지원 국가 다 발성 경화 증 사회 (RG 4768, RG 5179 및 RG 5180), Maisin 재단 및 Guthy 잭슨 자선 재단은 건강의 국립 연구소 (RO1 AI073737와 RO1 NS092835-01)에 의해 S.S.Z.를 제공 했다.

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소화기 세 이건, A. 크루즈-Herranz, 입방 미터 스펜서, 피 호, L. Steinman,이 그린, 그리고 R.A. 소블 아무 공개 보고. S.S. Zamvil 신경과, Neuroimmunology 및 Neuroinflammation의 부 편집장 이며 Neuroimmunology의 국제 사회에 대 한 자문 위원회의 회원입니다. 그는 임상 조사 저널, 면역학의 저널 및 신경 과학의 저널의편집 위원회에 봉사 했다 그리고 국가 기관에 대 한 부여 검토 위원회의 위원 되었습니다. 건강 (NIH) 임상 Neuroimmunology 및 뇌 종양 (CNBT)의 연구 섹션와 국가 다 발성 경화 증 사회 (NMSS). 그는 컨설턴트를 역임 및 honoraria 바이오 젠 Idec, EMD-세로 노, Genzyme, 노바 티 스, 로슈/Genentech, Teva 제약, 주식 회사, 그리고 봉사 했다 또는 릴리, BioMS, Teva 및 Opexa 치료제에 대 한 데이터 안전 모니터링 보드에 제공. 현재, 박사 Zamvil NIH, NMSS, Maisin 재단, 바이오 젠 및 Celgene에서 연구 보조금 지원을 받습니다.

AQP4는 20053NMO IgG에 주 대상으로 확인 되었습니다. 다음, 그것은 CNS autoimmunity의 AQP4 대상 동물 모델을 확립 하는 것이 중요 될 것 이라고 인정 받았다. 이러한 모델 AQP4 전용 T와 B 세포 CNS autoimmunity의 개발에 참여 하는 방법을 조사 하 고 후보 치료제 NMO 테스트 유용할 수 있었다. 비록 야생-타입 마우스에서 epitopes 201013, 그 epitopes에 응답 하는 T 세포에에서 처음 알려졌다 AQP4 전용 T 세포의 임상 또는 조직학 질병14,17를 일으키지 않았습니다. CNS 면역 면역 반응성 AQP4 기반으로 모델을 생성 하는 무 능력 2015 때까지 수수께끼에 남아 있었다 존스, 외. 25 AQP4/- 생쥐에서 기증자 AQP4 p135 153 준비 하는 T 세포 WT 쥐에서 CNS autoimmunity의 임상 및 조직학 징후를 일으키는 수 있었다 발견 했다. 관심의 높은 선호도17와 MHC II (-Ab)을 바인딩할 AQP4 p135-153 전망 이다. 단 하나의 다른 AQP4 아미노산 시퀀스, 201-220-Ab 비슷한 높은 선호도 바인딩할 전망 이다. 사실, 우리 p201-220 두 AQP4-/-, 하지만 WT 쥐에서 강력한 확산 유도 그 AQP4 p135-153를 관찰. 여기, 우리가 어떻게 분리 수 있고 확장 encephalitogenic Th17 AQP4 p135-153-및 p201-220-반응 T 세포 AQP4/- 생쥐에서 나타났습니다. WT 받는 쥐로 전송 하는 경우 기증자 AQP4 반응 Th17 세포 유도 마비, 척수와 시 신경에 단 세포 침투를 동행 했다. 성의 비주얼 시스템 부상 AQP4 seropositive NMOSD26를 가진 환자에서 잘 알려져 있다. 여기, 우리는 AQP4-반응성 고 집 고 양이 반응 Th17 세포에 의해 유도 하는 시 신경 염증은 뚜렷한 관찰 했다. 반면 AQP4 전용 Th17 세포 유도 광섬유 perineuritis, MOG 특정 Th17 세포 심각한 광학 신경 염 유발. 우리는 또한 직렬 10 월 AQP4 및 MOG 전용 T 세포에 의해 유도 하는 시 신경 염증을 모니터링 하는 데 사용 하는 기법을 설명 했습니다. 다른 수 사관은 지금 ATCA의 병원 성 기계 장치에 집중 하는 그들의 자신의 연구를 여기에 설명 된 프로토콜을 적용할 수 있어야 합니다.
하나는 쉽게 우리의 프로토콜에 3 개의 잠재적인 함정을 피할 수 있습니다. ATCA의 첫 번째, 입양 전송 AQP4-/- 기증자 쥐에서 AQP4 전용 T 세포의 사용을 요구 한다. 특히, 기증자 WT AQP4 p135-153-특정 T 세포 받는 WT 쥐 ATCA를 일으키지 않았습니다. 둘째, 그것은 "물-테스트" AQP4/- 생쥐 (프로토콜 단계 1.5)의 예방 접종 전에 펩 티 드/CFA 에멀젼 방울과 함께 수행 하는 것이 중요. 그것은 사우스 캐롤라이나 사출에 적합 때 유제 물에 분산 하지 해야. 유제 분 광 경우 하나 한 번 더 유제를 혼합 해야 다시 진정 고 물-테스트를 반복 합니다. 마지막으로, 활성화 된 기증자 CNS 항 원 특정 T 세포는 T 세포 휴식 보다 더 효율적으로 CNS 면역 유도. 하나는 시각적으로 입양 전송 위한 기증자 T 세포를 수확 전에 가벼운 현미경 그 문화를 검사 해야 합니다. 급속 하 게 세포 분할 클러스터, 쉽게 확인 양식 수 있습니다. 또한 때 많은 활성화 된 T 세포를 포함 하는 문화, 미디어 수 있습니다에서 전환 핑크 오렌지 또는 황색, ph에서 감소 때문. 프로토콜 단계 3에서 설명한 대로 하나 또한 확산에 대 한 기증자 림프절 AQP4 준비 하는 T 세포의 활성화 3H 티 미 딘 법인에 의해 평가할 수 있습니다.
두 개의 병원 성 AQP4 T 셀 epitopes는 (1) 예측 높은 선호도와 MHC II를 바인딩할 및 (2) AQP4-/-, 하지만 하지 WT에 강력한 증식 응답을 이끌어내는 우리의 발견, 쥐 그 결정을 대상으로 하는 T 세포는 일반적으로 제안 thymic 부정적인 선택17에 의해 제어. AQP4 p135-153, p201-220 AQP4/- 생쥐에서의 인식에 대 한 활용 TCR 레파토리는 독특한 (그림 2),이 클론 삭제 thymic 골 수 상피 세포에 의해 중재와 일치. 다른 tolerogenic 메커니즘 수 있습니다 일반적으로 AQP4에 대 한 면역 응답을 제 지. 우리의 초기 보고서17, 이후에 다른 그룹도 시연 했다 AQP4 p201-220 encephalitogenic T 셀 결정27포함 되어 있습니다. 때 α/β (TCRα-/-) T 세포 결핍 마우스 AQP4-/- CD4 재구성 했다+ T 셀, encephalitogenic AQP4 전용 T 세포 응답, 하지만 하지는 AQP4 특정 체액 반응, 그 암시를 이끌어내는 것이 가능 했다 WT 쥐 AQP4 특정 B 세포 응답, AQP4 전용 T 세포 응답, 비슷한 부정적인 선택 될 수 있습니다. 사실, 혼자 AQP4 전용 T 세포에 의해 유도 된 ATCA WT 쥐에서 관찰 하지는, 척추 축 삭 및 RGCs, 손실 병원 성 AQP4 특정 항 체의 참여를 요구할 수 있습니다. 그것은 분명 AQP4 대상 CNS autoimmunity의 마우스 모델 tolerogenic 메커니즘을 일반적으로 AQP4 전용 T 세포 및 B 세포 면역 제어에 대 한 자세한 내용은 진화를 계속 하는 것입니다.
AQP4 대상 CNS 면역의 다른 모델도 되 고 개발된6,16,,2829,30. 각자 공부 NMO 병 인에 관련 된 특정 측면에 대 한 장점을 제공할 수 있습니다. AQP4 전용 T 세포 WT 쥐6,,1629에서 확인 되었습니다. 그 AQP4 전용 T 세포 발생의 CNS 면역 조직학 변화 하지만, 마찬가지로 쥐에서 관찰, WT 쥐 AQP4 전용 T 세포 발생 하지 않습니다 임상 질병의 중요 한 표시. 따라서, WT 쥐의 T 세포와 B 세포 AQP4 특정 면역 응답을 제한 하는 허용의 메커니즘은 쥐에서 작동도. 관계 없이, 하나 해야 마우스 모델을 사용 하 여 질병의 병 인에 관여 하는 메커니즘을 공부에 전력을 과소 평가 하지. 녹아웃, 유전자 변형 및 기자 쥐의 부 유리할 수 있습니다. 그것은 또한 몇 가지 기본적인 발견 면역 마우스 EAE 모델을 사용 하 여 만들어진 인식 되어야 한다. 예를 들어 데모 그 T 세포 클론 자가 항 원에 대 한 특정 면역 질환31,32,33 면역에서 T 세포 costimulation의 역할 및의 발견을 중재할 수는 Th17 차별화34 에 대 한 개발 통로 처음 마우스 EAE 모델을 사용 하 여 설명 했다. 우리가 개발한 ATCA의 마우스 모델을 사용 하 여, 하나 지금가지고 연구 개발 및 병원 성 AQP4 특정 면역 응답을 vivo에서의 규제 수단 NMO 병 인에 관련 된 중요 한 통찰력을 제공 한다.

Neuromyelitis optica (NMO) 중앙 신경 시스템 (CNS) 자기 면역 염증 demyelinating 질병 잦은 마비와 영구적인 신경학 적 장애1로 이어지는 시각 손실의 원인입니다. NMO는 현재 간주 주로 체액 성 면역 질환2 aquaporin-4 (AQP4), 이다3,4에 풍부 하 게 표현 하는 수로 대상으로 하는 항 체 (Igs)와 관련으로. 그러나, CNS 염증 CNS AQP4 Ig5,6의 항목에 대 한 전제 조건입니다. 따라서, 그것은 안티-AQP4 Igs 혼자의 전송에 의해 NMO의 모델을 설치 하 게 가능 되지 않았습니다. NMO 환자에서 (1) 병원 성 AQP4 전용 Igs IgG11,2는 결과 T 세포 의존 Ig 서브 클래스7 (2) T 세포는 NMO 병 변8,9 (3) NMO 식별 됩니다 연결 된 특정 MHC II 유전자 (예: HLA-DR17 (DRB1 * 0301))10, 그리고 (4) proinflammatory AQP4-반응성 박사-제한 된 Th17 세포는 NMO 환자11,12 모든 확장 표시 AQP4 전용 T 세포는 중요 한 역할 NMO pathogenesis에서. 따라서, AQP4 전용 T 세포 NMO pathogenesis에 기여할 수는 어떻게 결정 하는 동물 모델을 개발 하는 것이 중요 하다.
몇 년 전, 여러 AQP4 T 셀 epitopes 야생-타입 (WT) 마우스13,14 와 쥐15에서 확인 되었다. AQP4 반응 T 세포 순진한 받는 사람 쥐15,16opticospinal 염증 유발 수 관찰 되었다, 그러나 CNS 질환의 중요 한 임상 증상 관찰 하지 했다. 마찬가지로, AQP4 T 셀 epitopes14,17를 포함 하는 펩 티 드와 WT 쥐의 면역을 직접 또는 그 결정 요인17를 대상으로 하는 proinflammatory T 세포의 전송, 임상 증상을 일으키지 않았습니다 또는 조직학 CNS 면역의 증거입니다.
최근에, 그것은 높은 선호도18C57BL/6 AQP4-결핍 (AQP4-/-) 마우스 AQP4 펩 티 드 (p) 135-153 또는 p201-220, MHC II (-Ab) 바인딩할 예측 결정 하는 2 개의 요인의 그 면역 관찰 했다, elicited 강한 CD4 + T 세포 응답17. 반면,이 두 펩 티 드 WT 쥐에만 겸손 증식 반응 elicited. 또한, AQP4/- 생쥐에서 T 세포에 의해 이러한 결정 요인의 인식에 대 한 사용 T 세포 수용 체 (TCR) 레 퍼 토리 독특한 했다. 샨 다, 이러한 연구 결과 AQP4의 T 세포 인식 thymic 부정적인 선택에 의해 규제 됩니다 나타냅니다. AQP4 p135-153-또는 p201-220-특정 AQP4-/- 기증자 쥐에서 Th17 세포 유도 순진한 받는 WT 쥐;의 거의 100%에 마비 이 T 세포, B 세포, monocytes의 opticospinal 침투와 연관 되었다. 직렬 opticospinal 일관성 단층 촬영 (OCT) 시연 동적 시각적 시스템 참여. AQP4 대상 CNS T 세포 중재 면역 (ATCA)와 쥐 마비 비주얼 시스템 부상에서 회복. EAE myelin oligodendrocyte 당단백질 (MOG) p35-55-특정 T 세포에 의해 지속적인 임상 질병 이끌어 유도 달리 혼자 T 세포에 의해 유도 된 ATCA axonal 손실 또는 감소 망막 신경 절 세포 (RGCs)에 연결 되지 않았습니다. 우리의 결과 명확 하 게 여러 병원 성 AQP4 T 셀 결정 요인 다는 것을 설명 했다. ATCA의이 새로운 모델은 어떻게 셀 CNS 염증을 유발 하 고 어떻게 그들이 AQP4 특정 B 세포 및 NMO 병 인을 촉진 하는 항 체와 협력 수 학습 병원 성 AQP4 전용 T 세포의 개발을 제어 하는 메커니즘을 공부 하는 데 유용 .
현재 보고서에서 우리는 유도 하 고 T 세포 유도 ATCA를 평가 하는 데 사용 하는 프로토콜을 설명 합니다. 우리 면역, T 세포 배양 및 Th17 분극 병원 성 AQP4 전용 T 세포, 양극 화 및 그 T 세포의 입양 전송 흐름 cytometry 분석 생성을 사용 하는 기법으로 시작 합니다. 우리는 다음 임상 및 조직학 질병 및 직렬 OCT 비주얼 시스템 부상을 받는 사람 마우스 모니터를 사용 하 여 평가 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다.

<table width="1066">
	<colgroup>
		<col style="width:246pt" width="328" />
		<col style="width:162pt" width="216" />
		<col style="width:104pt" width="139" />
		<col style="width:287pt" width="383" />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">M. tuberculosis H37Ra</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">BD Difco</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">231141</td>
			<td class="xl22" style="width:287pt" width="383">Dessicated, killed M. tuberculosis</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">Incomplete Freund&#39;s Adjuvant</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">BD Difco</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">263910</td>
			<td class="xl22"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">AQP4 peptide p135-153</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">Genemed</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">Custom Synthesis</td>
			<td class="xl22">Peptide sequence: LVTPPSVVGGLGVTMVHGN</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">AQP4 peptide p201-220</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">Genemed</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">Custom Synthesis</td>
			<td class="xl22">Peptide sequence: HLFAINYTGASMNPARSFGP</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">MOG peptide p35-55</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">Genemed / Auspep</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">Custom Synthesis</td>
			<td class="xl22">Peptide sequence: MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">3-way Stopcock</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">Kimble</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">420163-4503</td>
			<td class="xl22"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">HyClone Fetal Bovine Serum (Characterized)</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">SH30071</td>
			<td class="xl22"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">Recombinant Mouse IL-23</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">R&#38;D Systems (BioTechne)</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">1887-ML</td>
			<td class="xl22"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">Recombinant Mouse IL-6</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">R&#38;D Systems (BioTechne)</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">406-ML</td>
			<td class="xl22"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">Recombinant Mouse IL-12</td>
			<td class="xl23" style="width:162pt" width="216">R&#38;D Systems (BioTechne)</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">419-ML</td>
			<td class="xl22"></td>
		</tr>
		<tr height="25" style="height:18.75pt">
			<td class="xl19" height="25" style="width:246pt;height:18.75pt" width="328">Thymidine [Methyl-3H]</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">PerkinElmer</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">NET027</td>
			<td class="xl22"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">Glass Fiber Filtermats</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">PerkinElmer</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">1450-421</td>
			<td class="xl22"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">Anti-mouse antibodies</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">eBioscience (Affymetrix)</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">[various]</td>
			<td class="xl22"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">Anti-mouse TCR V&#946; Screening Panel</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">BD Biosciences</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">557004</td>
			<td class="xl22"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">LIVE/DEAD Fixable Dead Cell Stain</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">ThermoFisher Scientific</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">[various]</td>
			<td class="xl22"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">Paraformaldehyde (16%)</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">15710</td>
			<td class="xl22"></td>
		</tr>
		<tr height="42" style="height:31.5pt">
			<td class="xl19" height="42" style="width:246pt;height:31.5pt" width="328">Fixation/Permeabilization Solution Kit with GolgiPlug</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">BD Biosciences</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">555028</td>
			<td class="xl22"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">P8139</td>
			<td class="xl22"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">Iomomycin (calcium salt)</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">Sigma-Aldrich</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">I0634</td>
			<td class="xl22"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">Pertussis Toxin from B. pertussis</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">List Biological Laboratories</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">181</td>
			<td class="xl22"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">10% Formalin</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">VWR</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">89370-094</td>
			<td class="xl22"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">Variable-Flow Peristaltic Pump</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">13-876-2</td>
			<td class="xl22"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">Foam Biopsy Pads, Rectangular</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">Fisher Scientific</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">22-038-221</td>
			<td class="xl22"></td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">Isothesia (isoflurane, USP)</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">Henry Schein Animal Health</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139">050033</td>
			<td class="xl22">NDC : 11695-0500-2</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">Tropicamide Ophthalmic Solution, USP (1%)</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">Akorn</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139"></td>
			<td class="xl22">NDC: 17478-102-12</td>
		</tr>
		<tr height="21" style="height:15.75pt">
			<td class="xl19" height="21" style="width:246pt;height:15.75pt" width="328">Spectralis Diagnostic Imaging Platform</td>
			<td class="xl19" style="width:162pt" width="216">Heidelberg Engineering</td>
			<td class="xl24" style="width:104pt" width="139"></td>
			<td class="xl22"></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

induction of paralysis and visual system injury in mice by t cells specific for neuromyelitis optica autoantigen aquaporin-4

그것은 인식 하는 동안 그 aquaporin-4 (AQP4)-특정 T 세포와 항 체 neuromyelitis optica (NMO), 인간 중앙 신경 시스템 (CNS) 면역 demyelinating 질병, 둘 다 AQP4 타겟 모델의 생성의 병에 참여 CNS autoimmunity의 임상 및 조직학 발현 어려운 입증 했다. 그 T 세포 순진한 받는 사람 마우스 질병을 전송할 수 있지만 AQP4 펩 티 드와 야생-타입 (WT) 쥐의 면역 T 세포 증식을 elicited. 최근에, 2 개의 소설 AQP4 T 셀 epitopes, 펩 티 드 (p) 135-153, p201-220, 발견 했다 공부 하는 T 세포 반응성이이 epitopes 제안 하는 AQP4 불충분 한 (AQP4-/-) 마우스에서 AQP4에 대 한 면역 응답을 일반적으로 thymic 의해 제어 부정적인 선택입니다. AQP4-/- Th17 편광 p135-153 또는 p201-220 유발된 마비에 받는 WT 쥐에서 척수와 시 신경의 주로 환자의 염증에 연결 됐다는 T 세포. 염증 주변 시 신경 및 내부 망막 레이어 (IRL)의 참여 변화 직렬 광학 일관성 단층 촬영 (OCT)에 의해 각 성 했다. 여기, 우리는이 생체 내에서 의 새로운 모델 AQP4 대상 CNS 면역 (ATCA), 병원 성 AQP4 전용 T 세포와 그들이 어떻게 B 협조 수 있습니다의 개발을 허용 하는 메커니즘을 연구를 지금 사용할 수를 만드는 데 사용 하는 방법 설명 NMO 병 인에 셀입니다.

이 프로토콜에서 우리는 C57BL/6 AQP4/- 생쥐에서 기증자 T 세포를 사용합니다. 병원 성 T 세포 epitopes를 포함 하는 AQP4 p135-153 또는 p201-220,이 쥐의 피하 접종 elicited 강한 증식 T 세포 응답 배출 림프절 (그림 1)에이 두 펩 티 드 훨씬 약한 T 세포를 유도 하는 반면 WT 쥐에서 확산입니다. 비교에서는, AQP4 p91-110와 예방 접종 비 병원 성 AQP4 T 셀 결정13또는 MOG p35-55, 실험적인 자기 면역 뇌 (EAE)22,23 시키는 T 세포를 활성화 하는 수 초 펩 티 드를 포함 하 ,24, 유도에 AQP4-/- WT 쥐 T 세포 확산의 유사한 크기. 교류 cytometry 얼룩 TCR 사용률 분석 개별 Vβ 또는 Vβ, AQP4/- 생쥐에서 p135-153-및 p201-220-특정 T 세포 독특한 TCR 레파토리 활용 시연에 대 한. 선택적 하이퍼-확산 p135-153, p201-220 AQP4/- 생쥐로 독특한 TCR 활용 (그림 2), AQP4의 이러한 결정에 대 한 병원 성 T 세포 응답은 일반적으로 thymic 네거티브에 의해 규제 표시 선택, AQP4-/- 기증자 T 셀이이 프로토콜을 사용 하 여에 대 한 중요성을 강조.
ATCA의 유도 대 한 입양 전송 전에 림프절 세포 AQP4 펩 티 드 액 쥐에서 3 일 동안 Th17 또는 Th1 편광 조건에서 생체 외에서 경작 했다. 어느 정도 분극 기증자 CD4의+ T의 세포 (ICS)를 얼룩이 지는 세포내 cytokine에 의해 확인 되었고 cytometry (그림 3)에 의해 측정. 순진한 받는 사람 마우스는 2 x 107 기증자 AQP4 펩 티 드 관련 T 세포와 정 맥 주입 했다. 약 6 일 후, 거의 100% 받는 사람 마우스의 개발 CNS 자가 면역 질환, 다리를 절 며 꼬리와 뒷 다리 마비 (그림 4)를 포함 하 여 임상 증상. Th17 편광 AQP4 전용 T 세포 Th1 편광 AQP4 전용 T 세포 보다 더 심한 임상 질환을 유발. Th17 AQP4-펩 티 드-특정 받은 완전 한 뒷 다리 마비 (하반신 마비)를 개발 하는 대표적인 마우스 비디오 1에 표시 됩니다. MOG 특정 Th17 세포의 관리 후 EAE를 개발 하는 쥐와 받는 사람 마우스 AQP4 전용 Th17 세포에 의해 유도 된 임상 질병에서 회복. EAE MOG p35-55-특정 Th17 세포에 의해 유도 된에 관해서는 p135-153-특정 AQP4에 의해 유도 된 임상 질환 또는 p201-220-특정 Th17 세포 CNS 실질에서 meninges (그림 5) 단 세포의 침투와 관련 되었다. 병 변 더 AQP4 특정 Th17 세포에 의해 유도 된 CNS 면역에 대 한 실질에 보다 meninges에 풍부 했다.
조직학 평가 및 직렬 10 월 AQP4 관련 하 여 시 신경 관련 입증 되었다 고 집 고 양이 특정 Th17 세포 두 유도 시 신경 염증, 단 세포의 존재에 의해 특징 했다. 반면 AQP4 전용 Th17 세포 발생 광섬유 perineuritis, MOG 특정 Th17 세포 유도 심각한 광학 신경 염 (그림 5). 직렬 OCT를 사용 하 여, 시 신경 염증 분명 불어서 고 AQP4 또는 MOG 특정 Th17 세포 (그림 6)에 의해 유도 된 임상 질환에 대 한 내 망막 층 (IRL) 두께 증가. AQP4 Th17 유도 CNS 면역에 대 한 쥐로 기준선을 반환 IRL 두께 임상 질병에서 회복. 반면, EAE MOG 특정 Th17에 의해 유도 된의 지 속성 대응 IRL 엷게 하 고, 살펴본 바와 같이 이전17, 망막 신경 절 세포의 감소와 관련 되었다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig1.jpg"> 
그림 1 : AQP4/- 생쥐 하지만 하지 WT 쥐에서 강력한 T 세포 증식을 유도 하는 AQP4 p135-153, p201-220. 마우스 접종 했다 CFA에 표시 된 펩 티 드와 사우스 캐롤라이나. 11 일 후, 림프절 제거 하 고 중 아무 항 원 또는 펩 티 드 면역에 대 한 사용을 경작 했다. 확산 3H 티 미 딘 법인 (평균 ± SEM, 5 실험의 대표)에 의해 측정 되었다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig2.jpg"> 
그림 2 : AQP4/- 생쥐에서 AQP4 전용 T 세포 활용 독특한 TCR 레파토리. 표시 된 펩 티 드 AQP4-/- 와 WT 쥐 접종 했다. 11 일 후, 림프절 제거 하 고 예방 접종에 대 한 사용 하는 펩 티 드와 경작 했다. 세포를 수확 했다. TCR Vβ 사용률 cytometry에 의해 분석 되었다 (± sem의 의미 n = 5). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig3.jpg"> 
그림 3 : 기증자 AQP4 전용 T 세포의 양극 화 Proinflammatory. 11 일 AQP4 p135-153 또는 p201-220, 예방 접종 후 림프절 세포 수확 되었고 비 편광 조건, Th1 또는 Th17 편광 조건에서에서 예방 접종에 대 한 사용 하는 펩 티 드와 경작. Th17 Th1 분극 시험 되었다 IC 및 흐름 cytometry에 의해 IL-17 또는 IFN-γ, 각각. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig4.jpg"> 
그림 4 : Th17 편광 AQP4 전용 T 세포 유도 WT 받는 사람 마우스 마비. WT 받는 사람 마우스 AQP4/- 생쥐에서 2 x 107 기증자 Th17 편광 AQP4 p135-153 또는 p201-220-특정 T 세포를 받았다. Th17 편광 MOG 전용 T 세포 긍정적인 컨트롤로 제공 됩니다. 8 실험의 결과 (n = 5/그룹). * p &#60; 0.05, * * p &#60; 0.01, * * * p &#60; 0.001. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig5.jpg"> 
그림 5 : AQP4 특정 Th17 세포 유도 WT 쥐에 opticospinal 염증. 받는 사람 마우스 2 x 107 기증자 Th17 AQP4 p135-153-또는 p201-220-액 Th17 세포 AQP4/- 생쥐에서 또는 Th17 MOG p35-55-특정 셀을 접수 하 고 10 일 후를 희생 했다. 척수와 시 신경 조직 준비 되었고 H로 얼룩진 &#38; E/LFB 염증과 demyelination의 증거에 대 한 평가를각각. 결과 5 쥐/그룹의 대표입니다. 눈금 막대 = 50 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56185/56185fig6.jpg"> 
그림 6 : 시 신경 염증 AQP4 전용 Th17 세포에 의해 유도 된 경도 망막 10 월에 의해 모니터링할 수 있습니다 WT 받는 사람 마우스 하루 0에 2 x 107 기증자 Th17 편광 AQP4 p201-220-특정 또는 MOG p35-55-특정 T 세포를 받았다. 그들은 전날 0 (T 세포의 관리)에 10 월에 의해 시험 되었다 일에 다음 4, 7, 8, 9 10, 11 14 및 21. IRL 두께 측정된 (평균 ± SEM) 했다. 통계는 순진한 컨트롤과 비교를 나타냅니다. 결과 3 실험 (5 쥐/그룹)의 대표. * p &#60; 0.05, * * p &#60; 0.01, * * * p &#60; 0.001. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56185/56185fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Induction of Paralysis and Visual System Injury in Mice by T Cells Specific for Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4

여기, 선물이 aquaporin-4 (AQP4)의 양도 의해 마비 및 opticospinal 염증 유도 프로토콜-WT 쥐로 AQP4/- 생쥐에서 특정 T 세포. 또한, 우리는 시각 시스템 장애 모니터링을 직렬 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하는 방법을 보여 줍니다.

마비 및 비주얼 시스템 부상 Neuromyelitis Optica Autoantigen Aquaporin-4에 대 한 T 세포 관련 하 여 쥐에서의 유도

While it is recognized that aquaporin-4 (AQP4)-specific T cells and antibodies participate in the pathogenesis of neuromyelitis optica (NMO), a human ...

induction-paralysis-visual-system-injury-mice-t-cells-specific-for

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

11.3K 조회수.  University of California. 여기, 선물이 aquaporin-4 (AQP4)의 양도 의해 마비 및 opticospinal 염증 유도 프로토콜-WT 쥐로 AQP4/- 생쥐에서 특정 T 세포. 또한, 우리는 시각 시스템 장애 모니터링을 직렬 광학 일관성 단층 촬영을 사용 하는 방법을 보여 줍니다.

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Retroviral Transduction of T-cell Receptors in Mouse T-cells

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen presenting cells (APCs)1. This recognition leads to the activation of T-cells and a series of functional outcomes (e.g. cytokine production, killing of the target cells). Understanding the functional role of TCRs is critical to harness the power of the immune system to treat a variety of immunology related diseases (e.g. cancer or autoimmunity).
It is convenient to study TCRs in mouse models, which can be accomplished in several ways. Making TCR transgenic mouse models is costly and time-consuming and currently there are only a limited number of them available2-4. Alternatively, mice with antigen-specific T-cells can be generated by bone marrow chimera. This method also takes several weeks and requires expertise5. Retroviral transduction of TCRs into in vitro activated mouse T-cells is a quick and relatively easy method to obtain T-cells of desired peptide-MHC specificity. Antigen-specific T-cells can be generated in one week and used in any downstream applications. Studying transduced T-cells also has direct application to human immunotherapy, as adoptive transfer of human T-cells transduced with antigen-specific TCRs is an emerging strategy for cancer treatment6.
Here we present a protocol to retrovirally transduce TCRs into in vitro activated mouse T-cells. Both human and mouse TCR genes can be used. Retroviruses carrying specific TCR genes are generated and used to infect mouse T-cells activated with anti-CD3 and anti-CD28 antibodies. After in vitro expansion, transduced T-cells are analyzed by flow cytometry.

We present a protocol to produce antigen-specific mouse T-cells using retroviral transduction

마우스 T - 세포에서 T - 세포 수용체의 Retroviral 전달

T-cell receptors (TCRs) play a central role in the immune system. TCRs on T-cell surfaces can specifically recognize peptide antigens presented by antigen ...

연구

면역학 및 감염병학

Determining Optimal Cytotoxic Activity of Human Her2neu Specific CD8 T cells by Comparing the Cr51 Release Assay to the xCELLigence System

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host cells1. These cells express a specialized receptor, called the T cell receptor (TCR), which can recognize a specific antigenic peptide bound to HLA class I molecules2. Engagement of infected cells or tumor cells through their HLA class I molecule results in production of lytic molecules such as granzymes and perforin resulting in target cell death. While it is useful to determine frequencies of antigen-specific CD8 T cells using assays such as the ELIspot or flow cytometry, it is also helpful to ascertain the strength of CD8 T cell responses using cytotoxicity assays3. The most recognizable assay for assessing cytotoxic function is the Chromium Release Assay (CRA), which is considered a standard assay 4. The CRA has several limitations, including exposure of cells to gamma radiation, lack of reproducibility, and a requirement for large numbers of cells. Over the past decade, there has been interest in adopting new strategies to overcome these limitations. Newer approaches include those that measure caspase 
release 4, BLT esterase activity 5 and surface expression of CD107 6. The impedance-based assay, using the Roche xCelligence system, was examined in the present paper for its potential as an alternative to the CRA. Impedance or opposition to an electric current occurs when adherent tumor cells bind to electrode plates. Tumor cells detach following killing and electrical impedance is reduced which can be measured by the xCelligence system. The ability to adapt the impedance-based approach to assess cell-mediated killing rests on the observation that T cells do not adhere tightly to most surfaces and do not appear to have much impact on impedance thus diminishing any concern of direct interference of the T cells with the measurement. Results show that the impedance-based assay can detect changes in the levels of antigen-specific cytotoxic CD8 T cells with increased sensitivity relative to the standard CRA. Based on these results, impedance-based approaches may be good alternatives to CRAs or other approaches that aim to measure cytotoxic CD8 T cell functionality.

The chromium release assay, a common assay for detecting cytotoxic T cell activity, has several limitations. Using antigen-specific CD8 T cells and the human breast cancer tumor line, SKBR3, in the present article, an impedance-based approach was examined for the capability of detecting cell killing.

xCELLigence 시스템으로 CR51 릴리스 분석을 비교하여 인간 Her2neu 특정한 CD8 T 세포의 최적 세포 독성 활동 결정

Cytotoxic CD8 T cells constitute a subgroup of T  cells that are capable of inducing the death of infected or malignant host  cells1. These cells express ...

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most commonly utilizing two plasmids with one expressing the piggyBac transposase enzyme and a transposon plasmid harboring the gene(s) of interest between inverted repeat elements which are required for gene transfer activity. PiggyBac mediates gene transfer through a "cut and paste" mechanism whereby the transposase integrates the transposon segment into the genome of the target cell(s) of interest. PiggyBac has demonstrated efficient gene delivery activity in a wide variety of insect1,2, mammalian3-5, and human cells6 including primary human T cells7,8. Recently, a hyperactive piggyBac transposase was generated improving gene transfer efficiency9,10.
Human T lymphocytes are of clinical interest for adoptive immunotherapy of cancer11. Of note, the first clinical trial involving transposon modification of human T cells using the Sleeping beauty transposon system has been approved12. We have previously evaluated the utility of piggyBac as a non-viral methodology for genetic modification of human T cells. We found piggyBac to be efficient in genetic modification of human T cells with a reporter gene and a non-immunogenic inducible suicide gene7. Analysis of genomic integration sites revealed a lack of preference for integration into or near known proto-oncogenes13. We used piggyBac to gene-modify cytotoxic T lymphocytes to carry a chimeric antigen receptor directed against the tumor antigen HER2, and found that gene-modified T cells mediated targeted killing of HER2-positive tumor cells in vitro and in vivo in an orthotopic mouse model14. We have also used piggyBac to generate human T cells resistant to rapamycin, which should be useful in cancer therapies where rapamycin is utilized15.
Herein, we describe a method for using piggyBac to genetically modify primary human T cells. This includes isolation of peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) from human blood followed by culture, gene modification, and activation of T cells. For the purpose of this report, T cells were modified with a reporter gene (eGFP) for analysis and quantification of gene expression by flow cytometry.
PiggyBac can be used to modify human T cells with a variety of genes of interest. Although we have used piggyBac to direct T cells to tumor antigens14, we have also used piggyBac to add an inducible safety switch in order to eliminate gene modified cells if needed7. The large cargo capacity of piggyBac has also enabled gene transfer of a large rapamycin resistant mTOR molecule (15 kb)15. Therefore, we present a non-viral methodology for stable gene-modification of primary human T cells for a wide variety of purposes.

piggyBac Transposon System Modification of Primary Human T Cells

We describe a method to genetically modify primary human T cells with a transgene using the non-viral piggyBac transposon system. T cells modified to using the piggyBac transposon system exhibit stable transgene expression.

기본 인간 T 세포 piggyBac Transposon 시스템 변경

The piggyBac transposon system is naturally active, originally derived from the cabbage looper moth1,2. This non-viral system is plasmid based, most ...

Peptide:MHC Tetramer-based Enrichment of Epitope-specific T cells

A basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an ability to identify T cells based on their T cell antigen receptor (TCR) specificity. Many indirect methods are available in which a bulk population of T cells is stimulated in vitro with a specific antigen and epitope-specific T cells are identified through the measurement of a functional response such as proliferation, cytokine production, or expression of activation markers1. However, these methods only identify epitope-specific T cells exhibiting one of many possible functions, and they are not sensitive enough to detect epitope-specific T cells at naive precursor frequencies. A popular alternative is the TCR transgenic adoptive transfer model, in which monoclonal T cells from a TCR transgenic mouse are seeded into histocompatible hosts to create a large precursor population of epitope-specific T cells that can be easily tracked with the use of a congenic marker antibody2,3. While powerful, this method suffers from experimental artifacts associated with the unphysiological frequency of T cells with specificity for a single epitope4,5. Moreover, this system cannot be used to investigate the functional heterogeneity of epitope-specific T cell clones within a polyclonal population.
	The ideal way to study adaptive immunity should involve the direct detection of epitope-specific T cells from the endogenous T cell repertoire using a method that distinguishes TCR specificity solely by its binding to cognate peptide:MHC (pMHC) complexes. The use of pMHC tetramers and flow cytometry accomplishes this6, but is limited to the detection of high frequency populations of epitope-specific T cells only found following antigen-induced clonal expansion. In this protocol, we describe a method that coordinates the use of pMHC tetramers and magnetic cell enrichment technology to enable detection of extremely low frequency epitope-specific T cells from mouse lymphoid tissues3,7. With this technique, one can comprehensively track entire epitope-specific populations of endogenous T cells in mice at all stages of the immune response.

This protocol describes the use of peptide:MHC tetramers and magnetic microbeads to isolate low frequency populations of epitope-specific T cells and analyze them by flow cytometry. This method enables the direct study of endogenous T cell populations of interest from in vivo experimental systems.

펩타이드 : 에피토프 특정 T 세포의 MHC Tetramer 기반 강화

A  basic necessity for researchers studying adaptive immunity with in vivo experimental models is an  ability to identify T cells based on their T cell ...

Accelerated Type 1 Diabetes Induction in Mice by Adoptive Transfer of Diabetogenic CD4+ T Cells

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of human Type 1 diabetes (T1D). Cell transfer studies in irradiated recipient mice have established that T cells are pivotal in T1D pathogenesis in this model. We describe herein a simple method to rapidly induce T1D by adoptive transfer of purified, primary CD4+ T cells from pre-diabetic NOD mice transgenic for the islet-specific T cell receptor (TCR) BDC2.5 into NOD.SCID recipient mice. The major advantages of this technique are that isolation and adoptive transfer of diabetogenic T cells can be completed within the same day, irradiation of the recipients is not required, and a high incidence of T1D is elicited within 2 weeks after T cell transfer. Thus, studies of pathogenesis and therapeutic interventions in T1D can proceed at a faster rate than with methods that rely on heterogenous T cell populations or clones derived from diabetic NOD mice.

We provide a reproducible method to induce type 1 diabetes (T1D) in mice within two weeks by the adoptive transfer of islet antigen-specific, primary CD4+ T cells.

Diabetogenic CD4의 입양 전송하여 마우스의 가속 제 1 형 당뇨병 유도 + T 세포

The nonobese diabetic (NOD) mouse spontaneously develops autoimmune diabetes after 12 weeks of age and is the most extensively studied animal model of ...

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages and disadvantages. We describe here an experimental colitis model that is initiated by adoptive transfer of syngeneic splenic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipient mice. The CD4+CD45RBhigh T cell population that largely consists of na&#239;ve effector cells is capable of inducing chronic intestinal inflammation, closely resembling key aspects of human IBD. This method can be manipulated to study aspects of disease onset and progression. Additionally it can be used to study the function of innate, adaptive, and regulatory immune cell populations, and the role of environmental exposures, i.e., the microbiota, in intestinal inflammation. In this article we illustrate the methodology for inducing colitis with a step-by-step protocol. This includes a video demonstration of key technical aspects required to successfully develop this murine model of experimental colitis for research purposes.

Induction of Murine Intestinal Inflammation by Adoptive Transfer of Effector CD4+CD45RBhigh T Cells into Immunodeficient Mice

Here, we present a protocol to induce colonic inflammation in mice by adoptive transfer of syngeneic CD4+CD45RBhigh T cells into T and B cell deficient recipients. Clinical and histopathological features mimic human inflammatory bowel diseases. This method allows the study of the initiation of colonic inflammation and progression of disease.

이펙터 CD4의 입양 전송하여 쥐과 장내 염증의 유도<sup&gt; +</sup&gt; CD45RB<sup&gt; 높은</sup&gt; 면역 결핍 마우스에게 T 세포

There are many different animal models available for studying the pathogenesis of human inflammatory bowel diseases (IBD), each with its own advantages ...

Automated Cell Enrichment of Cytomegalovirus-specific T cells for Clinical Applications using the Cytokine-capture System

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection occurring after allogeneic hematopoietic stem-cell transplantation. Viral-specific T cells from allogeneic donors, including third party donors, can be propagated ex vivo in compliance with current good manufacturing practice (cGMP), employing repeated rounds of antigen-driven stimulation to selectively propagate desired T cells. The identification and isolation of antigen-specific T cells can also be undertaken based upon the cytokine capture system of T cells that have been activated to secrete gamma-interferon (IFN-&#947;). However, widespread human application of the cytokine capture system (CCS) to help restore immunity has been limited as the production process is time-consuming and requires a skilled operator. The development of a second-generation cell enrichment device such as CliniMACS Prodigy now enables investigators to generate viral-specific T cells using an automated, less labor-intensive system. This device separates magnetically labeled cells from unlabeled cells using magnetic activated cell sorting technology to generate clinical-grade products, is engineered as a closed system and can be accessed and operated on the benchtop. We demonstrate the operation of this new automated cell enrichment device to manufacture CMV pp65-specific T cells obtained from a steady-state apheresis product obtained from a CMV seropositive donor. These isolated T cells can then be directly infused into a patient under institutional and federal regulatory supervision. All the bio-processing steps including removal of red blood cells, stimulation of T cells, separation of antigen-specific T cells, purification, and washing are fully automated. Devices such as this raise the possibility that T cells for human application can be manufactured outside of dedicated good manufacturing practice (GMP) facilities and instead be produced in blood banking facilities where staff can supervise automated protocols to produce multiple products.

The goal of this protocol is to manufacture pathogen-specific clinical-grade T cells using a bench-top, automated, second generation cell enrichment device that incorporates a closed cytokine capture system and does not require dedicated staff or use of a GMP facility. The cytomegalovirus pp65-specific-T cells generated can be directly administered to patients.

사이토 카인 캡처 시스템을 사용하여 임상 응용 프로그램에 대한 거대 세포 바이러스 고유의 자동화 된 세포 농축은 T 세포

The adoptive transfer of pathogen-specific T cells can be used to prevent and treat opportunistic infections such as cytomegalovirus (CMV) infection ...

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents directly bind to T-cell receptors on the surface of CD8+ T-lymphocytes, fluorochrome-labeled pMHC-I tetramers enable the accurate detection of antigen (Ag)-specific CD8+ T-cells without the need for in vitro re-stimulation. Moreover, when combined with multi-color flow cytometry, pMHC-I tetramer staining can reveal key aspects of Ag-specific CD8+ T-cells, including differentiation stage, memory phenotype, and activation status. These types of analyses have been especially useful in the field of HIV immunology where CD8+ T-cells can affect progression to AIDS. Experimental infection of rhesus macaques with simian immunodeficiency virus (SIV) provides an invaluable tool to study cellular immunity against the AIDS virus. As a result, considerable progress has been made in defining and characterizing T-cell responses in this animal model. Here we present an optimized protocol for enumerating SIV-specific CD8+ T-cells in rhesus macaques by pMHC-I tetramer staining. Our assay permits the simultaneous quantification and memory phenotyping of two pMHC-I tetramer+ CD8+ T-cell populations per test, which might be useful for tracking SIV-specific CD8+ T-cell responses generated by vaccination or SIV infection. Considering the relevance of nonhuman primates in biomedical research, this methodology is applicable for studying CD8+ T-cell responses in multiple disease settings.

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Here, we present an optimized protocol for enumerating and characterizing rhesus macaque CD8+ T cells against the AIDS virus. This article is useful not only to the field of HIV immunology, but also to other areas of biomedical research where CD8+ T cell responses are known to affect disease outcome.

유인원 면역 결핍 바이러스 특정 CD8 분석<sup&gt; +</sup&gt; 펩티드 - MHC-I 테트라 머 염색에 의해 붉은 털 원숭이의 T 세포

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and damaging the testes. During an infection with the ZIKV, immune cells have been shown to infiltrate into the tissues. However, the cellular mechanisms that define the protection and/or immunopathogenesis of these immune cells during a ZIKV infection are still largely unknown. Herein, we describe methods to evaluate the virus-specific T-cell functionality in these immunoprivileged organs of ZIKV-infected mice. These methods include a) a ZIKV infection and vaccine inoculation in Ifnar1-/- mice; b) histopathology, immunofluorescence, and immunohistochemistry assays to detect the virus infection and inflammation in the brain, testes, and spleen; c) the preparation of a tetramer of ZIKV-derived T-cell epitopes; d) the detection of ZIKV-specific T cells in the monocytes isolated from the brain, testes, and spleen. Using these approaches, it is possible to detect the antigen-specific T cells that have infiltrated into the immunoprivileged organs and to evaluate the functions of these T cells during the infection: potential immune protection via virus clearance and/or immunopathogenesis to exacerbate the inflammation. These findings may also help to clarify the contribution of T cells induced by the immunization against ZIKV.

Evaluation of Zika Virus-specific T-cell Responses in Immunoprivileged Organs of Infected Ifnar1-/- Mice

A protocol to evaluate antigen-specific T-cell responses in the immunoprivileged organs of the Ifnar1-/- murine model for the Zika virus (ZIKV) infection is described. This method is pivotal for investigating the cellular mechanisms of the protection and immunopathogenesis of ZIKV vaccines and is also valuable for their efficacy evaluation.

감염 된 Ifnar1/- 생쥐의 Immunoprivileged 장기에서 Zika 바이러스 관련 T 세포 응답의 평가

The Zika virus (ZIKV) can induce inflammation in immunoprivileged organs (e.g., the brain and testis), leading to the Guillain-Barr&#233; syndrome and ...

Induction of Mouse Lung Injury by Endotracheal Injection of Bleomycin

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models continue to be an essential tool for developing new antifibrotic strategies. Here we provide an effective method to investigate in vivo antifibrotic activity of human mesenchymal stromal cells obtained from whole umbilical cord (hUC-MSC) in attenuating bleomycin-induced lung injury. C57BL/6 mice receive a single endotracheal injection of bleomycin (1.5 U/kg body weight) followed by a double infusion of hUC-MSC (2.5 x 105) into the tail vein, 24 h and 7 days after the bleomycin administration. Upon sacrifice at days 8, 14, or 21, inflammatory and fibrotic changes, collagen content, and hUC-MSC presence in explanted lung tissue are analyzed. The injection of bleomycin into the mouse&#160;trachea allows the direct targeting of the lungs, leading to extensive pulmonary inflammation and fibrosis. The systemic administration of a double dose of hUC-MSC results in the early blunting of the bleomycin-induced lung injury. Intravenously infused hUC-MSC are transiently engrafted into the mouse lungs, where they exert their anti-inflammatory and antifibrotic activity. In conclusion, this protocol has been successfully applied for the preclinical testing of hUC-MSC in an experimental mouse model of human pulmonary fibrosis. However, this technique can be easily extended both to study the effect of different endotracheally administered substances on the pathophysiology of the lungs and to validate new anti-inflammatory and antifibrotic systemic therapies.

Here we present an effective method to investigate the antifibrotic activity of intravenously infused human mesenchymal stromal cells obtained from the whole umbilical cord following the induction of lung injury by an endotracheal injection of bleomycin in C57BL/6 mice. This protocol can be easily extended to the preclinical testing of other therapeutics.

Bleomycin의 내시경 주입에 의한 마우스 폐 손상의 유도

Pulmonary fibrosis is a hallmark of several human lung diseases with a different etiology. Since current therapies are rather limited, mouse models ...