이 작품은 리그 Genevoise 죄수 르 암에 의해 지원 되었다 Fondation 박사 뒤부아 Ferriere Dinu Lipatti, Oncosuisse KPS OCS, OCS-02260-08-2008, 2914-02-2012, 스위스 국립 과학 재단 그랜트 31003A_156760 및 310030 153456.

인간의 혈액 샘플은 로컬 윤리 제네바 대학 병원의 인간 실험 위원회에 의해 승인 절차에 따라 사용 되었다.
동물 절차는 기관 윤리 위원회의 동물 관리 제네바, 스위스 및 Cantonal 수의 사무실에 따라 수행 했다 (승인 번호: GE/26/15).
1. 밀도 그라데이션 분리 하 여 기본 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)의 준비
참고: 말 초 혈액의 3-5 mL MCL leukemic 단계에서 제시 하는 환자에서 얻은 했다. 진단 그리고 염색체 전 좌 t(11;14)의 존재와  D1의 overexpression에 의해 확인 이후에 cytometry (CD5 +, CD23−, CD200 +, 단일 클로 널 B 세포 인구)에 대 한 표준 진단 기준에 따라 설립 되었다. 모든 경우에 단일 클론 B 세포를 구성 > 총 B 세포 인구의 90%. 나머지는 monocytes 그리고 몇몇 T 세포 주로 했다.
<ol><li>로스웰 파크 기념 연구소 매체 1640 (RPMI) (그림 1A)의 5 mL로 MCL 혈액 샘플의 (1:1) 5 mL를 희석.</li>
	<li>철저 하 게 혼합 되도록 사용 하기 전에 여러 번 밀도 그라데이션 미디어 (자료 테이블) 반전.</li>
	<li>피 펫 흡 인기를 사용 하 여 15 mL 원심 분리기 튜브에 밀도 그라데이션 미디어의 5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 밀도 그라데이션 미디어는 흡 인기 (혈액 밀도 그라데이션 미디어 비율을 2:1, 예를 들어, 밀도 그라데이션 미디어의 5 ml는 혈액 10 mL 이어야 한다)를 사용 하 여 15 mL 원심 분리기 튜브를 통해 희석된 혈액 샘플 레이어. 한다 주의 하지 믹스 (그림 1B, C) 두 개의 레이어.</li>
	<li>원심 브레이크 해제와 함께 실 온에서 40 분에 대 한 400 x g에서 샘플을 원심.</li>
	<li>중간 계층 (약간 흰, 얇은 반지 화살표 (그림 1D, E)으로 표시)을 발음 부드럽게 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 단 세포를 포함 하 고 깨끗 한 관으로 그들을 전송.</li>
	<li>단 셀의 세척<ol>
<li>전송 된 셀 서 스 펜 션의 볼륨을 예측 하 고 그것에 추가 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 살 균 1의 3 볼륨.</li>
		<li>여러 번 왔다 갔다 pipetting으로 현 탁 액을 혼합.</li>
		<li>실 온에서 10-15 분 400-500 x g에서 정지 원심</li>
		<li>셀 공 세척 단계를 다시 반복 하는 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 원하는 볼륨, 예를 들어, 1 또는 2 mL PBS의 셀 resuspend.</li>
		<li>자동된 셀 카운터 또는 수동으로 hemocytometer (Neubauer 챔버)을 사용 하 여 셀의 개수를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. B 세포 부정적인 선택에 의해 B 세포의 농축
<ol><li>50 x 106 셀/mL의 최종 농도에 셀 PBS에 희석.</li>
	<li>하단 폴리스 티 렌 튜브 라운드 5 mL에 셀을 전송. 세포 현 탁 액 2 mL를 B 세포 농축 키트에서 항 체 칵테일의 100 µ L을 추가 하 고 (그림 2-1) 위아래로 pipetting으로 부드럽게 혼합.</li>
	<li>10 분 동안 실내 온도에 세포를 품 어.</li>
	<li>짧게 소용돌이 자석 입자 키트에 제공 된는 B 세포 농축 30 s (그림 2-2). 샘플의 2 mL에 자석 입자의 150 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 또 다른 5 분에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	<li>1 x PBS 2% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 및 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)와 2.5 mL를 샘플 볼륨을 가져와. 자석에 튜브를 놓고 또 다른 3-5 분 (그림 2-3)에 대 한 튜브를 품 어.</li>
	<li>장소, 그리고 하나의 연속 모션 튜브와 자석까지, 풍부한 세포 현 탁 액을 신선한 튜브 (그림 2-4) 수집할 튜브를 가만히 따르다. 자동된 셀 카운터 또는 B 세포의 총 수익률을 얻을 수 있는 hemocytometer를 사용 하 여 수동으로 셀을 계산 합니다. 참고: 일반적으로 수익률은 ~ 105 B 셀/mL 정상 B 세포와 106 셀/MCL l x 5-50.</li>
	<li>B 세포 농축의 순도 확인<ol>
<li>받아 ~ 50000 셀 안티-CD19/CD20 항 체와 세포를 품 어 고 (1시 20분 희석)와 안티 CD45 항 체 결합 다른 형광 (1시 10분 희석) 15-30 분 동안 실내 온도에.</li>
		<li>PBS + 1% BSA x 1의 1 mL로 세척 하 고 400-500 x g 5 분 동안에 세포를 원심 resuspend ~ 200 µ L의 PBS에 셀.</li>
		<li>Cytometry에 의해 셀 샘플을 확보 하 고 B 세포의 순도 대 한 분석. 순도 대부분 > 90%가이 방법 (그림 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다.이 종이 식 마우스 모델의 개발
<ol><li>1 x PBS (마우스 당 주사 하는 데 필요한 볼륨)의 150-200 µ L에 106 셀 x 40-60을 일시 중단 합니다.</li>
	<li>세포 현 탁 액의 150 µ L를 정 맥 주사 (i.v.) (그림 4A) 성별에 관계 없이 오래 된 6-7 주 immunodeficient 끄 덕 scid 감마 (NSG) 쥐의 꼬리 정 맥 각에.</li>
	<li>쥐 인간 림프 종 ~ 10 주에 대 한 개발을 허용 합니다. 참고: 기본 인간 림프 종 세포 인간 림프 종 세포 라인 (3 주)에 비해 종양 개발에 훨씬 더 오래 걸릴.</li>
	<li>동물 체중 감소 같은 치명적인 질병의 증상을 보여 시작, 뻗 치고 머리, 감소 활동, 뒷 다리 마비, 등, 희생 쥐 CO2 질 피를 심장 심장 찔린 다음에 의해.</li>
	<li>수집 다른 쥐를 해 부하 여 골 수, 비장, 그리고 간 같은 기관과 종양 engraftment 분석에 대 한 희생의 때에는 심장에서 혈액을 그리기에 의해 말 초 혈액을 수집 (그림 4B -F).</li>
</ol>4. chimerism 분석 Engrafted 다른 장기에 종양 세포의
<ol><li>다른 장기를 수집한 후 기계적 장애 적혈구 (RBC) 세포 혈액 및 골 수, 비장, 대 500 µ L 간 2 mL에 대 한 염화 염화 칼륨 버퍼 x 1의 200 µ L를 사용 하 여 다음 단일 셀 정지를 생성 하 여 처리 .</li>
	<li>계산 하 고 인간 B 세포 특정 항 체, 즉, 안티-CD19, 안티-CD20, 및 안티-CD45를 사용 하 여 셀을 얼룩. 참고: NSG 마우스 부족 B 세포 그리고 그러므로 분석에 대 한 셀은 스테인드 인간의 특정 B 세포 마커.</li>
	<li>Cytometry에 의해 게이팅 (CD19 + CD20 +, CD45 +) B 세포에 의해 각 기관에서 파생 된 세포를 분석 합니다.</li>
	<li>4.3 (그림 4G) 단계에서 표시 된 대로 문이 셀에 따라 MCL 주입 마우스에서 파생 하는 다른 장기에 engrafted 종양 세포를 계량. 주: 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Baggiolini, M., Dewald, B., Moser, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chemokines:+an+update.">Human chemokines: an update.</a> Annu Rev Immunol. 15, 675-705 (1997).</li><li>Baggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+leukocyte+traffic.">Chemokines and leukocyte traffic.</a> Nature. 392, 565-568 (1998).</li><li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , (2001).</li><li>De Silva, N. S., Klein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+B+cells+in+germinal+centres.">Dynamics of B cells in germinal centres.</a> Nat Rev Immunol. 15 (3), 137-148 (2015).</li><li>Cohen, P. L., Kurtin, P. J., Donovan, K. A., Hanson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+and+peripheral+blood+involvement+in+mantle+cell+lymphoma.">Bone marrow and peripheral blood involvement in mantle cell lymphoma.</a> Br. J. Haematol. 101, 302-310 (1998).</li><li>Meusers, P., Hense, J., Brittinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mantle+cell+lymphoma:+diagnostic+criteria,+clinical+aspects+and+therapeutic+problems.">Mantle cell lymphoma: diagnostic criteria, clinical aspects and therapeutic problems.</a> Leukemia (Baltimore). 11 (Suppl 2), S60-S64 (1997).</li><li>Herrmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+overall+survival+in+advanced+stage+mantle+cell+lymphoma.">Improvement of overall survival in advanced stage mantle cell lymphoma.</a> J Clin Oncol. 27 (4), 511-518 (2008).</li><li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intensive+treatment+strategies+may+not+provide+superior+outcomes+in+mantle+cell+lymphoma:+overall+survival+exceeding+7+years+with+standard+therapies.">Intensive treatment strategies may not provide superior outcomes in mantle cell lymphoma: overall survival exceeding 7 years with standard therapies.</a> Ann Oncol. 19 (7), 1327-1330 (2008).</li><li>Iyengar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+human+primary+mantle+cell+lymphoma+engraftment+in+NSG+mice.">Characteristics of human primary mantle cell lymphoma engraftment in NSG mice.</a> Br J Haematol. 173 (1), 165-169 (2016).</li><li>Klco, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+genetically+defined+subclones+in+acute+myeloid+leukemia.">Functional heterogeneity of genetically defined subclones in acute myeloid leukemia.</a> Cancer cell. 25 (3), 379-392 (2014).</li><li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tumor+xenografts+as+predictive+preclinical+models+for+anticancer+drug+activity+in+humans:+better+than+commonly+perceived-but+they+can+be+improved.">Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved.</a> Cancer Biol Ther. 2 (4 Suppl 1), S134-S139 (2003).</li><li>Johnson, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+drug+activity+in+NCI+preclinical+in+vitro+and+in+vivo+models+and+early+clinical+trials.">Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials.</a> Br. J. Cancer. 84, 1424-1431 (2001).</li><li>Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+drug+response+in+patients+and+in+the+clonogenic+assay+with+solid+human+tumour+xenografts.">Correlation of drug response in patients and in the clonogenic assay with solid human tumour xenografts.</a> Eur. J. Cancer. 26, 901-905 (1990).</li><li>Do&#241;ate, C., Vijaya Kumar, A., Imhof, B. A., Matthes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontline+Science:+Anti-JAM-C+therapy+eliminates+tumor+engraftment+in+a+xenograft+model+of+mantle+cell+lymphoma.">Frontline Science: Anti-JAM-C therapy eliminates tumor engraftment in a xenograft model of mantle cell lymphoma.</a> J Leukoc Biol. 100 (5), 843-853 (2016).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

임상 약물 개발의 고급 단계에 있지만 약물 발견에 사용할 수 없습니다 수 있습니다. 인간 세포 xenotransplantation 동물 받는 초기 단계 약물을 테스트 하기 위해 개발 하는 노력 추구 오래 있다. 여기 우리가 제시 하는 동물 모델을 인간의 이식 거부를 방지 하 고 인간의 질병, MCL 같은 모델을 설정할 수 있습니다. 현재 인간의 종양 engraftment 및 종양의 성장 메커니즘 연구의 종이 식 모델입니다. 여기 ?...

자연으로 세포는 면역 감시에 중요 역할 그리고 림프 구 매매 항 원 특정 면역1,2설치에서 중요 한 단계. 이 프로세스는 naïve T 세포 혈 류를 thymus에서 그리고 동족 항 원을 만나는 2 차 림프 기관, 림프절, Peyer의 패치, 또는 비장를 포함 하 여 거기에서의 마이그레이션 포함 됩니다. B 세포 골 수에서 분화 하 고 2 차 림프 기관3의 낭으로 순진한 셀으로 마이그레이션할. 이 B 세포 중 일부는 그들의 수용 체와 항 원 바인딩 하 고 특정 T 세포에 의해 활성화 됩니다. 확산 및 B 세포의 뿌리의 맨 틀 영역으로 비-활성화, 순진한 B 셀을 푸시합니다. 활성화 된 세포 차별화할 수 있습니다 다음 메모리 B 세포, 몸, 순찰 또는 골4마이그레이션하는 플라스마 세포를 은닉 하는 면역 글로불린으로 성숙.
MCL 맨 틀 영역에서 순진한 B 림프 톨 종양으로 변환 될 때 발생 합니다. 이 림프 종 세포 림프 기관의 microenvironment에 있으며 특정 T 림프 구 제어 독립적으로 격 증. 그러나, 밀도의 특정 단계에서 그들은이 틈새에서 탈출 하 고 다른 장기에 틈새에 대 한 검색에서 혈 류에서 recirculate. 접착 분자의 복잡성과 발산 및 그들의 수용 체의 성행위, 고려이 셀룰러 밀매 vivo에서 의 메커니즘은 제대로 이해 하 고 따라서 치료를 저해. 림프 종 B 세포 새로운 microenvironments에 도달 하지 않도록 하려면이 마이그레이션 프로세스를 효과적으로 차단 하 새로운 방법 필요 합니다.
MCL B 세포 악성 종양을 치료 하는 가장 어려운 중 하나입니다. MCL의 종양 약 형의 개발 다단계 폭포, 독특한 생물 학적 속성의 취득에 의해 특징의 결과 이다. 진단의 시간, 대부분의 환자 (70%) 이미 현재 전파 질병, 비장, 골 수, 또는 위장5,6extranodal 참여 전시 하는 경우의 대다수와. 치료 환자에서 몇 년 이내에 저항 하는 종양에 의해 재발 하더라도 기존의 화학요법 유도 단기7,8에서 높은 면제 율 일반적입니다. 여기에 우리가 현재 MCL 보급의 기본 생물학을 이해 하는 것을 도울 수 있는 새로운 질병 모델: 우리는 환자의 기본 종양 세포에서 유래 하는 인간의 MCL이 종이 식 마우스 모델을 설립. 우리는이 모델 MCL 보급에 대 한 치료 전략을 개발 하 고 가능 하 게 최적의 진단 및 재발 환자의 치료에 대 한 새로운 임상 원근법을 제공 도움이 될 것입니다 바랍니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Ficoll-paque media</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-1440-02</td>
			<td>for separation of mononuclear cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RPMI Medium 1640</td>
			<td>Gibco-Life technologies</td>
			<td>61870-010</td>
			<td>for dilution of blood sample</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>D8537</td>
			<td>washing of cells</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A8412</td>
			<td>for preparation of PBS with 1% BSA used in washing cells during isolation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD19-APC700</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B49212</td>
			<td>human pan-B cell marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20-APC</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>A21693</td>
			<td>human pan-B cell marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD20-ECD</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>IM3607</td>
			<td>human pan-B cell marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD5-PC 5.5</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>PN A70203</td>
			<td>human T cell marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD23-PE</td>
			<td>Pharmingen</td>
			<td>555711</td>
			<td>Cell surface protein typically absent in MCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD45 KO</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>B36294</td>
			<td>Pan-leucocyte marker</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>CD200-PE</td>
			<td>Pharmingen</td>
			<td>552475</td>
			<td>Cell surface protein typically absent in MCL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NOD scid gamma (NSG) mice</td>
			<td>Charles River Laboratories</td>
			<td>5557</td>
			<td>used to develop MCL xenografts in this study</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Easy sep Human B cell enrichment kit</td>
			<td>Stem cell technologies</td>
			<td>19054</td>
			<td>used to enrich B cells to obtain pure cells for injecting into mice</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS</td>
			<td>Beckman Coulter</td>
			<td>Navios</td>
			<td>used to characterize MCL sample and to study the organs for MCL engraftment</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1X ammonium chloride potassium buffer</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>red blood lysis buffer (NH4Cl 8,024 mg/l; KHCO3 1,001 mg/l; EDTA.Na2&#183;2H2O 3.722 mg/l )</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

tumor engraftment in a xenograft mouse model of human mantle cell lymphoma

B 세포는 주로 집에 면역 세포 순환에 그들은 핵심 선수 하 고 림프 기관에. 반면 정상 B 세포는 T 세포에 의해 자극 될 때만 증식, 종양 B 세포 생존과 정의 되지 않은 장기 틈새에서 자율적으로 확장. 맨 틀 세포 림프 종 (MCL)은 하나의 같은 B 세포 장애, 환자의 평균 생존 율은 4-5 년. 이는 유도 및 이러한 셀의 engraftment는 생존을 증가 하기 위하여 차단 하는 효과적인 메커니즘의 필요와 환자 들의 장 수에 대 한 호출 합니다. 따라서, 유도 장치에는 vivo에서 차단 하 여 MCL 치료제의 효능을 연구 하는 종이 식 마우스 모델을 개발 하기 위해 노력 최대 중요성 이다. 관련 전 임상 마우스 모델은 화면 새로운 치료제에 중요 한, 개발 초기 단계 약물 테스트를 인간 세포 xenotransplantation 받는 동물의 긴 추구 되어 있다. 이 동물 모델 인간의 이식 거부를 방지 하 고 인간의 질병에 대 한 모델 설정 개발 되 고 그것은 다른 림프 종 종류의 질병의 진행을 공부 하 고 전 임상 후보 약물에 대 한 테스트를 수행 하는 매우 유용한 도구 될 수 있습니다. 혈액 악성 종양, MCL 같은. 우리는 종이 식 마우스 모델을 연구 하 고 MCL에 대 한 새로운 치료 접근을 개발 하는 우수한 자원으로 될 것입니다 설립.

원고는 engraftment MCL 셀의이 종이 식 마우스 모델의 성공적인 개발을 위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. (이 경우 MCL 셀에), 순수한 셀 인구의 준비는 매우 성공적인 MCL xenografts 개발에 중요 한 이다. 그림 1 밀도 그라데이션 분리에 의해 MCL 환자 혈액에서 단 세포 격리에 대 한 대리점 단계를 나타냅니다. 단 세포 쥐에이 종이 식 주입에 대 한 순수?...

Watch this Scientific Journal Video about Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma at JoVE.com

Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

맨 틀 세포 림프 종 (MCL) B 세포 장애 치료 하기 어려운 이며, 그것은 동등 하 게 연구 하 고 치료제를 개발 기본 MCL의이 종이 식 마우스 모델을 설정 하기가 어렵습니다. 여기, 우리 생물학의 기본을 이해할 수 있도록 마우스에 MCL xenografts의 성공적인 설립을 설명 합니다.

인간의 맨 틀 세포 림프 종의이 종이 식 마우스 모델에서 종양 Engraftment

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

tumor-engraftment-xenograft-mouse-model-human-mantle-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.1K 조회수.  University of Geneva. 맨 틀 세포 림프 종 (MCL) B 세포 장애 치료 하기 어려운 이며, 그것은 동등 하 게 연구 하 고 치료제를 개발 기본 MCL의이 종이 식 마우스 모델을 설정 하기가 어렵습니다. 여기, 우리 생물학의 기본을 이해할 수 있도록 마우스에 MCL xenografts의 성공적인 설립을 설명 합니다.

비디오: Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

Development and Maintenance of a Preclinical Patient Derived Tumor Xenograft Model for the Investigation of Novel Anti-Cancer Therapies

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor pieces are injected subcutaneously into athymic nude mice (immunocompromised, T cell deficient) to create a bank of tumors and subsequently are passaged into different generations of mice in order to maintain these tumors from patients. Importantly, cellular heterogeneity of the original tumor is closely emulated in this model, which provides a more clinically relevant model for evaluation of drug efficacy studies (single agent and combination), biomarker analysis, resistant pathways and cancer stem cell biology. Some limitations of the PDTX model include the replacement of the human stroma with mouse stroma after the first generation in mice, inability to investigate treatment effects on metastasis due to the subcutaneous injections of the tumors, and the lack of evaluation of immunotherapies due to the use of immunocompromised mice. However, even with these limitations, the PDTX model provides a powerful preclinical platform in the drug discovery process.

Utilizing patient-derived tumors in a subcutaneous preclinical model is an excellent way to study the efficacy of novel therapies, predictive biomarker discovery, and drug resistant pathways. This model, in the drug development process, is essential in determining the fate of many novel anti-cancer therapies prior to clinical investigation.

전임상 환자 유래 종양 소설 안티 - 암 치료의 조사를위한 이종 이식 모델의 개발 및 유지 보수

Patient derived tumor xenograft (PDTX) models provide a necessary platform in facilitating anti-cancer drug development prior to human trials. Human tumor ...

연구

암 연구학

Isolation of Circulating Tumor Cells in an Orthotopic Mouse Model of Colorectal Cancer

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate tumor biology and tumor cell dissemination. Orthotopic mouse models have been introduced to overcome these limitations; however, such models are technically demanding, especially in hollow organs such as the large bowel. In order to produce uniform tumors which reliably grow and metastasize, standardized techniques of tumor cell preparation and injection are critical. 
We have developed an orthotopic mouse model of colorectal cancer (CRC) which develops highly uniform tumors and can be used for tumor biology studies as well as therapeutic trials. Tumor cells from either primary tumors, 2-dimensional (2D) cell lines or 3-dimensional (3D) organoids are injected into the cecum and, depending on the metastatic potential of the injected tumor cells, form highly metastatic tumors. In addition, CTCs can be found regularly. We here describe the technique of tumor cell preparation from both 2D cell lines and 3D organoids as well as primary tumor tissue, the surgical and injection techniques as well as the isolation of CTCs from the tumor-bearing mice, and present tips for troubleshooting.

We describe the establishment of orthotopic colorectal tumors via injection of tumor cells or organoids into the cecum of mice and the subsequent isolation of circulating tumor cells (CTCs) from this model.

대장 암 정위 마우스 모델에서의 순환 종양 세포의 분리

Despite the advantages of easy applicability and cost-effectiveness, subcutaneous mouse models have severe limitations and do not accurately simulate ...

Digital Polymerase Chain Reaction Assay for the Genetic Variation in a Sporadic Familial Adenomatous Polyposis Patient Using the Chip-in-a-tube Format

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as tumors. Because digital polymerase chain reactions (PCR) enable the precise quantification of DNA copy number variants, they are becoming an essential tool for detecting rare genetic variations, such as drug-resistant mutations. It is expected that molecular diagnoses using digital PCR (dPCR) will be available in clinical practice in the near future; thus, how to efficiently conduct dPCR with human genetic material is a hot topic. Here, we introduce a method to detect Adenomatous polyposis coli (APC) somatic mosaicism using dPCR with the chip-in-a-tube format, which allows eight dPCR reactions to be simultaneously conducted. Care should be taken when filling and sealing the reaction mixture on the chips. This article demonstrates how to avoid the over- and underestimation of positive partitions. Furthermore, we present a simple procedure for collecting the dPCR product from the partitions on the chips, which can then be used to confirm the specific amplification. We hope that this methods report will help promote the dPCR with the chip-in-a-tube method in genetic research.

Digital polymerase chain reaction (PCR) is a useful tool for the high-sensitivity detection of single nucleotide variants and DNA copy number variants. Here, we demonstrate key considerations for measuring rare variants in the human genome using digital PCR with the chip-in-a-tube format.

튜브에 칩 형식을 사용 하 여 산발적 인 가족 용 대 환자에 있는 유전 변이 대 한 디지털 중 합 효소 연쇄 반응 분석 결과

The quantitative analysis of human genetic variation is crucial for understanding the molecular characteristics of serious medical conditions, such as ...

A Syngeneic Mouse B-Cell Lymphoma Model for Pre-Clinical Evaluation of CD19 CAR T Cells

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen receptors (CARs) for acute lymphoblastic leukemia (ALL) andnon-Hodgkin lymphoma (NHL). The focus of the field is now on emulating these successes in other hematological malignancies where less impressive complete response rates are observed. Further engineering of CAR T cells or co-administration of other treatment modalities may successfully overcome obstacles to successful therapy in other cancer settings.
We therefore present a model in which others can conduct pre-clinical testing of CD19 CAR T cells. Results in this well tested B-cell lymphoma model are likely to be informative CAR T-cell therapy in general.
This protocol allows the reproducible production of mouse CAR T cells through calcium phosphate transfection of Plat-E producer cells with MP71 retroviral constructs and pCL-Eco packaging plasmid followed by collection of secreted retroviral particles and transduction using recombinant human fibronectin fragment and centrifugation. Validation of retroviral transduction, and confirmation of the ability of CAR T cells to kill target lymphoma cells ex vivo, through the use of flow cytometry, luminometry and enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), is also described.
Protocols for testing CAR T cells in vivo in lymphoreplete and lymphodepleted syngeneic mice, bearing established, systemic lymphoma are described. Anti-cancer activity is monitored by in vivo bioluminescence and disease progression. We show typical results of eradication of established B-cell lymphoma when utilizing 1st or 2nd generation CARs in combination with lymphodepleting pre-conditioning and a minority of mice achieving long term remissions when utilizing CAR T cells expressing IL-12 in lymphoreplete mice.
These protocols can be used to evaluate CD19 CAR T cells with different additional modification, combinations of CAR T cells and other therapeutic agents or adapted for the use of CAR T cells against different target antigens.

Here, we present a protocol for the production and pre-clinical testing of murine CD19 CAR T cells by retroviral transduction and utilization as a therapy against established syngeneic A20 B-cell lymphoma in BALB/c mice with or without lymphodepleting pre-conditioning.

CD19 자동차 T 세포의 전 임상 평가 위한 Syngeneic 마우스 B-세포 림프 종 모델

The astonishing clinical success of CD19 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapy has led to the approval of two second generation chimeric antigen ...

Patient-derived Orthotopic Xenograft Models for Human Urothelial Cell Carcinoma and Colorectal Cancer Tumor Growth and Spontaneous Metastasis

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and colorectal cancer (CRC). More than 50% of patients with muscle-invasive UCC, despite curative therapy for clinically-localized disease, will develop metastases and die within 5 years, and metastatic CRC is a leading cause of cancer-related deaths in the US. Xenograft models that consistently mimic UCC and CRC metastasis seen in patients are needed. This study aims to generate patient-derived orthotopic xenograft (PDOX) models of UCC and CRC for primary tumor growth and spontaneous metastases under the influence of LN stromal cells mimicking the progression of human metastatic diseases for drug screening. Fresh UCC and CRC tumors were obtained from consented patients undergoing resection for HG-UCC and colorectal adenocarcinoma, respectively. Co-inoculated with LN stromal cell (LNSC) analog HK cells, luciferase-tagged UCC cells were intra-vesically (IB) instilled into female non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency (NOD/SCID) mice, and CRC cells were intra-rectally (IR) injected into male NOD/SCID mice. Tumor growth and metastasis were monitored weekly using bioluminescence imaging (BLI). Upon sacrifice, primary tumors and mouse organs were harvested, weighed, and formalin-fixed for Hematoxylin and Eosin and immunohistochemistry staining. In our unique PDOX models, xenograft tumors resemble patient pre-implantation tumors. In the presence of HK cells, both models have high tumor implantation rates measured by BLI and tumor weights, 83.3% for UCC and 96.9% for CRC, and high distant organ metastasis rates (33.3% detected liver or lung metastasis for UCC and 53.1% for CRC). In addition, both models have zero mortality from the procedure. We have established unique, reproducible PDOX models for human HG-UCC and CRC, which allow for tumor formation, growth, and metastasis studies. With these models, testing of novel therapeutic drugs can be performed efficiently and in a clinically-mimetic manner.

This protocol describes the generation of patient-derived orthotopic xenograft models by intra-vesically instilling high-grade urothelial cell carcinoma cells or intra-rectally injecting colorectal cancer cells into non-obese diabetic/severe combined immunodeficiency (NOD/SCID) mice for primary tumor growth and spontaneous metastases under the influence of lymph node stromal cells, which mimics the progression of human metastatic diseases.

인간 비뇨기과 세포 암 및 대장암 종양 성장 및 자발적 전이를 위한 환자 유래 직교 이종이식 모델

Cancer patients have poor prognoses when lymph node (LN) involvement is present in both high-grade urothelial cell carcinoma (HG-UCC) of the bladder and ...

A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture vessels versus in vivo in human patients. This is due to the bottleneck selection of clonal populations of melanoma cells that can robustly grow in vitro in the absence of physiological conditions. Further, responses to therapy in two-dimensional tissue cultures overall do not faithfully reflect responses to therapy in melanoma patients, with the majority of clinical trials failing to show the efficacy of therapeutic combinations shown to be effective in vitro. Although xenografting of melanoma cells into mice provides the physiological in vivo context absent from two-dimensional tissue culture assays, the melanoma cells used for engraftment have already undergone bottleneck selection for cells that could grow under two-dimensional conditions when the cell line was established. The irreversible alterations that occur as a consequence of the bottleneck include changes in growth and invasion properties, as well as the loss of specific subpopulations. Therefore, models that better recapitulate the human condition in vivo may better predict therapeutic strategies that effectively increase the overall survival of patients with metastatic melanoma. The patient-derived xenograft (PDX) technique involves the direct implantation of tumor cells from the human patient to a mouse recipient. In this manner, tumor cells are consistently grown under physiological stresses in vivo and never undergo the two-dimensional bottleneck, which preserves the molecular and biological properties present when the tumor was in the human patient. Notable, PDX models derived from organ sites of metastases (i.e., brain) display similar metastatic capacity, while PDX models derived from therapy naive patients and patients with acquired resistance to therapy (i.e., BRAF/MEK inhibitor therapy) display similar sensitivity to therapy.

Patient-derived xenograft (PDX) models more robustly recapitulate melanoma molecular and biological features and are more predictive of therapy response compared to traditional plastic tissue culture-based assays. Here we describe our standard operating protocol for the establishment of new PDX models and the characterization/experimentation of existing PDX models.

흑색종 환자 유래 이종이식 모델

Accumulating evidence suggests that molecular and biological properties differ in melanoma cells grown in traditional two-dimensional tissue culture ...

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment challenges persist. Robust and disease-relevant animal models are vital resources for continued preclinical research and development in order to address a range of additional immune checkpoints. Here, we describe a human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) &#8212; based humanized xenograft model. BGB-A317 (Tislelizumab), an investigational humanized anti-PD-1 antibody in late-stage clinical development, is used as an example to discuss platform set-up, model characterization and drug efficacy evaluations. These humanized mice support the growth of most human tumors tested, thus allowing the assessment of I-O therapies in the context of both human immunity and human cancers. Once established, our model is comparatively time- and cost-effective, and usually yield highly reproducible results. We suggest that the protocol outlined in this article could serve as a general guideline for establishing mouse models reconstituted with human PBMC and tumors for I-O research.

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell PBMC Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology I-O Research

We describe a human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) &#8212; based humanized xenograft mouse model for translational immuno-oncology research. This protocol could serve as a general guideline for establishing and characterizing similar models for I-O therapy assessment.

인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 번역 면역 종양학에 대한 인간화 제종이식 모델 (I-O) 연구

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. Although there are many established gastric cancer cell lines and many conventional transgenic mouse models for preclinical research, the disadvantages of these in vitro and in vivo models limit their applications. Because the characteristics of these models have changed in culture, they no longer model tumor heterogeneity, and their responses have not been able to predict responses in humans. Thus, alternative models that better represent tumor heterogeneity are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models preserve the histologic appearance of cancer cells, retain intratumoral heterogeneity, and better reflect the relevant human components of the tumor microenvironment. However, it usually takes 4-8 months to develop a PDX model, which is longer than the expected survival of many gastric patients. For this reason, establishing primary cancer cell lines may be an effective complementary method for drug response studies. The current protocol describes methods to establish PDX models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. These methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

The current protocol describes methods to establish patient-derived xenograft (PDX) models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. The methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

A Mouse Model to Investigate the Role of Cancer-Associated Fibroblasts in Tumor Growth

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role of CAFs in the tumor microenvironment can be helpful for understanding the functional importance of fibroblasts, fibroblasts from different tissues, and specific genetic factors in fibroblasts. Mouse models are essential for understanding the contributors to tumor growth and progression in an in vivo context. Here, a protocol in which cancer cells are mixed with fibroblasts and introduced into mice to develop tumors is provided. Tumor sizes over time and final tumor weights are determined and compared among groups. The protocol described can provide more insight into the functional role of CAFs in tumor growth and progression.

A protocol to co-inject cancer cells and fibroblasts and monitor tumor growth over time is provided. This protocol can be used to understand the molecular basis for the role of fibroblasts as regulators of tumor growth.

종양 성장에서 암 관련 섬유아세포의 역할을 조사하기 위한 마우스 모델

Cancer-associated fibroblasts (CAFs) can play an important role in tumor growth by creating a tumor-promoting microenvironment. Models to study the role ...

A Murine Ommaya Xenograft Model to Study Direct-Targeted Therapy of Leptomeningeal Disease

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers that cause LMD are breast and lung cancers and melanoma. Patients diagnosed with LMD have a very poor prognosis and generally survive for only a few weeks or months. One possible reason for the lack of efficacy of systemic therapy against LMD is the failure to achieve therapeutically effective concentrations of drug in the CSF because of an intact and relatively impermeable blood-brain barrier (BBB) or blood-CSF barrier across the choroid plexus. Therefore, directly administering drugs intrathecally or intraventricularly may overcome these barriers. This group has developed a model that allows for the effective delivery of therapeutics (i.e., drugs, antibodies, and cellular therapies) chronically and the repeated sampling of CSF to determine drug concentrations and target modulation in the CSF (when the tumor microenvironment is targeted in mice). The model is the murine equivalent of a magnetic resonance imaging-compatible Ommaya reservoir, which is used clinically. This model, which is affixed to the skull, has been designated as the &#34;Murine Ommaya.&#34; As a therapeutic proof of concept, human epidermal growth factor receptor 2 antibodies (clone 7.16.4) were delivered into the CSF via the Murine Ommaya to treat mice with LMD from human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer. The Murine Ommaya increases the efficiency of drug delivery using a miniature access port and prevents the wastage of excess drug; it does not interfere with CSF sampling for molecular and immunological studies. The Murine Ommaya is useful for testing novel therapeutics in experimental models of LMD.

Here, we describe a murine xenograft model that functionally resembles an Ommaya reservoir in patients. We developed the Murine Ommaya to study novel therapeutics for the universally fatal leptomeningeal disease.

렙토메뇌질환의 직접 표적 치료를 연구하는 뮤린 옴마야 제노이식 모델

Leptomeningeal disease (LMD) is an uncommon type of central nervous system (CNS) metastasis to the cerebral spinal fluid (CSF). The most common cancers ...