이 작업은 R01DK102001 (N.A.Z.), P30DK072488 (N.A.Z.), 및 T32DK098107에 의해 지원 되었다 (T.L.H. 및 J.E.N.).

아래에 설명 된 모든 동물 프로토콜 따라 고 메릴랜드 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)의 대학에 의해 승인.
 1. 배아 준비 <ol><li>자연 교배를 통해 배아를 생성 <ol><li>3 개월, 문화 배아 생식 성숙 5 , 8 .</li>
		<li>배아 컬렉션, 전에 저녁에 나누어 짝짓기 탱크에 원하는 긴장에서 성인 남성과 여성 물고기를 분리 하 고 각 탱크 2 남성 및 여성 3 추가. 
		참고: 유전자 변형 insulin2a:mCherry 형광 기자 긴장의 사용 허용 췌 장 β-세포의 분석.</li>
		<li>전송 물고기 짝짓기를 신선한 시스템 물 탱크 및 다음 아침에와 서 불 후에 즉시 구분선 제거.</li>
		<li>배아 하단 탱크에서 관찰 된다 때까지 자연스럽 게 짝을 물고기 허용. 원하는 금액을 수집 될 때까지 30 분 간격으로 배아를 수집 합니다. 각 저장소 수집 시간 포인트에서 28.5 배아 미디어에서 별도 접시에 ° c.</li>
		<li>바란다면, 실험적인 문화 미디어 6, 유전 물질 또는 배치의 microinjection를 수행 하 고 신선한 행 크에 배아를 문화 &#39; s 배아 중간 8 28.5 ° c.에 10 cm 배양 접시에 참고: morpholino (MO) 주입 또는 돌연변이 동물 유전자 표정 분석, 참고 각 조작 유전자 발현에 부수적 영향을 미칠 수 있습니다. 뮤턴트 전사 모 기반 유전자 9를 대상으로 관찰 되지 않는 수준에서 유전자 보상을 전시할 수 있다.</li>
	</ol></li> <li>단계 배아 <ol><li>배아의 그룹에서 문화 50 &#8211; 75 배아 모든 배아의 일관 된 발달 타이밍 홍보 10 cm 배양 접시 당.</li>
		<li>모니터링 발달 형태를 사용 하 여 해 현미경 blastomere, epiboly, 및 somite 단계에서 발달 진행 10. 
		참고: 제거 접시에 발달 지연을 방지 하기 위해 모든 죽어가는 또는 잘못 된 배아.</li>
		<li>배아 발달 연령에 따라 구분 합니다. 약 24까지 세분화 (포스트 gastrulation, 10.33 h 게시물 수정 (hpf)) 후 somite 번호를 사용 하 여 태아 나이 측정 hpf. 배아와 24 후 몸 전체 길이 사용 하 여 애벌레 hpf. 
		참고:는 somites는 태아의 등 쪽 부분에 쉐 브 론 모양의 mesodermal 조직.</li>
		<li>28.5 ° C 인큐베이터에 정렬 된 배아를 놓고 원하는 시대에 진행에 개발을 허용.</li>
	</ol></li></ol> 2. 단일 셀 분리: 모든 배아 및 정렬 셀 인구 <ol><li>전체 태아 분리 <ol><li>운동 관찰 될 때까지 5-15 분 동안 얼음에 페 트리 접시를 배치 하 여 원하는 단계에서 zebrafish 태아 안락사 .</li>
		<li>레이블이 1.5 mL microcentrifuge 튜브 수영장 20 배아 전송. Microcentrifuge 튜브에서 초과 배아 미디어를 제거.</li>
		<li>추가 200 µ L 세포 시 약 (재료의 표 참조) 배아를 포함 하는 관에. 기계적으로 방 앗 공이 사용 하 여 세포 시 약에 배아 균질 1 ml 전체 볼륨을가지고 800 µ L 세포 시 약을 추가 합니다. RNA 추출까지-80 ° C에서 저장소.</li>
	</ol></li> <li>흐름 정렬 셀 격리 11 <ol><li>1.5 mL microcentrifuge 튜브로 페 트리 접시에서 배아를 전송 하 고 가능한 많은 배아 매체 제거. 
		참고: 배아 나이 따라 기계적 분리도 필요할 수 있습니다이 단계에서. 배아와 &#62; 48 hpf, 좋습니다 계속 하기 전에 배아 무결성을 방해 하는 유 봉 사용.</li>
		<li>분리 버퍼 1의 1 mL와 함께 태아를 품 어 (재료의 표 참조) 1.5 mL microcentrifuge 관에서. 실 온에서 15-30 분 동안 품 어. 부드럽게 인큐베이션 단계 마다 3-4 분 섞어 P1000 팁을 사용 하 여 위아래로 pipetting으로 솔루션을 triturate. 와 동 하지 마십시오.</li>
		<li>X 300g에 3 분 동안 원심 분리 하 여 배아를 수집 하 고는 상쾌한 제거. 다시 1 mL 분리 버퍼 2 (재료의 표 참조)에 태아를 일시 중단 합니다. 일반 피펫으로 분쇄와 실 온에서 15-30 분 동안 품 어.</li>
		<li>현미경 (FACS) 버퍼를 정렬 하는 형광 활성화 셀에서 서 스 펜 션의 1-2 µ L를 diluting 하 여 소화를 평가. 
		참고: 완전 한 소화 시험된 약 수 최소 셀 클러스터 및 배아 조직의 조각으로 단일 셀 때 발생 했습니다.</li>
		<li>5 분 제거 상쾌한에 대 한 300 x g에서 원심 분리 하 여 세포를 수집합니다. 다시 1 mL FACS 버퍼, 그리고 중력 필터에 소화 되지 않은 조직 샘플에서 제거 하려면 40 µ m 셀 스 트레이너를 통해 셀을 중단.</li>
		<li>는 hemocytometer를 사용 하 여 셀의 개수 및 FACS 버퍼 약 1 x 10 6 셀/mL FACS 튜브에서를 희석. 
		참고: 셀 배아 (5% 미만 총의), 췌 장 β-세포 등 당 상대적으로 작은 수를 사용 하 여 1000 단계 일치 하는 배아의 최소.</li>
		<li>FACS 정렬 FACS 관 세포 시 약 또는 FACS 버퍼만 포함 된 뿐만 아니라 FACS 튜브 셀 서 스 펜 션의 1 mL를 포함 하는 시설을 제공 합니다. 형광 기자를 나타내는 단일 셀만 수집 FACS 흐름 정렬 게이트.</li>
		<li>FACS 흐름 정렬 원하는 셀 번호가 수집 될 때까지 수행. 
		참고: RNASeq를 수행 하려면 저기는 최소한 총 RNA. 우리 3000-5000 셀 충분 한 높은-품질, 고 농도 RNA를 분리 하는 것으로 나타났습니다.</li>
		<li>얼음에 수집 된 세포를 저장 하 고 즉시 RNA 준비 진행.</li>
	</ol></li></ol> 3. RNA 준비 <ol><li>RNA 추출 <ol><li>세포 시 약 실 온에서 5 분으로 (2 단계)에서 수집 된 샘플을 품 어.</li>
		<li>추가 세포 시 약의 각 1.0 ml 클로 프롬의 0.2 mL 사용 하 고 실 온에서 2-3 분 15 미 품에 대 한 손으로 튜브를 반전. 4에서 15 분 동안 12000 x g에서 샘플을 원심 ° c.</li>
		<li>신선한 튜브를 분리, 수성 단계를 전송 하 고 세포 시 약 사용의 각 1.0 ml 소 프로 파 놀의 0.5 mL를 추가 합니다. 실 온에서 10 분 동안 품 어. 4에서 10 분 동안 12000 x g에서 샘플을 원심 ° c.</li>
		<li>75% 에탄올 세척 및 4에 5 분 동안 7500 x g에서 샘플을 원심 ° c.는 상쾌한을 완전히 제거 하 고 실 온에서 건조 공기를 허용. 다시 15-30 µ L diethyl pyrocarbonate (DEPC)에서 RNA를 중단-물 처리.</li>
	</ol></li> <li>Purify 높은-품질 RNA <ol><li>1/10 볼륨 3 M 나트륨 아세테이트 (pH 5.5) RNA 서 스 펜 션 결합 및 소 프로 파 놀의 1 볼륨. 실 온에서 20 분 동안 품 어와 4에서 10 분 동안 12500 x g에서 샘플을 원심 ° c.</li>
		<li>DEPC 처리 물에 얼음 처럼 차가운 70% 에탄올과 펠 릿을 세척 하 고 4 시 5 분에 대 한 10000 x g에서 샘플을 원심 ° C. 반복 세척 단계를 한 번.</li>
		<li>는 상쾌한을 제거 하 고 실 온에서 건조를 허용. DEPC 처리 물에 다시 중단.</li>
		<li>농도 (ng / µ L) 및 순도 (260/230 비율)는 흡수 분 광 계를 사용 하 여 추출 된 RNA 분석 결과. 260/230 값 인지 확인 ~ 2.0 RNASeq와 함께 진행 하기 전에. 우리까지-80 ° C에서 저장e (최대 6 개월).</li>
		<li>RNA 샘플 공급 업체 또는 코어에 RNASeq에 대 한 보내고 유전자 발현 분석 읽기 시퀀싱의 정량화에 따라 변경 하십시오. 공급 업체에서 반환 되는 결과 일반적으로 샘플 사이 대 본 읽기에 중요 한 배 변화를 전시 하는 유전자의 목록으로 제공. 
		참고: 위의 방법 품질 RNA를 생성 하는 경우 열 사용할 수 있습니다. 금액, 농도, 및 RNA 무결성 번호 (린) RNA 샘플에 대 한 코어를 확인 한다. 공급 업체 또는 코어 린 평가 또한 일반적으로 것입니다.</li>
	</ol></li></ol> 4. 통로 이동 기간 분석 참고: 코어 또는 공급 업체에서 제공 하는 RNASeq 후 그림 1 유전자 표정 분석의 대표적인 출력을 참조 하십시오.
스프레드시트 관리 소프트웨어에서 <ol><li><ol><ol><li>오픈 컨트롤에 대 한 실험 조건 비교 <li>정렬 차동 유전자 표현 데이터 (결과) (참조 자료 테이블 ).</li>
			<li>선택 드롭-다운 화살표 옆에 &#39; 정렬 &#39; 단추 및 선택 &#34; 사용자 정의 정렬 &#34; 제어 조건 대 실험에서 차동 표현한 유전자를 포함 하는 스프레드시트 내에서.</li>
			<li>선택 아래에 있는 상자 &#39; 열 &#39; 팝업 창에서 고 기준으로 정렬 하려면 선택 합니다 &#39; LFC &#39; 열. 확인 &#39; 값 &#39;에서 선택은 &#39;에 정렬 &#39; 열. 정렬 선택 &#39; 내림차순 오름차순 &#39;에 &#39; 순서 &#39; 열과 클릭 &#34; 확인 &#34;. 
			참고:이 정렬 됩니다 차동 표현한 유전자는 그 감소 식 (부정적인 LFC) 목록 하단에 나타납니다 동안 증가 식 (긍정적인 LFC)와 그 목록의 상단에 나타납니다.</li>
		</ol></li> <li>다음과 같이 단일 컨트롤에 여러 실험 조건 비교.
		<li>선택 <ol>차동 결정 제어 스프레드시트 대 실험 1에 빈 열에서 첫 번째 셀 두 실험 조건에서 발견 하는 유전자 표현. 셀에 다음 수식을 입력: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56187/56187eq1.jpg" /> 참고:이 식은 if, ISERROR, 조합 및 일치 기능. (i) MATCH 함수를 일치 (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0), a 1에 값에 대 한 보이는 것입니다 (합 ID) Experimental2_vs_Control 라는 스프레드시트의 A 열 (A:A)에서 (Experimental2_vs_Control!). &#34; 0 &#34;, 정확 하 게 일치 찾아가 정확히 일치 하는 경우 함수 값을 반환 합니다 &#34; 1 &#34;, 일치 하는 것이 없는 경우 함수는 오류를 반환 합니다 &#34; n / &#34;. (ii) 일치 함수의 결과 다음 ISERROR 함수, ISERROR (일치 (A1, Experimental2_vs_Control로 입력! A:A, 0)), 어디에, 입력이 &#34; 1 &#34; 반환 됩니다 발견 일치 하는 항목을 나타내는 &#34; FALSE &#34;, 그리고 입력이 &#34; n / &#34; 나타내는 일치 하는 찾을 수 없습니다, 그것은 반환 됩니다 &#34; 진정한 &#34;. (iii)는 &#34; 진정한 &#34; 또는 &#34; FALSE &#34; 결과 다음 IF 함수에 입력 하는 경우 (ISERROR (일치 (A1, Experimental2_vs_Control! A:A, 0)), &#34; &#34;, &#34; 중복 &#34;), 어디에, 입력이 &#34; 진정한 &#34; 나타내는 일치 하는 항목을 찾을 수 없습니다, 그것은 첫 번째 집합 따옴표의 사이 값을 반환 합니다 (&#34; &#34;)는 빈, 그리고 따라서 해당 셀이 비어 있을 것입니다. 입력이 &#34; FALSE &#34; 발견 일치 하는 항목을 나타내는, 그것의 따옴표 두 번째 집합의 중간 값을 반환 합니다 (&#34; 중복 &#34;), 그리고 셀 말할 것 이다 &#34; 중복 &#34;.</li>
			<li>기자 &#34; 입력 &#34; 또는 &#34; 반환 &#34; 방정식을 실행. 방정식에 포함 된 셀을 선택 하 고 셀의 오른쪽 하단 모서리에 있는 상자를 클릭 합니다. 마우스 클릭을 유지 하 고 마지막까지 열 아래로 선택된 영역을 끌어 &#39; 기능 ID &#39;, 열에 있는 각 셀에 수식 복사.</li>
			<li>선택 &#34; 사용자 정의 정렬 &#34; 다시 클릭 하 여 정렬의 두 번째 수준 추가 &#34; + &#34; 왼쪽된 하단 모서리에 아이콘. 첫 번째 레벨에서 &#34;으로 정렬 &#34;, 열 선택에서 &#34; 중복 &#34;, 정렬에 선택에서 &#39; 값 &#39;, 주문 선택 아래 &#39; a Z &#39;. 두 번째 레벨에서 &#34;에 의해 다음 &#34;, 열 선택에서 &#39; LFC &#39;, 선택 정렬에에서 &#39; 값 &#39;, 주문 선택 아래 &#39; 내림차순 오름차순 &#39; 선택 &#34; 확인 &#34;. 
			참고:이 식 변경의 방향에 따라 4 그룹으로 유전자 목록이 정렬 됩니다. 식에서 변화 같은 방향 또는 반대 방향에서 둘 다에 되도록 두 실험 조건에서 발견 하는 유전자를 확인 하는 것이 중요 하다.</li>
			<li>절차 또는 결과 데이터베이스에서 발견 되지 것입니다 하기 전에 유전자 기호 열에서 모든 괄호를 제거 합니다. 유전자 기호를 포함 하는 전체 열을 선택 합니다. 선택 &#34; 편집 &#34; 다음 &#34; 대체 &#34; 드롭-다운에서 &#39; 파일 &#39; 메뉴. 유형 &#34; (*) &#34;에 &#34; 찾을 내용: &#34; 바꾸기 창과 휴가의 바는 &#34; 바꿉니다: &#34; 빈 바. 선택 &#39; 모두 &#39; 괄호의 모든 인스턴스를 제거 하려면. 
			참고:는 * 임의 개수의 문자, 프로그램은 강조 표시 된 셀에서 모든 인스턴스를 찾을 것인지 묻는 메시지가 두 괄호 및 괄호의 모든 인스턴스 사이이 문자를 배치 하 여 아무것도, 그로 인하여 그들을 제거 교체 될 것 이다 나타냅니다.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>결정 농축 경로 <ol><li>복사 클립보드에 농축된 경로 결정 하는 한 세트의 유전자 기호 소원. ConsensusPathDB 12로 이동 합니다. 선택 &#34; 유전자 분석 설정 &#34; 다음 웹 페이지의 왼쪽된 사이드바에서 &#34; 이상의 표현 분석 &#34;.</li>
		<li>에 유전자의 목록을 붙여 넣습니다는 &#34; 유전자/단백질 식별자의 목록을 붙여 넣습니다 &#34; 상자. 선택 유전자 기호는 &#34; 유전자/단백질 식별자 형식 &#34; 상자와 클릭 &#34; 진행 &#34;. 옆에 있는 상자를 선택 &#34; 경로 경로 데이터베이스에 정의 된 대로 &#34; 통로-기반 설정 섹션. 
		참고: 다양 한 분석에 대 한 옵션 검색 가능한 데이터베이스의 목록을 포함 하 여 표시 됩니다. 그들은 가장 설립 하 고 포괄적인 드 Kegg 및 Reactome 데이터베이스를 제외한 모든 데이터베이스를 선택 하는 것이 좋습니다. 입력 목록 및 p-값 컷오프 설정 최소 중복 또한 필요에 따라 조정할 수 있다. 이러한 설정은 기본 2 유전자 최소 중복 및 0.01 p-값 구분에서 떠나는 것이 좋습니다.</li>
		<li>선택 &#34; 찾을 풍부한 세트 &#34; 입력된 목록에서 유전자를 포함 하는 경로 목록을 가져올 수. 
		참고: 출력 다음 각 통로의 이름을 포함 하는 표 형식에 있을 것입니다 &#34; 크기 설정 &#34; (통로에서 전체 유전자의 수를 나타내는), &#34; 후보자 포함 된 &#34; (그 경로에 있는 입력된 목록에 있는 유전자의 수를 나타내는 ), p-값 및 q 값 (루즈벨트), 및 통로 식별 되.</li>
	</ol></li> <li>통로 네트워크의 세대 <ol><li>농축된 경로 위에서 설명한 대로 결정.</li>
		<li>모든 수를 경로 이름 옆에 있는 각 상자를 선택 하 여 또는 클릭 하 여 경로 네트워크에 시각화 하 농축된 경로 선택 &#34; 모든 &#34; 아래 &#34; 선택 &#34; 선택 상자 위에 열 머리글에서 다음 선택 &#34; 시각화 선택 된 세트 &#34;. 
		참고: 좋습니다 미만 30; 있다면 모든 경로 시각화 30 경로 보다 큰 경우 (입력된 목록에서 유전자의 많은 수를 포함 하는 그들) 최고 30 가장 풍부한 경로 선택 하면 것이 좋습니다.</li>
		<li>조정은 &#34; 상대 오버랩 &#34; 및 &#34; 공유 후보 &#34; desir 페이지의 위쪽 가운데의 중 상자를 선택 하 고 입력 필터,에 드 % 상대 겹치거나 통로 네트워크, 명확 하 고 선택에서 더 많은 관련 있도록 더 엄격한 것 공유 후보자의 수 겹치는 &#34; 적용 &#34;. 
		참고: 좋습니다 0.2, 최소 상대 중복을 연결, 2 경로와 2 공유 후보자의 최소 20% 유전자 중복을 나타내는. 그래프 범례 페이지의 왼쪽 상단에 있는 그래프 범례를 클릭 하 여 볼 수 있습니다.</li>
	</ol></li> <li>농축 이동 용어의 결정 <ol><li>하나 클립보드에 풍부한 유전자 온톨로지를 결정 하고자 하는 그룹의 유전자 기호를 복사. 이동 하는 &#39;가 농축 분석 도구 &#39; 유전자 존재론 협회 13에. 유전자 기호 목록 아래에 있는 페이지의 왼쪽에 있는 상자에 붙여 &#34; 여기 당신의 유전자 Id &#8230; &#34;</li> <li>유전자 Id 상자 아래에 나열 됩니다를 사용 하려면 이동 용어 집합 선택: 생물 학적 과정, 분자 또는 세포 구성 요소. (권장) 선택 &#39; 생물 학적 과정 &#39;. 선택 &#39; Danio rerio &#39; 이동 아래 조건 상자와 클릭 &#34; 제출 &#34;. 
		참고: 사용 하 여 좋습니다 0.05의 기본 p-값 컷오프.</li>
	</ol></li></ol> 5. QRT-PCR 확인 참고: RNASeq에 중요 한 유전자 식 변경으로 확인 된 개별 유전자 복제 실험에서 대상된 qRT-PCR에 의해 확인 되어야 한다.
<ol><li>cDNA 합성 <ol><li>섹션 3.1에 설명 된 방법을 사용 하 여 태아에서 RNA를 추출 합니다. RNA 추출.</li>
		<li>CDNA cDNA 변환을 사용 하 게 RNA의 변환 1 µ g 키트 (재료의 표 참조). RNA, dNTPs, 역전사 효소를 결합. 제조 업체에 따르면 thermocycler 반응 수행 &#39; s 사양.</li>
		<li>는 CDNA DEPC 처리 물에 1:3 희석. 1-2 개월까지 4 ° C에서 저장소.</li>
	</ol></li> <li>qRT-PCR 확인 <ol><li>유전자 RNA 시퀀싱 결과에서 qRT-PCR에 의해 확인를 선택 합니다. 식에 높은 배 변화 유전자를 식별 합니다. 또한 높은 읽기 수를 포함 하는 하는이 유전자의 결정이 풍부한 식 나타냅니다.</li>
		<li>높은 배 변화, 유전자의 높은 읽기 수 목록에서에서 10-12 목표를 선택합니다. 적어도 1 intron-엑손 경계에 걸쳐 있는 대상 유전자를 증폭 하는 뇌관 디자인.</li>
		<li>정량 Pcr 뇌관 디자인 사이트 14에 유전자 또는 유전자의 대상된 영역을 입력합니다. 선택은 &#34; 2 정량 Pcr 뇌관 디자인 &#34; 및 뇌관 세트를 만드는 사이트. 
		참고: 샘플 사이의 비교를 정상화 하 내부 제어 뇌관, β-걸, 등을 포함 해야 합니다. Β-말라 뇌관은 f: 5 &#39;-TCGAGCTGTCTTCCCATCCA-3 &#39; r: 5 &#39;-TCACCAACGTAGCTGTCTTTCTG-3 &#39;.</li>
		<li>는 CDNA, 앞으로 뇌관, 역방향 뇌관, 및 중 합 효소 결합. QRT-PCR 증폭 유전자 15의 상대 식을 결정 하려면 수행.</li>
		<li>상대 부 량 결정 15 관심사의 유전자의 상대적 mRNA 표정 분석.</li>
		<li>QRT-PCR RNASeq 차동 식의 방향을 일치 하는지 확인 결과를 비교.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+effects+on+beta-cell+mass+by+disruption+of+Bardet-Biedl+syndrome+or+Alstrom+syndrome+genes.">Differential effects on beta-cell mass by disruption of Bardet-Biedl syndrome or Alstrom syndrome genes.</a> Hum Mol Genet. 25 (1), 57-68 (2016).</li><li>Hostelley, T. L., Lodh, S., Zaghloul, N. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+organism+transcriptome+analysis+of+zebrafish+models+of+Bardet-Biedl+Syndrome+and+Alstrom+Syndrome+provides+mechanistic+insight+into+shared+and+divergent+phenotypes.">Whole organism transcriptome analysis of zebrafish models of Bardet-Biedl Syndrome and Alstrom Syndrome provides mechanistic insight into shared and divergent phenotypes.</a> BMC Genomics. 17, 318 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

이 프로토콜에서 설명 하는 접근의 전체 또는 특정 정렬된 셀 인구 transcriptome 수준 분석에 대 한 상대적으로 신속 하 고 비용 효과적인 전략을 제공 합니다. Zebrafish는 편리 함과 소재, 유전 구현의 용이성 또는 환경 실험 조건, 및 큰의 가용성을 시작 하는 많은 양의 생성 속도 때문에 연구의이 유형에 대 한 유리한 모델을 제공 합니다. 셀 형 구체적이 고 조직 특정 인구의 격리를 허용 하는 유전자 ...

글로벌 유전자 발현의 비교 분석 관찰된 고기에 기여 하는 새로운 유전자를 식별 하는 중요 한 도구입니다. 이러한 분석 일반적으로 사본 풍부 실험 사이 비교의 양적 평가에 의존 및 샘플을 제어. QRT-PCR 등 타겟된 방법을 상대적으로 신속 하 고 정확한 단일 유전자 식 변경의 조사에 대 한 있습니다. RNA 시퀀싱 (RNASeq) 샘플, 그건 지금 그런 수사에 대 한 표준 실험 시스템 사이의 유전자 발현에 중요 한 변화를 식별 하는 광범위 한, 가설-무료 접근을 제공 합니다.
Zebrafish는 많은 질병 분야에 걸쳐 눈에 띄는 모델로 떠오르고 있다. 원래 발달 생물학 연구, 그들의 높은 통치 및 유지 보수, 상대적으로 낮은 비용 때문에 그들의 유틸리티에 대 한 개발 zebrafish의 실험적인 사용 진화 했다 다양 한로 서 뿐만 아니라 성인 단계 배아에서 고기를 포함 한 다양 한 분자의1,2,3분석 실험. 사실, 이러한 장점을 분자 기계 연구 급속 한 만들고 많은 양의 자료를 습득의 용이성 때문에 비용 효율적인 생활의 모든 단계에서 유전과 환경 조작의 용이성과 결합. 또한, zebrafish 태아 그리고 애벌레의 투명 한 자연 세포-조직-특정 유전자 변형 기자 라인 개별 셀 인구4의 비보에 시각화 수 있도록 생성에 대 한 이상적인 게. 같은 라인의 착취 리포터 유전자 발현에 따라 특정 격리 된 세포 유형에서 글로벌 유전자 표정 분석을 허용 합니다.
여기 선물이 zebrafish 태아의 문화 후 RNASeq를 사용 하 여 글로벌 유전자 표정 분석에 대 한 포괄적인 프로토콜. Morpholino (모)를 포함 하 여 유전 실험 조작-기반된 변이 유전자 최저 또는 CRISPR 중재 게놈 편집, 제시 된 다른5,,67. 우리는 따라서 전체 배아에서 RNA의 격리에 대 한 자세한 프로토콜에 초점 또는 경로 도구와 유전자 존재론 (가십시오) 용어를 사용 하 여 RNASeq 결과의 간단한 계산 분석 뒤 유전자 변형 기자 표현 셀 정렬. 마지막으로, 우리 정량 역전사 PCR (qRT-PCR)에 의해 유전자 표현 변경의 유효성 검사에 대 한 전략을 포함 했다. 이러한 프로토콜 zebrafish 태아 다양 한 실험 조건, 유전 돌연변이 또는 환경 조건 비교를 포함 하 여 대상에 적용 됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Commercial Reagents</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TriZol</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>15596026</td>
			<td>lysis reagent</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TrypLE</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>12604013</td>
			<td>dissociation buffer 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSMax</td>
			<td>Genlantis</td>
			<td>T200100</td>
			<td>dissociation buffer 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DEPC-treated water</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>95284</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FirstStrand cDNA conversion</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>K1621</td>
			<td>cDNA conversion kit</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>2X SYBR Green Master Mix</td>
			<td>Roche</td>
			<td>4707516001</td>
			<td>qRT-PCR Master Mix</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS buffer</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>50-105-9042</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>chloroform</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>288306</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>sodium acetate</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S2889</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Zebrafish Strains</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tuebingen</td>
			<td>ZIRC</td>
			<td>ZL57</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ins2a:mCherry</td>
			<td>ZIRC</td>
			<td>ZL1483</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Equipment</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40 micron cell strainer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>CLS431750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>hemocytometer</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z359629</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissecting Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Inverted Microscope</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nanodrop</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Illumina HiSeq</td>
			<td>Illumina</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LightCycler 480</td>
			<td>Roche</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mating tanks 1.0L Crossing Tank Set</td>
			<td>Aquaneering</td>
			<td>ZHCT100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACS tube 5 mL polypropylene tube</td>
			<td>BD Falcon</td>
			<td>352063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Software</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Consensus Path DB</td>
			<td>http://cpdb.molgen.mpg.de/</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GO Enrichment Analysis</td>
			<td colspan="2">http://geneontology.org/page/go-enrichment-analysis</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sample preparation and analysis of rnaseq-based gene expression data from zebrafish

글로벌 진 식 변화의 분석 기본 관찰된 phenotypes 소설 경로 식별 하는 데 유용한 도구입니다. Zebrafish는 동물의 많은 수에서 RNA의 분리의 용이성으로 인해 전체 동물 또는 개별 세포 인구에서 전체 transcriptome의 신속한 평가 위한 훌륭한 모델입니다. 여기에서 zebrafish 태아 RNA 시퀀싱 (RNASeq)를 사용 하 여 글로벌 진 식 분석을 위한 프로토콜 제공 됩니다. 우리는 전체 배아 또는 유전자 변형 동물에서 정렬 셀을 사용 하 여 얻은 세포 인구에서 RNA의 준비를 설명 합니다. 또한 RNASeq 데이터 농축된 경로 및 글로벌 유전자 표현 데이터 세트에 유전자 존재론 (가십시오) 용어를의 분석에 대 한 접근 방식을 설명 합니다. 마지막으로, 우리는 유전자 식 변경 정량 역전사 PCR (qRT-PCR)를 사용 하 여 유효성 검사에 대 한 프로토콜을 제공 합니다. 이러한 프로토콜 사용할 수 있습니다 제어의 비교 분석 및 실험 세트 zebrafish의 소설 유전자 표현 변화를 식별 하 고 분자 통찰력의 고기를 제공 합니다.

차동 정렬 유전자 표현:
Zebrafish 모델의 Alström 증후군 및 Bardet Biedl 증후군 (게시판)의 애벌레 단계에서 차동 표현한 유전자를 식별 하기 위해 우리 중 alms1 타겟 또는 주입 bbs1 녹취 록 이전 스플라이스 차단 MOs로 검증 야생-타입 zebrafish 태아16,17. 5 일에서 포스트 수정 (dpf), ...

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Sample Preparation and Analysis of RNASeq-based Gene Expression Data from Zebrafish

샘플 준비 및 제 브라에서 RNASeq 기반 유전자 표현 데이터의 분석

이 프로토콜에서 zebrafish 태아, 애벌레, 전체 transcriptome 분석에 대 한 접근을 제공 하거나 셀을 정렬 합니다. 우리는 RNA의 격리, RNASeq 데이터의 통로 분석 및 유전자 표정 변화의 qRT-PCR 기반 유효성 검사를 포함합니다.

The analysis of global gene expression changes is a valuable tool for identifying novel pathways underlying observed phenotypes. The zebrafish is an ...

sample-preparation-analysis-rnaseq-based-gene-expression-data-from

Research

JoVE Journal

Genetics

10.7K 조회수.  University of Maryland School of Medicine. 이 프로토콜에서 zebrafish 태아, 애벌레, 전체 transcriptome 분석에 대 한 접근을 제공 하거나 셀을 정렬 합니다. 우리는 RNA의 격리, RNASeq 데이터의 통로 분석 및 유전자 표정 변화의 qRT-PCR 기반 유효성 검사를 포함합니다.

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Parallel Measurement of Circadian Clock Gene Expression and Hormone Secretion in Human Primary Cell Cultures

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental changes. Considerable progress in our understanding of the tight connection between the circadian clock and most aspects of physiology has been made in the field over the last decade. However, unraveling the molecular basis that underlies the function of the circadian oscillator in humans stays of highest technical challenge. Here, we provide a detailed description of an experimental approach for long-term (2-5 days) bioluminescence recording and outflow medium collection in cultured human primary cells. For this purpose, we have transduced primary cells with a lentiviral luciferase reporter that is under control of a core clock gene promoter, which allows for the parallel assessment of hormone secretion and circadian bioluminescence. Furthermore, we describe the conditions for disrupting the circadian clock in primary human cells by transfecting siRNA targeting CLOCK. Our results on the circadian regulation of insulin secretion by human pancreatic islets, and myokine secretion by human skeletal muscle cells, are presented here to illustrate the application of this methodology. These settings can be used to study the molecular makeup of human peripheral clocks and to analyze their functional impact on primary cells under physiological or pathophysiological conditions.

Here, we describe settings to monitor in parallel circadian bioluminescence and the secretory activity of human islet cells and primary myotubes. For this, we employed lentiviral gene delivery of a luciferase core clock reporter, followed by in vitro synchronization and collection of outflow medium by continuous cell perifusion.

인간의 기본 세포 배양의 일주기 시계 유전자 발현 및 호르몬 분비의 병렬 측정

Circadian clocks are functional in all light-sensitive organisms, allowing for an adaptation to the external world by anticipating daily environmental ...

연구

유전학

Single-cell Gene Expression Profiling Using FACS and qPCR with Internal Standards

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those populations. Single-cell gene expression measurements can help assess the role of noise in gene expression, identify correlations in the expression of pairs of genes, and reveal subpopulations of cells that respond differently to a stimulus. Here, we describe a procedure to measure the expression of up to 96 genes in single mammalian cells isolated from a population growing in tissue culture. Cells are sorted into lysis buffer by fluorescence-activated cell sorting (FACS), and the mRNA species of interest are reverse-transcribed and amplified. Gene expression is then measured using a microfluidic real-time PCR machine, which performs up to 96 qPCR assays on up to 96 samples at a time. We also describe the generation and use of PCR amplicon standards to enable the estimation of the absolute number of each transcript. Compared with other methods of measuring gene expression in single cells, this approach allows for the quantification of more distinct transcripts than RNA FISH at a lower cost than RNA-Seq.

We describe a method to sort single mammalian cells and to quantify the expression of up to 96 target genes of interest in each cell. This method includes the use of internal qPCR standards to enable the estimation of absolute transcript counts.

내부 기준에 FACS 및 qPCR에 사용 단일 세포 유전자 발현 프로파일 링

Gene expression measurements from bulk populations of cells can obscure the considerable transcriptomic variation of individual cells within those ...

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such as cancer. Cell cycle-regulated gene expression analysis depends on cell synchronization into specific phases. Here we describe a method utilizing two complementary synchronization protocols that is commonly used for studying periodic variation of gene expression during the cell cycle. Both procedures are based on transiently blocking the cell cycle in one defined point. The synchronization protocol by hydroxyurea (HU) treatment leads to cellular arrest in late G1/early S phase, and release from HU-mediated arrest provides a cellular population uniformly progressing through S and G2/M. The synchronization protocol by thymidine and nocodazole (Thy-Noc) treatment blocks cells in early mitosis, and release from Thy-Noc mediated arrest provides a synchronized cellular population suitable for G1 phase and S phase-entry studies. Application of both procedures requires monitoring of the cell cycle distribution profiles, which is typically performed after propidium iodide (PI) staining of the cells and flow cytometry-mediated analysis of DNA content. We show that the combined use of two synchronization protocols is a robust approach to clearly determine the transcriptional profiles of genes that are differentially regulated in the cell cycle (i.e. E2F1 and E2F7), and consequently to have a better understanding of their role in cell cycle processes. Furthermore, we show that this approach is useful for the study of mechanisms underlying drug-based therapies (i.e. mitomycin C, an anticancer agent), because it allows to discriminate genes that are responsive to the genotoxic agent from those solely affected by cell cycle perturbations imposed by the agent.

We report two cell synchronization protocols that provide a context for studying events related to specific phases of the cell cycle. We show that this approach is useful for analyzing the regulation of specific genes in an unperturbed cell cycle or upon exposure to agents affecting the cell cycle.

두 개의 상보적인 세포 동기화 프로토콜에 의한 세포주기 조절 유전자 발굴 연구

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

Bidirectional Retroviral Integration Site PCR Methodology and Quantitative Data Analysis Workflow

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral gene therapy studies, IS assays, in combination with next-generation sequencing, have been used as a cell-tracking tool to characterize clonal stem cell populations sharing the same IS. For the accurate comparison of repopulating stem cell clones within and across different samples, the detection sensitivity, data reproducibility, and high-throughput capacity of the assay are among the most important assay qualities. This work provides a detailed protocol and data analysis workflow for bidirectional IS analysis. The bidirectional assay can simultaneously sequence both upstream and downstream vector-host junctions. Compared to conventional unidirectional IS sequencing approaches, the bidirectional approach significantly improves IS detection rates and the characterization of integration events at both ends of the target DNA. The data analysis pipeline described here accurately identifies and enumerates identical IS sequences through multiple steps of comparison that map IS sequences onto the reference genome and determine sequencing errors. Using an optimized assay procedure, we have recently published the detailed repopulation patterns of thousands of Hematopoietic Stem Cell (HSC) clones following transplant in rhesus macaques, demonstrating for the first time the precise time point of HSC repopulation and the functional heterogeneity of HSCs in the primate system. The following protocol describes the step-by-step experimental procedure and data analysis workflow that accurately identifies and quantifies identical IS sequences.

This manuscript describes the experimental procedure and software analysis for a bidirectional integration site assay that can simultaneously analyze upstream and downstream vector-host junction DNA. Bidirectional PCR products can be used for any downstream sequencing platform. The resulting data are useful for a high-throughput, quantitative comparison of integrated DNA targets.

양방향 레트로 바이러스 통합 사이트 PCR 방법론 및 정량적 데이터 분석 워크 플로

Integration Site (IS) assays are a critical component of the study of retroviral integration sites and their biological significance. In recent retroviral ...

Measuring Gene Expression in Bombarded Barley Aleurone Layers with Increased Throughput

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for germination or early seedling development are activated by gibberellin (GA), while genes associated with stress responses are activated by abscisic acid (ABA). The mechanisms of GA and ABA signaling can be interrogated by introducing reporter gene constructs into aleurone cells via particle bombardment, with the resulting transient expression measured using enzyme assays. An improved protocol is reported that partially automates and streamlines the grain homogenization step and the enzyme assays, allowing significantly more throughput than existing methods. Homogenization of the grain samples is carried out using an automated tissue homogenizer, and GUS (&#946;-glucuronidase) assays are carried out using a 96-well plate system. Representative results using the protocol suggest that phospholipase D activity may play an important role in the activation of HVA1 gene expression by ABA, through the transcription factor TaABF1.

An improved protocol is presented for the measurement of transient gene expression from reporter constructs in barley aleurone cells after particle bombardment. The combination of automated grain grinding with 96-well plate enzyme assays provides high throughput for the procedure.

포 격하 보 리 Aleurone 레이어 증가 처리량에서 유전자 발현을 측정

The aleurone layer of barley grains is an important model system for hormone-regulated gene expression in plants. In aleurone cells, genes required for ...

An Optogenetic Method to Control and Analyze Gene Expression Patterns in Cell-to-cell Interactions

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling pathway is one of such essential molecular machinery for cell-to-cell communications, which plays key roles in normal development of embryos. This pathway involves a cell-to-cell transfer of oscillatory information with ultradian rhythms, but despite the progress in molecular biology techniques, it has been challenging to elucidate the impact of multicellular interactions on oscillatory gene dynamics. Here, we present a protocol that permits optogenetic control and live monitoring of gene expression patterns in a precise temporal manner. This method successfully revealed that intracellular and intercellular periodic inputs of Notch signaling entrain intrinsic oscillations by frequency tuning and phase shifting at the single-cell resolution. This approach is applicable to the analysis of the dynamic features of various signaling pathways, providing a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

Here, we present a protocol to analyze cell-to-cell transfer of oscillatory information by optogenetic control and live monitoring of gene expression. This approach provides a unique platform to test a functional significance of dynamic gene expression programs in multicellular systems.

제어 하 고 셀 상호 작용에서 유전자 표현 패턴을 분석 하는 Optogenetic 메서드

Cells should respond properly to temporally changing environments, which are influenced by various factors from surrounding cells. The Notch signaling ...

An Ecdysone Receptor-based Singular Gene Switch for Deliberate Expression of Transgene with Robustness, Reversibility, and Negligible Leakiness

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene switches requires the transfer of two therapeutic expression units concurrently into a single cell, the practical application of the system for gene therapy is limited. To simplify the transgene expression system, we generated a gene switch designated as pEUI(+) encompassing a complete set of transgene expression modules in a single vector. Comprising of the GAL4 DNA-binding domain and modified EcR (GvEcR), a minimal VP16 activation domain fused with a GAL4 DNA-binding domain, as well as a modified Drosophila ecdysone receptor (EcR), the newly developed singular gene switch is highly responsive to the administration of a chemical inducer in a time- and dosage-dependent manner. The pEUI(+) vector is a potentially powerful tool for improving the control of transgene expression in both biological research and pre-clinical studies. Here, we present a detailed protocol for modulation of a transient and stable transgene expression using pEUI(+) vector by the treatment of tebufenozide (Teb). Additionally, we share important guidelines for the use of Teb as a chemical inducer.

Here, we present a protocol for the modulation of transgene expression using pEUI(+) singular gene switch by tebufenozide treatment.

Ecdysone 수용 체 기반 단일 유전자 스위치 견고성, 가역, 및 무시할 수 시키는 Transgene의 의도적인 표현에 대 한

Precise control of transgene expression is desirable in biological and clinical studies. However, because the binary feature of currently employed gene ...

Exploring the Root Microbiome: Extracting Bacterial Community Data from the Soil, Rhizosphere, and Root Endosphere

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to abiotic stresses and diseases. As the plant microbiome can be highly complex, low-cost, high-throughput methods such as amplicon-based sequencing of the 16S rRNA gene are often preferred for characterizing its microbial composition and diversity. However, the selection of appropriate methodology when conducting such experiments is critical for reducing biases that can make analysis and comparisons between samples and studies difficult. This protocol describes in detail a standardized methodology for the collection and extraction of DNA from soil, rhizosphere, and root samples. Additionally, we highlight a well-established 16S rRNA amplicon sequencing pipeline that allows for the exploration of the composition of bacterial communities in these samples, and can easily be adapted for other marker genes. This pipeline has been validated for a variety of plant species, including sorghum, maize, wheat, strawberry, and agave, and can help overcome issues associated with the contamination from plant organelles.

Here, we describe a protocol to obtain amplicon sequence data of soil, rhizosphere, and root endosphere microbiomes. This information can be used to investigate the composition and diversity of plant-associated microbial communities, and is suitable for the use with a wide range of plant species.

루트 미생물 탐색: 토양, Rhizosphere, 및 루트 Endosphere에서 세균성 지역 사회 데이터 추출

The intimate interaction between plant host and associated microorganisms is crucial in determining plant fitness, and can foster improved tolerance to ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing high-throughput short-read DNA sequencing. The resulting sequence datasets can not only track what genes in a population that are enriched during selection for positive yeast 2-hybrid interactions, but also give detailed information about the relevant subdomains of proteins sufficient for interaction. Here, we describe a full suite of stand-alone software programs that allow non-experts to perform all the bioinformatics and statistical steps to process and analyze DNA sequence fastq files from a batch yeast 2-hybrid assay. The processing steps covered by these software include: 1) mapping and counting sequence reads corresponding to each candidate protein encoded within a yeast 2-hybrid prey library; 2) a statistical analysis program that evaluates the enrichment profiles; and 3) tools to examine the translational frame and position within the coding region of each enriched plasmid that encodes the interacting proteins of interest.

Deep sequencing of yeast populations selected for positive yeast 2-hybrid interactions potentially yields a wealth of information about interacting partner proteins. Here, we describe the operation of specific bioinformatics tools and customized updated software to analyze sequence data from such screens.

일괄 처리 효 모 2 잡종 스크린에서 시퀀스 데이터의 informatic 분석

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Preparation and Gene Modification of Nonhuman Primate Hematopoietic Stem and Progenitor Cells

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, underlies the only known cure of human immunodeficiency virus (HIV-1) infection, and shows immense promise in the treatment of genetic diseases such as beta thalassemia. Our group has developed a protocol to model HSPC gene therapy in nonhuman primates (NHPs), allowing scientists to optimize many of the same reagents and techniques that are applied in the clinic. Here, we describe methods for purifying CD34+ HSPCs and long-term persisting hematopoietic stem cell (HSC) subsets from primed bone marrow (BM). Identical techniques can be employed for the purification of other HSPC sources (e.g., mobilized peripheral blood stem cells [PBSCs]). Outlined is a 2 day protocol in which cells are purified, cultured, modified with lentivirus (LV), and prepared for infusion back into the autologous host. Key readouts of success include the purity of the CD34+ HSPC population, the ability of purified HSPCs to form morphologically distinct colonies in semisolid media, and, most importantly, gene modification efficiency. The key advantage to HSPC gene therapy is the ability to provide a source of long-lived cells that give rise to all hematopoietic cell types. As such, these methods have been used to model therapies for cancer, genetic diseases, and infectious diseases. In each case, therapeutic efficacy is established by enhancing the function of distinct HSPC progeny, including red blood cells, T cells, B cells, and/or myeloid subsets. The methods to isolate, modify, and prepare HSPC products are directly applicable and translatable to multiple diseases in human patients.

The goal of this protocol is to isolate nonhuman primate CD34+ cells from primed bone marrow, to gene-modify these cells with lentiviral vectors, and to prepare a product for infusion into the autologous host. The total protocol length is approximately 48 h.

준비 및 Nonhuman 영장류 조 혈 줄기와 조상 세포의 유전자 수정

Hematopoietic stem and progenitor cell (HSPC) transplantation has been a cornerstone therapy for leukemia and other cancers for nearly half a century, ...