우리는 아주 많이 룽 자오, Jie Li 및 연 잉의 도움 주셔서 감사합니다.

이러한 연구 관리 및 사용의 실험실 동물 건강의 국가 학회에 의해 출판 및 동물 프로토콜 승인 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (IACUC)에 대 한 가이드에 따라 실시 했다 베일 러 의과대학 프로토콜의 번호는-4203.
 1. 초음파 임신 마우스의 준비 1700 후 <ol><ol><li>장소 입증 된 비옥한 남성으로 댐 짝짓기 타임 <li>마우스 하룻밤 시작. 별도 댐 및 남성 0700 시간 (h)에 관계 없이 있으면 질 플러그, 임신의 정확한 데이트 되도록. 
		참고: 0.5 일 것으로 간주 됩니다 짝짓기 후 아침 게시물 coitum (d.p.c.).</li>
	</ol></li> <li>초음파에 대 한 준비 <ol><li>봉인된 마 취 유도 컨테이너에 임신 마우스를 놓습니다.</li>
		<li>Isoflurane (2%) 흡입 마 취 제 및 산소 (1 L/min) 동물 잃는다 righting 반사 (약 1-2 분 크기에 따라 마우스의)와 자발적인 움직임 (호흡) 외에 나타나지 않으면 때까지 Sedate.</li>
		<li>장소 진정 마우스 원뿔 isoflurane (2%)와 흡입 마 취 제 및 산소 (1 L/min)에서 부정사의 위치에서. 동물 안과 연 고를 적용 &#39; s 눈.</li>
		<li>, 면봉으로 전체 복 부, 질, 하 흉 골을 depilatory 크림을 적용 하 고 측면에 측면.</li>
		<li>크림 최대 3 분 동안 유지 하 고 크림와 조직으로 머리 제거. 모든 머리 제거 되도록 모든 나머지 머리 이미지 품질 저하 됩니다 있으므로.</li>
	</ol></li></ol> 2. 초음파 무대의 준비 <ol><li>변환기 설정.</li>
	<li>변환기에 연결할 3 차원 모터 단계 모터 단계.
	3D 모터 커넥터 후면 패널에 3D 모터 케이블을 연결 하 여 <ol><li>3D로 플러그 모터. 3D 모터 시스템 이미징 역에 연결 하는 상단에 빠른 릴리스 게시물을 사용 하 여 장착 시스템에 연결 및 변환기 클램프 부착 하 하단에 빠른 릴리스.</li>
	</ol></li> <li>변환기 클램프 프로브 연결.</li></ol>
 3. 임신 마우스 이미징 시작 <ol><li>장소 마우스 모니터링 플랫폼에 부정사. 마우스 지속적으로 받는 isoflurane 마 취 (사이 1.5-2.5%)와 산소 (1 L/min) 코 콘을 통해. 부드럽게 심장 박동 모니터링 플랫폼에 패드를 모든 발 테이프.
	<ol><li>복 부에 초음파 전송 젤의 1-2 mL를 적용.</li>
	</ol></li> <li>더 낮은 복 부에 초음파 프로브 위치 수동 모터 단계를 사용 하 여.
	<ol><li>질을 그냥 cephalad 액체가 채워진 어두운 원형으로 나타납니다 방광을 찾습니다.</li>
		<li>일단 방광이 위치, 이동 조사 매우 느리게 cephalad 임신 사이트에서 둥근 분야와 원통형 모양으로 나타납니다 임신 자 궁을 시각화. 이 체인에 진주 처럼 보이는으로 기술 될 수 있다.</li>
		<li>임신 자 궁을 확인 한 시작 2 차원 이미징.</li>
	</ol></li></ol> 4. 2 차원 초음파 영상 (그림 1) <ol><li>임신 자 궁을 확인 한 방광에 가까운 임신 사이트에서 시작 하 고 천천히 그리고 순차적으로 이동 cephalad 수와 임신 사이트의 위치를 결정.</li>
	<li>신장, 비장, 또는 간 시각는 경우 프로브 위치 가까이 꼬리 (가까이 방광) 사용자 cephalad 너무 멀리 간.</li>
	<li>Contralateral 자 궁 경적 같은 방식으로 이미지.</li>
	<li>고정 이미지 초음파 프레임 나중 분석 및 측정 하기 주입/임신 사이트의 중심에 있을 때. 
	참고: 냉동 하 여 나중에 분석을 위해 저장 된 이미지에 대 한 1 초 미만의 걸립니다.</li>
	<li>측정 이식 거리에 수동으로 클릭 하 여 hyperechoic decidualization 반응 마커로 사용 하는 &#34; 측정 &#34; 도구를 먼저, 그리고 하나의 이식 사이트의 위치에 클릭. 다음, 다음 이식 사이트를 컴퓨터 것입니다 자동으로 거리를 보고 선 그리기를 클릭 하 여 커서를 끌어. 소프트웨어 다음 수동 측정은 보고 합니다. 이 단계는 전산화 하지 하지만 프로그램 측정 대 한을 제공 합니다 decidualized 사이트 사이의 선을 그려 decidualized 사이트 사이의 거리를 표시 하는 사용자에 의존</li>
	<li>이식 크기, 임신 낭 크기 및 태아 극 크기 측정.</li>
</ol> 5. 태아 심장 박동 참고: 9.5 d.p.c.에서 태아 심장 박동 한다 명확 하 게 시각화.
<ol><li>프로브를 매우 여전히 유지 하면서 펄스 파 도플러에 설정 하 고 보이는 심장 박동이 놓고.</li>
	<li>레코드는 심장 심장 박동 pulsations. 
	참고: 심장은 그렇다 하 고이 절차 또한 기록할 수 pulsations 탯.</li>
</ol> 6. 3 차원 초음파 수집 <ol><li>임신 자 궁에 2 차원 영상 시각 되었습니다 후 원하는 3 차원 이미지의 대략 중간 지점에 있는 지역에 프로브를 위치. 예를 들어 3 차원에서 사과 이미징 했다 하나, 경우 프로브 처음 배치 해야 어디 애플 코어 (즉, 개체의 중간)를 찾을 수 전망 이다.</li>
	<li>이미지의 중간에 원하는 위치에서 프로브와 3 차원 획득 얻을. 3 차원 모터 단계는 일련의 단계 또는 프레임에 자 궁이이 거리 여행 것입니다, 전체에서 캡처는 의도로 어떤 탐정 욕망.</li>
	<li>의도 구조 실시간 초음파 부분을 완료 하기 전에 3 차원 스캔에 캡처됩니다 완전히 확인. 나중에 후 처리에 대 한 3 차원 정보를 저장 합니다. 2 차원 및 3 차원 초음파 수집에 대 한 총 시간은 약 10 ~ 20 분 숙련된 된 사용자에 의해 수행 될 때.</li>
</ol> 7. 3 차원 재구성 후 처리 (그림 2) <ol><li>3 차원 이미지 처리에 대 한 원하는 데이터 로드.</li>
	<li>선택 &#34; 병렬 및 회전 메서드 &#34;는 하나의 3 차원으로 모든 3D 이미지 프레임을 로드 합니다 &#34; 상자 &#34; 사용자 다음 프레임으로 프레임에 원하는 개체를 추적 한다. 단계 선택 0.08 mL 크기. 이미지 블록의 한쪽 끝에서 시작 하 고 공간 내에서 캡처한 이미지를 스크롤할.
	<ol><li>이미지와 수동으로 추적 개체의 개요의 한쪽 끝에서 시작.</li>
		<li>다음 2 차원 이미지 슬라이스를 스크롤 또는 &#34; 프레임 &#34; 수동으로 추적 개체의 개요.</li>
		<li>모든 프레임 수동으로 주석/추적 사용자 되었습니다 때까지이 과정을 계속.</li>
		<li>클릭 &#34; 완료 &#34; 3 차원 이미지 및 전체 볼륨 계산.</li>
	</ol></li> <li>메쉬 및 고체 중첩, 왼쪽된 상단 모서리에 있는 화살표는 사이 선택.</li>
	<li>유지 하거나 선명도 대 한 주변 초음파 이미지 정보를 제거 하려면 선택 합니다. 각 3 차원 재구성 10 그리고 20 분 사이 걸릴 수 있습니다</li>
</ol> 8. 포스트 절차적 케어 <ol><li>초음파 완료 되 면 마 취 가스를 해제, 플랫폼에서 마우스를 제거 하 고 부드럽게 닦 고 동물에서 어떤 초음파 젤을 씻어.</li>
	<li>패딩된 영역 내에서 발생 하기 쉬운 위치에 장에 다시 마우스를 놓습니다. 때까지 동물 깨어 이동 자발적 모니터링.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Rai, R., Regan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recurrent+miscarriage.">Recurrent miscarriage.</a> Lancet. 368 (9535), 601-611 (2006).</li><li>Sugiura-Ogasawara, M., Ozaki, Y., Suzumori, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Management+of+recurrent+miscarriage.">Management of recurrent miscarriage.</a> J Obstet Gynaecol Res. 40 (5), 1174-1179 (2014).</li><li>Kutteh, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+strategies+for+the+management+of+recurrent+pregnancy+loss.">Novel strategies for the management of recurrent pregnancy loss.</a> Semin Reprod Med. 33 (3), 161-168 (2015).</li><li>Page, J. M., Silver, R. 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E., Hildebrandt, T. B., Kuhl, A. A., Drews, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+detection+and+staging+of+spontaneous+embryo+resorption+by+ultrasound+biomicroscopy+in+murine+pregnancy.">Early detection and staging of spontaneous embryo resorption by ultrasound biomicroscopy in murine pregnancy.</a> Reprod Biol Endocrinol. 12, 38 (2014).</li><li>Nguyen, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estimation+of+mouse+fetal+weight+by+ultrasonography:+application+from+clinic+to+laboratory.">Estimation of mouse fetal weight by ultrasonography: application from clinic to laboratory.</a> Lab Anim. 46 (3), 225-230 (2012).</li><li>Singh, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+volumetric+imaging+of+normal,+neoplastic+and+hyperplastic+mouse+prostate+using+ultrasound.">Quantitative volumetric imaging of normal, neoplastic and hyperplastic mouse prostate using ultrasound.</a> BMC Urol. 15, 97 (2015).</li><li>Liu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrasound-mediated+destruction+of+paclitaxel+and+oxygen+loaded+lipid+microbubbles+for+combination+therapy+in+ovarian+cancer+xenografts.">Ultrasound-mediated destruction of paclitaxel and oxygen loaded lipid microbubbles for combination therapy in ovarian cancer xenografts.</a> Cancer Lett. 361 (1), 147-154 (2015).</li><li>Ni, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+Prostate+Tumor+Growth+in+an+Orthotopic+Mouse+Model+Using+Three-Dimensional+Ultrasound+Imaging+Technique.">Monitoring Prostate Tumor Growth in an Orthotopic Mouse Model Using Three-Dimensional Ultrasound Imaging Technique.</a> Transl Oncol. 9 (1), 41-45 (2016).</li><li>Peavey, M. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+High-Frequency+Ultrasonography+for+Early+Detection+and+Characterization+of+Embryo+Implantation+Site+Development+in+the+Mouse.">Three-Dimensional High-Frequency Ultrasonography for Early Detection and Characterization of Embryo Implantation Site Development in the Mouse.</a> PLoS One. 12 (1), e0169312 (2017).</li><li>Song, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytosolic+phospholipase+A2alpha+is+crucial+[correction+of+A2alpha+deficiency+is+crucial]+for+'on-time'+embryo+implantation+that+directs+subsequent+development.">Cytosolic phospholipase A2alpha is crucial [correction of A2alpha deficiency is crucial] for 'on-time' embryo implantation that directs subsequent development.</a> Development. 129 (12), 2879-2889 (2002).</li><li>Nallasamy, S., Li, Q., Bagchi, M. K., Bagchi, I. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Msx+homeobox+genes+critically+regulate+embryo+implantation+by+controlling+paracrine+signaling+between+uterine+stroma+and+epithelium.">Msx homeobox genes critically regulate embryo implantation by controlling paracrine signaling between uterine stroma and epithelium.</a> PLoS Genet. 8 (2), e1002500 (2012).</li><li>Hirate, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+Sox17+haploinsufficiency+leads+to+female+subfertility+due+to+impaired+implantation.">Mouse Sox17 haploinsufficiency leads to female subfertility due to impaired implantation.</a> Sci Rep. 6, 24171 (2016).</li><li>Wang, T. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulated+LIF-STAT3+pathway+is+responsible+for+impaired+embryo+implantation+in+a+Streptozotocin-induced+diabetic+mouse+model.">Dysregulated LIF-STAT3 pathway is responsible for impaired embryo implantation in a Streptozotocin-induced diabetic mouse model.</a> Biol Open. 4 (7), 893-902 (2015).</li><li>Ji, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Onset+of+cardiac+function+during+early+mouse+embryogenesis+coincides+with+entry+of+primitive+erythroblasts+into+the+embryo+proper.">Onset of cardiac function during early mouse embryogenesis coincides with entry of primitive erythroblasts into the embryo proper.</a> Circ Res. 92 (2), 133-135 (2003).</li><li>Srinivasan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noninvasive,+in+utero+imaging+of+mouse+embryonic+heart+development+with+40-MHz+echocardiography.">Noninvasive, in utero imaging of mouse embryonic heart development with 40-MHz echocardiography.</a> Circulation. 98 (9), 912-918 (1998).</li><li>Franco, N. H., Olsson, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scientists+and+the+3Rs:+attitudes+to+animal+use+in+biomedical+research+and+the+effect+of+mandatory+training+in+laboratory+animal+science.">Scientists and the 3Rs: attitudes to animal use in biomedical research and the effect of mandatory training in laboratory animal science.</a> Lab Anim. 48 (1), 50-60 (2014).</li><li>Pratap, K., Singh, V. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+training+course+on+laboratory+animal+science:+an+initiative+to+implement+the+Three+Rs+of+animal+research+in+India.">A training course on laboratory animal science: an initiative to implement the Three Rs of animal research in India.</a> Altern Lab Anim. 44 (1), 21-41 (2016).</li><li>Landi, M. S., Shriver, A. J., Mueller, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Consideration+and+checkboxes:+incorporating+ethics+and+science+into+the+3Rs.">Consideration and checkboxes: incorporating ethics and science into the 3Rs.</a> J Am Assoc Lab Anim Sci. 54 (2), 224-230 (2015).</li></ol>

저자는 공개 없다.

3 차원 HFUS 이미징의 소설의 사용이 성공적으로 감지, 시각화, 및 비-침략 적 방법으로 배아 이식 사이트 murine 임신 초기 동안 특성의 수를 보여 줍니다. 기술 총 조직 및 조직 특성에 대 한 임신의 중단에 의존 하는 현재의 방법에 비해 상당한 개선을 제공 합니다. 그러나 그 조직학 방법 아직도 간주 됩니다 더 최적의 특성 더 확대 하 고 더 많은 세포 수준에서 원하는 때 또는 때 유전자와 단백질 ?...

재발 이른 임신 손실 하나 가장 일반적인 합병증의 임신 후 이며1,2임신을 하려고 하는 커플의 약 1%에 영향을 미칩니다. 이른 임신 손실의 기본 메커니즘 변화 된다: 내장 배아 이상 및 모성 comorbidities 자궁내 막 감수1,,34에 결함에서. 그들의 유전 추적성 때문에 마우스 모델 초기 배아 이식 및 임신의 수사를 위해 널리 이용 되어 있다. 또한, 마우스와 대규모 연구를 수행 하는 능력의 짧은 임신 시간 인간의 생식 의학5핵심 임상 질문 해결에 마우스의 성장 유틸리티를 보장입니다. 즉, murine 실험적인 디자인의 대다수 여전히 요구 순차적 임신 일 임신6, 동안 주입 사이트 위치, 번호, 크기 및 간격 패턴을 분석 하 고 계량 하에 안락사를 수많은 댐 7,8, 따라서 제외 같은 동물에 대 한 경도 연구.
병원에서 초음파는 인간의 태아 생존 능력 및 비-침략 적 방식으로9,,1011개발 모니터링 하 고 귀중 한 도구 이다. 더 최근에, 높은-주파수 초음파 (HFUS) 태아 생존 능력 및 임신12,,1314동안 모니터링을 위한 방법으로 마우스에 제한 된 응용 프로그램을 찾을 시작 했다. 초음파 영상에서 최근의 기술 진보는 동물 장기의 시각적 재구성 및 pathologies15,16의 후속 모니터링에 대 한 3 차원 (3 차원) 데이터의 응용 프로그램을 허용 했 17. 이 고급 이미징 기술의 사용은 현저 하 게 작은 볼륨 변동을 줄이고 간 동물 다양성, 모니터는 병의 진행 이나 치료 적 개입17의 효능을 검색 하는 힘을 향상 시켰다. 이 기술의 기본 유틸리티 oncomouse 모델15,16암 진행 모니터링 하고있다, 반면 3 차원 HFUS 이미징 최근에 quantitate 배아 이식의 활성 증가 모니터링 하 사용 되었습니다. 그리고18의 마우스 자 궁 태아의 개발.
여기, HFUS 2 차원 및 3 차원 데이터를 생성 이미징 생성 초기 임신 마우스 자 궁의 개조를 수행 하는 방법을 보여 줍니다. 비-침략 적 방식으로 데이터를 수집 하는 연구를 수 있도록이 소설 방법 임신 종료 하지 않고도 이러한 초기 배아 이식 이벤트 감지의 유틸리티를 설명 합니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>VisualSonics Vevo 2100 Ultrasound Imaging Platform/Machine</td>
			<td>VisualSonics, inc.</td>
			<td>VS-11945</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vevo Imaging Station</td>
			<td>VisualSonics, inc.</td>
			<td>SA-11982</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aquasonic 100 Ultrasound Transmission Gel</td>
			<td>Parker</td>
			<td>#SKU PLI 01-08</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isoflurane (IsoThesia) 100mL bottle</td>
			<td>Henry Shein</td>
			<td>#29404</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PuraLubenAnimal Ophthalmic Ointment</td>
			<td>Dechra</td>
			<td>#12920060</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a novel use of three-dimensional high-frequency ultrasonography for early pregnancy characterization in the mouse

높은 주파수 초음파 (HFUS) 비 접촉 utero에인간 태아의 실시간 개발을 모니터링 하는 일반적인 방법입니다. 마우스 배아 착상과 임신 진행을 vivo에서 모델 정기적으로 사용 됩니다. 불행히도, 이러한 murine 연구 후속 phenotypic 분석을 임신 중단을 요구. 이 문제를 해결 하려면 우리는 HFUS 조기 발견 및 murine 배아 이식 사이트 및 그들의 개인적인 발달 진행 utero의 특성화에 대 한 데이터를 이미징의 3 차원 (3 차원) 재구성을 사용 합니다. 3 차원 개조와 HFUS 이미징 및 모델링을 결합 수 있었습니다 정확 하 게 계량 배아 이식 사이트 번호로 9.5 d.p.c. 통해 5.5 일 포스트 성교 (d.p.c.)에서 임신 C57BL6J/129S 마우스에 발달 진행 모니터링 와 변환기의 사용. 포함 하는 측정: 번호, 위치, 및 간 이식 사이트 간격; 이식 사이트의 볼륨 태아 생존 능력은 심장 활동을 모니터링 하 여 평가 했다. 즉시 포스트 주입 기간 (5.5 8.5 d.p.c.), 메쉬 및 고체 오버레이 벗 자 궁의 3 차원 재구성 형식 각 자 궁 경적 내 개발 임신의 시각적 표현을 사용할 수 있습니다. 유전자 조작된 생쥐 여성 생식 고기 자 궁 기능 장애에서 파생 하는 데 사용할 계속,이 방법은 검색 하 고, 계량, 초기 이식 이벤트에서 vivo에서성격에 새로운 접근 방식을 제공 합니다. 3 차원 HFUS 이미징의 소설의 사용이 성공적으로 감지, 시각화, 및 비-침략 적 방법으로 배아 이식 사이트 murine 임신 초기 동안 특성의 수를 보여 줍니다. 기술 총 조직 및 조직 특성에 대 한 임신의 중단에 의존 하는 현재의 방법에 비해 상당한 개선을 제공 합니다. 여기 비디오와 텍스트 형식을 사용 하 여 성공적으로 메쉬 및 고체 3 차원 이미지에서 재건의 자 궁 형태와 안정적이 고 재현 가능한 데이터를 생성 하는 murine 임신 초기의 초음파를 수행 하는 방법을 설명 하.

그림 1에서처럼 높은 주파수 초음파 이식 사이트 개발 시작 초기 5.5 d.p.c 시간 지점으로 검색할 수 있습니다. 밝은 hyperechoic를 사용 하 여 decidualized endometrium 6.5 d.p.c에서 이식 사이트의 표식으로 이식 사이트 및 이러한 사이트를 측정할 수의 간격의 수가 있습니다. 임신으로 7.5 d.p.c., 어두운 hypoechoic 임신 낭 및 태아 극 진행 쉽게 식별할 수 있습니다.</p...

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A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

마우스에서 초기 임신 특성에 대 한 3 차원 높은-주파수 초음파의 새로운 사용

마우스 널리 임신 생물학을 공부 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 임신 종료는 이러한 연구는 경도 조사 하는 걸로 하 고 동물의 큰 숫자의 사용을 필요로 필요 합니다. 따라서 조기 발견에 대 한 높은 주파수 초음파의 비-침략 적 기법 및 임신 마우스에서 후 이식 이벤트 모니터링 설명 합니다.

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

8.1K 조회수.  Baylor College of Medicine. 마우스 널리 임신 생물학을 공부 하는 데 사용 됩니다. 그러나, 임신 종료는 이러한 연구는 경도 조사 하는 걸로 하 고 동물의 큰 숫자의 사용을 필요로 필요 합니다. 따라서 조기 발견에 대 한 높은 주파수 초음파의 비-침략 적 기법 및 임신 마우스에서 후 이식 이벤트 모니터링 설명 합니다.

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Contrast Imaging in Mouse Embryos Using High-frequency Ultrasound

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted applications, facilitate the detection and measure of vascular biomarkers at the molecular level. Within the mouse embryo, this noninvasive technique may be used to uncover basic mechanisms underlying vascular development in the early mouse circulatory system and in genetic models of cardiovascular disease. The mouse embryo also presents as an excellent model for studying the adhesion of microbubbles to angiogenic targets (including vascular endothelial growth factor receptor 2 (VEGFR2) or &#945;v&#946;3) and for assessing the quantitative nature of molecular ultrasound. We therefore developed a method to introduce ultrasound contrast agents into the vasculature of living, isolated embryos. This allows freedom in terms of injection control and positioning, reproducibility of the imaging plane without obstruction and motion, and simplified image analysis and quantification. Late gestational stage (embryonic day (E)16.6 and E17.5) murine embryos were isolated from the uterus, gently exteriorized from the yolk sac and microbubble contrast agents were injected into veins accessible on the chorionic surface of the placental disc. Nonlinear contrast ultrasound imaging was then employed to collect a number of basic perfusion parameters (peak enhancement, wash-in rate and time to peak) and quantify targeted microbubble binding in an endoglin mouse model. We show the successful circulation of microbubbles within living embryos and the utility of this approach in characterizing embryonic vasculature and microbubble behavior.

Here, we present a protocol to inject ultrasound microbubble contrast agents into living, isolated late-gestation stage murine embryos. This method enables the study of perfusion parameters and of vascular molecular markers within the embryo using contrast-enhanced high-frequency ultrasound imaging.

고주파 초음파를 사용하여 마우스 태아에 대비 이미징

Ultrasound contrast-enhanced imaging can convey essential quantitative information regarding tissue vascularity and perfusion and, in targeted ...

연구

발생학

Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

마우스 자궁에서 임신 기간 동안 산모의 혈관 재 평가

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

Horizontal Whole Mount: A Novel Processing and Imaging Protocol for Thick, Three-dimensional Tissue Cross-sections of Skin

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality microscopic images is not entirely dependent upon the quality of the microscope, but also upon the methods of tissue processing, which often involve multiple critical actions or steps. Furthermore, mesenchymal cell types in the skin and other tissues represent a new challenge for tissue preparation and imaging. Here, we present a complete process, from tissue harvest to microscopy. Our technique, called &#34;horizontal whole mount,&#34; is one that novices can quickly become proficient in and that allows for antigen preservation and detection in 60-300 &#181;m-thick sections cut with a cryostat. Sections of this thickness provide enhanced visualization of tissue microarchitecture in a three-dimensional environment. In addition, the protocol preserves mesenchymal cells in a manner that enhances image quality when compared to standard cryostat or paraffin sections, thereby increasing the efficacy and reliability of immunostaining. We believe that this protocol will benefit all laboratories that visualize skin, and possibly other tissues and organs.

This work presents a novel processing and imaging protocol for thick, three-dimensional tissue cross-section analysis that enables the full exploitation of confocal imaging modalities. This protocol preserves antigenicity and represents a robust system to analyze skin histology and potentially other tissue types.

수평 한 전체적인 거치 : 피부의 두껍고, 3 차원 조직 단면도를위한 비발 한 가공 그리고 화상 진찰 의정서

Processing a tissue of interest to generate a microscopic image that supports a scientific argument can be challenging. The acquisition of high-quality ...

Three-dimensional Rendering and Analysis of Immunolabeled, Clarified Human Placental Villous Vascular Networks

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that makes up much of the parenchyma of the human placenta. The distal villous capillary network is the terminus of the fetal blood supply after several generations of branching of vessels extending out from the umbilical cord. This network has a contiguous cellular sheath, the syncytial trophoblast barrier layer, which prevents mixing of fetal blood and the maternal blood in which it is continuously bathed. Insults to the integrity of the placental capillary network, occurring in disorders such as maternal diabetes, hypertension and obesity, have consequences that present serious health risks for the fetus, infant, and adult. To better define the structural effects of these insults, a protocol was developed for this study that captures capillary network structure on the order of 1 - 2 mm3 wherein one can investigate its topological features in its full complexity. To accomplish this, clusters of terminal villi from placenta are dissected, and the trophoblast layer and the capillary endothelia are immunolabeled. These samples are then clarified with a new tissue clearing process which makes it possible to acquire confocal image stacks to z- depths of ~1 mm. The three-dimensional renderings of these stacks are then processed and analyzed to generate basic capillary network measures such as volume, number of capillary branches, and capillary branch end points, as validation of the suitability of this approach for capillary network characterization.

This study presents a protocol for the reversible tissue clearing, immunostaining, 3D-rendering and analysis of vascular networks in human placenta villi samples on the order of 1 - 2 mm3.

3 차원 렌더링 및 Immunolabeled, 분석 인간 Placental Villous 혈관 네트워크를 명확히

Nutrient and gas exchange between mother and fetus occurs at the interface of the maternal intervillous blood and the vast villous capillary network that ...

Three-dimensional Inflammatory Human Tissue Equivalents of Gingiva

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental physiopathology of periodontal diseases. Current experimental models of periodontal diseases have been established in various types of animals. However, the physiopathology of animal models is different from that of humans, making it difficult to analyze cellular and molecular mechanisms and evaluate new medicines for periodontal diseases. Here, we present a detailed protocol for reconstructing human inflammatory tissue equivalents of gingiva (iGTE) in vitro. We first build human tissue equivalents of gingiva (GTE) by utilizing two types of human cells, including human gingival fibroblasts (HGF) and human skin epidermal keratinocytes (HaCaT), under three-dimensional conditions. We create a wound model by using a tissue puncher to punch a hole in the GTE. Next, human THP-1 monocytes mixed with collagen gel are injected into the hole in the GTE. By adimistration of 10 ng/mL phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) for 72 h, THP-1 cells differentiated into macrophages to form inflammatory foci in GTE (iGTE) (IGTE also can be stumilated with 2 &#181;g/mL of lipopolysaccharides (LPS) for 48 h to initiate inflammation). IGTE is the first in vitro model of inflammatory gingiva using human cells with a three-dimensional architecture. IGTE reflects major pathological changes (immunocytes activition, intracellular interactions among fibryoblasts, epithelial cells, monocytes and macrophages) in periodontal diseases. GTE, wounded GTE, and iGTE can be used as versatile tools to study wound healing, tissue regeneration, inflammation, cell-cell interaction, and screen potential medicines for periodontal diseases.

The goal of the protocol is to build an inflammatory human gingiva model in vitro. This tissue model co-cultivates three types of human cells, HaCaT keratinocytes, gingival fibroblasts, and THP-1 macrophages, under three-dimensional conditions. This model can be applied to investigating periodontal diseases, such as gingivitis and periodontitis.

3 차원 선 동적인 인간 조직 Gingiva 등가물

Periodontal diseases (such as gingivitis and periodontitis) are the leading causes of tooth loss in adults. Inflammation in gingiva is the fundamental ...

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound (30/45MHZ) System

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular mechanisms of CHDs is&#160;crucial for inventing new preventive and therapeutic strategies. Mutant mouse models are powerful tools to discover new&#160;mechanisms&#160;and environmental stress modifiers that drive cardiac development and their potential&#160;alteration in CHDs. However, efforts to establish the causality of these putative contributors have been limited to histological&#160;and molecular studies&#160;in non-survival animal experiments, in which&#160;monitoring the key physiological and hemodynamic parameters is&#160;often absent. Live imaging technology has become an essential tool to establish the&#160;etiology of CHDs. In particular,&#160;ultrasound imaging can be used prenatally without surgically exposing the fetuses,&#160;allowing maintaining&#160;their baseline physiology while monitoring the impact of environmental stress&#160;on the hemodynamic and structural aspects of cardiac chamber development. Herein, we use the High-Frequency Ultrasound (30/45)&#160;system to examine the cardiovascular system in fetal mice at E18.5 in utero at the baseline and in response to prenatal hypoxia exposure. We demonstrate the feasibility of the system to measure cardiac chamber size, morphology, ventricular function, fetal heart rate, and umbilical artery flow indices, and their alterations in fetal mice exposed to systemic chronic hypoxia in utero in real time.

Fetal Mouse Cardiovascular Imaging Using a High-frequency Ultrasound 30/45MHZ System

High-frequency ultrasound imaging of the fetal mouse has improved imaging resolution and can provide precise non-invasive characterization of cardiac development and structural defects. The protocol outlined herein is designed to perform real-time fetal mice echocardiography in vivo.

태아 마우스 심장 혈관 이미징 높은 주파수 초음파 (30/45 m h Z) 시스템을 사용 하 여

Congenital heart defects (CHDs) are the most common cause of childhood morbidity and early mortality. Prenatal detection&#160;of the underlying molecular ...

Three-dimensional Organotypic Cultures of Vestibular and Auditory Sensory Organs

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. Moreover, although existing culture techniques allow biochemical perturbations, these methods do not provide a means to study the effects of mechanical force and tissue stiffness during development of the inner ear sensory organs. Here we describe a method for three-dimensional organotypic culture of the intact murine utricle and cochlea that overcomes these limitations. The technique for adjustment of a three-dimensional matrix stiffness described here permits manipulation of the elastic force opposing tissue growth. This method can therefore be used to study the role of mechanical forces during inner ear development. Additionally, the cultures permit virus-mediated gene delivery, which can be used for gain- and loss-of-function experiments. This culture method preserves innate hair cells and supporting cells and serves as a potentially superior alternative to the traditional two-dimensional culture of vestibular and auditory sensory organs.

Three-dimensional organotypic cultures of the murine utricle and cochlea in optically clear collagen I gels preserve innate tissue morphology, allow for mechanical stimulation through adjustment of matrix stiffness, and permit virus-mediated gene delivery.

Vestibular 및 청각 감각 기관의 3 차원 Organotypic 문화

The sensory organs of the inner ear are challenging to study in mammals due to their inaccessibility to experimental manipulation and optical observation. ...

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell types include enzyme-secreting acinar cells, an arborized ductal system responsible for the transportation of enzymes to the gut, and hormone-producing endocrine cells. 
Endocrine beta-cells are the sole cell type in the body that produce insulin to lower blood glucose levels. Diabetes, a disease characterized by a loss or the dysfunction of beta-cells, is reaching epidemic proportions. Thus, it is essential to establish protocols to investigate beta-cell development that can be used for screening purposes to derive the drug and cell-based therapeutics. While the experimental investigation of mouse development is essential, in vivo studies are laborious and time-consuming. Cultured cells provide a more convenient platform for screening; however, they are unable to maintain the cellular diversity, architectural organization, and cellular interactions found in vivo. Thus, it is essential to develop new tools to investigate pancreatic organogenesis and physiology.
Pancreatic epithelial cells develop in the close association with mesenchyme from the onset of organogenesis as cells organize and differentiate into the complex, physiologically competent adult organ. The pancreatic mesenchyme provides important signals for the endocrine development, many of which are not well understood yet, thus difficult to recapitulate during the in vitro culture. Here, we describe a protocol to culture three-dimensional, cellular complex mouse organoids that retain mesenchyme, termed pancreatoids. The e10.5 murine pancreatic bud is dissected, dissociated, and cultured in a scaffold-free environment. These floating cells self-assemble with mesenchyme enveloping the developing pancreatoid and a robust number of endocrine beta-cells developing along with the acinar and the duct cells. This system can be used to study the cell fate determination, structural organization, and morphogenesis, cell-cell interactions during organogenesis, or for the drug, small molecule, or genetic screening.

Generation of Scaffold-free, Three-dimensional Insulin Expressing Pancreatoids from Mouse Pancreatic Progenitors In Vitro

Here, we present a protocol to generate insulin expressing 3D murine pancreatoids from free-floating e10.5 dissociated pancreatic progenitors and the associated mesenchyme.

비 계, 3 차원 인슐린 표현 Pancreatoids 마우스 췌 장 창시자에 체 외에서 의 세대

The pancreas is a complex organ composed of many different cell types that work together to regulate blood glucose homeostasis and digestion. These cell ...

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and painless, and the application is easy, fast, and can be done anywhere, even with mobile devices. During pregnancy, ultrasound imaging is standardly used to closely monitor fetal development. The technique is important to assess intrauterine growth restriction (IUGR), a pregnancy complication with short- and long-term health consequences for both the mother and fetus. Understanding the process of IUGR is indispensable for developing effective therapeutic strategies. 
The ultrasound system used in this manuscript is an ultrasound device produced for the analysis of small animals and can be used in various research fields, including pregnancy research. Here we describe the usage of the system for in vivo analysis of fetuses from natural killer (NK) cell/mast cell (MC)-deficient mothers that give birth to growth-restricted pups. The protocol includes preparation of the system, handling of the mice before and during measurements, and the usage of the B-mode, color doppler mode, and pulse-wave doppler mode. Fetal size, placental size, and blood supply to the fetus were analyzed. We found reduced implantation sizes and smaller placentas in NK/MC-deficient mice from mid-gestation onwards. In addition, MC/NK-deficiency was associated with absent and reversed end diastolic flow in the fetal Arteria umbilicalis(UmA) and an elevated resistance index. The methods described in the protocol can easily be used for related and non-related research topics.

High Frequency Ultrasound for the Analysis of Fetal and Placental Development In Vivo

Here we describe the technique of high frequency ultrasound for in vivo analysis of fetuses in mice. This method allows the follow-up of fetuses and the analysis of placental parameters as well as maternal and fetal blood flow throughout pregnancy.

비보에 태아 및 태 반 개발의 분석에 대 한 높은 주파수 초음파

Ultrasound imaging is a widespread method used to detect organ anomalies and tumors in human and animal tissues. The method is non-invasive, harmless, and ...

Preparation of Small RNA Libraries for Sequencing from Early Mouse Embryos

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs during early development are technically challenging due to the limiting cell number. Moreover, many approaches require a miRNA of interest to be defined in assays such as northern blotting, microarray, and qPCR. Therefore, the expression of many miRNAs and their isoforms have not been studied during early development. Here, we demonstrate a protocol for small RNA sequencing of sorted cells from early mouse embryos to enable relatively unbiased profiling of miRNAs in early populations of neural crest cells. We overcome the challenges of low cell input and size selection during library preparation using amplification and gel-based purification. We identify embryonic age as a variable accounting for variation between replicates and stage-matched mouse embryos must be used to accurately profile miRNAs in biological replicates. Our results suggest that this method can be broadly applied to profile the expression of miRNAs from other lineages of cells. In summary, this protocol can be used to study how miRNAs regulate developmental programs in different cell lineages of the early mouse embryo.

We describe a technique for profiling microRNAs in early mouse embryos. This protocol overcomes the challenge of low cell input and small RNA enrichment. This assay can be used to analyze changes in miRNA expression over time in different cell lineages of the early mouse embryo.

초기 마우스 배아에서 시퀀싱을 위한 작은 RNA 라이브러리 의 준비

MicroRNAs (miRNAs) are important for the complex regulation of cell fate decisions and developmental timing. In vivo studies of the contribution of miRNAs ...