Name: sample preparation and analysis of rnaseq-based gene expression data from zebrafish
Uploaded: 2017-10-27T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 42 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish at JoVE.com

이 작업은 R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.), 및 T32DK098107에 의해 지원 되었다 (T.L.H. 및 J.E.N.).

아래에 설명 된 모든 동물 프로토콜 따라 고 메릴랜드 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 대학에 의해 승인.
 1. 배아 준비 <ol><li>자연 교배를 통해 배아를 생성 <ol><li>3 개월, 문화 배아 생식 성숙 5 , 8 .</li>
		<li>배아 컬렉션, 전에 저녁에 나누어 짝짓기 탱크에 원하는 긴장에서 성인 남성과 여성 물고기를 분리 하 고 각 탱크 2 남성 및 여성 3 추가. 
		참고: 유전자 변형 insulin2a:mCherry 형광 기자 긴장의 사용 허용 췌 장 β-세포의 분석.</li>
		<li>전송 물고기 짝짓기를 신선한 시스템 물 탱크 및 다음 아침에와 서 불 후에 즉시 구분선 제거.</li>
		<li>배아 하단 탱크에서 관찰 된다 때까지 자연스럽 게 짝을 물고기 허용. 원하는 금액을 수집 될 때까지 30 분 간격으로 배아를 수집 합니다. 각 저장소 수집 시간 포인트에서 28.5 배아 미디어에서 별도 접시에 ° c.</li>
		<li>바란다면, 실험적인 문화 미디어 6, 유전 물질 또는 배치의 microinjection를 수행 하 고 신선한 행 크에 배아를 문화 &#39; s 배아 중간 8 28.5 ° c.에 10 cm 배양 접시에 참고: morpholino (MO) 주입 또는 돌연변이 동물 유전자 표정 분석, 참고 각 조작 유전자 발현에 부수적 영향을 미칠 수 있습니다. 뮤턴트 전사 모 기반 유전자 9를 대상으로 관찰 되지 않는 수준에서 유전자 보상을 전시할 수 있다.</li>
	</ol></li> <li>단계 배아 <ol><li>배아의 그룹에서 문화 50 &#8211; 75 배아 모든 배아의 일관 된 발달 타이밍 홍보 10 cm 배양 접시 당.</li>
		<li>모니터링 발달 형태를 사용 하 여 해 현미경 blastomere, epiboly, 및 somite 단계에서 발달 진행 10. 
		참고: 제거 접시에 발달 지연을 방지 하기 위해 모든 죽어가는 또는 잘못 된 배아.</li>
		<li>배아 발달 연령에 따라 구분 합니다. 약 24까지 세분화 (포스트 gastrulation, 10.33 h 게시물 수정 (hpf)) 후 somite 번호를 사용 하 여 태아 나이 측정 hpf. 배아와 24 후 몸 전체 길이 사용 하 여 애벌레 hpf. 
		참고:는 somites는 태아의 등 쪽 부분에 쉐 브 론 모양의 mesodermal 조직.</li>
		<li>28.5 ° C 인큐베이터에 정렬 된 배아를 놓고 원하는 시대에 진행에 개발을 허용.</li>
	</ol></li></ol> 2. 단일 셀 분리: 모든 배아 및 정렬 셀 인구 <ol><li>전체 태아 분리 <ol><li>운동 관찰 될 때까지 5-15 분 동안 얼음에 페 트리 접시를 배치 하 여 원하는 단계에서 zebrafish 태아 안락사 .</li>
		<li>레이블이 1.5 mL microcentrifuge 튜브 수영장 20 배아 전송. Microcentrifuge 튜브에서 초과 배아 미디어를 제거.</li>
		<li>추가 200 µ L 세포 시 약 (재료의 표 참조) 배아를 포함 하는 관에. 기계적으로 방 앗 공이 사용 하 여 세포 시 약에 배아 균질 1 ml 전체 볼륨을가지고 800 µ L 세포 시 약을 추가 합니다. RNA 추출까지-80 ° C에서 저장소.</li>
	</ol></li> <li>흐름 정렬 셀 격리 11 <ol><li>1.5 mL microcentrifuge 튜브로 페 트리 접시에서 배아를 전송 하 고 가능한 많은 배아 매체 제거. 
		참고: 배아 나이 따라 기계적 분리도 필요할 수 있습니다이 단계에서. 배아와 &#62; 48 hpf, 좋습니다 계속 하기 전에 배아 무결성을 방해 하는 유 봉 사용.</li>
		<li>분리 버퍼 1의 1 mL와 함께 태아를 품 어 (재료의 표 참조) 1.5 mL microcentrifuge 관에서. 실 온에서 15-30 분 동안 품 어. 부드럽게 인큐베이션 단계 마다 3-4 분 섞어 P1000 팁을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 솔루션을 triturate. 와 동 하지 마십시오.</li>
		<li>X 300g에 3 분 동안 원심 분리 하 여 배아를 수집 하 고는 상쾌한 제거. 다시 1 mL 분리 버퍼 2 (재료의 표 참조)에 태아를 일시 중단 합니다. 일반 피펫으로 분쇄와 실 온에서 15-30 분 동안 품 어.</li>
		<li>현미경 (FACS) 버퍼를 정렬 하는 형광 활성화 셀에서 서 스 펜 션의 1-2 µ L를 diluting 하 여 소화를 평가. 
		참고: 완전 한 소화 시험된 약 수 최소 셀 클러스터 및 배아 조직의 조각으로 단일 셀 때 발생 했습니다.</li>
		<li>5 분 제거 상쾌한에 대 한 300 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수집합니다. 다시 1 mL FACS 버퍼, 그리고 중력 필터에 소화 되지 않은 조직 샘플에서 제거 하려면 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 셀을 중단.</li>
		<li>는 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수 및 FACS 버퍼 약 1 x 10 6 셀/mL FACS 튜브에서를 희석. 
		참고: 셀 배아 (5% 미만 총의), 췌 장 β-세포 등 당 상대적으로 작은 수를 사용 하 여 1000 단계 일치 하는 배아의 최소.</li>
		<li>FACS 정렬 FACS 관 세포 시 약 또는 FACS 버퍼만 포함 된 뿐만 아니라 FACS 튜브 셀 서 스 펜 션의 1 mL를 포함 하는 시설을 제공 합니다. 형광 기자를 나타내는 단일 셀만 수집 FACS 흐름 정렬 게이트.</li>
		<li>FACS 흐름 정렬 원하는 셀 번호가 수집 될 때까지 수행. 
		참고: RNASeq를 수행 하려면 저기는 최소한 총 RNA. 우리 3000-5000 셀 충분 한 높은-품질, 고 농도 RNA를 분리 하는 것으로 나타났습니다.</li>
		<li>얼음에 수집 된 세포를 저장 하 고 즉시 RNA 준비 진행.</li>
	</ol></li></ol> 3. RNA 준비 <ol><li>RNA 추출 <ol><li>세포 시 약 실 온에서 5 분으로 (2 단계)에서 수집 된 샘플을 품 어.</li>
		<li>추가 세포 시 약의 각 1.0 ml 클로 프롬의 0.2 mL 사용 하 고 실 온에서 2-3 분 15 미 품에 대 한 손으로 튜브를 반전. 4에서 15 분 동안 12000 x g에서 샘플을 원심 ° c.</li>
		<li>신선한 튜브를 분리, 수성 단계를 전송 하 고 세포 시 약 사용의 각 1.0 ml 소 프로 파 놀의 0.5 mL를 추가 합니다. 실 온에서 10 분 동안 품 어. 4에서 10 분 동안 12000 x g에서 샘플을 원심 ° c.</li>
		<li>75% 에탄올 세척 및 4에 5 분 동안 7500 x g에서 샘플을 원심 ° c.는 상쾌한을 완전히 제거 하 고 실 온에서 건조 공기를 허용. 다시 15-30 µ L diethyl pyrocarbonate (DEPC)에서 RNA를 중단-물 처리.</li>
	</ol></li> <li>Purify 높은-품질 RNA <ol><li>1/10 볼륨 3 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.5) RNA 서 스 펜 션 결합 및 소 프로 파 놀의 1 볼륨. 실 온에서 20 분 동안 품 어와 4에서 10 분 동안 12500 x g에서 샘플을 원심 ° c.</li>
		<li>DEPC 처리 물에 얼음 처럼 차가운 70% 에탄올과 펠 릿을 세척 하 고 4 시 5 분에 대 한 10000 x g에서 샘플을 원심 ° C. 반복 세척 단계를 한 번.</li>
		<li>는 상쾌한을 제거 하 고 실 온에서 건조를 허용. DEPC 처리 물에 다시 중단.</li>
		<li>농도 (ng / µ L) 및 순도 (260/230 비율)는 흡수 분 광 계를 사용 하 여 추출 된 RNA 분석 결과. 260/230 값 인지 확인 ~ 2.0 RNASeq와 함께 진행 하기 전에. 우리까지-80 ° C에서 저장e (최대 6 개월).</li>
		<li>RNA 샘플 공급 업체 또는 코어에 RNASeq에 대 한 보내고 유전자 발현 분석 읽기 시퀀싱의 정량화에 따라 변경 하십시오. 공급 업체에서 반환 되는 결과 일반적으로 샘플 사이 대 본 읽기에 중요 한 배 변화를 전시 하는 유전자의 목록으로 제공. 
		참고: 위의 방법 품질 RNA를 생성 하는 경우 열 사용할 수 있습니다. 금액, 농도, 및 RNA 무결성 번호 (린) RNA 샘플에 대 한 코어를 확인 한다. 공급 업체 또는 코어 린 평가 또한 일반적으로 것입니다.</li>
	</ol></li></ol> 4. 통로 이동 기간 분석 참고: 코어 또는 공급 업체에서 제공 하는 RNASeq 후 그림 1 유전자 표정 분석의 대표적인 출력을 참조 하십시오.
스프레드시트 관리 소프트웨어에서 <ol><li><ol><ol><li>오픈 컨트롤에 대 한 실험 조건 비교 <li>정렬 차동 유전자 표현 데이터 (결과) (참조 자료 테이블 ).</li>
			<li>선택 드롭-다운 화살표 옆에 &#39; 정렬 &#39; 단추 및 선택 &#34; 사용자 정의 정렬 &#34; 제어 조건 대 실험에서 차동 표현한 유전자를 포함 하는 스프레드시트 내에서.</li>
			<li>선택 아래에 있는 상자 &#39; 열 &#39; 팝업 창에서 고 기준으로 정렬 하려면 선택 합니다 &#39; LFC &#39; 열. 확인 &#39; 값 &#39;에서 선택은 &#39;에 정렬 &#39; 열. 정렬 선택 &#39; 내림차순 오름차순 &#39;에 &#39; 순서 &#39; 열과 클릭 &#34; 확인 &#34;. 
			참고:이 정렬 됩니다 차동 표현한 유전자는 그 감소 식 (부정적인 LFC) 목록 하단에 나타납니다 동안 증가 식 (긍정적인 LFC)와 그 목록의 상단에 나타납니다.</li>
		</ol></li> <li>다음과 같이 단일 컨트롤에 여러 실험 조건 비교.
		<li>선택 <ol>차동 결정 제어 스프레드시트 대 실험 1에 빈 열에서 첫 번째 셀 두 실험 조건에서 발견 하는 유전자 표현. 셀에 다음 수식을 입력: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56187/56187eq1.jpg" /> 참고:이 식은 if, ISERROR, 조합 및 일치 기능. (i) MATCH 함수를 일치 (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0), a 1에 값에 대 한 보이는 것입니다 (합 ID) Experimental2_vs_Control 라는 스프레드시트의 A 열 (A:A)에서 (Experimental2_vs_Control!). &#34; 0 &#34;, 정확 하 게 일치 찾아가 정확히 일치 하는 경우 함수 값을 반환 합니다 &#34; 1 &#34;, 일치 하는 것이 없는 경우 함수는 오류를 반환 합니다 &#34; n / &#34;. (ii) 일치 함수의 결과 다음 ISERROR 함수, ISERROR (일치 (A1, Experimental2_vs_Control로 입력! A:A, 0)), 어디에, 입력이 &#34; 1 &#34; 반환 됩니다 발견 일치 하는 항목을 나타내는 &#34; FALSE &#34;, 그리고 입력이 &#34; n / &#34; 나타내는 일치 하는 찾을 수 없습니다, 그것은 반환 됩니다 &#34; 진정한 &#34;. (iii)는 &#34; 진정한 &#34; 또는 &#34; FALSE &#34; 결과 다음 IF 함수에 입력 하는 경우 (ISERROR (일치 (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0)), &#34; &#34;, &#34; 중복 &#34;), 어디에, 입력이 &#34; 진정한 &#34; 나타내는 일치 하는 항목을 찾을 수 없습니다, 그것은 첫 번째 집합 따옴표의 사이 값을 반환 합니다 (&#34; &#34;)는 빈, 그리고 따라서 해당 셀이 비어 있을 것입니다. 입력이 &#34; FALSE &#34; 발견 일치 하는 항목을 나타내는, 그것의 따옴표 두 번째 집합의 중간 값을 반환 합니다 (&#34; 중복 &#34;), 그리고 셀 말할 것 이다 &#34; 중복 &#34;.</li>
			<li>기자 &#34; 입력 &#34; 또는 &#34; 반환 &#34; 방정식을 실행. 방정식에 포함 된 셀을 선택 하 고 셀의 오른쪽 하단 모서리에 있는 상자를 클릭 합니다. 마우스 클릭을 유지 하 고 마지막까지 열 아래로 선택된 영역을 끌어 &#39; 기능 ID &#39;, 열에 있는 각 셀에 수식 복사.</li>
			<li>선택 &#34; 사용자 정의 정렬 &#34; 다시 클릭 하 여 정렬의 두 번째 수준 추가 &#34; + &#34; 왼쪽된 하단 모서리에 아이콘. 첫 번째 레벨에서 &#34;으로 정렬 &#34;, 열 선택에서 &#34; 중복 &#34;, 정렬에 선택에서 &#39; 값 &#39;, 주문 선택 아래 &#39; a Z &#39;. 두 번째 레벨에서 &#34;에 의해 다음 &#34;, 열 선택에서 &#39; LFC &#39;, 선택 정렬에에서 &#39; 값 &#39;, 주문 선택 아래 &#39; 내림차순 오름차순 &#39; 선택 &#34; 확인 &#34;. 
			참고:이 식 변경의 방향에 따라 4 그룹으로 유전자 목록이 정렬 됩니다. 식에서 변화 같은 방향 또는 반대 방향에서 둘 다에 되도록 두 실험 조건에서 발견 하는 유전자를 확인 하는 것이 중요 하다.</li>
			<li>절차 또는 결과 데이터베이스에서 발견 되지 것입니다 하기 전에 유전자 기호 열에서 모든 괄호를 제거 합니다. 유전자 기호를 포함 하는 전체 열을 선택 합니다. 선택 &#34; 편집 &#34; 다음 &#34; 대체 &#34; 드롭-다운에서 &#39; 파일 &#39; 메뉴. 유형 &#34; (*) &#34;에 &#34; 찾을 내용: &#34; 바꾸기 창과 휴가의 바는 &#34; 바꿉니다: &#34; 빈 바. 선택 &#39; 모두 &#39; 괄호의 모든 인스턴스를 제거 하려면. 
			참고:는 * 임의 개수의 문자, 프로그램은 강조 표시 된 셀에서 모든 인스턴스를 찾을 것인지 묻는 메시지가 두 괄호 및 괄호의 모든 인스턴스 사이이 문자를 배치 하 여 아무것도, 그로 인하여 그들을 제거 교체 될 것 이다 나타냅니다.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>결정 농축 경로 <ol><li>복사 클립보드에 농축된 경로 결정 하는 한 세트의 유전자 기호 소원. ConsensusPathDB 12로 이동 합니다. 선택 &#34; 유전자 분석 설정 &#34; 다음 웹 페이지의 왼쪽된 사이드바에서 &#34; 이상의 표현 분석 &#34;.</li>
		<li>에 유전자의 목록을 붙여 넣습니다는 &#34; 유전자/단백질 식별자의 목록을 붙여 넣습니다 &#34; 상자. 선택 유전자 기호는 &#34; 유전자/단백질 식별자 형식 &#34; 상자와 클릭 &#34; 진행 &#34;. 옆에 있는 상자를 선택 &#34; 경로 경로 데이터베이스에 정의 된 대로 &#34; 통로-기반 설정 섹션. 
		참고: 다양 한 분석에 대 한 옵션 검색 가능한 데이터베이스의 목록을 포함 하 여 표시 됩니다. 그들은 가장 설립 하 고 포괄적인 드 Kegg 및 Reactome 데이터베이스를 제외한 모든 데이터베이스를 선택 하는 것이 좋습니다. 입력 목록 및 p-값 컷오프 설정 최소 중복 또한 필요에 따라 조정할 수 있다. 이러한 설정은 기본 2 유전자 최소 중복 및 0.01 p-값 구분에서 떠나는 것이 좋습니다.</li>
		<li>선택 &#34; 찾을 풍부한 세트 &#34; 입력된 목록에서 유전자를 포함 하는 경로 목록을 가져올 수. 
		참고: 출력 다음 각 통로의 이름을 포함 하는 표 형식에 있을 것입니다 &#34; 크기 설정 &#34; (통로에서 전체 유전자의 수를 나타내는), &#34; 후보자 포함 된 &#34; (그 경로에 있는 입력된 목록에 있는 유전자의 수를 나타내는 ), p-값 및 q 값 (루즈벨트), 및 통로 식별 되.</li>
	</ol></li> <li>통로 네트워크의 세대 <ol><li>농축된 경로 위에서 설명한 대로 결정.</li>
		<li>모든 수를 경로 이름 옆에 있는 각 상자를 선택 하 여 또는 클릭 하 여 경로 네트워크에 시각화 하 농축된 경로 선택 &#34; 모든 &#34; 아래 &#34; 선택 &#34; 선택 상자 위에 열 머리글에서 다음 선택 &#34; 시각화 선택 된 세트 &#34;. 
		참고: 좋습니다 미만 30; 있다면 모든 경로 시각화 30 경로 보다 큰 경우 (입력된 목록에서 유전자의 많은 수를 포함 하는 그들) 최고 30 가장 풍부한 경로 선택 하면 것이 좋습니다.</li>
		<li>조정은 &#34; 상대 오버랩 &#34; 및 &#34; 공유 후보 &#34; desir 페이지의 위쪽 가운데의 중 상자를 선택 하 고 입력 필터,에 드 % 상대 겹치거나 통로 네트워크, 명확 하 고 선택에서 더 많은 관련 있도록 더 엄격한 것 공유 후보자의 수 겹치는 &#34; 적용 &#34;. 
		참고: 좋습니다 0.2, 최소 상대 중복을 연결, 2 경로와 2 공유 후보자의 최소 20% 유전자 중복을 나타내는. 그래프 범례 페이지의 왼쪽 상단에 있는 그래프 범례를 클릭 하 여 볼 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>농축 이동 용어의 결정 <ol><li>하나 클립보드에 풍부한 유전자 온톨로지를 결정 하고자 하는 그룹의 유전자 기호를 복사. 이동 하는 &#39;가 농축 분석 도구 &#39; 유전자 존재론 협회 13에. 유전자 기호 목록 아래에 있는 페이지의 왼쪽에 있는 상자에 붙여 &#34; 여기 당신의 유전자 Id &#8230; &#34;</li> <li>유전자 Id 상자 아래에 나열 됩니다를 사용 하려면 이동 용어 집합 선택: 생물 학적 과정, 분자 또는 세포 구성 요소. (권장) 선택 &#39; 생물 학적 과정 &#39;. 선택 &#39; Danio rerio &#39; 이동 아래 조건 상자와 클릭 &#34; 제출 &#34;. 
		참고: 사용 하 여 좋습니다 0.05의 기본 p-값 컷오프.</li>
	</ol></li></ol> 5. QRT-PCR 확인 참고: RNASeq에 중요 한 유전자 식 변경으로 확인 된 개별 유전자 복제 실험에서 대상된 qRT-PCR에 의해 확인 되어야 한다.
<ol><li>cDNA 합성 <ol><li>섹션 3.1에 설명 된 방법을 사용 하 여 태아에서 RNA를 추출 합니다. RNA 추출.</li>
		<li>CDNA cDNA 변환을 사용 하 게 RNA의 변환 1 µ g 키트 (재료의 표 참조). RNA, dNTPs, 역전사 효소를 결합. 제조 업체에 따르면 thermocycler 반응 수행 &#39; s 사양.</li>
		<li>는 CDNA DEPC 처리 물에 1:3 희석. 1-2 개월까지 4 ° C에서 저장소.</li>
	</ol></li> <li>qRT-PCR 확인 <ol><li>유전자 RNA 시퀀싱 결과에서 qRT-PCR에 의해 확인를 선택 합니다. 식에 높은 배 변화 유전자를 식별 합니다. 또한 높은 읽기 수를 포함 하는 하는이 유전자의 결정이 풍부한 식 나타냅니다.</li>
		<li>높은 배 변화, 유전자의 높은 읽기 수 목록에서에서 10-12 목표를 선택합니다. 적어도 1 intron-엑손 경계에 걸쳐 있는 대상 유전자를 증폭 하는 뇌관 디자인.</li>
		<li>정량 Pcr 뇌관 디자인 사이트 14에 유전자 또는 유전자의 대상된 영역을 입력합니다. 선택은 &#34; 2 정량 Pcr 뇌관 디자인 &#34; 및 뇌관 세트를 만드는 사이트. 
		참고: 샘플 사이의 비교를 정상화 하 내부 제어 뇌관, β-걸, 등을 포함 해야 합니다. Β-말라 뇌관은 f: 5 &#39;-TCGAGCTGTCTTCCCATCCA-3 &#39; r: 5 &#39;-TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG-3 &#39;.</li>
		<li>는 CDNA, 앞으로 뇌관, 역방향 뇌관, 및 중 합 효소 결합. QRT-PCR 증폭 유전자 15의 상대 식을 결정 하려면 수행.</li>
		<li>상대 부 량 결정 15 관심사의 유전자의 상대적 mRNA 표정 분석.</li>
		<li>QRT-PCR RNASeq 차동 식의 방향을 일치 하는지 확인 결과를 비교.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+on+beta-cell+mass+by+disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+or+Alstrom+syndrome+genes.">Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes.</a> Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).</li><li>Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+organism+transcriptome+analysis+of+zebrafish+models+of+Bardet-Biedl+Syndrome+and+Alstrom+Syndrome+provides+mechanistic+insight+into+shared+and+divergent+phenotypes.">Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes.</a> BMC Genomics. 17, 318 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 설명 하는 접근의 전체 또는 특정 정렬된 셀 인구 transcriptome 수준 분석에 대 한 상대적으로 신속 하 고 비용 효과적인 전략을 제공 합니다. Zebrafish는 편리 함과 소재, 유전 구현의 용이성 또는 환경 실험 조건, 및 큰의 가용성을 시작 하는 많은 양의 생성 속도 때문에 연구의이 유형에 대 한 유리한 모델을 제공 합니다. 셀 형 구체적이 고 조직 특정 인구의 격리를 허용 하는 유전자 변형 기자 라인의 스펙트럼.
여기서 설명 하지, 하는 동안이 방법을 수 쉽게 조직 단면도 FACs 및 수집 하는 대신 청소년 이나 성인 물고기에서 수집을 수용 하 게 됩니다. 우리는 또한 기본적인 스프레드시트 명령 및 기존 통로 및 이동 데이터베이스의 사용에만 의존 하는 기본적인 후속 분석 전략을 개발 했다. 이 방법의 주요 장점은 컴퓨터 프로그래밍 이나 데이터베이스 관리에서 높은 수준의 전문성을 필요로 하지 않고 접근의 용이성입니다. 따라서,이 전략은 큰 유전자 표현 데이터 세트의 정보 분석을 위해 모든 백그라운드의 조사를 위해 적용 가능한.
우리의 접근 뒤에 RNASeq 표준 RNA 추출 기법 기본 zebrafish 태아 그리고 애벌레 문화 결합 합니다. RNASeq 필요한 많은 양의 양질의 시작 물자; 일부 공급 업체는 총 RNA의 2 µ g을 필요합니다. 그 결과, 희귀 동식물 세포 유형 또는 개별 배아 분석에 도달입니다. 그러나, 지난 5 년 동안 낮은 수익률 분석, 작은 샘플 및 낮은 RNA 수량에서 생성 된 데이터 집합에 있는 극적인 개선 증명 하고있다 그리고 우리는 이러한 응용 프로그램이 될 것으로 기대 가능한 가까운 장래에. 정확한 결과, 즉, 두 기술 복제의 추가 두 RNA 라이브러리를 생성 하는 단일 샘플 및 생물 복제, 즉, 여러 matings에서 수집 배아에서 이상적 이다. 이 단계 샘플, 변화에 대 한 제어 연구를 허용 하 고 모든 샘플에서 식별 하는 시퀀스는 더 낮은 읽기 카운트 결과 누락의 감소 가능성과 실제 결과 될 것.

글로벌 유전자 발현의 비교 분석 관찰된 고기에 기여 하는 새로운 유전자를 식별 하는 중요 한 도구입니다. 이러한 분석 일반적으로 사본 풍부 실험 사이 비교의 양적 평가에 의존 및 샘플을 제어. QRT-PCR 등 타겟된 방법을 상대적으로 신속 하 고 정확한 단일 유전자 식 변경의 조사에 대 한 있습니다. RNA 시퀀싱 (RNASeq) 샘플, 그건 지금 그런 수사에 대 한 표준 실험 시스템 사이의 유전자 발현에 중요 한 변화를 식별 하는 광범위 한, 가설-무료 접근을 제공 합니다.
Zebrafish는 많은 질병 분야에 걸쳐 눈에 띄는 모델로 떠오르고 있다. 원래 발달 생물학 연구, 그들의 높은 통치 및 유지 보수, 상대적으로 낮은 비용 때문에 그들의 유틸리티에 대 한 개발 zebrafish의 실험적인 사용 진화 했다 다양 한로 서 뿐만 아니라 성인 단계 배아에서 고기를 포함 한 다양 한 분자의1,2,3분석 실험. 사실, 이러한 장점을 분자 기계 연구 급속 한 만들고 많은 양의 자료를 습득의 용이성 때문에 비용 효율적인 생활의 모든 단계에서 유전과 환경 조작의 용이성과 결합. 또한, zebrafish 태아 그리고 애벌레의 투명 한 자연 세포-조직-특정 유전자 변형 기자 라인 개별 셀 인구4의 비보에 시각화 수 있도록 생성에 대 한 이상적인 게. 같은 라인의 착취 리포터 유전자 발현에 따라 특정 격리 된 세포 유형에서 글로벌 유전자 표정 분석을 허용 합니다.
여기 선물이 zebrafish 태아의 문화 후 RNASeq를 사용 하 여 글로벌 유전자 표정 분석에 대 한 포괄적인 프로토콜. Morpholino (모)를 포함 하 여 유전 실험 조작-기반된 변이 유전자 최저 또는 CRISPR 중재 게놈 편집, 제시 된 다른5,,67. 우리는 따라서 전체 배아에서 RNA의 격리에 대 한 자세한 프로토콜에 초점 또는 경로 도구와 유전자 존재론 (가십시오) 용어를 사용 하 여 RNASeq 결과의 간단한 계산 분석 뒤 유전자 변형 기자 표현 셀 정렬. 마지막으로, 우리 정량 역전사 PCR (qRT-PCR)에 의해 유전자 표현 변경의 유효성 검사에 대 한 전략을 포함 했다. 이러한 프로토콜 zebrafish 태아 다양 한 실험 조건, 유전 돌연변이 또는 환경 조건 비교를 포함 하 여 대상에 적용 됩니다.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Commercial Reagents&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>TriZol</td><td>Thermo Scientific</td><td>15596026</td><td>lysis reagent</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Gibco</td><td>12604013</td><td>dissociation buffer 1</td></tr><tr><td>FACSMax</td><td>Genlantis</td><td>T200100</td><td>dissociation buffer 2</td></tr><tr><td>DEPC-treated water</td><td>Sigma</td><td>95284</td><td></td></tr><tr><td>FirstStrand cDNA conversion</td><td>Thermo Scientific</td><td>K1621</td><td>cDNA conversion kit</td></tr><tr><td>2X SYBR Green Master Mix</td><td>Roche</td><td>4707516001</td><td>qRT-PCR Master Mix</td></tr><tr><td>FACS buffer</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-105-9042</td><td></td></tr><tr><td>chloroform</td><td>Sigma Aldrich</td><td>288306</td><td></td></tr><tr><td>sodium acetate</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S2889</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Zebrafish Strains&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tuebingen</td><td>ZIRC</td><td>ZL57</td><td></td></tr><tr><td>ins2a:mCherry</td><td>ZIRC</td><td>ZL1483</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>40 micron cell strainer</td><td>Sigma</td><td>CLS431750</td><td></td></tr><tr><td>FACS tube</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>hemocytometer</td><td>Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>Dissecting Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Inverted Microscope</td><td>Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nanodrop</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Illumina HiSeq</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LightCycler 480</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set</td><td>Aquaneering</td><td>ZHCT100</td><td></td></tr><tr><td>FACS tube 5 mL polypropylene tube</td><td>BD Falcon</td><td>352063</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Name&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Company&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Catalog Number&lt;/strong&gt;</td><td>&lt;strong&gt;Comments&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Software&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Excel</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Consensus Path DB</td><td>http://cpdb.molgen.mpg.de/</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GO Enrichment Analysis</td><td>http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

sample preparation and analysis of rnaseq-based gene expression data from zebrafish

글로벌 진 식 변화의 분석 기본 관찰된 phenotypes 소설 경로 식별 하는 데 유용한 도구입니다. Zebrafish는 동물의 많은 수에서 RNA의 분리의 용이성으로 인해 전체 동물 또는 개별 세포 인구에서 전체 transcriptome의 신속한 평가 위한 훌륭한 모델입니다. 여기에서 zebrafish 태아 RNA 시퀀싱 (RNASeq)를 사용 하 여 글로벌 진 식 분석을 위한 프로토콜 제공 됩니다. 우리는 전체 배아 또는 유전자 변형 동물에서 정렬 셀을 사용 하 여 얻은 세포 인구에서 RNA의 준비를 설명 합니다. 또한 RNASeq 데이터 농축된 경로 및 글로벌 유전자 표현 데이터 세트에 유전자 존재론 (가십시오) 용어를의 분석에 대 한 접근 방식을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 유전자 식 변경 정량 역전사 PCR (qRT-PCR)를 사용 하 여 유효성 검사에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 이러한 프로토콜 사용할 수 있습니다 제어의 비교 분석 및 실험 세트 zebrafish의 소설 유전자 표현 변화를 식별 하 고 분자 통찰력의 고기를 제공 합니다.

차동 정렬 유전자 표현:
Zebrafish 모델의 Alström 증후군 및 Bardet Biedl 증후군 (게시판)의 애벌레 단계에서 차동 표현한 유전자를 식별 하기 위해 우리 중 alms1 타겟 또는 주입 bbs1 녹취 록 이전 스플라이스 차단 MOs로 검증 야생-타입 zebrafish 태아16,17. 5 일에서 포스트 수정 (dpf), 제 3 항에에서 설명 된 대로 RNA의 2 개의 복제 배아 제어 모, 주사 뿐만 아니라 각 조건에서 추출 되었다. 각 샘플에서 RNA의 깊이에 시퀀싱 했다 ~ 120 백만으로 읽습니다 ~ 107 백만 읽고 zebrafish 게놈에 정렬. 게놈의 exonic 영역에 매핑된 정렬된 읽기의 85-90% 사이
1,348 총 유전자 Alström 모델에서 크게 바뀌었다 고 471 총 유전자 게시판 모델에서 크게 바뀌었다. 모델 또는 모델 중 하나에 변경 사이 유전자 발현에서 공유 변경 섹션 4.2에 설명 된 대로 확인 되었다. 1,084 총 유전자 Alström 모델에서 유일 하 게 바뀌었다, 612 위로 472 다운 통제, 및 207 유전자 게시판 모델, 176 위로 및 아래로 31 (그림 2, 테이블 S1, s 2 테이블)에서 고유 하 게 바뀌었다. 264 유전자 두 모델에서 크게 바뀔 것을 발견 했다, 73 위로 182 아래로 통제 했다 그리고 9 식 (그림 2, 테이블 S1및 테이블 S2 (참조 두 모델 사이에서 반대로 변화를 보여준 추가 Tables.xlsx)). 두 모델 간의 차동 표현한 유전자의 어긋나는 숫자는 bbs1 및 alms1 개발에서 다른 단계 영향을 수 있습니다 것이 좋습니다.
흥미롭게도, Alström 모델에서 차동 표현한 유전자의 다 수는 alms1 역할 5 dpf 단계에서 개발에 중요 한 역할 유전자 변화 게시판 모델에 더 작은 수는 제안 하는 동안 의 제안 bbs1 이 시간 시점으로 눈에 띄는 되지 않을 수 있습니다. 반면, 2 dpf에 이전 transcriptomic 분석18역 제안 했다.
농축된 경로 및 Zebrafish 모델 Alström 증후군의 유전자 온톨로지의 결정:
더 명확 하 게 명료 하 게 하는 Alström 모델의 분자 프로 파일, 경로 및 유전자 온톨로지 차동 표현한 유전자에서 풍성 하 게 확인 되었다. 농축된 경로 ConsensusPathDB 쿼리하여 결정 했다 그리고 풍부한 유전자 온톨로지 섹션 4.3-4.5에 설명 된 대로 유전자 존재론 협회를 쿼리하여 결정 했다. Alström에서 위로 통제 하는 유전자 중 가장 높은 농축 모델, 유전자의 수에 의해 또는 배 농축, 분석 되었다. 31 총 경로 Alström 모델에서 최대 통제 했다. "대사"의 광범위 한 그룹, 이외에도 가장 높은 영향을 받는 경로 각각 32와 20 유전자 타고 난 및 적응형 면역 체계가 있었다 (그림 3A). 다운스트림 β-세포 수용 체 신호 또한 되었다 농축 면역 시스템 업 레 귤 레이 션이 모델에서을 제안 합니다. 여러 신호 경로 또한 기본 cilium 부전, (그림 3A) 셀의 주요 신호 센터 Alström 증후군의 협회와 Alström 모델에서 위로 유전자 중 농축 했다. 또한, 인슐린 분 비와 관련 된 3 개의 통로 위로 했다: 지방산 바인딩된 GPR40, 자유로운 지방산, 아 세 틸 콜린 (그림 3A). 이것은 Alström 환자에 높은 침투 인슐린 저항 및 유형 2 당뇨병 고기 일치 합니다. 6 이동 용어 등 적혈구 감 별 법, 적혈구 항상성, 골수성 세포 항상성, homeostatic 프로세스 (그림 3B) Alström 모델에서 위로 유전자 중 농축 했다. 위로 통로의 상호 평가를 모델 위로 경로 Alström의 통로 네트워크 생성 (그림 3C). 상호 연결 된 통로의 주요 노드 경로 및 신호, 보조 노드 중 하나가 공개 3 인슐린 규정 경로 간의 연결 하는 동안 면역 체계와 관련 된 사이 연결의 높은 학위를 밝혔다. 마지막으로, 어느 최대-또는 아래로 통제 되는 Alström 모델에 있던 5 유전자 대상의 평가 의해 RNASeq로 식별 유전자 식 변경 확인 합니다. QRT-PCR aste, gck, bmb, btr26, 및 ifi35, 제어, 기준에 의해 유전자 표현 변화의 방향을 RNASeq (그림 4A-B)에 의해 관찰 하는 지.

<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56187/56187fig1.jpg"> 
그림 1입니다. 코어 또는 공급 업체에서 제공 하는 RNASeq 후 유전자 표정 분석의 대표적인 출력. 기능 ID 합 유전자 ID 번호를 나타냅니다. 읽기 개수 읽기 제어 또는 그 유전자는 게놈에 정렬 실험 샘플의 수를 나타냅니다. 배 변화 및 배 변경의 로그 실험 사이 유전자의 표현에 변화의 정도 나타냅니다 및 제어에 샘플 실험 샘플 방향에 식에서 긍정적인 (증가) 또는 식에서 (감소)를 제외 실험 샘플 방향. P-값과 루즈벨트는 결과;의 의미를 확인 하기 위해 통계적 테스트 RNASeq 실험, 0.05의 더 엄격한 루즈벨트 값 의미를 결정 하기 위해 사용 됩니다. Gene_symbol NCBI 유전자 ID를 나타내고 gene_name 유전자의 전체 이름을 나열 합니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56187/56187fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56187/56187fig2.jpg"> 
그림 2입니다. 차동 게시판 및 Alström 모델에서 유전자 표현. 유전자 위로 (빨강) 또는 아래로 (노랑) alms1 모 (녹색) 주입 태아, bbs1 모 (오렌지) 주입 태아, 또는 표준 제어 모 주입 태아에 비해 둘 다의 수입니다. * 모두에서 변경 하지만 변경 식에 반대 하는 유전자의 수를 나타냅니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56187/56187fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56187/56187fig3.jpg"> 
Figure 3입니다. Upregulated 경로 그리고 Alström 모델에서 풍부한 이동 용어. (A) 유전자의 수에 의해 Upregulated 경로. (B) Upregulated가 배 농축에 의해 조건. (C) Alström 모델에서 upregulated 통로의 통로 연결. 최소 20%에 의해 결정 하는 통로 연결 경로 사이 유전자를 공유 하 고 2 유전자 중복. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56187/56187fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56187/56187fig4.jpg"> 
그림 4. qRT-PCR 유전자 식 변경의 유효성 검사. RNASeq로 식별 하는 유전자 발현에서 변화는 나이 및 치료 일치 5 dpf 배아, 제어, alms1, 또는 bbs1 모 (A) 하위 집합 qRT-PCR를 사용 하 여 유전자의 mRNA 표정 보여주는 유전자의 주입에서 확인 되었다. (B) 해당 데이터 읽기를 보여주는 RNASeq 데이터 집합에서 계산 합니다. 모든 데이터, 컨트롤에 상대적인 고 qRT-PCR 걸으로 표준화 되었다. aste, 소행성 체 1; gck, glucokinase; bmb, brambleberry; btr26, 피에 굶주린 관련 유전자 가족 회원 26; ifi35, 인터페론 유도 된 단백질 35 <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56187/56187fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석

이 프로토콜에서 zebrafish 태아, 애벌레, 전체 transcriptome 분석에 대 한 접근을 제공 하거나 셀을 정렬 합니다. 우리는 RNA의 격리, RNASeq 데이터의 통로 분석 및 유전자 표정 변화의 qRT-PCR 기반 유효성 검사를 포함합니다.

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

sample-preparation-analysis-rnaseq-based-gene-expression-data-from

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Genetics

10.8K 조회수.  University of Maryland School of Medicine. 이 프로토콜에서 zebrafish 태아, 애벌레, 전체 transcriptome 분석에 대 한 접근을 제공 하거나 셀을 정렬 합니다. 우리는 RNA의 격리, RNASeq 데이터의 통로 분석 및 유전자 표정 변화의 qRT-PCR 기반 유효성 검사를 포함합니다.

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Large-scale Zebrafish Embryonic Heart Dissection for Transcriptional Analysis

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the cardiac transcriptome from being masked by the global embryonic transcriptome, it is necessary to collect sufficient numbers of hearts for further analyses. Furthermore, as zebrafish cardiac development proceeds rapidly, heart collection and RNA extraction methods need to be quick in order to ensure homogeneity of the samples. Here, we present a rapid manual dissection protocol for collecting functional/beating hearts from zebrafish embryos. This is an essential prerequisite for subsequent cardiac-specific RNA extraction to determine cardiac-specific gene expression levels by transcriptome analyses, such as quantitative real-time polymerase chain reaction (RT-qPCR). The method is based on differential adhesive properties of the zebrafish embryonic heart compared with other tissues; this allows for the rapid physical separation of cardiac from extracardiac tissue by a combination of fluidic shear force disruption, stepwise filtration and manual collection of transgenic fluorescently labeled hearts.

To analyse cardiac gene expression profiles during zebrafish heart development, total RNA has to be extracted from isolated hearts. Here, we present a protocol for collecting functional/beating hearts by rapid manual dissection from zebrafish embryos to obtain cardiac-specific mRNA.

전사 분석을위한 대규모 Zebrafish의 배아 심장의 해부

The zebrafish embryonic heart is composed of only a few hundred cells, representing only a small fraction of the entire embryo. Therefore, to prevent the ...

연구

발생학

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

DNA 복제 타이밍 Zebrafish Vivo에서 모델 시스템으로 사용 하 여 프로 파일링

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

유전학

Isolation and Characterization of Single Cells from Zebrafish Embryos

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been described at the morphological level, little is known about the molecular basis of cellular changes that occur as the organism develops. With recent advancements in microfluidics and multiplexing technologies, it is now possible to characterize gene expression in single cells. This allows for investigation of heterogeneity between individual cells of specific cell populations to identify and classify cell subtypes, characterize intermediate states that occur during cell differentiation, and explore differential cellular responses to stimuli. This study describes a protocol to isolate viable, single cells from zebrafish embryos for high throughput multiplexing assays. This method may be rapidly applied to any zebrafish embryonic cell type with fluorescent markers. An extension of this method may also be used in combination with high throughput sequencing technologies to fully characterize the transcriptome of single cells. As proof of principle, the relative abundance of cardiac differentiation markers was assessed in isolated, single cells derived from nkx2.5 positive cardiac progenitors. By evaluation of gene expression at the single cell level and at a single time point, the data support a model in which cardiac progenitors coexist with differentiating progeny. The method and work flow described here is broadly applicable to the zebrafish research community, requiring only a labeled transgenic fish line and access to microfluidics technologies.

This protocol describes a method for isolating single cells from zebrafish embryos, enriching for cells of interest, capturing zebrafish cells in microfluidic based single cell multiplex systems, and assessing gene expression from single cells.

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

The zebrafish (Danio rerio) is a powerful model organism to study vertebrate development. Though many aspects of zebrafish embryonic development have been ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

유전자 발현 분석을위한 배아 Zebrafish 및 cDNA 합성에서 RNA 격리

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

생물학

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Zebrafish Oligonucleotide Microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

<meta charset="utf8"></head><body>CRISPR/Cas9 Knock-In을 사용한 제브라피시 유충의 형광 단백질 태깅

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in vivo imaging due to its transparency during the early developmental stage. Here, we provide a detailed protocol for performing high-efficiency fluorescence gene KI, rapid screening for KI founders, and low-abundance protein tracing in zebrafish larvae, which will lay a critical foundation for subsequent physio-pathological studies in zebrafish. The current protocol includes complete steps for the sgRNA design for the gene of interest, sgRNA in vitro transcription, Cas9 mRNA in vitro transcription, in vivo sgRNA screen for the one with the highest efficiency, donor plasmid design and construction, microinjection in zebrafish larvae, KI founder screen and zebrafish live imaging. Critical steps, troubleshooting tips, quality control methods, and advantages and applications of this protocol are included and discussed. This protocol assures quick and accurate results at a low cost and has been validated by multiple trials.

<meta charset="utf8"></head><body>제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

Here, we present a protocol to label proteins with a fluorescence protein tag in zebrafish larvae, a newly developed and modified in vivo system especially useful for visualizing low-abundance proteins in zebrafish.

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...

Single-Cell RNA 염기서열분석을 위한 Zebrafish 유충의 장세포 처리

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric neuromuscular disorders, highlighting the importance to understand the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction. In this study, we present a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization to obtain live,&#160;viable cells which can be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis. This protocol is based on the manual dissection of the zebrafish intestine, followed by enzymatic dissociation with papain. Subsequently, cells are submitted to fluorescence-activated cell sorting, and viable cells are collected for scRNA-seq. With this method, we were able to successfully identify different intestinal cell types, including epithelial, stromal, blood, muscle, and immune cells, as well as enteric neurons and glia. Therefore, we consider it to be a valuable resource for studying the composition of the GI tract in health and disease, using the zebrafish.

저자 스포트라이트: 위장 발달의 전사체학적 측면을 조사하기 위한 제브라피시 유충의 장 세포 분리 및 분석 

Here, we describe a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization, for single-cell RNA sequencing analysis.

샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석

요약

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전사 분석을위한 대규모 Zebrafish의 배아 심장의 해부

DNA 복제 타이밍 Zebrafish Vivo에서 모델 시스템으로 사용 하 여 프로 파일링

분리 및 Zebrafish의 배아에서 단일 세포의 특성

유전자 발현 분석을위한 배아 Zebrafish 및 cDNA 합성에서 RNA 격리

Zebrafish Oligonucleotide Microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

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초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

Single-cell RNA 염기서열분석을 위한 Zebrafish 유충의 장 분리