Name: tumor engraftment in a xenograft mouse model of human mantle cell lymphoma
Uploaded: 2018-03-30T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 52 s
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이 작품은 리그 Genevoise 죄수 르 암에 의해 지원 되었다 Fondation 박사 뒤부아 Ferriere Dinu Lipatti, Oncosuisse KPS OCS, OCS-02260-08-2008, 2914-02-2012, 스위스 국립 과학 재단 그랜트 31003A_156760 및 310030 153456.

인간의 혈액 샘플은 로컬 윤리 제네바 대학 병원의 인간 실험 위원회에 의해 승인 절차에 따라 사용 되었다.
동물 절차는 기관 윤리 위원회의 동물 관리 제네바, 스위스 및 Cantonal 수의 사무실에 따라 수행 했다 (승인 번호: GE/26/15).
1. 밀도 그라데이션 분리 하 여 기본 주변 혈액 단 세포 (PBMCs)의 준비
참고: 말 초 혈액의 3-5 mL MCL leukemic 단계에서 제시 하는 환자에서 얻은 했다. 진단 그리고 염색체 전 좌 t(11;14)의 존재와  D1의 overexpression에 의해 확인 이후에 cytometry (CD5 +, CD23−, CD200 +, 단일 클로 널 B 세포 인구)에 대 한 표준 진단 기준에 따라 설립 되었다. 모든 경우에 단일 클론 B 세포를 구성 > 총 B 세포 인구의 90%. 나머지는 monocytes 그리고 몇몇 T 세포 주로 했다.
<ol><li>로스웰 파크 기념 연구소 매체 1640 (RPMI) (그림 1A)의 5 mL로 MCL 혈액 샘플의 (1:1) 5 mL를 희석.</li>
	<li>철저 하 게 혼합 되도록 사용 하기 전에 여러 번 밀도 그라데이션 미디어 (자료 테이블) 반전.</li>
	<li>피 펫 흡 인기를 사용 하 여 15 mL 원심 분리기 튜브에 밀도 그라데이션 미디어의 5 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 밀도 그라데이션 미디어는 흡 인기 (혈액 밀도 그라데이션 미디어 비율을 2:1, 예를 들어, 밀도 그라데이션 미디어의 5 ml는 혈액 10 mL 이어야 한다)를 사용 하 여 15 mL 원심 분리기 튜브를 통해 희석된 혈액 샘플 레이어. 한다 주의 하지 믹스 (그림 1B, C) 두 개의 레이어.</li>
	<li>원심 브레이크 해제와 함께 실 온에서 40 분에 대 한 400 x g에서 샘플을 원심.</li>
	<li>중간 계층 (약간 흰, 얇은 반지 화살표 (그림 1D, E)으로 표시)을 발음 부드럽게 살 균 파스퇴르 피 펫을 사용 하 여 단 세포를 포함 하 고 깨끗 한 관으로 그들을 전송.</li>
	<li>단 셀의 세척<ol>
<li>전송 된 셀 서 스 펜 션의 볼륨을 예측 하 고 그것에 추가 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 버퍼링 하는 인산 염 (PBS) x 살 균 1의 3 볼륨.</li>
		<li>여러 번 왔다 갔다 pipetting으로 현 탁 액을 혼합.</li>
		<li>실 온에서 10-15 분 400-500 x g에서 정지 원심</li>
		<li>셀 공 세척 단계를 다시 반복 하는 상쾌한을 삭제 합니다.</li>
		<li>상쾌한을 제거 하 고 원하는 볼륨, 예를 들어, 1 또는 2 mL PBS의 셀 resuspend.</li>
		<li>자동된 셀 카운터 또는 수동으로 hemocytometer (Neubauer 챔버)을 사용 하 여 셀의 개수를 계산 합니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. B 세포 부정적인 선택에 의해 B 세포의 농축
<ol><li>50 x 106 셀/mL의 최종 농도에 셀 PBS에 희석.</li>
	<li>하단 폴리스 티 렌 튜브 라운드 5 mL에 셀을 전송. 세포 현 탁 액 2 mL를 B 세포 농축 키트에서 항 체 칵테일의 100 µ L을 추가 하 고 (그림 2-1) 위아래로 pipetting으로 부드럽게 혼합.</li>
	<li>10 분 동안 실내 온도에 세포를 품 어.</li>
	<li>짧게 소용돌이 자석 입자 키트에 제공 된는 B 세포 농축 30 s (그림 2-2). 샘플의 2 mL에 자석 입자의 150 µ L를 추가 합니다.</li>
	<li>실 온에서 또 다른 5 분에 대 한 샘플을 품 어.</li>
	<li>1 x PBS 2% 태아 종 아리 혈 청 (FCS) 및 1 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA)와 2.5 mL를 샘플 볼륨을 가져와. 자석에 튜브를 놓고 또 다른 3-5 분 (그림 2-3)에 대 한 튜브를 품 어.</li>
	<li>장소, 그리고 하나의 연속 모션 튜브와 자석까지, 풍부한 세포 현 탁 액을 신선한 튜브 (그림 2-4) 수집할 튜브를 가만히 따르다. 자동된 셀 카운터 또는 B 세포의 총 수익률을 얻을 수 있는 hemocytometer를 사용 하 여 수동으로 셀을 계산 합니다. 참고: 일반적으로 수익률은 ~ 105 B 셀/mL 정상 B 세포와 106 셀/MCL l x 5-50.</li>
	<li>B 세포 농축의 순도 확인<ol>
<li>받아 ~ 50000 셀 안티-CD19/CD20 항 체와 세포를 품 어 고 (1시 20분 희석)와 안티 CD45 항 체 결합 다른 형광 (1시 10분 희석) 15-30 분 동안 실내 온도에.</li>
		<li>PBS + 1% BSA x 1의 1 mL로 세척 하 고 400-500 x g 5 분 동안에 세포를 원심 resuspend ~ 200 µ L의 PBS에 셀.</li>
		<li>Cytometry에 의해 셀 샘플을 확보 하 고 B 세포의 순도 대 한 분석. 순도 대부분 > 90%가이 방법 (그림 3).</li>
	</ol>
</li>
</ol>3입니다.이 종이 식 마우스 모델의 개발
<ol><li>1 x PBS (마우스 당 주사 하는 데 필요한 볼륨)의 150-200 µ L에 106 셀 x 40-60을 일시 중단 합니다.</li>
	<li>세포 현 탁 액의 150 µ L를 정 맥 주사 (i.v.) (그림 4A) 성별에 관계 없이 오래 된 6-7 주 immunodeficient 끄 덕 scid 감마 (NSG) 쥐의 꼬리 정 맥 각에.</li>
	<li>쥐 인간 림프 종 ~ 10 주에 대 한 개발을 허용 합니다. 참고: 기본 인간 림프 종 세포 인간 림프 종 세포 라인 (3 주)에 비해 종양 개발에 훨씬 더 오래 걸릴.</li>
	<li>동물 체중 감소 같은 치명적인 질병의 증상을 보여 시작, 뻗 치고 머리, 감소 활동, 뒷 다리 마비, 등, 희생 쥐 CO2 질 피를 심장 심장 찔린 다음에 의해.</li>
	<li>수집 다른 쥐를 해 부하 여 골 수, 비장, 그리고 간 같은 기관과 종양 engraftment 분석에 대 한 희생의 때에는 심장에서 혈액을 그리기에 의해 말 초 혈액을 수집 (그림 4B -F).</li>
</ol>4. chimerism 분석 Engrafted 다른 장기에 종양 세포의
<ol><li>다른 장기를 수집한 후 기계적 장애 적혈구 (RBC) 세포 혈액 및 골 수, 비장, 대 500 µ L 간 2 mL에 대 한 염화 염화 칼륨 버퍼 x 1의 200 µ L를 사용 하 여 다음 단일 셀 정지를 생성 하 여 처리 .</li>
	<li>계산 하 고 인간 B 세포 특정 항 체, 즉, 안티-CD19, 안티-CD20, 및 안티-CD45를 사용 하 여 셀을 얼룩. 참고: NSG 마우스 부족 B 세포 그리고 그러므로 분석에 대 한 셀은 스테인드 인간의 특정 B 세포 마커.</li>
	<li>Cytometry에 의해 게이팅 (CD19 + CD20 +, CD45 +) B 세포에 의해 각 기관에서 파생 된 세포를 분석 합니다.</li>
	<li>4.3 (그림 4G) 단계에서 표시 된 대로 문이 셀에 따라 MCL 주입 마우스에서 파생 하는 다른 장기에 engrafted 종양 세포를 계량. 주: 자세한 내용은 테이블의 자료 를 참조 하십시오.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Baggiolini, M., Dewald, B., Moser, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+chemokines:+an+update.">Human chemokines: an update.</a> Annu Rev Immunol. 15, 675-705 (1997).</li><li>Baggiolini, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemokines+and+leukocyte+traffic.">Chemokines and leukocyte traffic.</a> Nature. 392, 565-568 (1998).</li><li>Janeway, C. A., Travers, P., Walport, M., Shlomchik, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Immunobiology: The Immune System in Health and Disease. , (2001).</li><li>De Silva, N. S., Klein, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+B+cells+in+germinal+centres.">Dynamics of B cells in germinal centres.</a> Nat Rev Immunol. 15 (3), 137-148 (2015).</li><li>Cohen, P. L., Kurtin, P. J., Donovan, K. A., Hanson, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bone+marrow+and+peripheral+blood+involvement+in+mantle+cell+lymphoma.">Bone marrow and peripheral blood involvement in mantle cell lymphoma.</a> Br. J. Haematol. 101, 302-310 (1998).</li><li>Meusers, P., Hense, J., Brittinger, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mantle+cell+lymphoma:+diagnostic+criteria,+clinical+aspects+and+therapeutic+problems.">Mantle cell lymphoma: diagnostic criteria, clinical aspects and therapeutic problems.</a> Leukemia (Baltimore). 11 (Suppl 2), S60-S64 (1997).</li><li>Herrmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improvement+of+overall+survival+in+advanced+stage+mantle+cell+lymphoma.">Improvement of overall survival in advanced stage mantle cell lymphoma.</a> J Clin Oncol. 27 (4), 511-518 (2008).</li><li>Martin, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intensive+treatment+strategies+may+not+provide+superior+outcomes+in+mantle+cell+lymphoma:+overall+survival+exceeding+7+years+with+standard+therapies.">Intensive treatment strategies may not provide superior outcomes in mantle cell lymphoma: overall survival exceeding 7 years with standard therapies.</a> Ann Oncol. 19 (7), 1327-1330 (2008).</li><li>Iyengar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characteristics+of+human+primary+mantle+cell+lymphoma+engraftment+in+NSG+mice.">Characteristics of human primary mantle cell lymphoma engraftment in NSG mice.</a> Br J Haematol. 173 (1), 165-169 (2016).</li><li>Klco, J. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+heterogeneity+of+genetically+defined+subclones+in+acute+myeloid+leukemia.">Functional heterogeneity of genetically defined subclones in acute myeloid leukemia.</a> Cancer cell. 25 (3), 379-392 (2014).</li><li>Kerbel, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+tumor+xenografts+as+predictive+preclinical+models+for+anticancer+drug+activity+in+humans:+better+than+commonly+perceived-but+they+can+be+improved.">Human tumor xenografts as predictive preclinical models for anticancer drug activity in humans: better than commonly perceived-but they can be improved.</a> Cancer Biol Ther. 2 (4 Suppl 1), S134-S139 (2003).</li><li>Johnson, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relationships+between+drug+activity+in+NCI+preclinical+in+vitro+and+in+vivo+models+and+early+clinical+trials.">Relationships between drug activity in NCI preclinical in vitro and in vivo models and early clinical trials.</a> Br. J. Cancer. 84, 1424-1431 (2001).</li><li>Scholz, C. C., Berger, D. P., Winterhalter, B. R., Henss, H., Fiebig, H. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlation+of+drug+response+in+patients+and+in+the+clonogenic+assay+with+solid+human+tumour+xenografts.">Correlation of drug response in patients and in the clonogenic assay with solid human tumour xenografts.</a> Eur. J. Cancer. 26, 901-905 (1990).</li><li>Do&#241;ate, C., Vijaya Kumar, A., Imhof, B. A., Matthes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Frontline+Science:+Anti-JAM-C+therapy+eliminates+tumor+engraftment+in+a+xenograft+model+of+mantle+cell+lymphoma.">Frontline Science: Anti-JAM-C therapy eliminates tumor engraftment in a xenograft model of mantle cell lymphoma.</a> J Leukoc Biol. 100 (5), 843-853 (2016).</li></ol>

저자 들은 아무 경쟁 금융 관심사 선언 합니다.

임상 약물 개발의 고급 단계에 있지만 약물 발견에 사용할 수 없습니다 수 있습니다. 인간 세포 xenotransplantation 동물 받는 초기 단계 약물을 테스트 하기 위해 개발 하는 노력 추구 오래 있다. 여기 우리가 제시 하는 동물 모델을 인간의 이식 거부를 방지 하 고 인간의 질병, MCL 같은 모델을 설정할 수 있습니다. 현재 인간의 종양 engraftment 및 종양의 성장 메커니즘 연구의 종이 식 모델입니다. 여기 ?...

자연으로 세포는 면역 감시에 중요 역할 그리고 림프 구 매매 항 원 특정 면역1,2설치에서 중요 한 단계. 이 프로세스는 naïve T 세포 혈 류를 thymus에서 그리고 동족 항 원을 만나는 2 차 림프 기관, 림프절, Peyer의 패치, 또는 비장를 포함 하 여 거기에서의 마이그레이션 포함 됩니다. B 세포 골 수에서 분화 하 고 2 차 림프 기관3의 낭으로 순진한 셀으로 마이그레이션할. 이 B 세포 중 일부는 그들의 수용 체와 항 원 바인딩 하 고 특정 T 세포에 의해 활성화 됩니다. 확산 및 B 세포의 뿌리의 맨 틀 영역으로 비-활성화, 순진한 B 셀을 푸시합니다. 활성화 된 세포 차별화할 수 있습니다 다음 메모리 B 세포, 몸, 순찰 또는 골4마이그레이션하는 플라스마 세포를 은닉 하는 면역 글로불린으로 성숙.
MCL 맨 틀 영역에서 순진한 B 림프 톨 종양으로 변환 될 때 발생 합니다. 이 림프 종 세포 림프 기관의 microenvironment에 있으며 특정 T 림프 구 제어 독립적으로 격 증. 그러나, 밀도의 특정 단계에서 그들은이 틈새에서 탈출 하 고 다른 장기에 틈새에 대 한 검색에서 혈 류에서 recirculate. 접착 분자의 복잡성과 발산 및 그들의 수용 체의 성행위, 고려이 셀룰러 밀매 vivo에서 의 메커니즘은 제대로 이해 하 고 따라서 치료를 저해. 림프 종 B 세포 새로운 microenvironments에 도달 하지 않도록 하려면이 마이그레이션 프로세스를 효과적으로 차단 하 새로운 방법 필요 합니다.
MCL B 세포 악성 종양을 치료 하는 가장 어려운 중 하나입니다. MCL의 종양 약 형의 개발 다단계 폭포, 독특한 생물 학적 속성의 취득에 의해 특징의 결과 이다. 진단의 시간, 대부분의 환자 (70%) 이미 현재 전파 질병, 비장, 골 수, 또는 위장5,6extranodal 참여 전시 하는 경우의 대다수와. 치료 환자에서 몇 년 이내에 저항 하는 종양에 의해 재발 하더라도 기존의 화학요법 유도 단기7,8에서 높은 면제 율 일반적입니다. 여기에 우리가 현재 MCL 보급의 기본 생물학을 이해 하는 것을 도울 수 있는 새로운 질병 모델: 우리는 환자의 기본 종양 세포에서 유래 하는 인간의 MCL이 종이 식 마우스 모델을 설립. 우리는이 모델 MCL 보급에 대 한 치료 전략을 개발 하 고 가능 하 게 최적의 진단 및 재발 환자의 치료에 대 한 새로운 임상 원근법을 제공 도움이 될 것입니다 바랍니다.

<table><tbody><tr><td>Ficoll-paque media</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1440-02</td><td>for separation of mononuclear cells</td></tr><tr><td>RPMI Medium 1640</td><td>Gibco-Life technologies</td><td>61870-010</td><td>for dilution of blood sample</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td>washing of cells</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8412</td><td>for preparation of PBS with 1% BSA used in washing cells during isolation</td></tr><tr><td>CD19-APC700</td><td>Beckman Coulter</td><td>B49212</td><td>human pan-B cell marker</td></tr><tr><td>CD20-APC</td><td>Beckman Coulter</td><td>A21693</td><td>human pan-B cell marker</td></tr><tr><td>CD20-ECD</td><td>Beckman Coulter</td><td>IM3607</td><td>human pan-B cell marker</td></tr><tr><td>CD5-PC 5.5</td><td>Beckman Coulter</td><td>PN A70203</td><td>human T cell marker</td></tr><tr><td>CD23-PE</td><td>Pharmingen</td><td>555711</td><td>Cell surface protein typically absent in MCL</td></tr><tr><td>CD45 KO</td><td>Beckman Coulter</td><td>B36294</td><td>Pan-leucocyte marker</td></tr><tr><td>CD200-PE</td><td>Pharmingen</td><td>552475</td><td>Cell surface protein typically absent in MCL</td></tr><tr><td>NOD scid gamma (NSG) mice</td><td>Charles River Laboratories</td><td>5557</td><td>used to develop MCL xenografts in this study</td></tr><tr><td>Easy sep Human B cell enrichment kit</td><td>Stem cell technologies</td><td>19054</td><td>used to enrich B cells to obtain pure cells for injecting into mice</td></tr><tr><td>FACS</td><td>Beckman Coulter</td><td>Navios</td><td>used to characterize MCL sample and to study the organs for MCL engraftment</td></tr><tr><td>1X ammonium chloride potassium buffer</td><td></td><td></td><td>red blood lysis buffer (NH4Cl 8,024 mg/l; KHCO3 1,001 mg/l; EDTA.Na2&amp;middot;2H2O 3.722 mg/l )</td></tr></tbody></table>

tumor engraftment in a xenograft mouse model of human mantle cell lymphoma

B 세포는 주로 집에 면역 세포 순환에 그들은 핵심 선수 하 고 림프 기관에. 반면 정상 B 세포는 T 세포에 의해 자극 될 때만 증식, 종양 B 세포 생존과 정의 되지 않은 장기 틈새에서 자율적으로 확장. 맨 틀 세포 림프 종 (MCL)은 하나의 같은 B 세포 장애, 환자의 평균 생존 율은 4-5 년. 이는 유도 및 이러한 셀의 engraftment는 생존을 증가 하기 위하여 차단 하는 효과적인 메커니즘의 필요와 환자 들의 장 수에 대 한 호출 합니다. 따라서, 유도 장치에는 vivo에서 차단 하 여 MCL 치료제의 효능을 연구 하는 종이 식 마우스 모델을 개발 하기 위해 노력 최대 중요성 이다. 관련 전 임상 마우스 모델은 화면 새로운 치료제에 중요 한, 개발 초기 단계 약물 테스트를 인간 세포 xenotransplantation 받는 동물의 긴 추구 되어 있다. 이 동물 모델 인간의 이식 거부를 방지 하 고 인간의 질병에 대 한 모델 설정 개발 되 고 그것은 다른 림프 종 종류의 질병의 진행을 공부 하 고 전 임상 후보 약물에 대 한 테스트를 수행 하는 매우 유용한 도구 될 수 있습니다. 혈액 악성 종양, MCL 같은. 우리는 종이 식 마우스 모델을 연구 하 고 MCL에 대 한 새로운 치료 접근을 개발 하는 우수한 자원으로 될 것입니다 설립.

원고는 engraftment MCL 셀의이 종이 식 마우스 모델의 성공적인 개발을 위한 최적화 된 프로토콜을 설명합니다. (이 경우 MCL 셀에), 순수한 셀 인구의 준비는 매우 성공적인 MCL xenografts 개발에 중요 한 이다. 그림 1 밀도 그라데이션 분리에 의해 MCL 환자 혈액에서 단 세포 격리에 대 한 대리점 단계를 나타냅니다. 단 세포 쥐에이 종이 식 주입에 대 한 순수?...

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Tumor Engraftment in a Xenograft Mouse Model of Human Mantle Cell Lymphoma

맨 틀 세포 림프 종 (MCL) B 세포 장애 치료 하기 어려운 이며, 그것은 동등 하 게 연구 하 고 치료제를 개발 기본 MCL의이 종이 식 마우스 모델을 설정 하기가 어렵습니다. 여기, 우리 생물학의 기본을 이해할 수 있도록 마우스에 MCL xenografts의 성공적인 설립을 설명 합니다.

인간의 맨 틀 세포 림프 종의이 종이 식 마우스 모델에서 종양 Engraftment

B lymphocytes are key players in immune cell circulation and they mainly home to and reside in lymphoid organs. While normal B cells only proliferate when ...

tumor-engraftment-xenograft-mouse-model-human-mantle-cell

Research

JoVE Journal

Cancer Research

11.1K 조회수.  University of Geneva. 맨 틀 세포 림프 종 (MCL) B 세포 장애 치료 하기 어려운 이며, 그것은 동등 하 게 연구 하 고 치료제를 개발 기본 MCL의이 종이 식 마우스 모델을 설정 하기가 어렵습니다. 여기, 우리 생물학의 기본을 이해할 수 있도록 마우스에 MCL xenografts의 성공적인 설립을 설명 합니다.

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Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to inhibit tumor growth must be performed in a suitable animal model. The type of animal model that is best for this purpose is a topic of intense discussion. Some evidence indicates that preclinical trials examining drug effects on tumors arising in transgenic mice are more predictive of clinical outcome1and so candidate therapeutic agents are often tested in these models. Unfortunately, transgenic models are not available for many tumor types. Further, transgenic models often have other limitations such as concerns as to how well the mouse tumor models its human counterpart, incomplete penetrance of the tumor phenotype and an inability to predict when tumors will develop.
Consequently, many investigators use xenograft models (human tumor cells grafted into immunodeficient mice) for preclinical trials if appropriate transgenic tumor models are not available. Even if transgenic models are available, they are often partnered with xenograft models as the latter facilitate rapid determination of therapeutic ranges. Further, this partnership allows a comparison of the effectiveness of the agent in transgenic tumors and genuine human tumor cells. Historically, xenografting has often been performed by injecting tumor cells subcutaneously (ectopic xenografts). This technique is rapid and reproducible, relatively inexpensive and allows continuous quantitation of tumor growth during the therapeutic period2. However, the subcutaneous space is not the normal microenvironment for most neoplasms and so results obtained with ectopic xenografting can be misleading due to factors such as an absence of organ-specific expression of host tissue and tumor genes. It has thus been strongly recommended that ectopic grafting studies be replaced or complemented by studies in which human tumor cells are grafted into their tissue of origin (orthotopic xenografting)2. Unfortunately, implementation of this recommendation is often thwarted by the fact that orthotopic xenografting methodologies have not yet been developed for many tumor types.
Malignant peripheral nerve sheath tumors (MPNSTs) are highly aggressive sarcomas that occur sporadically or in association with neurofibromatosis type 13and most commonly arise in the sciatic nerve4. Here we describe a technically straightforward method in which firefly luciferase-tagged human MPNST cells are orthopically xenografted into the sciatic nerve of immunodeficient mice. Our approach to assessing the success of the grafting procedure in individual animals and subsequent non-biased randomization into study groups is also discussed.

Orthotopic Xenografting of Human Luciferase-Tagged Malignant Peripheral Nerve Sheath Tumor Cells for in vivo Testing of Candidate Therapeutic Agents

A method for reliably grafting luciferase-tagged human malignant peripheral nerve sheath tumor cells into the sciatic nerve of immunodeficient mice is described. The use of bioluminescence imaging to demonstrate proper establishment of tumor grafts and criteria for random segregation of animals into study groups are also discussed.

대한 인간 루시페라제 태그가 추가된 악성 주변 신경 쉬스 종양 세포 Orthotopic Xenografting 생체내에</em후보 치료 대리점> 테스트

Although in vitro screens are essential for the initial identification of candidate therapeutic agents, a rigorous assessment of the drug's ability to ...

연구

의학

Utilization of Ultrasound Guided Tissue-directed Cellular Implantation for the Establishment of Biologically Relevant Metastatic Tumor Xenografts

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard subcutaneous flank models include procedural ease and the ability to monitor tumor progression and response without invasive imaging. Such models are often inconsistent in translational clinical trials and have limited biologically relevant characteristics with low proclivity to produce metastasis, as there is a lack of a native microenvironment. In comparison, orthotopic xenograft models at native tumor sites have been shown to mimic the tumor microenvironment and replicate important disease characteristics such as distant metastatic spread. These models often require tedious surgical procedures with prolonged anesthetic time and recovery periods. To address this, cancer researchers have recently utilized ultrasound-guided injection techniques to establish cancer xenograft models for preclinical experiments, which allows for rapid and reliable establishment of tissue-directed murine models. Ultrasound visualization also provides a noninvasive method for longitudinal assessment of tumor engraftment and growth. Here, we describe the method for ultrasound-guided injection of cancer cells, utilizing the adrenal gland for NB and renal sub capsule for ES. This minimally invasive approach overcomes tedious open surgery implantation of cancer cells in tissue-specific locations for growth and metastasis, and abates morbid recovery periods. We describe the utilization of both established cell lines and patient derived cell lines for orthotopic injection. Pre-made commercial kits are available for tumor dissociation and luciferase tagging of cells. Injection of cell suspension using image-guidance provides a minimally invasive and reproducible platform for the creation of preclinical models. This method is utilized to create reliable preclinical models for other cancers such as bladder, liver and pancreas exemplifying its untapped potential for numerous cancer models.

Here, we present a protocol to utilize ultrasound-guided injection of neuroblastoma (NB) and Ewing's sarcoma (ES) cells (established cell lines and patient-derived tumor cells) at biologically relevant sites to create reliable preclinical models for cancer research.

초음파의 이용 가이드 생물학 관련 전이성 종양 Xenografts의 설립을 위한 세포 이식 조직 감독

Preclinical testing of anticancer therapies relies on relevant xenograft models that mimic the innate tendencies of cancer. Advantages of standard ...

암 연구학

Multimodal Bioluminescent and Positronic-emission Tomography/Computational Tomography Imaging of Multiple Myeloma Bone Marrow Xenografts in NOG Mice

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular interactions that exist within this microenvironment. Yet the BM microenvironment cannot be easily replicated in vitro, which potentially limits the physiologic relevance of many in vitro and ex vivo experimental models. These issues can be overcome by utilizing a xenograft model in which luciferase (LUC)-transfected 8226 MM cells will specifically engraft in the mouse skeleton. When these mice are given the appropriate substrate, D-luciferin, the effects of therapy on tumor growth and survival can be analyzed by measuring changes in the bioluminescent images (BLI) produced by the tumors in vivo. This BLI data combined with positronic-emission tomography/computational tomography (PET/CT) analysis using the metabolic marker 2-deoxy-2-(18F)fluoro-D-glucose (18F-FDG) is used to monitor changes in tumor metabolism over time. These imaging platforms allow for multiple noninvasive measurements within the tumor/BM microenvironment.

Here we use bioluminescent, X-ray, and positron-emission tomography/computed tomography imaging to study how inhibiting mTOR activity impacts bone marrow-engrafted myeloma tumors in a xenograft model. This allows for physiologically relevant, non-invasive, and multimodal analyses of the anti-myeloma effect of therapies targeting bone marrow-engrafted myeloma tumors in vivo.

다 발성 골 수 Xenografts 노 그 쥐에서의 복합 발광 및 양자 방출 단층 촬영/컴퓨터 단층 촬영 영상

Multiple myeloma (MM) tumors engraft in the bone marrow (BM) and their survival and progression are dependent upon complex molecular and cellular ...

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell (PBMC) Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology (I-O) Research

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment challenges persist. Robust and disease-relevant animal models are vital resources for continued preclinical research and development in order to address a range of additional immune checkpoints. Here, we describe a human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) &#8212; based humanized xenograft model. BGB-A317 (Tislelizumab), an investigational humanized anti-PD-1 antibody in late-stage clinical development, is used as an example to discuss platform set-up, model characterization and drug efficacy evaluations. These humanized mice support the growth of most human tumors tested, thus allowing the assessment of I-O therapies in the context of both human immunity and human cancers. Once established, our model is comparatively time- and cost-effective, and usually yield highly reproducible results. We suggest that the protocol outlined in this article could serve as a general guideline for establishing mouse models reconstituted with human PBMC and tumors for I-O research.

A Human Peripheral Blood Mononuclear Cell PBMC Engrafted Humanized Xenograft Model for Translational Immuno-oncology I-O Research

We describe a human peripheral blood mononuclear cell (PBMC) &#8212; based humanized xenograft mouse model for translational immuno-oncology research. This protocol could serve as a general guideline for establishing and characterizing similar models for I-O therapy assessment.

인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC) 번역 면역 종양학에 대한 인간화 제종이식 모델 (I-O) 연구

The discovery and development of immuno-oncology (I-O) therapy in recent years represents a milestone in the treatment of cancer. However, treatment ...

Establishment of Gastric Cancer Patient-derived Xenograft Models and Primary Cell Lines

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. Although there are many established gastric cancer cell lines and many conventional transgenic mouse models for preclinical research, the disadvantages of these in vitro and in vivo models limit their applications. Because the characteristics of these models have changed in culture, they no longer model tumor heterogeneity, and their responses have not been able to predict responses in humans. Thus, alternative models that better represent tumor heterogeneity are being developed. Patient-derived xenograft (PDX) models preserve the histologic appearance of cancer cells, retain intratumoral heterogeneity, and better reflect the relevant human components of the tumor microenvironment. However, it usually takes 4-8 months to develop a PDX model, which is longer than the expected survival of many gastric patients. For this reason, establishing primary cancer cell lines may be an effective complementary method for drug response studies. The current protocol describes methods to establish PDX models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. These methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

The current protocol describes methods to establish patient-derived xenograft (PDX) models and primary cancer cell lines from surgical gastric cancer samples. The methods provide a useful tool for drug development and cancer biology research.

위암 환자 유래 이종이식 모델 및 1차 세포주 구축

The use of preclinical models to advance our understanding of tumor biology and investigate the efficacy of therapeutic agents is key to cancer research. ...

Generation of a Liver Orthotopic Human Uveal Melanoma Xenograft Platform in Immunodeficient Mice

In recent decades, subcutaneously implanted patient-derived xenograft tumors or cultured human cell lines have been increasingly recognized as more representative models to study human cancers in immunodeficient mice than traditional established human cell lines in vitro. Recently, orthotopically implanted patient-derived tumor xenograft (PDX) models in mice have been developed to better replicate features of patient tumors. A liver orthotopic xenograft mouse model is expected to be a useful cancer research platform, providing insights into tumor biology and drug therapy. However, liver orthotopic tumor implantation is generally complicated. Here we describe our protocols for the orthotopic implantation of patient-derived liver-metastatic uveal melanoma tumors. We cultured human liver metastatic uveal melanoma cell lines into immunodeficient mice. The protocols can result in consistently high technical success rates using either a surgical orthotopic implantation technique with chunks of patient-derived uveal melanoma tumor or a needle injection technique with cultured human cell line. We also describe protocols for CT scanning to detect interior liver tumors and for re-implantation techniques using cryopreserved tumors to achieve re-engraftment. Together, these protocols provide a better platform for liver orthotopic tumor mouse models of liver metastatic uveal melanoma in translational research.

Orthotopic human liver metastatic uveal melanoma xenograft mouse models were created using surgical orthotopic implantation techniques with patient-derived tumor chunk and needle injection techniques with cultured human uveal melanoma cell lines.

면역결핍 마우스에서 간 직교 인간 편도 흑색종 Xenograft 플랫폼의 생성

In recent decades, subcutaneously implanted patient-derived xenograft tumors or cultured human cell lines have been increasingly recognized as more ...

Generation of Subcutaneous and Intrahepatic Human Hepatocellular Carcinoma Xenografts in Immunodeficient Mice

In vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate the human disease provide a valuable platform for research into disease pathophysiology and for the preclinical evaluation of novel therapies. We present a variety of methods to generate subcutaneous or orthotopic human HCC xenografts in immunodeficient mice that could be utilized in a variety of research applications. With a focus on the use of primary tumor tissue from patients undergoing surgical resection as a starting point, we describe the preparation of cell suspensions or tumor fragments for xenografting. We describe specific techniques to xenograft these tissues i) subcutaneously; or ii) intrahepatically, either by direct implantation of tumor cells or fragments into the liver, or indirectly by injection of cells into the mouse spleen. We also describe the use of partial resection of the native mouse liver at the time of xenografting as a strategy to induce a state of active liver regeneration in the recipient mouse that may facilitate the intrahepatic engraftment of primary human tumor cells. The expected results of these techniques are illustrated. The protocols described have been validated using primary human HCC samples and xenografts, which typically perform less robustly than the well-established human HCC cell lines that are widely used and frequently cited in the literature. In comparison with cell lines, we discuss factors which may contribute to the relatively low chance of primary HCC engraftment in xenotransplantation models and comment on technical issues that may influence the kinetics of xenograft growth. We also suggest methods that should be applied to ensure that xenografts obtained accurately resemble parent HCC tissues.

Human tumor xenografts in immunodeficient mice are valuable tools to study cancer biology. Specific protocols to generate subcutaneous and intrahepatic xenografts from human hepatocellular carcinoma cells or tumor fragments are described. Liver regeneration induced by partial hepatectomy in recipient mice is presented as a strategy to facilitate intrahepatic engraftment.

면역 결핍 마우스의 피하 및 간내 인간의 간세포 암 이종 이식의 생성

In  vivo experimental models of hepatocellular carcinoma (HCC) that recapitulate  the human disease provide a valuable platform for research into disease  ...

Induction and Scoring of Graft-Versus-Host Disease in a Xenogeneic Murine Model and Quantification of Human T Cells in Mouse Tissues using Digital PCR

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological deficiencies and malignancies. Acute GVHD occurs when donor T cells recognize host tissues as a foreign antigen and mount an immune response to the host. Current treatments involve toxic immunosuppressive drugs that render patients susceptible to infection and recurrence. Thus, there is ongoing research to provide an acute GVHD therapy that can effectively target donor T cells and reduce side effects. Much of this pre-clinical work uses the xenogenic GVHD (xenoGVHD) murine model that allows for testing of immunosuppressive therapies on human cells rather than murine cells in an in vivo system. This protocol outlines how to induce xenoGVHD and how to blind and standardize clinical scoring to ensure consistent results. Additionally, this protocol describes how to use digital PCR to detect human T cells in mouse tissues, which can subsequently be used to quantify efficacy of tested therapies. The xenoGVHD model not only provides a model to test GVHD therapies but any therapy that can suppress human T cells, which could then be applied to many inflammatory diseases.

Here, we present a protocol to induce and score disease in a xenogeneic graft-versus-host disease (xenoGVHD) model. xenoGVHD provides an in vivo model to study immunosuppression of human T cells. Additionally, we describe how to detect human T cells in tissues with digital PCR as a tool to quantify immunosuppression.

디지털 PCR을 사용하여 마우스 조직에서 인간 T 세포의 Xegeneic Murine 모델 및 정량화에서 이식편 대 숙주 질환의 유도 및 채점

Acute graft-versus-host disease (GVHD) is a significant limitation for patients receiving hematopoietic stem cell transplant as therapy for hematological ...

면역학 및 감염병학

Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo

The human skin xenograft model, in which human donor skin is transplanted onto an immunodeficient mouse host, is an important option for translational research in skin immunology. Murine and human skin differ substantially in anatomy and immune cell composition. Therefore, traditional mouse models have limitations for dermatological research and drug discovery. However, successful xenotransplants are technically challenging and require optimal specimen and mouse graft site preparation for graft and host survival. The present protocol provides an optimized technique for transplanting human skin onto mice and discusses necessary considerations for downstream experimental aims. This report describes the appropriate preparation of a human donor skin sample, assembly of a surgical setup, mouse and surgical site preparation, skin transplantation, and post-surgical monitoring. Adherence to these methods allows for maintenance of xenografts for over 6 weeks post-surgery. The techniques outlined below allow maximum grafting efficiency due to the development of engineering controls, sterile technique, and pre- and post-surgical conditioning. Appropriate performance of the xenograft model results in long-lived human skin graft samples for experimental characterization of human skin and preclinical testing of compounds in vivo.

Xenograft Skin Model to Manipulate Human Immune Responses In Vivo

The present protocol describes how to graft human skin onto non-obese diabetic (NOD)-scid interleukin-2 gamma chain receptor (NSG) mice. A detailed description of the preparation of human skin for transplant, preparation of mice for transplant, transplantation of split-thickness human skin, and post-transplantation recovery procedure are included in the report.

생체 내에서 인간 면역 반응을 조작하기 위한 이종이식 피부 모델

The human skin xenograft model, in which human donor skin is transplanted onto an immunodeficient mouse host, is an important option for translational ...

Patient-derived Xenograft Modeling: A Technique to Generate Melanoma Mouse Models

Source: Min Xiao et al. <a href="https://www.jove.com/v/59508"> A Melanoma Patient-Derived Xenograft Model</a>. J. Vis. Exp. (2018)
In this video, human-derived melanoma cells are implanted subcutaneously into the flank region of an immunocompromised mouse. The PDX model allows preclinical investigation of melanoma cells that better recapitulate the tumor heterogeneity and melanoma aggressiveness observed in in vivo conditions.

인간의 맨 틀 세포 림프 종의이 종이 식 마우스 모델에서 종양 Engraftment

요약

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대한 인간 루시페라제 태그가 추가된 악성 주변 신경 쉬스 종양 세포 Orthotopic Xenografting 생체내에 테스트