1 부 : cDNA의 형광 라벨링 microarray 실험에 사용된 Cy3 염료는 사진 저하에 민감합니다. 절차는 빛의 최소한의 자리를 차지할 것입니다. 라벨 프로토콜은 BioPrime 배열 CGH의 게놈 라벨 시스템 매뉴얼 1 적응했다. <ol><li> 라벨 반응에 대한 시약은 -20 ° C.에 저장됩니다 BioPrime 배열 CGH의 게놈의 라벨링 시스템 해동 2.5X 랜덤 프리머 버퍼, 10X dCTP 믹스, 그리고 nuclease없는 물. 또한 Cy3 - dCTP 염료를 녹여. 해동 후, 간단히 사용하기 전에 모든 시약을 원심 분리기. </li><li> 별도의 레이블 반응 분석 각 cDNA 샘플에 대해 완료해야합니다. 0.6 ML 두꺼운 벽으로 둘러싸인 튜브에 86 μl의 총 볼륨을 달성하기 위해 cDNA 500 NG, 40 μl 2.5X 랜덤 프리머 버퍼와 nuclease없는 물을 추가합니다. </li><li> 잘 믹스하고 짧게 원심 분리기. 100 5 분 반응 ° thermocycler에서 C를 품어. </li><li> 즉시 10 분 동안 얼음 목욕 슬러리에 반응을 전송합니다. </li><li> 각각의 튜브하려면 다음 10 μl 10X dCTP 믹스, 2 μl 1 ㎜ Cy3 - dCTP와 2 μl의 DNA 엑소 Klenow 효소를 추가합니다. 엑소 Klenow DNA의 효소가 필요 때까지 냉장고에 남아 있어야하며 항상 얼음에 보관해야합니다. </li><li> 잘 반응을 혼합하고 간단히 원심 분리기. </li><li> thermocycler 16 시간 동안 37 ° C에서 반응을 품어. </li></ol> 2 부 : 라벨 cDNA의 강수량 <ol><li> NimbleGen의 하이브리드화 시스템에서 프로토콜 차례로 계속하고 시스템이 42 ° C.에 평형 수 있도록하기 전에 </li><li> 각 반응 들어, 1.5 ML 튜브에 Microcon 열을 넣으십시오. 라벨 반응 (100 μl)의 내용을 다음 각 열의 300 μl 0.1X SSC를 추가합니다. </li><li> 4 10 분 16,100 XG에있는 열을 포함하는 튜브 ° C.를 원심 분리기 </li><li> 컬러로 약간 핑크색 수 있으며, 컬럼에 다른 300 μl 0.1X SSC를 추가할 수 있습니다 통해 흐름을 삭제. </li><li> 4 10 분 16,100 XG에서 원심 분리를 반복 ° C. </li><li> 을 통해 흐름을 취소하고 열 추가 300 μl 0.1X SSC를 추가합니다. </li><li> 4 12 분 16,100 XG에 원심 분리기 ° C. </li><li> 을 통해 흐름을 폐기하십시오. 을 통해 흐름이 마지막으로 씻고 나서 명확해야하고,이 칼럼에서 분홍색 표시 cDNA를 볼 수 있어야합니다. </li><li> 열 100 μl nuclease 무료 물을을 적용합니다. 1.5 ML 튜브에서 열을 제거하고 새로운 1.5 ML 튜브에 열을 반전. </li><li> 4 2 분 2,300 XG에 원심 분리기 ° C. 분류 cDNA는 튜브의 아래쪽에 수집 물 속에 rehydrated해야합니다. </li><li> DNA 농도를 계산하고 Cy3 비율 뉴클레오 티드가 23.15 곱한 260 / 550 비율을 동일 어디 비율을 염색하는 기지를 계산하여 염료 정관을 평가하는 제조 업체의 지시에 따라 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용합니다. 염색 비율 기지 50 80 사이 여야합니다. </li><li> cDNA 충분한 표시된 경우 경우의 나누어지는 6 μg는 새로운 1.5 ML 튜브로 cDNA 표시. </li><li> 3 M NaOAc, 산도 5.2의 0.1X 볼륨과 이소프로판올 1X 볼륨에 섞는다. 혼합물은 실온에서 30 분 어둠 속에 품어 수 있습니다. </li><li> 다음 실온에서 20 분 동안 16,100 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 컬러 핑크되어야 DNA 펠렛을 방해하지 않고 표면에 뜨는를 주의깊게 폐기. </li><li> 500 μl 70 % EtOH 부드러운 역전의 믹스를 추가하여 에탄올 세척을 수행합니다. </li><li> 실온에서 5 분간 16,100 XG에 샘플을 원심 분리기. </li><li> 튜브 반전, 표면에 뜨는를 제거하고, 펠릿 5 분 동안 건조하실 수 있습니다. 이 단계에서는 펠렛은 -20에 저장될 수 있습니다 ° C 원하는 또는 프로토콜 하이브 리다이 제이션 단계로 계속 수있는 경우. </li></ol> 파트 3 : 하이브 리다이 제이션 하이브 리다이 제이션 절차는 유전자 발현 분석 2 로체 NimbleGen 배열 사용자 가이드에서 적응됩니다. <ol><li> nuclease - 무료 물 5 μl의 펠렛을 디졸브. </li><li> 일단 펠렛은 표 1에 나열된 하이브 리다이 제이션 구성 요소를 추가 해산합니다. 하이브 리다이 제이션 구성 요소는 로체 NimbleGen의 하이브 리다이 제이션 키트에서입니다. 모든 구성 요소가 추가되면 전체 볼륨이 18 μl 총해야합니다. 잘 믹스하고 간략하게 아래에있는 내용을 수집하기 위해 튜브를 스핀. </li><li> 다음 단계는 5 분 동안 95 ° C에서 열 블록에 배치하여 표시 cDNA를 변성하는 것입니다. </li><li> 배열은 다음 단계에서 준비하는 동안 즉시 NimbleGen의 하이브리드화 시스템에 튜브를 전송합니다. </li><li> Microarrays는 항상 신중하게 처리하고 제조 업체의 지침에 따라 보관해야합니다. 로체 NimbleGen는 실온에서 건조와 함께 어둠 속에서 자신의 표현의 배열을 저장하는 것이 좋습니다. </li><li> NimbleGen 배열 처리 액세서리에서 제공하는 정밀 믹서 정렬 도구 (PMAT)에 배열을로드합니다. </li> &lt;리&gt;는 PMAT에 X1 믹서를로드하고 집게와 접착 스트립을 제거합니다. 안전 PMAT를 닫습니다. PMAT에있는 구멍을 통해 믹서에 압력을 적용 천천히 배열 믹서는 PMAT에서 공격을 수 있도록 엽니다. </li><li> 단단히 배열에 인감을 위해 믹서의 외부 주위 브레 이어와 압력을 적용 완료하고 거품을 제거합니다. 따뜻하게 하이브 리다이 제이션 시스템에 배열 믹서 복잡한를 놓습니다. </li><li> 변위 피펫을 사용하여 천천히 입력 포트에 표시된 샘플의 15 μl를 추가합니다. 이것은 믹서의 중심에있는 구멍이다. 샘플 어떤 기포없이 믹서를 통해 균일하게 확산되도록 피펫으로 느리고 꾸준한 압력을 적용합니다. 포트 구멍에서 초과 샘플을 닦아 및 접착제 스트립과 포트 구멍을 밀봉. </li><li> 래치를 닫고 NimbleGen의 하이브리드화 시스템에서 프로그램 B를 사용하여 하이브 리다이 제이션 솔루션의 혼합 시작합니다. microarrays은 16-20시간에 대한 잡종 수 있습니다. </li></ol> 4 부 : 포스트 하이브 리다이 제이션 세척 및 Microarray의 스캔 세탁 및 검사 절차는 유전자 발현 분석 2 로체 NimbleGen 배열 사용자 가이드에서 적응됩니다. <ol><li> 일단 하이브 리다이 제이션은 표 2에 제시된 세척 버퍼를 준비 완료 근처​​에 있습니다. 42 미리 따뜻하게 씻으 버퍼 IA ° C 물 목욕 인치 </li><li> GenePix 4000B 배열 스캐너 전원을 켜고 스캐너를 사용하기 전에 약 15 분 동안 따뜻한하실 수 있습니다. </li><li> 접시에 미리 따뜻하게 씻으 버퍼 IA 하거라. </li><li> 치구 (NimbleGen 배열 처리 액세서리로 제공)에 NimbleGen의 하이브리드화 시스템과 슬라이드에서 배열 믹서 복잡한를 제거합니다. 잠수함의 미리 따뜻하게 씻으 버퍼 IA에 조립 조심스럽게 거리 슬라이드에서 필링하여 믹서를 제거합니다. </li><li> 와시 버퍼 아이오와에서 15 초 동안 지그과 선동의 배열을 제거합니다. </li><li> 신속하게 실내 온도 와시 버퍼 IB의 슬라이드 선반에 배열을 전송합니다. 이분에 대해 적극적으로 슬라이드 선반을 선동하다. </li><li> 와시 버퍼 II에 슬라이드 랙을 전송하고 1 분 선동. </li><li> 15 초간 씻으 버퍼 III와 선동에 슬라이드 선반을 전송합니다. </li><li> 원심 분리기를 건조 슬라이드로 배열을 전송하고 모든 수분을 제거하는 2 분 돌린다. 스캔을 진행합니다. </li><li> 이것은 염료는 빛과 오존에 모두 민감한이기 때문에 즉시 배열을 검사하는 것이 좋습니다. </li><li> GenePix 4000B 배열 스캐너로, 아래로 배열, 바코드를로드합니다. </li><li> GenePix Pro 소프트웨어를 열고 배열의 스캔을 진행합니다. 로체 NimbleGen 유전자 표현 배열 한 색상 하이브 리다이 제이션 전략을 사용합니다. 결과적으로 하나의 파장은 스캔이 필요합니다. 532 NM 레이저를 사용하여 Cy3 형광 신호를 검사합니다. 하드웨어 설정 대화 상자를 열고 500 값을 532 nm의 레이저의 PMT 값을 설정합니다. </li><li> 하드웨어 설정 대화 상자에서, 100 %, 픽셀 크기 5 미크론으로, 평균 1 라인, 전원을 설정하고 0 미크론으로 위치를 중점을두고 있습니다. </li><li> 미리보기 스캔을 수행하고 스캔 영역을 설정합니다. </li><li> 스캔 수행합니다. </li><li> 일단 스캔은 이미지 히스토그램을 확인 완료됩니다. 이상 적으로는 1E - 5 표준 카운트는 기능 ~ 1~2%가 포화되는 65,000 포화 제한 의미에서해야합니다. 표준 카운트가 1E - 5보다 적은 경우, PMT 이득과 다시 검색 슬라이드를 향상시킬 수 있습니다. 표준 카운트가 1E - 5보다 큰 경우, PMT 이득과 다시 검색 슬라이드를 감소. </li><li> 일단 스캔은 이미지를 저장 완료됩니다. 그것은 참조에 쉽게 이미지에 대한 표준 명명 규칙을 선택하는 것이 좋습니다. 이미지는 이제 데이터 정상화와 강도 값을 계산에 대한 환경의 데이터 분석 프로그램에 로드할 수 있습니다. </li></ol> 대표 결과 당신이 먼저 0.1X SSC와 세척을 시작하면 cDNA의 Cy3 형광 라벨 반응의 효율성을 평가하기 시작할 수 있습니다. 이후의 각 세척하는 동안을 통해 흐름은 분명 통해 최근 흐름과 색상이 덜 분홍색이 될 것입니다. 또한, Cy3 - 라벨 cDNA 제품이 세척 단계 동안 열을 표시해야합니다. 을 통해 흐름이 컬러 밝은 분홍색 또는 열을 핑크색 제품이 없다면, 이것은 상표 반응이 제대로 진행되지 않은 좋은 표시이다. 라벨 반응은 양적 염료 비율 (그림 1)에 표시 DNA와 기지의 농도를 결정하는 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용하여 평가하실 수 있습니다. 레이블링 반응은 일상적으로 우리 연구실에 표시 DNA의 적어도 10 μg을 산출. 염료 법인은 Cy3 비율 뉴클레오 티드가 23.15 곱한 260 / 550 비율을 동일 간단한 기본 / 염료 비율을 사용하여 계산하실 수 있습니다. 50-80까지 값은 상표 반응에 충분한 염료 법인을 나타냅니다. 라벨 반응은 마이크에 DNA 또는 가난한 염료의 설립, 샘플 하이브 리다이 제이션의 낮은 농도를 산출하는 경우roarray 권장되지 않으며 라벨 반응은 반복해야합니다. 하이브 리다이 제이션의 품질 평가는 이미지 히스토그램 및 microarray의 스캔 이미지 (그림 2) 평가 실시하실 수 있습니다. 허용 hybridizations은 포화 기능 1-2 % (즉, 항복을 1E - 5 65,000 채도 제한에서 표준 계산)이 포함됩니다 500 근처에 설정된 PMT 값을. PMT 값을 65,000 채도 제한에 1E - 5 표준 계산을 달성하기 위해 500부터 대폭 조정해야있다면, 이것은 일반적으로 microarray에 표시된 cDNA의 가난한 하이브 리다이 제이션을 나타냅니다. 이 데이터는 이후의 분석을 통해 지속적인 경우에는 데이터 품질로 구성됩니다. 하이브리드화 품질도 질적으로 스캔 배열 (그림 3)의 이미지를 보면 평가하실 수 있습니다. 로체 NimbleGen의 하이브 리다이 제이션 키트 정렬 oligo의의 혼합 Cy3와 배열에 정렬 기능을 잡종 Cy5 - 라벨 48mer oligonucleotides가 포함되어 있습니다. 배열의 다른 기능에 대한 정렬 oligos의 강도의 질적 평가는 배열에 찬란 레이블 cDNA의 하이브리드화 효율에 대한 품질 검사를 허용합니다. 자세한 분석에 따라, 귀하의 분석 데이터의 스캐터 플롯은 유전자 발현의 상대적 수준을 결정하고 differentially하여 샘플 (그림 4) 사이에 표현됩니다 유전자를 식별하는 데 사용할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure1thumb.jpg" alt="그림 1의 축소판 이미지" /> 그림 1. cDNA Cy3와 함께 표시. 라벨 cDNA 수율 및 염료의 정관에서 NanoDrop 스펙트럼은 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용하여 평가하실 수 있습니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1471/1471figure1.jpg">여기를 클릭</a> 그림 1의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure2thumb.jpg" alt="그림 1의 축소판 이미지" /> 그림 2. 하이브 리다이 제이션의 microarray 검사합니다. 품질 GenePix 히스토그램은 이미지 히스토그램을 평가하여 평가하실 수 있습니다. 허용 hybridizations 500 근처에 설정된 PMT 값을 65,000 채도 제한에 1E - 5 표준 계산과 포화 기능이 1-2 %를해야합니다. 하시기 바랍니다 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/1471/1471figure2.jpg">여기를 클릭</a> 그림 2의 더 큰 버전을 볼 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure3.jpg" border="0" alt="그림 3" /> 그림 3. 스캔 microarray 이미지. 하이브리드화 품질은 microarray의 스캔 이미지를 보면 평가하실 수 있습니다. 이미지가 기능의 형광 강도의 정확한 계산을 방지하므로 먼지 또는 각 기능의 시각화를 금지 기타 방해 요인의 존재에 대한 검사해야합니다. 정렬 oligos의 강도는 하이브 리다이 제이션 효율성을 평가하기 위해 배열의 다른 기능을 비교할 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1471/1471figure4.jpg" border="0" alt="그림 4" /> 그림 4. 분석 microarray 실험의 스캐터 줄거리.이 절차의 목적은 differentially 귀하의 샘플에 표현됩니다 유전자를 식별하는 것입니다. Microarray 데이터가 추가로 분석하고 differentially 표현 유전자를 시각화하는 스캐터 플롯에서 볼 수 있습니다. 표 1. 로체 NimbleGen의 하이브 리다이 제이션 키트의 구성 요소 하이브 리다이 제이션 2 단계에 대한 추가합니다. <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 음량 </td></tr><tr><td> 샘플 (물속에 녹아있는) </td><td> 5 μl </td></tr><tr><td> 2X 하이브리드화 버퍼 </td><td> 9 μl </td></tr><tr><td> Hyb </td><td> 3.6 μl </td></tr><tr><td> 정렬 Oligo </td><td> 0.4 μl </td></tr><tr><td> 총 부피 </td><td> 18 μl </td></tr></tbody></table> 표 2. 하이브리드화 다음과 같은 배열의 세척에 대비하기 위해 버퍼를 씻으십시오. <table border="1"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 와시 버퍼 IA * </td><td> 버퍼 IB 와시 </td><td> 와시 버퍼 II </td><td> 와시 버퍼 III </td></tr><tr><td> 물 </td><td> 225 ML </td><td> 225 ML </td><td> 225 ML </td><td> 225 ML </td></tr><tr><td> 10X 워시 버퍼 I, II, III 또는 </td><td> 25 ML </td><td> 25 ML </td><td> 25 ML </td><td> 25 ML </td></tr><tr><td> 1 M DTT </td><td> 25 μl </td><td> 25 μl </td><td> 25 μl </td><td> 25 μl </td></tr><tr><td> 총 부피 </td><td> 250 ML </td><td> 250 ML </td><td> 250 ML </td><td> 250 ML </td></tr></tbody></table> 42 * 사전 따뜻한 ° C

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> BioPrime Array CGH Genomic Labeling System Manual. , (2004).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Roche NimbleGen Arrays User's Guide for Gene Expression Analysis. , (2008).</li></ol>

여기에 자세한 사람 등 많은 microarray 프로토콜은 하이브 리다이 제이션을 측정하고 quantifying의 수단으로 형광 염료를 사용합니다. Cy3 형광 염료는 사진 및 오존 파괴에 민감합니다. 이것은 프로 시저가 최소한의 조명을 실시하는 것이 좋습니다. 또한, 작은 먼지 입자는 하이브 리다이 제이션 및 스캔을 방해할 수 있습니다. 특별한주의는 작업 지역 깨끗하고 먼지에서 무료로 있는지 확인하기 위해...

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<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Array Microcentrifuge Dryer</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>ISC Bioexpress</td>
<td>C-1303-T</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>BioPrime Array CGH Genomic Labeling System</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>18095-011</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Cyanine 3-dCTP</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>PerkinElmer</td>
<td>NEL576</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>GenePix 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Molecular Devices</td>
<td>GENEPIX 4000B</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Microcon YM-30</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Millipore</td>
<td>42411</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Array Processing Accessories</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223539001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Hybridization Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223474001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Hybridization System 4</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223652001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NimbleGen Wash Buffer Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223504001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>X1 Mixers</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche NimbleGen</td>
<td>5223725001</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

global gene expression analysis using a zebrafish oligonucleotide microarray platform

진 microarray 기술은 게놈 전체의 기준으로 명시 수준의 양적 측정과 유전자 발현 프로 파일링을 수 있습니다. 유전자 microarray 기술은 질병 상태로 발달 단계와 관련하여 세계적인 유전자 발현 분석을 포함한 다양한 응용 프로그램에서 다양한 생물 학적 분야에 사용하고, 독성 반응 인치입니다 여기에, 우리는 포괄적인 zebrafish 특정 oligonucleotide microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석의 데모를 포함합니다. zebrafish의 표현 microarray 플랫폼은 목표 당 12 프로브까지와 37,157 목표를 심문 385,000 프로브, 길이 60 기본 쌍을 포함하고 있습니다. 이 플랫폼은 zebrafish에 대해 사용할 수있는 모든 cDNA 및 게놈 정보는 Ensembl (http://www.ensembl.org), 베가 (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (포함한 다양한 게놈 데이터베이스에서 수집되었습니다 http://genome.ucsc.edu) 및 ZFIN (http://www.zfin.org). 결과적으로이 표현 배열은 현재 zebrafish의 transcriptome의 완전한 혜택을받을 수 있습니다. zebrafish의 표현 microarray는 로체 NimbleGen (매디슨, WI)에 의해 인쇄되었다. 이 기술 데모는 형광 cDNA 제품의 라벨, microarray 플랫폼에 표시된 제품의 cDNA 하이브 리다이 제이션, 그리고 한 색상 분석 전략을 사용하여 신호 획득을위한 배열 검사를 포함합니다.

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Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

유전자 microarrays는 게놈 전체의 수준에서 유전자 발현 프로 파일링에 강력한 도구입니다. 이 기술은 발달 생물학 및 독성학을 포함한 생물 학적 다양한 분야에 응용 프로그램을하고 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 세부 zebrafish에 대한 포괄적인 oligonucleotide microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석을위한 프로토콜을.

Zebrafish Oligonucleotide Microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

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Research

JoVE Journal

Biology

11.6K 조회수.  Purdue University. 유전자 microarrays는 게놈 전체의 수준에서 유전자 발현 프로 파일링에 강력한 도구입니다. 이 기술은 발달 생물학 및 독성학을 포함한 생물 학적 다양한 분야에 응용 프로그램을하고 있습니다. 이 비디오에서는, 우리는 세부 zebrafish에 대한 포괄적인 oligonucleotide microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석을위한 프로토콜을.

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Bacterial Gene Expression Analysis Using Microarrays

Microarrays을 사용하여 세균의 유전자 발현 분석

연구

생물학

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead to disastrous results in downstream experimental applications.  It is therefore, of utmost importance to use solid techniques with numerous safeguards and quality control checks to ensure a superior sample.  Herein, we detail a protocol to isolate total RNA from whole zebrafish embryos using a commercially available chemical denaturant and subsequent cleanup to remove traces of DNA and impurities using a commercial RNA isolation kit. As RNA is relatively unstable and easily prone to cleavage by RNAses, most protocols assay gene expression using a cDNA product that is directly synthesized from an RNA template. We detail a procedure to convert RNA into the more stable cDNA product using a commercially available kit. Throughout these procedures there are numerous quality control checks to ensure that the sample is not degraded or contaminated.  The end product of these protocols is cDNA that is suitable for microarray analysis, RT-PCR or long-term storage.    

The isolation of high quality, intact RNA is an essential step in many laboratory protocols. Here, we demonstrate RNA extraction from whole zebrafish embryos and cDNA synthesis for subsequent application in various experimental procedures including gene expression microarray analysis.

유전자 발현 분석을위한 배아 Zebrafish 및 cDNA 합성에서 RNA 격리

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

에메랄드 애쉬 보러에서 유전자 발현 분석 ( Agrilus planipennis)를 사용하여 정량 리얼 타임 PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of muscle specification, formation and function in model systems has provided valuable insight into muscle physiology. Therefore, identifying and characterizing molecular mechanisms that underlie muscle damage is critical. The structure of adult Drosophila multi-fiber muscles resemble vertebrate striated muscles 1 and the genetic tractability of Drosophila has made it a great system to analyze dystrophic muscle morphology and characterize the processes affecting muscular function in ageing adult flies 2. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. These preparations allow for the tissue to be stained with classical histological stains and labeled with protein detecting dyes, and specifically cryosections are ideal for immunohistochemical detection of proteins in intact muscles. This allows for analysis of muscle tissue structure, identification of morphological defects, and detection of the expression pattern for muscle/neuron-specific proteins in Drosophila adult muscles. These techniques can also be slightly modified for sectioning of other body parts.

Paraffin-Embedded and Frozen Sections of Drosophila Adult Muscles

Identification of mechanisms underlying muscle damage is crucial. Here we present the histological technique for preparing paraffin-embedded and frozen sections of Drosophila thoracic muscles. This allows analysis of muscle morphology and localization of protein and other muscle cell components.

의 파라핀 - 임베디드 및 냉동 섹션 Drosophila 성인 근육

The molecular characterization of muscular dystrophies and myopathies in humans has revealed the complexity of muscle disease and genetic analysis of ...

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, messages are carried by neurotransmitters released from presynaptic terminals and received by receptors on postsynaptic cells. Our previous research in Caenorhabditis elegans has shown that VSM-1 negatively regulates exocytosis. Additionally, analysis of synapses in vsm-1 mutants showed that animals lacking a fully functional VSM-1 have increased synaptic connectivity. Based on these preliminary findings, we hypothesized that C. elegans VSM-1 may play a crucial role in synaptogenesis. To test this hypothesis, double-labeled microarray analysis was performed, and gene expression profiles were determined. First, total RNA was isolated, reversely transcribed to cDNA, and hybridized to the DNA microarrays. Then, in-silico analysis of fluorescent probe hybridization revealed significant induction of many genes coding for members of the major sperm protein family (MSP) in mutants with enhanced synaptogenesis. MSPs are the major component of sperm in C. elegans and appear to signal nematode oocyte maturation and ovulation . In fruit flies, Chai and colleagues 1 demonstrated that MSP-like molecules regulate presynaptic bouton number and size at the neuromuscular junction. Moreover, analysis performed by Tsuda and coworkers 2 suggested that MSPs may act as ligands for Eph receptors and trigger receptor tyrosine kinase signaling cascades. Lastly, real time PCR analysis corroborated that the gene coding for MSP-32 is induced in vsm-1(ok1468) mutants. Taken together, research performed by our laboratory has shown that vsm-1 mutants have a significant increase in synaptic density, which could be mediated by MSP-32 signaling.

Determining Genetic Expression Profiles in C. elegans Using Microarray and Real-time PCR

Microarray analysis was conducted to determine genetic expression profiles in C. elegans, and real-time PCR was used to validate and quantify microarray data.

의 유전자 표현 프로필 결정 C. 엘레간스 Microarray 및 실시간 PCR을 사용하여

Synapses are composed of a presynaptic active zone in the signaling cell and a postsynaptic terminal in the target cell. In the case of chemical synapses, ...

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.
Telomerase is a specialized reverse transcriptase1 that adds short DNA repeats, called telomeres, to the 3' end of linear chromosomes2 that serve to protect them from end-to-end fusion and degradation. Following DNA replication, a short segment is lost at the end of the chromosome3 and without telomerase, cells continue dividing until eventually reaching their Hayflick Limit4. Additionally, telomerase is dormant in most somatic cells5 in adults, but is active in cancer cells6 where it promotes cell immortality7.
The minimal telomerase enzyme consists of two core components: the protein subunit (TERT), which comprises the catalytic subunit of the enzyme and an integral RNA component (TER), which contains the template TERT uses to synthesize telomeres8,9. Prior to 2008, only structures for individual telomerase domains had been solved10,11. A major breakthrough in this field came from the determination of the crystal structure of the active12, catalytic subunit of T. castaneum telomerase, TcTERT1.
Here, we present methods for producing large quantities of the active, soluble TcTERT for structural and biochemical studies, and the reconstitution of the telomerase RNP complex in vitro for telomerase activity assays. An overview of the experimental methods used is shown in Figure 1.

In vitro Reconstitution of the Active T. castaneum Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more than a decade. Here, we present methods for the isolation of the recombinant Tribolium castaneum TERT (TcTERT) and the reconstitution of the active T. castaneum telomerase ribonucleoprotein (RNP) complex in vitro.

활성 T.의 체외의 Reconstitution에서 castaneum의 Telomerase

Efforts to isolate the catalytic subunit of telomerase, TERT, in sufficient quantities for structural studies, have been met with limited success for more ...

Gene Trapping Using Gal4 in Zebrafish

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional mutagenesis using fluorescent reporters to tag expression of mutated genes. Several laboratories have constructed and tested enhancer- and gene-trap vectors in zebrafish, using fluorescent proteins, Gal4- and lexA- based transcriptional activators as reporters 1-7. These vectors had two potential drawbacks: suboptimal stringency (e.g. lack of ability to differentiate between enhancer- and gene-trap events) and low mutagenicity (e.g. integrations into genes rarely produced null alleles). Gene Breaking Transposon (GBTs) were developed to address these drawbacks 8-10. We have modified one of the first GBT vectors, GBT-R15, for use with Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter and added UAS:eGFP as the secondary reporter for direct detection of gene trap events. Application of Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter provides two main advantages. First, it increases sensitivity for genes expressed at low expression levels. Second, it enables researchers to use gene trap lines as Gal4 drivers to direct expression of other transgenes in very specific tissues. This is especially pertinent for genes with non-essential or redundant functions, where gene trap integration may not result in overt phenotypes. The disadvantage of using Gal4-VP16 as the primary gene trap reporter is that genes coding for proteins with N-terminal signal sequences are not amenable to trapping, as the resulting Gal4-VP16 fusion proteins are unlikely to be able to enter the nucleus and activate transcription. Importantly, the use of Gal4-VP16 does not pre-select for nuclear proteins: we recovered gene trap mutations in genes encoding proteins which function in the nucleus, the cytoplasm and the plasma membrane.

This protocol describes the method of gene trap insertional mutagenesis using Gal4-VP16 as the primary reporter and GFP/RFP as secondary reporters in zebrafish. Approximately one in ten high-expressing F0 fish yield gene trap progeny co-expressing GFP and RFP. The screening procedure can be readily scaled to adapt to the size of the laboratory performing the insertional mutagenesis screen.

제브라 피쉬의 인 Gal4을 사용하여 유전자 트래핑

Large clutch size and external development of optically transparent embryos make zebrafish an exceptional vertebrate model system for in vivo insertional ...