이 작업은 소피아 재단(SSWO WAR-63)의 친구들이 자금을 지원했습니다.

모든 제브라피시 사육 및 실험은 에라스무스 MC 및 동물 복지 법률의 제도적 지침에 따라 수행되었습니다. 수정 후 5일 동안 제브라피시 유충을 사용하는 것은 네덜란드 규정에 명시된 대로 공식적인 윤리적 승인이 필요하지 않은 실험 범주에 속합니다.
1. 수정 후 5일(dpf) 야생형 및 tg(phox2bb:GFP) 유충 획득
<ol><li>야생형 제브라피시 사육을 설정하고 15cm 페트리 접시에 HEPES 완충 E3 배지(이하 E3)에 50개의 알을 수집합니다. 이 물고기를 형광 활성화 세포 분류(FAC)를 위한 음성 대조군으로 사용하십시오.</li>
	<li>tg(phox2bb:GFP) 제브라피쉬를 번식시키고 15cm 페트리 접시에 E3에서 약 300개의 알을 수집합니다.</li>
	<li>수정란을 3°C의 인큐베이터에서 14시간/10시간 밝음/어두움 주기로 E28.5(접시당 최대 50개)에 보관합니다.</li>
	<li>1 dpf에서 수정되지 않은 난자를 제거하고 수정란이 5 dpf로 발달하도록 합니다.</li>
	<li>1dpf에서 tg(phox2bb:GFP) 유충을 선택합니다.</li>
</ol>2. 야생형 전체 유충 해리
<ol><li>5 dpf 유충에 0.016 % 트리카인을 마취합니다.</li>
	<li>10x 트립신-EDTA 용액 1mL가 들어 있는 페트리 접시에 면도날을 사용하여 제브라피시 30마리를 작은 조각으로 자릅니다.</li>
	<li>잘게 썬 제브라피시를 총 부피 2mL의 10x 트립신-EDTA 용액이 담긴 마이크로 원심분리 튜브에 옮기고 얼음 위에 3시간 동안 그대로 둡니다. 해리를 자극하기 위해 매시간 P1000 피펫으로 피펫을 위아래로 움직입니다.</li>
</ol>3. 장 격리
<ol><li>0.016% 트리카인으로 마취된 6-10 dpf 유충을 1.8% 아가로스 플레이트(E3 25mL에 아가로스 0.45g)에 연속으로 놓습니다.</li>
	<li>제브라피쉬의 머리에 곤충 핀 하나를 꽂습니다.</li>
	<li>티슈를 사용하여 남아 있는 E3를 모두 제거합니다.</li>
	<li>다른 장기를 건드리지 않고 다른 곤충 핀을 사용하여 장을 분리하십시오. 노른자가 제거되었는지 확인하십시오(보충 그림 S1A).</li>
	<li>격리 후 장을 검사하고 필요한 경우 장과 관련이 없는 모든 물질(예: 피부, 지방, 간)을 제거합니다.</li>
	<li>핀셋으로 장을 채취하여 얼음 위에 10% 태아 송아지 혈청(FCS)이 포함된 인산염 완충 식염수(PBS)가 포함된 미세 원심분리기 튜브에 넣습니다. 알림: 최소 244개의 장을 격리해야 하며 총 해부 시간을 3시간으로 유지해야 합니다. 이것은 두 사람이 동시에 작업할 때 가능합니다.</li>
</ol>4. 장 해리
<ol><li>모든 내장을 해부한 직후 미세 원심분리기 튜브를 최대 속도(13,800× g)로 30초 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>PBS/10% FCS를 제거하되 장이 건조해지는 것을 방지하기 위해 소량(~100μL)을 남겨 둡니다. CaCl2 및 MgCl2 를 함유한 HBSS에 500μL의 2.17mg/mL 파파인을 첨가하여 세포를 해리시킵니다.</li>
	<li>2.5μL의 시스테인(1M)으로 파파인을 활성화합니다.</li>
	<li>내장을 37°C의 수조에서 10분 동안 배양합니다. 피펫을 중간(5분 후)에 위아래로 움직여 효소 조직 소화를 자극합니다.</li>
	<li>0.5mL의 PBS/10% FCS로 미리 습윤된 35μm 세포 스트레이너를 사용하여 세포를 FACS 튜브로 옮깁니다.</li>
	<li>0.5mL 단위로 총 2mL의 PBS/10% FCS를 추가하여 스트레이너를 세척합니다.</li>
	<li>700× g 에서 4°C에서 5분 동안 원심분리합니다.</li>
	<li>상층액을 제거하고 펠릿을 300μL의 PBS/10% FCS에 재현탁시킵니다.</li>
	<li>죽은 세포(1:1,000)를 라벨링하기 위해 1μg/mL의 4',6-diamidino-2-phenylindole(DAPI)을 추가하고 FACS 중에 제외할 수 있도록 5분 동안 배양합니다.</li>
</ol>5. FACS 강화
<ol><li>wildtype 샘플을 사용하여 유세포 분석기에 3,000개의 세포 를 기록하여 분류된 세포 집단의 게이트를 설정합니다(보충 그림 S1B-E).</li>
	<li>100μm 노즐을 사용하고 순도에 대한 분류 정밀도를 설정하고 200μL의 PBS/5% FCS가 포함된 수집 튜브를 FACS 기계에 넣습니다.</li>
	<li>내장의 세포 현탁액을 로드하고 이중세포(그림 2B)와 죽은 세포(그림 2C)를 제외하여 살아있는 세포(DAPI 음성), 단일 세포를 수집 튜브(그림 2C)로 분류합니다. 참고: tg(phox2bb) 제브라피쉬의 경우 모든 단일 살아있는 세포가 정렬되므로 GFP+ 세포의 비율은 참조용으로만 확인됩니다.</li>
	<li>세포 분류 후 수집 튜브를 얼음 위에 보관하십시오.</li>
	<li>trypan blue를 사용한 생존력 검사를 포함하여 혈구계로 세포 현탁액을 계산합니다. 생존 가능성이 80% 이상이면 다음 단계를 계속합니다.</li>
	<li>이제 세포는 scRNAseq(즉, 10x Genomics Chromium 플랫폼)를 위해 처리할 준비가 되었습니다. 샘플당 약 20,000개의 세포를 사용합니다.</li>
</ol>

Single-Cell RNA 염기서열분석을 위한 Zebrafish 유충의 장세포 처리

<ol>
	<li>Saldana-Morales, F. B., Kim, D. V., Tsai, M. T., Diehl, G. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Healthy+intestinal+function+relies+on+coordinated+enteric+nervous+system,+immune+system,+and+epithelium+eesponses.">Healthy intestinal function relies on coordinated enteric nervous system, immune system, and epithelium eesponses.</a> Gut Microbes. 13 (1), 1-14 (2021).</li><li>Sitrin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The Gastrointestinal System. , (2014).</li><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+organisation+of+the+autonomic+nervous+system:+peripheral+connections.">The organisation of the autonomic nervous system: peripheral connections.</a> Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical. 130 (1-2), 1-5 (2006).</li><li>Furness, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+enteric+nervous+system+and+neurogastroenterology.">The enteric nervous system and neurogastroenterology.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 9 (5), 286-294 (2012).</li><li>Obata, Y., Pachnis, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+microbiota+and+the+immune+system+on+the+development+and+organization+of+the+enteric+nervous+system.">The effect of microbiota and the immune system on the development and organization of the enteric nervous system.</a> Gastroenterology. 151 (5), 836-844 (2016).</li><li>Heuckeroth, R. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hirschsprung+disease+-+integrating+basic+science+and+clinical+medicine+to+improve+outcomes.">Hirschsprung disease - integrating basic science and clinical medicine to improve outcomes.</a> Nature Reviews. Gastroenterology &amp; Hepatology. 15 (3), 152-167 (2018).</li><li>Antonucci, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+intestinal+pseudo-obstruction.">Chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> World Journal of Gastroenterology. 14 (19), 2953-2961 (2008).</li><li>De Giorgio, R., Sarnelli, G., Corinaldesi, R., Stanghellini, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advances+in+our+understanding+of+the+pathology+of+chronic+intestinal+pseudo-obstruction.">Advances in our understanding of the pathology of chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Gut. 53 (11), 1549-1552 (2004).</li><li>Bianco, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enteric+neuromyopathies:+highlights+on+genetic+mechanisms+underlying+chronic+intestinal+pseudo-obstruction.">Enteric neuromyopathies: highlights on genetic mechanisms underlying chronic intestinal pseudo-obstruction.</a> Biomolecules. 12 (12), 1849 (2022).</li><li>Kimmel, C. B., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullmann, B., Schilling, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stages+of+embryonic+development+of+the+zebrafish.">Stages of embryonic development of the zebrafish.</a> Dev Dyn. 203 (3), 253-310 (1995).</li><li>Lieschke, G. J., Currie, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Animal+models+of+human+disease:+zebrafish+swim+into+view.">Animal models of human disease: zebrafish swim into view.</a> Nature Reviews. Genetics. 8 (5), 353-367 (2007).</li><li>Howe, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+zebrafish+reference+genome+sequence+and+its+relationship+to+the+human+genome.">The zebrafish reference genome sequence and its relationship to the human genome.</a> Nature. 496 (7446), 498-503 (2013).</li><li>Wallace, K. N., Akhter, S., Smith, E. M., Lorent, K., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intestinal+growth+and+differentiation+in+zebrafish.">Intestinal growth and differentiation in zebrafish.</a> Mechanisms of Development. 122 (2), 157-173 (2005).</li><li>Wallace, K. N., Pack, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unique+and+conserved+aspects+of+gut+development+in+zebrafish.">Unique and conserved aspects of gut development in zebrafish.</a> Developmental Biology. 255 (1), 12-29 (2003).</li><li>Harrison, C., Wabbersen, T., Shepherd, I. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+visualization+of+the+development+of+the+enteric+nervous+system+using+a+Tg(-8.3bphox2b:Kaede)+transgenic+zebrafish.">In vivo visualization of the development of the enteric nervous system using a Tg(-8.3bphox2b:Kaede) transgenic zebrafish.</a> Genesis. 52 (12), 985-990 (2014).</li><li>Kuil, L. E., Chauhan, R. K., Cheng, W. W., Hofstra, R. M. W., Alves, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zebrafish:+a+model+organism+for+studying+enteric+nervous+system+development+and+disease.">Zebrafish: a model organism for studying enteric nervous system development and disease.</a> Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 629073 (2020).</li><li>Stuart, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comprehensive+Integration+of+Single-Cell+Data.">Comprehensive Integration of Single-Cell Data.</a> Cell. 177 (7), 1888-1902 (2019).</li><li>Kuil, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbiased+characterization+of+the+larval+zebrafish+enteric+nervous+system+at+a+single+cell+transcriptomic+level.">Unbiased characterization of the larval zebrafish enteric nervous system at a single cell transcriptomic level.</a> iScience. 26 (7), 107070 (2023).</li><li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unraveling+differential+transcriptomes+and+cell+types+in+zebrafish+larvae+intestine+and+liver.">Unraveling differential transcriptomes and cell types in zebrafish larvae intestine and liver.</a> Cells. 11 (20), 3290 (2022).</li><li>Jin, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cdx1b+protects+intestinal+cell+fate+by+repressing+signaling+networks+for+liver+specification.">Cdx1b protects intestinal cell fate by repressing signaling networks for liver specification.</a> Journal of Genetics and Genomics. 49 (12), 1101-1113 (2022).</li><li>Willms, R. J., Jones, L. O., Hocking, J. C., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+cell+atlas+of+microbe-responsive+processes+in+the+zebrafish+intestine.">A cell atlas of microbe-responsive processes in the zebrafish intestine.</a> Cell Reports. 38 (5), 110311 (2022).</li><li>Kline, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Fishing for answers: Isolating enteric neurons and identifying putative ENS mutants. , (2016).</li><li>Allan, K., DiCicco, R., Ramos, M., Asosingh, K., Yuan, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparing+a+single+cell+suspension+from+zebrafish+retinal+tissue+for+flow+cytometric+cell+sorting+of+Muller+glia.">Preparing a single cell suspension from zebrafish retinal tissue for flow cytometric cell sorting of Muller glia.</a> Cytometry A. 97 (6), 638-646 (2020).</li><li>Lopez-Ramirez, M. A., Calvo, C. F., Ristori, E., Thomas, J. L., Nicoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+culture+of+adult+zebrafish+brain-derived+neurospheres.">Isolation and culture of adult zebrafish brain-derived neurospheres.</a> Journal of Visualized Experiments. 53617 (108), 53617 (2016).</li></ol>

저자는 공개할 이해 상충이 없습니다.

여기에서는 FACS를 사용하여 5dpf 제브라피시 유충의 내장을 분리하고 해리하는 방법을 제시합니다. 이 방법을 통해 10x Genomics Chromium 플랫폼을 사용하여 scRNA-seq로 다양한 장 세포 유형을 성공적으로 수집 및 분석했습니다. 우리는 생존 가능한 ENS 세포도 분리할 수 있다는 징후를 원했기 때문에 tg(phox2bb:GFP) 제브라피시 계통을 선택했습니다(그림 2D). 그러나 이 방법은 신?...

위장관(GI)은 전반적인 건강과 웰빙에 중요한 역할을 하는 복잡한 시스템입니다. 그것은 영양소의 소화 및 흡수뿐만 아니라 노폐물 1,2의 제거를 담당합니다. 위장관은 상피세포, 평활근세포, 면역세포, 장신경계(ENS) 등 여러 세포 유형으로 구성되어 있으며, 이들은 서로 긴밀하게 소통하여 적절한 장 기능을 조절하고 유지합니다 3,4,5. 위장관 발달의 결함은 영양소 흡수, 미생물군 구성, 장-뇌 축 및 ENS와 같은 다양한 측면에 광범위한 영향을 미칠 수 있으며, 히르슈스프룽 병(Hirschsprung disease) 및 만성 장 가성 폐쇄(Chronic intestinal pseudo-obstruction)와 같은 여러 장 신경근 장애를 유발할 수 있습니다 6,7. 이러한 장애는 Cajal의 간질 세포, 평활근 세포 및 ENS 6,8,9와 같은 다양한 주요 세포의 변화로 인한 심각한 장 운동성 장애를 특징으로 합니다. 그러나 위장 발달과 기능 장애의 기저에 있는 분자 메커니즘은 여전히 잘 이해되지 않고 있습니다.
제브라피쉬는 빠른 배아 발달, 배아 및 유충 단계의 투명성, 유전적 다루기 쉬움으로 인해 위장 발달 및 기능 장애를 연구하는 데 귀중한 모델 유기체입니다 10,11,12,13,14. 형광 단백질을 발현하는 수많은 형질전환 제브라피시 계통을 사용할 수 있습니다. 이러한 계통의 예로는 장 뉴런을 포함한 모든 phox2bb+ 세포가15,16으로 표지되어 있기 때문에 ENS를 연구하는 데 일반적으로 사용되는 tg(phox2bb:GFP) 제브라피시가 있습니다. 여기에서는 tg(phox2bb:GFP) 제브라피시 계통을 사용하여 단세포 RNA 염기서열분석(scRNA-seq) 분석을 위한 수정 후 5일(dpf) 유충의 장 분리 방법을 제시합니다(그림 1).

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>10x Trypsin (0.5%)-EDTA (0.2%)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>59418C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5 mL round bottom tube with cell-strainer cap</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>352235</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Agarose</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9539</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD Falcon Round-Bottom Tube 5 mL (FACS tubes) snap cap</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>352054</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell Ranger v3.0.2</td>
			<td>10X Genomics</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DAPI</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>Cat#D-9542</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dissection microscope</td>
			<td>Olympus SZX16</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>FACSAria III sorter machine</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with CaCl2 and MgCl2</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>14025050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Insect pins</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>26000-25</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Cysteine</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>C7352</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MS-222, Tricaine</td>
			<td>Supelco</td>
			<td>A5040-250G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Papain</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P4762</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Seurat v3</td>
			<td>Stuart et&#160;al. (2019)</td>
			<td>N/A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Trypan blue&#160;</td>
			<td>Sigma&#160;</td>
			<td>Cat#T8154</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

gut isolation from zebrafish larvae for single-cell rna sequencing

위장관(GI)은 생명에 필수적인 다양한 기능을 수행합니다. 발달에 영향을 미치는 선천적 결함은 장 신경근 장애로 이어질 수 있으며, 이는 위장 발달 및 기능 장애의 기저에 있는 분자 메커니즘을 이해하는 것이 중요하다는 점을 강조합니다. 이 연구에서는 수정 후 5일에 제브라피시 유충에서 장을 분리하여 단일 세포 RNA 염기서열 분석(scRNA-seq) 분석에 사용할 수 있는 살아 있는 생존 가능한 세포를 얻는 방법을 제시합니다. 이 프로토콜은 제브라피시 장의 수동 해부 후 파파인과의 효소 해리를 기반으로 합니다. 그 후, 세포를 형광 활성화 세포 분류에 제출하고 scRNA-seq를 위해 생존 가능한 세포를 수집합니다. 이 방법을 통해 상피, 기질, 혈액, 근육 및 면역 세포와 장 신경 세포 및 신경교세포를 포함한 다양한 장 세포 유형을 성공적으로 식별할 수 있었습니다. 따라서 제브라피시를 사용하여 건강과 질병에서 위장관의 구성을 연구하는 데 귀중한 자료라고 생각합니다.

The gastrointestinal (GI) tract is a complex system that plays a vital role in overall health and well-being. It is responsible for the digestion and absorption of nutrients, as well as the elimination of waste products1,2. The GI tract is composed of multiple cell types, including epithelial cells, smooth muscle cells, immune cells, and the enteric nervous system (ENS), which communicate closely together to regulate and maintain proper intestinal function3,4,5. Defects in the development of the GI tract can have far-reaching effects on various aspects such as nutrient absorption, microbiota composition, the gut-brain axis, and the ENS, leading to several enteric neuromuscular disorders, such as Hirschsprung disease and Chronic intestinal pseudo-obstruction6,7. These disorders are characterized by severe gut dysmotility caused by alterations in various key cells, such as the interstitial cells of Cajal, smooth muscle cells, and the ENS6,8,9. However, the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction are still poorly understood.
The zebrafish is a valuable model organism for studying GI development and dysfunction due to its rapid embryonic development, transparency during embryonic and larval stages, and genetic tractability10,11,12,13,14. Numerous transgenic zebrafish lines expressing fluorescent proteins are available. An example of such a line is the tg(phox2bb:GFP) zebrafish, commonly used to study the ENS, as all phox2bb+ cells, including enteric neurons, are labeled15,16. Here, using the tg(phox2bb:GFP) zebrafish line, we present a method for intestinal isolation of 5 days post fertilization (dpf) larvae for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis (Figure 1).

저자 스포트라이트: 위장 발달의 전사체학적 측면을 조사하기 위한 제브라피시 유충의 장 세포 분리 및 분석 

Single-cell RNA 염기서열분석을 위한 Zebrafish 유충의 장 분리

Our research aims to investigate the transcriptomic changes occurring during gastrointestinal development and dysfunction in zebrafish larvae. Here, we provide a new protocol that allows isolation of different cell types within the zebrafish intestine, which has potential applications in understanding gastrointestinal health and disease. In recent years, there has been growing interest in exploring the interaction between the enteric nervous system and other intestinal cell types during development and disease.Understanding these complex dynamics using advanced techniques like single-cell RNA sequencing, holds the potential to reveal critical insights into enteric neuromyopathies, leading to more precise diagnostics and treatments. Using this protocol, we successfully identified various intestinal cell types, including epithelial, stromal, bloods, muscle, immune cells, and even enteric neurons and glia, which have not been captured before at this amount using similar approaches. Thus, we provide a reliable technique to study the gastrointestinal composition during development and dysfunction.

이 프로토콜을 사용하여 5개의 dpf 유충에서 전체 장을 성공적으로 분리하고 해리했습니다. 파파인을 해리 효소로 사용하여 세포 생존율을 크게 향상시켜 244개의 분리된 장에서 단일 생존 가능한 세포(전체 세포의 6.4%)와 관련된 46,139개의 이벤트를 포착할 수 있었습니다(그림 2A). 야생형 전체 유충을 대조군으로 사용하여 분류 공정을 최적화하여 효과적인 세포 식별 및 분류?...

Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Analyzing Intestinal Cells of Zebrafish Larvae for Investigating Transcriptomic Aspects of Gastrointestinal Development at JoVE.com

여기에서는 단세포 RNA 염기서열 분석을 위해 수정 후 5일에 제브라피시 유충에서 장을 분리하는 방법을 설명합니다.

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric ...

우리의 연구는 제브라피시 유충의 위장 발달 및 기능 장애 중에 발생하는 전사체 변화를 조사하는 것을 목표로 합니다. 여기에서 우리는 제브라피시 장 내에서 다양한 세포 유형을 분리할 수 있는 새로운 프로토콜을 제공하며, 이는 위장 건강과 질병을 이해하는 데 잠재적으로 응용될 수 있습니다. 최근 몇 년 동안 발달 및 질병 중 장 신경계와 다른 장 세포 유형 간의 상호 작용을 탐구하는 데 대한 관심이 높아지고 있습니다.단일 세포 RNA 염기서열 분석과 같은 고급 기술을 사용하여 이러한 복잡한 역학을 이해하면 장 신경근병증에 대한 중요한 통찰력을 얻을 수 있어 보다 정확한 진단 및 치료가 가능합니다. 이 프로토콜을 사용하여 상피, 기질, 혈액, 근육, 면역 세포, 심지어 장 뉴런 및 신경교세포를 포함한 다양한 장 세포 유형을 성공적으로 식별했으며, 이는 유사한 접근 방식을 사용하여 이전에 이 양으로 캡처되지 않았습니다. 따라서 우리는 발달 및 기능 장애 중 위장 구성을 연구할 수 있는 신뢰할 수 있는 기술을 제공합니다.

gut-isolation-from-zebrafish-larvae-for-single-cell-rna-sequencing

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Gut Isolation from Zebrafish Larvae for Single-cell RNA Sequencing

988 조회수.  Erasmus University Medical Center - Sophia Children's Hospital. 우리의 연구는 제브라피시 유충의 위장 발달 및 기능 장애 중에 발생하는 전사체 변화를 조사하는 것을 목표로 합니다. 여기에서 우리는 제브라피시 장 내에서 다양한 세포 유형을 분리할 수 있는 새로운 프로토콜을 제공하며, 이는 위장 건강과 질병을 이해하는 데 잠재적으로 응용될 수 있습니다. 최근 몇 년 동안 발달 및 질병 중 장 신경계와 다른 장 세포 유형 간의 상호 ?...

비디오: 저자 스포트라이트: 위장 발달의 전사체학적 측면을 조사하기 위한 제브라피시 유충의 장 세포 분리 및 분석 

The gastrointestinal (GI) tract performs a range of functions essential for life. Congenital defects affecting its development can lead to enteric neuromuscular disorders, highlighting the importance to understand the molecular mechanisms underlying GI development and dysfunction. In this study, we present a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization to obtain live,&#160;viable cells which can be used for single-cell RNA sequencing (scRNA-seq) analysis. This protocol is based on the manual dissection of the zebrafish intestine, followed by enzymatic dissociation with papain. Subsequently, cells are submitted to fluorescence-activated cell sorting, and viable cells are collected for scRNA-seq. With this method, we were able to successfully identify different intestinal cell types, including epithelial, stromal, blood, muscle, and immune cells, as well as enteric neurons and glia. Therefore, we consider it to be a valuable resource for studying the composition of the GI tract in health and disease, using the zebrafish.

Here, we describe a method for gut isolation from zebrafish larvae at 5 days post fertilization, for single-cell RNA sequencing analysis.

연구

발생학

Obtaining Wildtype and Transgenic Zebrafish Larvae and WildType Whole Larvae Dissociation

Begin by obtaining the wildtype and transgenic zebrafish eggs from the respective breeding setup. Take a 15-centimeter Petri dish containing HEPES-buffered E3 medium or E3.And collect the appropriate amount of fertilized eggs from the desired zebrafish breeding setup. Incubate the fertilized eggs in E3 at 28 degrees Celsius with an appropriate light and dark cycle.At one days post fertilization or dpf, remove any unfertilized eggs and let the fertilized ones develop until five dpf. Select the transgenic zebrafish larvae at one dpf. Before proceeding for whole larvae dissociation, anesthetize the five dpf wildtype larvae using 0.016%Tricaine, and transfer 30 anesthetized larvae into a Petri dish containing one milliliter of 10x trypsin-EDTA solution.Then, using a razor blade, chop the larvae into small pieces in the Petri dish. Transfer the chopped larvae into a micro centrifuge tube with two milliliters of 10x trypsin-EDTA solution, and leave the tube on ice for three hours. Pipette the contents up and down with a P1000 pipette every hour to stimulate dissociation.

야생형 및 형질전환 제브라피시 유충 및 WildType 전체 유충 해리 획득

Isolation and Dissociation of Gut from Zebrafish Larvae for FACS Enrichment of Gut Cells

To begin, prepare a 1.8%agarose plate with HEPES Buffered E3 medium or E3.While working under a dissection microscope, place six to 10 anesthetized larvae in a row on the agarose plate. Put one insect pin on the head of each larvae. Then remove the remaining E3 from the plate using a tissue.Using another insect pin, isolate the intestine from a larvae without disturbing any other organs. Ensure proper removal of yolk. Once isolated, inspect the intestine and remove all non-intestinal material, such as skin, fat, or liver.Use tweezers to collect the intestine and transfer it to PBS containing 10%FCS in a microcentrifuge tube placed on ice. Immediately after the dissection of all intestines, centrifuge the microcentrifuge tube at 13, 800 g for 30 seconds. Remove the supernatant, leaving about 100 microliters in the tube to prevent the intestines from drying out.Add 500 microliters of papain solution to the intestines in the tube. Activate the papain by adding 2.5 microliters of one molar cysteine. Then incubate the tube containing the intestines in a water bath at 37 degrees Celsius for 10 minutes.Pipette the contents up and down halfway after five minutes to stimulate enzymatic tissue digestion. Transfer the dissociated cells into a fluorescence-activated cell sorting, or FACS, tube through a pre-wedded 35-micron cell strainer. Wash the strainer several times by adding 0.5 milliliters of PBS containing 10%FCS to a total wash volume of two milliliters.Centrifuge the collected filtrate at 700 g for five minutes at 4 degrees Celsius, and remove the supernatant. Add one microgram per milliliter DAPI to 300 microliters of PBS containing 10%FCS. Add this mixture to the pellet and resuspend to label the dead cells.Then incubate for five minutes on ice to allow their exclusion during subsequent FACS analysis.

FACS 장 세포 농축을 위한 제브라피시 유충의 장 분리 및 해리

FACS Enrichment of Zebrafish Gut Cell Suspension for scRNAseq

To perform fluorescence-activated cell sorting, or FACS, on the gut cells isolated from zebrafish larvae, use the wild-type whole larvae sample to set the gates of the sorted cell population by recording 3, 000 cells on the flow cytometer. Use a 100-micron nozzle and set Sort Precision to 4-Way Purity. Put the collection tube containing 200 microliters of PBS with 5%fetal calf serum in the fax machine.Load the cell suspension prepared from the isolated guts, and after excluding doublets in dead cells, sort live or DAPI-negative single cells into the collection tube. Keep the collection tube on ice after cell sorting, employing a viability check with trypan blue. Count the number of cells in the suspension with a hemocytometer.The cells are now ready to be processed for single-cell RNA sequencing. Use approximately 20, 000 cells per sample.