 판에 티슈 조각을 붙일 수 있고 진동을 사용하여 뇌 조직을 400 마이크로미터 두께의 조각으로 슬라이스하여 절단 중에 필요에 따라 진동과 진동의 진폭과 속도를 조절합니다. 인간 해마의 일부 부분은 다른 사람보다 절단에 더 저항 할 수 있습니다.
추가 주의와 시간을 하면 샘플 품질을 크게 향상시킬 수 있습니다. 메스를 사용하여 뇌 조각을 다듬어 기록실에 맞고 주걱과 작은 집게를 사용하여 적어도 한 시간 동안 인터페이스 챔버의 작은 필터 용지에 조각을 조심스럽게 놓습니다. 간질 활성 레코딩의 경우, 플라스틱 링에 접착된 반 투과성 멤브레인을 챔버에 넣고 챔버의 유입 및 유출 튜브를 연동 펌프에 연결합니다.
미리 데워진 환생 aCSF로 튜브와 챔버를 채웁니다. 기록 전극을 준비하기 위해 154 밀리머 나트륨 염화 나트륨 용액으로 1~2메가옴 유리 파이펫을 채우기. 파이펫을 전극 홀더에 넣고 핀셋과 주걱을 사용하여 인터페이스 챔버에서 해마 조각을 발보 aCSF로 채워진 페트리 접시로 옮기습니다.
슬라이스를 뒤집지 않고 필터 용지를 제거하고 슬라이스를 기록 실에 넣습니다. 슬라이스를 슬라이스 메쉬로 제자리에 놓고 전극을 관심 지역에 배치합니다. 녹음을 시작합니다.
높은 칼륨과 4-aminopyridine에 의해 유도된 버스트 활동은 세척 후 2~5분 후에 표시되어야 하며, 낮은 마그네슘과 비큐큘린에 의한 발작과 같은 이벤트의 유도는 최대 30분이 소요될 수 있다. 높은 칼륨과 4-aminopyridine의 응용 프로그램은 몇 분 이내에 버스트 이벤트의 형태로 간질 활성을 유도한다. 10초 이상의 지속 시간을 가진 발작과 같은 이벤트는 낮은 마그네슘과 비큐컬린을 적용하여 유도될 수 있다.
라코사미드를 적용하고 디메틸레타놀라민을 적용하는 동안 버스트 이벤트의 수는 모두 감소하지만 진폭은 대부분 영향을 받지 않습니다. 뇌 조직의 품질또한 준비 중 오염 및 손상을 줄임으로써 향상 될 수 있습니다. 우리의 방법으로 준비 된 인간의 두뇌 조각 패치 클램프를 사용 하 여 뉴런의 기본적인 생리 적 기능을 조사 하거나 다양 한 기술을 사용 하 여 유전자 발현을 조사 하는 데 사용할 수 있습니다.
전 세계의 실험실은 인간의 뇌 내의 기본 메커니즘을 연구하기 시작했으며, 이러한 통찰력은 약물 개발을 돕기 위해 사용될 수 있으며 제안된 방법을 사용하여 테스트 할 수 있습니다.
