1 부 : TRIzol 시약을 사용하여 총 RNA의 추출 RNA와 함께 작업하는 경우가 RNAses 무료입니다 환경에서 작동하는 것은 매우 중요합니다. 이러한 RNA 절차에만 사용하기 위해 예약된 pipettes가 발생하고 절차를 시작하기 전에 decontaminant 시약 (예 : RNAse 거리)로 작업 영역을 분사와 같은 간단한주의 사항은 매우 도움이됩니다. <ol><li> 1.5 ML의 microfuge 튜브에 RNA 수영장 50 zebrafish의 배아 충분한 양의 달성하고 피펫과 함께 가능한 한 많은 물을으로 제거하려면 다음과 같이하십시오. </li><li> 바로 배아를 포함하는 microfuge 튜브에 TRIzol 시약 1 250 μl를 추가합니다. TRIzol 시약은 페놀이 포함되어 있습니다 단 퓸 후드에서 사용해야합니다. </li><li> 조직이 충분히 교란 때까지 펠렛 유봉 (약 20 치기)와 배아를 Lyse 및 균질. </li><li> 세포가 충분히 균질 경우 1 ML 총 볼륨을 동일하기 위해 750 μl TRIzol 시약을 추가합니다. </li><li> 핵 단백질의 단지의 완전한 분리를 허용하려면, 실온에서 5 분 균질 샘플을 품어. 이 단계에서는 예제 플래시 액화 질소에 냉동 및 -80 ° C에서 또는 프로토콜이 계속 수 있습니다 저장할 수 있습니다. </li><li> 클로로포름의 0.2 ML를 추가 계속 믹스 15 초 동안 튜브를 일으키고. </li><li> 4 15 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기 다음 상온에서 2 분 동안 샘플을 품어하고 ° C. </li><li> 혼합물은 낮은 붉은 페놀 - 클로로포름 위상, 계면 및 무색 위 수성 단계로 구분됩니다. 위 수성 단계는 RNA가 포함되어 있습니다. 상위 레이어는 TRIzol (약 0.6 ML)의 초기 부피의 약 60 %를 구성한다. 계면 층 중 하나를 전송하지 않도록주의하는 1 ML의 피펫을 사용하여 새 microfuge 튜브로 가기 수성 레이어를 전송합니다. </li><li> RNA는 0.5 ML 이소프로판올를 추가 촉진합니다. </li><li> 샘플 10 분 실온에서 앉아 후 4 10 분 12,000 XG에서 샘플을 원심 수 있도록 허용 ° C. RNA는 튜브의 바닥에 젤 같은 펠렛을 형성합니다. </li><li> 펠렛을 방해하지 않고, 피펫으로 뜨는을 제거하고 한 ML 75 % 에탄올에 펠렛 씻으십시오. 4 5 분 7500의 XG에 부드러운 역전과 원심 분리기에 의해 샘플을 혼합 ° C. </li><li> 원심 분리 후 피펫으로 에탄올을 제거하고 10 분 동안 거꾸로 샘플 건조 수 있습니다. </li><li> RNAse없는 물 100 μl를 추가하여 펠렛을 Resuspend 55에서 샘플을 품어 ° C를 10 분. 이것은 RNA의 rehydration에 도움을 배양하는 동안 자주 와동을 손가락을 권장합니다. 선택, 당신은 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용하여 샘​​플의 품질과 수량을 확인하거나 직접 다음 단계를 계속합니다. </li></ol> 2 부 : Qiagen RNEasy 미니 키트를 사용하여 RNA 정리 Qiagen RNEasy 미니 키트 2 다른 방법에서 분리된 RNA 샘플에서 오염 물질 및 불순물을 제거하는 데 유용합니다. 이 절차에 대한, β - 메르 캅 토 에탄올, 에탄올, 그리고 nuclease없는 물이 키트에 포함된 구성 요소에 추가로 필요합니다. 옵션 DNAse 치료는이 절차를 수행하는 동안 권장합니다. <ol><li> 키트의 처음 사용시, 버퍼 RPE는 버퍼 RPE 1 볼륨에 100 % 에탄올 4 볼륨을 추가하여 준비해야합니다. </li><li> 절차의 날, 버퍼 RLT 신선한 준비해야합니다. 필요한 것입니다 버퍼 RLT의 총 금액을 계산합니다. 350 μl의 볼륨 샘플마다 필요합니다. 버퍼 RLT를 준비하려면, 버퍼의 모든 1 ML에 대한 β - 메르 캅 토 에탄올 10 μl를 추가합니다. 이것은 퓸 후드 아래에 완료해야합니다. </li><li> 각 견본 버퍼 RLT 350 μl와 100 % 에탄올 250 μl를 추가합니다. 몇 시간을 아래와 pipetting으로 잘 섞는다. </li><li> 실온에서 1 분 8,000 XG에 2 ML 수집 관과 원심 분리기에 배치됩니다 RNEasy 열에 약 700 μl되어야 샘플을 전송합니다. </li><li> centrifuging 후,을 통해 흐름을 버리고 RNEasy 스핀 열 버퍼 RW1 700 μl를 추가합니다. </li><li> 실온에서 1 분 8,000 XG에서 샘플을 원심 다음을 통해 흐름을 폐기. </li><li> Qiagen RNAse - 무료 DNAse 키트와 함께 DNAse 치료 : DNAse 치료는 선택 사항이지만 매우 최고 품질의 샘플을 권장합니다. <ol style="list-style-type:upper-alpha;"><li> 먼저 DNAse 처리 키트를받을 때, 당신은 DNAse에 550 μl nuclease 무료 물을 추가하여 DNAse I 주식 솔루션을 준비해야합니다. 반전에 의해 부드럽게 섞어 와동하지 않습니다. 주식 솔루션 10 μl를 포함하는 단일 사용 유리병으로 나누어지는. 당신은 최대 9개월까지 -20 ° C에서 재고 솔루션을 저장할 수 있습니다. 해동 aliquots는 ° C 6주 필요한 경우 4 저장할 수 있지만, 해동 후 aliquots를 refreeze하지 않습니다. </li><li> 준비하는 DNAse I 보육 혼합 10 μl DNAse I s의 RDD 70 μl 버퍼를 추가샘플마다 째깍 솔루션입니다. 부드러운 역전과 원심 분리기 튜브의 혼합 간략 잔여 액체 형태 튜브의 측면을 수집합니다. 직접 RNEasy 스핀 컬럼 80 μl DNAse I 보육 믹스를 추가합니다. 실온에서 30 분 DNAse 치료를 품어. </li></ol></li><li> 다음 DNAse 치료는 상온에서 1 분 8,000 XG에서 스핀 컬럼 및 원심 분리기 350 μl 버퍼 RW1를 추가합니다. </li><li> 원심 분리는을 통해 흐름을 버리고 스​​핀 컬럼 500 μl 버퍼 RPE를 추가한 후. 상온에서 5 분 샘플을 품어. </li><li> 실온에서 1 분 8,000 XG에 샘플을 원심 분리기와를 통해 흐름을 폐기. </li><li> 원심 분리 후 스핀 컬럼 500 μl의 75 % 에탄올을 추가합니다. </li><li> 8,000 XG에서 원심 분리를 반복하지만, 상온에서 2 분. </li><li> 원심 분리는을 통해 흐름을 버리고 열에 5 분 동안 건조 후 수 있습니다. </li><li> 즉시 에탄올 성분 이상 남아를 제거하는 상온에서 5 분 8,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후 전송이 완료되었습니다는 새로운 1.5 ML 수집 관에 스핀 컬럼입니다 10 μl nuclease 무료 물을 추가합니다. 실온에서 1 분 10,000 XG에 원심 분리기 다음 1 분 부화합니다. RNA가 통과 흐름있을 것입니다. </li><li> 스핀 컬럼에 nuclease없는 물의 또 다른 10 μl를 추가하고 1 분 상온에서 알을 품다. 실온에서 1 분 10,000 XG에 샘플을 원심 분리기. </li><li> 원심 분리 후 제거하고 스핀 컬럼을 폐기. RNA는을 통해 흐름을있을 것입니다. </li><li> 제조 업체의 지침에 따라 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용하여 RNA의 수량과 품질을 확인하십시오. </li><li> 또한, denaturing 젤을 실행하거나 RNA의 무결성을 확인하는 애질런트 2100 bioanalyzer을 사용합니다. </li><li> cDNA 합성을 수행할 수 있습니다 ° C까지 샘플은 -80에서 보관해야합니다. </li></ol> 파트 3 : Invitrogen 윗첨자 첫번째 - 스트랜드 시스템을 사용하여 cDNA 합성 RNA는 저하로 이어지는 RNAses에 의해 절단 쉽게 경향이있다. 결과적으로 많은 유전자 발현 프로토콜 직접 RNA로부터 합성되어보다 안정적인 cDNA 제품을 사용하기 위해 개발되었습니다. Invitrogen 어깨 첫번째 - 스트랜드 합성 시스템 3을 사용 처음 가닥 cDNA의 여기 상세 합성. 각 cDNA 합성 반응은 RNA의 5 μg 수용할 수 있습니다. <ol><li> 프로 시저 믹스를 시작하기 전에하고 잠시 각각의 구성 요소를 원심 분리기. </li><li> 로 표 1에 명시된 멸균 0.5 ML의 microfuge 튜브에 RNA / 프라이머 혼합물을 준비합니다. </li><li> ° C 5 분 65 샘플을 품어. </li><li> 즉시 10 분 동안 얼음 슬러리에 샘플을 전송할 수 있습니다. </li><li> 예제는 표 2에 나와있는 구성 요소 마스터 믹스를 준비 냉각되는 동안. 볼륨은 1 반응 당 나열되어 있습니다. 반응의 총 개수에 대한 적절하게 볼륨을 조정합니다. </li><li> 냉각 후, 각각의 RNA / 프라이머 혼합물을 5 단계에서 준비한 마스터 믹스 9 μl를 추가합니다. 부드럽게 혼합 및 간단한 원심 분리하여 수집합니다. 각 샘플의 총 부피는 19 μl해야합니다. </li><li> thermocycler 2 분 42 ° C에서 샘플을 품어. </li><li> 각 튜브에 어깨 II RT 1 μl를 (50 세대) 추가 혼합하고, 42 품어 ° thermocycler 60 분 C. </li><li> 70 반응을 종료 후 15 분 ° C 4 ° C.에 냉기 샘플 thermocycler은 단계 8과 9 프로그래밍할 수 있습니다. </li><li> 샘플 4 ° C에 도달 후 얼음 목욕에 반응을 전송합니다. </li><li> 얼음에있는 각 튜브에 RNAse H 1 μl를 추가하고 37 20 분 동안 품어 ° C. 총 볼륨 이제 21 μl입니다. 샘플에 RNAse H의 추가는 RNA 템플릿을 저하만을 단일 가닥 cDNA 제품을 떠날 것입니다. </li></ol> 4 부 : cDNA 분리 및 강수량 <ol><li> 1.5 ML 위상 잠금 겔 튜브는 cDNA 제품의 절연에 사용됩니다. 2 분 동안 12,000 XG에서 원심 분리하여 1.5 ML 위상 잠금 겔 튜브를 준비합니다. 젤은 모든 튜브의 하단에 있어야합니다. </li><li> 위상 잠금 겔 튜브로 (21 μl), (트리스 - 포화 산도 8.0 버퍼) 81.5 μl 페놀 24:1 클로로포름 isoamyl 알콜의 81.5 μl, 그리고 샘플을 추가합니다. 부드러운 역전에 의해 여러 번 섞는다. </li><li> 실온에서 5 분간 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> cDNA는 위 수성 단계에 있어야합니다. 깨끗한 1.5 ML의 microfuge 관으로 상위 단계를 전송합니다. 총 부피는 20 μl 주위해야합니다. </li><li> 3 M NaOAc, 산도 5.2의 1X 볼륨을 추가하고 부드럽게 섞는다. 상단 수성 단계의 볼륨을 20 μl와 동일 경우 예를 들어, 3 M NaOAc, 산도 5.2 2 μl를 추가해야합니다. </li><li> 5 MG / ML 글리코겐 7 μl를 추가하고 부드럽게 섞는다. </li><li> 이소프로판올의 1X 볼륨을 추가하고 부드럽게 섞는다. 일반적으로이 주위에 이소프로판올 30 μl입니다. </li><li> 샘플 룸 temperatur에서 부화 허용다음 10 분 전자하고 실온에서 20 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 작은 cDNA 펠렛은 튜브의 바닥에 서식한다. 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거합니다. </li><li> 70 % 에탄올과 역전의 믹스 500 μl를 추가합니다. </li><li> 5 분 12,000 XG에서 샘플을 원심 분리기. </li><li> 원심 분리는 피펫으로 뜨는을 제거하고 70 % 에탄올 세척 및 원심 분리를 (단계 10 11) 반복 후. </li><li> 원심 분리 후 피펫으로 뜨는을 제거합니다. 튜브의 측면에 남은 액체가있다면, 그것은 간단히 튜브를 회전하여 수집하실 수 있습니다. 초과 액체를 제거하고 펠릿 5 분 동안 상온에서 건조하실 수 있습니다. </li><li> 펠렛을 rehydrate하는 nuclease없는 물을 20 μl를 추가합니다. 펠렛의 rehydration 5 분 55 ° C에서 샘플을 놓으십시오. </li><li> cDNA 제품의 수량과 품질은 다음 제조 업체의 지침에 따라 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용하여 검사합니다. cDNA는 -20 ° C.에 저장할 수 있습니다 </li></ol> 대표 결과 RNA 정리 후,​​ 고품질의 총 RNA의 약 15 μg 50 zebrafish의 배아에서 기대하실 수 있습니다. 총 RNA 품질, 분광 광도계, 젤 전기 영동 및 애질런트 2100 Bioanalyzer을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. NanoDrop ND - 1000 분광 광도계는 280 nm의 (그림 1)에서 흡광도에 비해 260 nm의 흡광도에서를 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 260 / 280 비율은 오염 물질의 존재를 공개 가능한 열화의 증거를 제공할 수 있습니다. 260 / 1.9-2.0의 280 비율 허용으로 간주됩니다. 또한, 그것은 매우 RNA의 변성 젤이 RNA의 무결성을 평가하기 위해 실행하는 것이 좋습니다. RNA의 가닥은 작은 가닥이 젤 아래 추가로 마이 그 레이션과 함께, 그들의 크기의 기준으로 구분됩니다. 비 저하 샘플 두 개의 강한 밴드와 얼룩으로 나타납니다. 얼룩은 서로 다른 크기의 mRNA의 가닥이 인구의 결과이며 밴드는 28S와 18S rRNA에 대응. 28S 밴드는 18S 밴드 (그림 2)에 대한 두 배나 강렬해야합니다. 또는, 총 RNA의 무결성 애질런트 2100 bioanalyzer를 사용하여 평가하실 수 있습니다. 28S와 18S rRNA를 나타내는 별개의 두 봉우리는 (그림 3) 예정입니다. 28S 피크는 봉우리 아래 면적 정상 18S 약 2시 1분, 각각보다 큰해야합니다. 별개의 두 봉우리가 저하 샘플에서 관찰되지 않습니다. 저하를 전시 RNA 샘플은 후속 실험 절차를 통해 수행해서는 안됩니다. 분광 분석은 cDNA 제품의 품질 (그림 4)을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 260 / 280 1.8 주변한다. 총 RNA의 5 μg의 입력과 cDNA 반응이 일상적으로 우리 연구실에 cDNA 제품 1-2 μg를 얻을 수 있습니다. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig1.jpg" alt="그림 1" /> 그림 1. RNA 샘플의 스펙트럼 NanoDrop. RNA 정리 후, RNA의 수량 및 품질은 NanoDrop ND - 1000 분광 광도계를 사용하여 평가하실 수 있습니다. 고품질의 전체 RNA의 약 15 μg는 정기적으로 1.9-2.0 주변 260 / 280의 비율로 50 zebrafish 배아에서 굴복이다. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig2.jpg" alt="그림 2" /> 그림 2. RNA의 변성 젤. 총 RNA 격리의 무결성을 평가하려면, RNA의 변성 젤을 실행하실 수 있습니다. 28S 및 18S rRNA에 대응하는이 밝은 밴드와 얼룩이 예상된다. 28S 밴드는 약 두 번 18S 밴드로 강렬한으로해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig3.jpg" alt="그림 3" /> 그림 3. 총 RNA 격리의 무결성을 평가 bioanalyzer에서.하려면 RNA 샘플의 흔적은 샘플도 애질런트 2100 bioanalyzer에 분석할 수 있습니다. 28S와 18S rRNA의에 해당하는 두 개의 날카로운 봉우리는, 표시해야합니다. 28S 피크는 봉우리 아래 면적 정상 18S 약 2시 1분, 각각보다 큰해야합니다. <img src="/files/ftp_upload/1470/1470fig4.jpg" alt="그림 4" /> 그림 4. cDNA 샘플의 스펙트럼 NanoDrop. NanoDrop ND - 1000과 분광 분석은 cDNA 제품의 수량과 품질을 평가하는 데 사용할 수 있습니다. 260 / 280 비율은 1.8 주위해야합니다. 총 RNA의 5 UG의 입력과 cDNA 반응이 일상적으로 우리 연구실에 cDNA 1-2 UG를 얻을 수 있습니다. 표 1. 구성 요소 cDNA 합성 단계 중 2 단계에서 RNA / 프라이머의 혼합물을 위해 추가할 수 있습니다. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 음량 </td></tr><tr><td> 총 RNA (최대 5 μg) </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> 10 MM dNTP 믹스 </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> Oligo (DT) 12-18 (0.5 μg / μl) </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> DEPC - 처리된 물 </td><td> N의 μl </td></tr><tr><td> 총 부피 </td><td> 10 μl </td></tr></tbody></table> cDNA 합성 단계 5 표 2. 반응 혼합물. 나열된 볼륨 반응 당 수 있습니다. 반응의 총 개수에 대한 각 구성 요소의 볼륨을 높이십시오. <table border="1" cellspacing="0" cellpadding="0"><tbody><tr><td> 구성 요소 </td><td> 음량 </td></tr><tr><td> 10X RT 버퍼 </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> 25 MM MgCl2 </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> 0.1 MM DTT </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> RNAseOUT </td><td> 1 μl </td></tr></tbody></table>

<ol>
	<li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TRIzol Reagent Manual. , (2007).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> RNEasy Mini Handbook. , (2006).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR. , (2003).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

RNA 분자의 취약성이 프로토콜을 통해 기억되어야하는 가장 중요한 고려 사항이다. RNAse - 무료 살균 장비는 항상 연구실의 RNAse없는 영역에서 사용해야합니다. 단 RNA 절차에 사용하는 실험실의 일부를 예약하는 것이 도움이 그것입니다. 이 지역은 자주 자리 비움 같은 RNAse으로 RNAse 제거 제품과 뿌렸해야합니다. RNA 샘플은 항상 장갑을 착용 한채로 처리하고 저하를 방지하기 위해 얼음에 보관해야?...

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		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Glycogen (5 mg/ml)</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Ambion</td>
<td>9510</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>NanoDrop ND-100</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Thermo Scientific </td>
<td>ND-1000</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Pellet Pestles with Microfuge Tube</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>KT749520-0090</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phase Lock Gel Light, 1.5 ml</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Eppendorf</td>
<td>2302800</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>Phenol, Tris-saturated</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Roche Diagnostics</td>
<td>3117944001</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNAse Away</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>VWR</td>
<td>17810-491</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNAse-Free DNase Set</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>79254</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>RNEasy Mini Kit</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Qiagen</td>
<td>74104</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>SuperScript&reg; First-Strand Synthesis System for RT-PCR</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>11904-018</td>
<td>&nbsp;</td>
<tr>
<td>TRIzol</td>
<td>&nbsp;</td>
<td>Invitrogen</td>
<td>15596-026</td>
<td>&nbsp;</td>		</tbody>
		</table>
		</div>

rna isolation from embryonic zebrafish and cdna synthesis for gene expression analysis

대부분의 중요하고 복잡한 실험 절차는 고품질, 손상 RNA의 입력을 필요로합니다. 타락한 샘플이나 불순물의 존재는 하류 실험 응용 프로그램에서 치명적인 결과를 초래할 수 있습니다. 그것은 우수한 샘플을 보장하기 위해 다양한 안전 및 품질 관리 검사와 견고한 기술을 사용하는 가장 중요 따라서이다. 여기에, 우리는 세부 상업 RNA 분리 키트를 사용하여 DNA와 불순물의 흔적을 제거하는 상용 화학 denaturant 이후 정리를 사용하여 전체 zebrafish의 배아에서 총 RNA를 분리하는 프로토콜. RNA는 상대적으로 불안정하고 RNAses에 의해 절단 쉽게 경향이 있으므로, 대부분의 프로토콜 분석 유전자 발현 직접 RNA의 템플릿에서 합성되는 cDNA 제품을 사용하고 있습니다. 우리는 세부 절차를 상용 키트를 사용하여보다 안정적인 cDNA 제품에 RNA를 변환합니다. 이러한 절차를 통해 샘플 강등 당하거나 오염되지 않도록하기 위해 다양한 품질 관리 검사가 없습니다. 이러한 프로토콜의 최종 제품은 microarray 분석, RT - PCR 또는 장기 보관에 적합한 것을 cDNA입니다.

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RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

양질의 절연이 손상 RNA는 많은 실험실 프로토콜에서 필수적인 단계입니다. 여기, 우리는 전체 zebrafish의 배아 및 유전자 표현 microarray 분석 등 다양한 실험 절차에 후속 응용 프로그램에 대한 cDNA 합성에서 RNA 추출을 보여줍니다.

유전자 발현 분석을위한 배아 Zebrafish 및 cDNA 합성에서 RNA 격리

Many important and complex laboratory procedures require an input of high quality, intact RNA.  A degraded sample or the presence of impurities can lead ...

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Research

JoVE Journal

Biology

37.7K 조회수.  Purdue University. 양질의 절연이 손상 RNA는 많은 실험실 프로토콜에서 필수적인 단계입니다. 여기, 우리는 전체 zebrafish의 배아 및 유전자 표현 microarray 분석 등 다양한 실험 절차에 후속 응용 프로그램에 대한 cDNA 합성에서 RNA 추출을 보여줍니다.

비디오: RNA Isolation from Embryonic Zebrafish and cDNA Synthesis for Gene Expression Analysis

The Preparation of Primary Hematopoietic Cell Cultures From Murine Bone Marrow for Electroporation

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell  electroporation system and Gene Pulser  electroporation buffer were specifically developed to transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells.This video demonstrates how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow, and then prepare them for electroporation in the MXcell system. We begin by isolating femur and tibia. Bone marrow from both femur and tibia are then harvested and cultures are established. Cultured bone marrow cells are then transfected and analyzed.

This procedure describes how to establish primary hematopoietic cell cultures from murine bone marrow and is followed by transfection using the Gene Pulser MXCell electroporation system.

Electroporation에 대한 Murine 골수에서 조혈 세포 차 문화의 준비

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser ...

연구

생물학

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Zebrafish Oligonucleotide Microarray의 플랫폼을 사용하여 글로벌 유전자 발현 분석

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Using the Gene Pulser MXcell Electroporation System to Transfect Primary Cells with High Efficiency

It is becoming increasingly apparent that electroporation is the most effective way to introduce plasmid DNA or siRNA into primary cells. The Gene Pulser MXcell electroporation system and Gene Pulser electroporation buffer (Bio-Rad) were specifically developed to easily transfect nucleic acids into mammalian cells and difficult-to-transfect cells, such as primary and stem cells. We will demonstrate how to perform a simple experiment to quickly identify the best electroporation conditions. We will demonstrate how to run several samples through a range of electroporation conditions so that an experiment can be conducted at the same time as optimization is performed. We will also show how optimal conditions identified using 96-well electroporation plates can be used with standard electroporation cuvettes, facilitating the switch from electroporation plates to electroporation cuvettes while maintaining the same electroporation efficiency. In the video, we will also discuss some of the key factors that can lead to the success or failure of electroporation experiments.

This procedure shows how to use the Gene Pulser MXcell electroporation system to rapidly and easily identify the best electroporation conditions for mouse embryonic fibroblasts (MEFs) or other primary cells. Considerations for troubleshooting are also discussed in the associated video.

고효율 기본 셀을 Transfect하는 진 Pulser Electroporation MXcell의 시스템을 사용하여

Using an Automated Cell Counter to Simplify Gene Expression Studies: siRNA Knockdown of IL-4 Dependent Gene Expression in Namalwa Cells

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only to study the effects of downregulating single genes, but also to interrogate signaling pathways and other complex interaction networks.  These pathway analyses require both the use of relevant cellular models and methods that cause less perturbation to the cellular physiology.  Electroporation is increasingly being used as an effective way to introduce siRNA and other nucleic acids into difficult to transfect cell lines and primary cells without altering the signaling pathway under investigation. There are multiple critical steps to a successful siRNA experiment, and there are ways to simplify the work while improving the data quality at several experimental stages.  To help you get started with your siRNA mediated gene knockdown project, we will demonstrate how to perform a pathway study complete from collecting and counting the cells prior to electroporation through post transfection real-time PCR gene expression analysis.  The following study investigates the role of the transcriptional activator STAT6 in IL-4 dependent gene expression of CCL17 in a Burkitt lymphoma cell line (Namalwa).  The techniques demonstrated are useful for a wide range of siRNA-based experiments on both adherent and suspension cells.  We will also show how to streamline cell counting with the TC10 automated cell counter, how to electroporate multiple samples simultaneously using the MXcell electroporation system, and how to simultaneously assess RNA quality and quantity with the Experion automated electrophoresis system.

This procedure describes a quick and easy workflow to introduce siRNA into difficult to transfect cell lines and follow gene expression by real-time PCR. Use of an automated cell counter, multi-well electroporation plate, and automated electrophoresis station provide quick and reliable results without the need for expensive robotic handling.

유전자 발현 연구를 단순화하는 자동 셀 카운터를 사용하여 : Namalwa 셀에서 IL - 4 종속 유전자 발현의 siRNA의 최저

The use of siRNA mediated gene knockdown is continuing to be an important tool in studies of gene expression.  siRNA studies are being conducted not only ...

Isolation and Culture of Cells from the Nephrogenic Zone of the Embryonic Mouse Kidney

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and to gain understanding of the origins of congenital kidney disease. More recently, the possibility of steering na&iuml;ve embryonic stem cells toward nephrogenic fates has been explored in the emerging field of regenerative medicine. Genetic studies in the mouse have identified several pathways required for kidney development, and a global catalog of gene transcription in the organ has recently been generated <a href="http://www.gudmap.org/">http://www.gudmap.org/</a>, providing numerous candidate regulators of essential developmental functions. Organogenesis of the rodent kidney can be studied in organ culture, and many reports have used this approach to analyze outcomes of either applying candidate proteins or knocking down the expression of candidate genes using siRNA or morpholinos. However, the applicability of organ culture to the study of signaling that regulates stem/progenitor cell differentiation versus renewal in the developing kidney is limited as cultured organs contain a compact extracellular matrix limiting diffusion of macromolecules and virus particles. To study the cell signaling events that influence the stem/progenitor cell niche in the kidney we have developed a primary cell system that establishes the nephrogenic zone or progenitor cell niche of the developing kidney ex vivo in isolation from the epithelial inducer of differentiation. Using limited enzymatic digestion, nephrogenic zone cells can be selectively liberated from developing kidneys at E17.5. Following filtration, these cells can be cultured as an irregular monolayer using optimized conditions. Marker gene analysis demonstrates that these cultures contain a distribution of cell types characteristic of the nephrogenic zone in vivo, and that they maintain appropriate marker gene expression during the culture period. These cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which greatly facilitates the study of candidate stem/progenitor cell regulator effects. Basic cell biological parameters such as proliferation and cell death as well as changes in expression of molecular markers characteristic of nephron stem/progenitor cells in vivo can be successfully used as experimental outcomes. Ongoing work in our laboratory using this novel primary cell technique aims to uncover basic mechanisms governing the regulation of self-renewal versus differentiation in nephron stem/progenitor cells.

In this report we describe a method for the isolation and culture of the progenitor cell niche from the embryonic mouse kidney that can be used to study signaling pathways regulating stem/progenitor cells of the developing kidney. These cultured cells are highly accessible to small molecule and recombinant protein treatment, and importantly also to viral transduction, which allows efficient manipulation of candidate pathways.

배아 마우스 신장의 Nephrogenic 지대의 세포의 분리 및 문화

Embryonic development of the kidney has been extensively studied both as a model for epithelial-mesenchymal interaction in organogenesis and  to gain ...

Metabolic Labeling of Newly Transcribed RNA for High Resolution Gene Expression Profiling of RNA Synthesis, Processing and Decay in Cell Culture

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene expression. Along with a better understanding of the involved molecular mechanisms, precise measurements of the underlying kinetics have become increasingly important. Here, these powerful methodologies face major limitations due to intrinsic properties of the template samples they study, i.e. total cellular RNA. In many cases changes in total cellular RNA occur either too slowly or too quickly to represent the underlying molecular events and their kinetics with sufficient resolution. In addition, the contribution of alterations in RNA synthesis, processing, and decay are not readily differentiated.
We recently developed high-resolution gene expression profiling to overcome these limitations. Our approach is based on metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine (thus also referred to as 4sU-tagging) followed by rigorous purification of newly transcribed RNA using thiol-specific biotinylation and streptavidin-coated magnetic beads. It is applicable to a broad range of organisms including vertebrates, Drosophila, and yeast. We successfully applied 4sU-tagging to study real-time kinetics of transcription factor activities, provide precise measurements of RNA half-lives, and obtain novel insights into the kinetics of RNA processing. Finally, computational modeling can be employed to generate an integrated, comprehensive analysis of the underlying molecular mechanisms.

Total cellular RNA provides a poor template for studying short-term changes in RNA synthesis and decay as well as the kinetics of RNA processing. Here, we describe metabolic labeling of newly transcribed RNA with 4-thiouridine followed by thiol-specific biotinylation and purification of newly transcribed RNA allowing to overcome these limitations.

세포 배양에서 RNA 합성, 처리 및 부패의 높은 해상도 유전자 발현 프로파일에 대한 새로 전사 RNA 대사 라벨링

The development of whole-transcriptome microarrays and next-generation sequencing has revolutionized our understanding of the complexity of cellular gene ...

Analysis of Embryonic and Larval Zebrafish Skeletal Myofibers from Dissociated Preparations

The zebrafish has proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and for studying human muscle diseases. Despite the many advantages offered by in vivo analysis of skeletal muscle in the zebrafish, visualizing the complex and finely structured protein milieu responsible for muscle function, especially in whole embryos, can be problematic. This hindrance stems from the small size of zebrafish skeletal muscle (60 &mu;m) and the even smaller size of the sarcomere. Here we describe and demonstrate a simple and rapid method for isolating skeletal myofibers from zebrafish embryos and larvae. We also include protocols that illustrate post preparation techniques useful for analyzing muscle structure and function. Specifically, we detail the subsequent immunocytochemical localization of skeletal muscle proteins and the qualitative analysis of stimulated calcium release via live cell calcium imaging. Overall, this video article provides a straight-forward and efficient method for the isolation and characterization of zebrafish skeletal myofibers, a technique which provides a conduit for myriad subsequent studies of muscle structure and function.

Zebrafish are an emerging system for modeling human disorders of the skeletal muscle. We describe a fast and efficient method to isolate skeletal muscle myofibers from embryonic and larval zebrafish. This method yields a high-density myofiber preparation suitable for study of single skeletal muscle fiber morphology, protein subcellular localization, and muscle physiology.

해리 된 준비에서 배아와 애벌레 Zebrafish의 골격 근섬유의 분석

The zebrafish has  proven to be a valuable model system for exploring skeletal muscle function and  for studying human muscle diseases. Despite  the many ...

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene expression in these tissues. Thus, to analyze cell-specific gene expression profiles from Drosophila tissues, it may be necessary to isolate specific cell types with high purity and at sufficient yields for downstream applications such as transcriptional profiling and chromatin immunoprecipitation. However, the irregular cellular morphology in tissues such as the central nervous system, coupled with the rare population of specific cell types in these tissues, can pose challenges for traditional methods of cell isolation such as laser microdissection and fluorescence-activated cell sorting (FACS). Here, an alternative approach to characterizing cell-specific gene expression profiles using affinity-based isolation of tagged nuclei, rather than whole cells, is described. Nuclei in the specific cell type of interest are genetically labeled with a nuclear envelope-localized EGFP tag using the Gal4/UAS binary expression system. These EGFP-tagged nuclei can be isolated using antibodies against GFP that are coupled to magnetic beads. The approach described in this protocol enables consistent isolation of nuclei from specific cell types in the Drosophila larval central nervous system at high purity and at sufficient levels for expression analysis, even when these cell types comprise less than 2% of the total cell population in the tissue. This approach can be used to isolate nuclei from a wide variety of Drosophila embryonic and larval cell types using specific Gal4 drivers, and may be useful for isolating nuclei from cell types that are not suitable for FACS or laser microdissection.

Affinity-based Isolation of Tagged Nuclei from Drosophila Tissues for Gene Expression Analysis

Drosophila tissues often contain a heterogeneous mixture of cell types.&#160;To examine gene expression in specific cell types from a particular tissue, nuclei can be genetically tagged and subsequently isolated using an affinity-based approach. Isolated nuclei can be used for downstream applications such as gene expression analysis and chromatin immunoprecipitation.

에서 태그가 핵의 선호도 기반 격리<em&gt; 초파리</em유전자 발현 분석을위한&gt; 조직

Drosophila melanogaster embryonic and larval tissues often contain a highly heterogeneous mixture of cell types, which can complicate the analysis of gene ...

Analysis of Global RNA Synthesis at the Single Cell Level following Hypoxia

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a particular transcriptional program in order to mount an appropriate and coordinated cellular response. The cell possesses several oxygen sensor enzymes that require molecular oxygen as cofactor for their activity. These range from prolyl-hydroxylases to histone demethylases. The majority of studies analyzing cellular responses to hypoxia are based on cellular populations and average studies, and as such single cell analysis of hypoxic cells are seldom performed. Here we describe a method of analysis of global RNA synthesis at the single cell level in hypoxia by using Click-iT RNA imaging kits in an oxygen controlled workstation, followed by microscopy analysis and quantification.&nbsp; Using cancer cells exposed to hypoxia for different lengths of time, RNA is labeled and measured in each cell. This analysis allows the visualization of temporal and cell-to-cell changes in global RNA synthesis following hypoxic stress.

We describe a technique for analysis of global RNA synthesis in hypoxia using imaging. Click-chemistry labeling of RNA has not previously been performed under hypoxia and allows visualization of global RNA changes at the single cell level. This approach complements the existing averaged RNA techniques, allowing direct visualization of cell-to-cell changes in global RNA synthesis.

저산소증에 따라 단일 세포 수준에서 글로벌 RNA의 합성 분석

Hypoxia or lowering of the oxygen availability is involved in many physiological and pathological processes. At the molecular level, cells initiate a ...

Targeted RNA Sequencing Assay to Characterize Gene Expression and Genomic Alterations

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding RNAs. Standard RNAseq requires 30 - 100 million sequencing reads and can include multiple RNA products such as mRNA and noncoding RNAs. We demonstrate how targeted RNAseq (capture) permits a focused study on selected RNA products using a desktop sequencer. RNAseq capture can characterize unannotated, low, or transiently expressed transcripts that may otherwise be missed using traditional RNAseq methods. Here we describe the extraction of RNA from cell lines, ribosomal RNA depletion, cDNA synthesis, preparation of barcoded libraries, hybridization and capture of targeted transcripts and multiplex sequencing on a desktop sequencer. We also outline the computational analysis pipeline, which includes quality control assessment, alignment, fusion detection, gene expression quantification and identification of single nucleotide variants. This assay allows for targeted transcript sequencing to characterize gene expression, gene fusions, and mutations.

We describe a targeted RNA sequencing-based method that includes preparation of indexed cDNA libraries, hybridization and capture with custom probes and data analysis to interrogate selected transcripts for gene expression, mutations, and gene fusions. Targeted RNAseq permits cost-effective, rapid evaluation of selected transcripts on a desktop sequencer.

RNA 시퀀싱 분석은 유전자 발현 및 게놈 변경을 특성화를 대상으로

RNA sequencing (RNAseq) is a versatile method that can be utilized to detect and characterize gene expression, mutations, gene fusions, and noncoding ...