현재 다발성 경화증에 대한 완전한 치료법은 없습니다. 우리의 프로토콜은 다발성 경화증 질환 치료법을 탐색하는 데 도움이 되는 실험적 자가면역 뇌척수염 모델의 효과적인 구축을 허용합니다. 우리 프로토콜의 가장 큰 장점은 여러 관점에서 실험적 자가면역 뇌척수염 치료에 대한 보다 포괄적인 평가입니다.
먼저 pH 7.4에서 칼슘 및 마그네슘 이온이 없는 동결건조된 펩타이드와 멸균 예냉된 PBS를 용해시켜 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩타이드 에멀젼을 제조합니다. 멸균 된 5mm 스틸 볼 하나를 깨끗한 2 밀리리터 마이크로 원심 분리기 튜브에 추가하십시오. 그런 다음 동결 건조 된 미생물 결핵 밀리리터 당 5 밀리그램과 미엘린 희소 돌기 아교 세포 당 단백질 펩타이드 에멀젼 500 마이크로 리터를 포함하는 500 마이크로 리터의 완전한 프로이트 보조제를 튜브에 첨가하십시오.
이제 조직 용해기에서 튜브를 10 분 동안 진동시킵니다. 그런 다음 튜브를 얼음 위에서 10 분 동안 식히십시오. 흰색 점성 용액이 형성 될 때까지 과정을 4 번 반복하십시오.
다음으로, 백일해 독소 줄기 용액을 칼슘 및 마그네슘 이온이 없는 pH 7.4의 멸균 PBS에서 50배 희석하여 100 마이크로리터당 200 나노그램의 최종 농도를 달성한다. 초기에 준비된 모든 미엘린 희소돌기아교세포 당단백질 펩타이드 에멀젼을 튜브 바닥에 침전시키려면 장비의 펄스 버튼을 눌러 섭씨 4도에서 2-3초 동안 튜브를 원심분리합니다. 22 게이지 바늘이 장착 된 1 밀리리터 주사기로 미엘린 희소 돌기 아교 세포 당 단백질 펩타이드 에멀젼을 흡인하고 에멀젼을 새로운 1 밀리리터 주사기 배럴로 옮깁니다.
26 게이지 바늘을 배럴에 부착하고 밀봉 필름으로 연결을 고정합니다. 100 마이크로 리터의 미엘린 희소 돌기 아교 세포 당 단백질 펩타이드 에멀젼을 마우스의 등쪽 척추의 양쪽에 피하 주사합니다. 주사 후 피부와 등쪽 아래에 구근 덩어리가 자동으로 형성되는 것을 관찰하십시오.
그런 다음 복강 내로 100 마이크로 리터의 백일해 독소를 동일한 마우스에 주사하십시오. 오픈 필드 반응 챔버를 준비하고 마우스 이동을 기록하기위한 비디오 분석 시스템을 설정합니다. 실험 전에 반응 챔버를 청소하려면 전체 영역에 70 % 에탄올을 뿌리고 깨끗한 종이 타월로 닦으십시오.
다음으로 반응 챔버의 구석에 마우스를 놓습니다. 촬영을 시작하려면 비디오 녹화 시스템의 메뉴 표시 줄에서 캡처 시작 버튼을 클릭하고 시간을 기록하십시오. 테스트 룸에서 침묵을 유지하면서 마우스를 5 분 동안 자유롭게 움직입니다.
그런 다음 녹화를 중지하고 비디오를 저장하십시오. 마우스를 케이지에 다시 넣으십시오. 그런 다음 70 % 에탄올로 테스트 영역을 청소하고 다음 마우스로 진행하십시오.
안락사 된 마우스를 해부 트레이에 평평하게 유지하고 사지를 고정하십시오. 집게로 마우스의 뒷다리 피부를 잡고 가위로 피부와 근육을여십시오. 다음으로, 가위를 조심스럽게 사용하여 경골과 엉덩이 뼈에서 대퇴골을 분리하십시오.
가위로 대퇴골에 부착 된 근육을 제거하십시오. 그런 다음 대퇴골을 실온에서 70 % 에탄올에 놓습니다. 본 연구에서, EAE를 유도하는 미엘린 희소돌기아교세포 유래 펩티드의 능력을 평가하였다.
펩티드를 주입한 마우스는 점진적인 체중 감소를 경험하였다. 주사 6-9 일 후, 그들은 14-16 일 후에 최고조에 달하는 EAE 증상을 나타 냈습니다. 오픈 필드 테스트의 트랙 플롯은 EAE가 마우스의 정상적인 탐색 행동을 변경한다는 것을 보여주었습니다.
정상 마우스와 비교하여 EAE를 가진 마우스는 초기 발병, 피크 및 관해 단계에서 훨씬 적은 거리를 이동했습니다. EAE를 가진 마우스는 또한 질병의 피크 및 관해 단계에서 활동 지속 시간이 현저히 감소했습니다. 더욱이, 3 단계 모두에서 EAE 마우스는 이동 거리와 중심에서 보낸 시간이 현저히 적었다.
EAE 마우스의 대퇴골에 대한 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 스캔은 정상 마우스와 다른 섬유주 구조를 나타 냈습니다. EAE 마우스의 대퇴골은 정상 마우스의 골밀도와 뼈 부피 대 조직 부피 비율이 현저히 낮았습니다. 더욱이, EAE를 가진 마우스의 대퇴골은 정상 마우스의 것보다 섬유주 연결 밀도, 섬유주 수 및 섬유주 두께가 적었다.
정상 마우스와 비교하여, 섬유주 간격이 향상되었고, EAE 마우스에서 피질골 두께가 감소되었다. 우리는 또한 질병의 절정에서 EAE 마우스의 뇌와 척수 코드를 분리하고 독감 세포 측정법에 의해 면역 세포 및 사이토 카인의 생성을 분석 할 수 있습니다.
