The authors would like to thank all members of the Colucci lab for helpful discussions. This work was funded by The Wellcome Trust [094073/Z/10/Z], The Centre for Trophoblast Research and The British Heart Foundation.

이 논문에서 논의 된 모든 절차는 영국 홈 오피스 규정에 따라이며 캠브리지 윤리 검토위원회에 의해 승인됩니다. 1. 표본 수집 <ol><li> 오후에 (남성 당 2 여성까지) 성인 남성과 8~12주 세 여성 C57BL / 6 마​​우스를 사용하여 시간 제한 교배를 설정합니다. 이른 다음 날 아침에 교미의 표시로 질 플러그의 존재를 확인합니다. 아침 마크 gd0.5에서 플러그의 존재. </li><li> gd9.5에서 자궁 전위에 의해 동물을 안락사 및 복강을 엽니 다. 혈관 확장의 원인이 이산화탄소에 의한 안락사를합니다. </li><li> 부드럽게 자궁 동맥 (그림 1, 점선 화살표)을 결찰하는 치실을 사용합니다. 자궁 경부 주위뿐만 아니라, 난소 각 자궁, 근위부의 끝에서 동맥 주위에 치실을 묶어. 참고 :이 붕괴 동맥을 초래할 수 있으므로 혈관을 파열하지 마십시오. </li> &lt;리&gt; 자궁 뿔과 자궁 경부의 끝에서 세 결찰 점 원심 전체 자궁을 절개, 해부 가위를 사용하여 신속하게 자궁을 해부하다. </li><li> 모두 뿔이 자궁 경부에서 반대 방향으로 같은 긴 축을 따라 정렬되도록 준비된 폴리스티렌 조각에 자궁을 놓습니다. 부드럽게 스트레칭 2-3 25 G 바늘을 사용하여 제자리에 고정. </li><li> 준비 50 ML 원뿔 튜브에 폴리스티렌을 담가. 10 % 포르말린에 50 ㎖까지 최고. 실온에서 5-6 시간 동안 수정. </li><li> 포르말린 용액을 취소하고 5 분 50 ㎖ 1X 인산염 완충 식염수 (PBS)로 교체. </li><li> 중앙에 자궁 경부에 근위 양쪽 끝 부분에있는 결찰 점과 근위 두 개의 자궁 뿔을 절제 주입 부위 주변에 여분의 지방을 잘라 내고 포르말린의 흔적을 제거하는 5 분 동안 PBS로 두 번 씻는다. </li><li> 처리 될 때까지 (최대 2 주) 4 ° C에서 70 % 에탄올에 샘플을 저장합니다. 주의 : ETHanol는 가연성이다. </li><li> . 표 1의 파라미터를 이용하여 자동화 된 처리 시스템을 사용하여 그들이 자궁의 긴 축에 수직 인 평면을 따라 절단 할 수 있도록 개별적으로 파라핀 뿔 임베드. 이는 각각의 주입 부위의 최대 면적은 블록 (도 2a)의 중간 분석에 노출되는 것을 보장한다. 옵션 : 원하는 경우이 블록의 랜덤위한 편리한 시점이다. </li><li> 마이크로톰을 사용하여, 블록 7 μm의 두께 직렬 섹션을 자른다. 헤 마톡 실린 및 에오신으로 모든 49 μm의 간격에서 하나의 섹션을 얼룩 (H &amp; E는 2.1 절 참조). SMA 염색 및 기타 다운 스트림 응용 프로그램에 대한 실온에서 나머지 부분을 저장합니다. </li></ol><table fo:keep-together.within-page="1"><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:99px;"> 해결책 </td><td style="width:43px;"> 시간<html></td><td style="width:97px;"> 온도 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 70 % 에탄올 </td><td> 1 시간 </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100 % 에탄올 </td><td> 1 시간 </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100 % 에탄올 </td><td> 1 시간 </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100 % 에탄올 </td><td> 1 시간 </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100 % 에탄올 </td><td> 1 시간 </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100 % 에탄올 </td><td> 1 시간 </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 100 % 에탄올 </td><td> 1 시간 </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21">: 21px; &quot;&gt; 크실렌 </td><td> 1 시간 </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 크실렌 </td><td> 1 시간 </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 크실렌 </td><td> 1 시간 </td><td> 40 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 파라핀 </td><td> 1 시간 </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 파라핀 </td><td> 1 시간 </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> 파라핀 </td><td> 1 시간 </td><td> 63 ° C </td></tr><tr height="22"><td height="22" style="height:22px;"> 파라핀 </td><td> 1 시간 </td><td> 63 ° C </td></tr></tbody></table> 표 1. 자궁 조직의 처리에 사용되는 설정을 자동으로 조직 처리를위한 설정 개요 2. STEReological 평가 <ol><li> H &amp; E 염색 <ol><li> 실온에서 10 분 동안 100 % 크실렌 욕에 슬라이드 랙에 장착 된 슬라이드를 침지 Deparaffinize 섹션. 주의 : 크실렌 가연성과의 접촉과 흡입을 통해 독성이 의심되는 발암 물질이다. 이 작품은 개인 보호 장비 (PPE)를 사용하여, 흄 후드에서 수행해야합니다. </li><li> 추가로 10 분 동안 깨끗한 자일 렌을 포함하는 목욕에 슬라이드를 담가. </li><li> 순차적으로 각 5 분, 100 % 에탄올, 95 % 에탄올, 70 % 에탄올 및 정제수를 함유하는 욕조에 담궈 슬라이드. </li><li> 5 분 동안 순수로 희석하고, 50 % 길 없음 3 마톡 실린 용액에 담가 슬라이드. 주의 : 헤 마톡 실린 섭취와 눈에 접촉하면 유해 함이다. 취급시 적절한 개인 보호구를 착용 할 것. </li><li> 10 분 동안 수돗물 흐르는 염색 통에 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 10 초 동안 (70 % 에탄올을 1 % 염산 10 M)에 1 % 산 / 알콜 용액을 슬라이드 담가수돗물 흐르는 염색 통에 씻는다. </li><li> 30 초 동안 에오신 솔루션에 슬라이드를 담그고 10 분 동안 수돗물 흐르는 염색 통에 씻는다. </li><li> 흄 후드 내에서, 순차적으로 각 5 분 동안 70 % 에탄올, 95 % 에탄올 및 100 % 에탄올을 함유하는 욕조에 담궈 슬라이드. </li><li> 10 분 동안 자일 렌을 포함하는 목욕에 슬라이드를 담가. </li><li> 마운트 크실렌 계 장착 매체를 이용하여 커버 슬립. 현미경 슬라이드를 시각화하기 전에 흄 후드에서 가로 철저히 건조. </li></ol></li><li> 선박의 크기와 리모델링 상태의 Stereological 평가 <ol><li> 각 주입 사이트에 대해 midsagittal 포인트 가까이있는 부분을 결정합니다. 태아 개발 태반 사이의 융모 첨부 midsagittal 점의 좋은 지표 역할을한다. </li><li> 분석을위한 midsagittal 점에 가까운 49 μm의 간격으로 3 섹션을 선택합니다. 선택한 슬라이드를 스캔합니다. INC을 피하기 위해더 둘레 주입 부위 (16)에 위치되는 것으로 도시되었다 luding 정맥, 각 이식 장소 (도 2a)의 중앙 2/4의 해석을 제한. </li><li> 루멘 크기를 평가하기 위해, 용기의 내부 및 주위에 그릴이 형상의 영역을 기록한다. 전체 용기의 크기, 내피 세포, 혈관 주위 세포와 백혈구 벽내 포함한 용기의 외벽 주위에 그릴. 주 : 루멘 총 혈관 크기의 비는 용기의 개조 상태에 대한 프록시이다. 혈관 부분을 따라서 절단 한면을 통해 코일로서, 하나의 슬라이드에 동일한 동맥의 여러 단면이있을 수있다. 같은 동맥을 여러 번 측정하지 마십시오. </li><li> 최대 규모의 roundest 루멘 각각 주입 사이트의 5 배에서 측정 값을 기록한다. 중으로 각 이식 장소를 (세 부분이 서로 49 μm의 이격)를 측정한다. 이 15 측정 represe의 평균큰 용기의 평균 직경 NTS. </li><li> 일부 샘플의 더 큰 용기 overrepresentation을 피하​​기 위해, 각각의 주입 부위에서의 혈관의 동일한 수를 측정한다. </li></ol></li></ol> 면역 조직 화학을 사용하여 3. 질적 평가 <ol><li> 탈 파라핀과 재수 <ol><li> 실온에서 10 분 동안 100 % 크실렌 욕에 내열 슬라이드 랙에 장착 된 슬라이드를 침지 Deparaffinize 섹션. </li><li> 추가로 10 분 동안 깨끗한 자일 렌을 포함하는 목욕에 슬라이드를 담가. </li><li> 순차적으로 각 5 분, 100 % 에탄올, 95 % 에탄올 및 70 %의 정제수를 함유하는 욕조에 담궈 슬라이드. </li></ol></li><li> 항원 검색 <ol><li> 정제 된 물에 10 mM 시트르산 나트륨 완충액을 준비하고, 10 M 염산을 사용하여 pH를 6으로 조정한다. </li><li> 충분한 와트를 포함하는 국내 압력 밥솥에 400 ml의 나트륨 구연산 버퍼와 장소 600 mL로 보유 할 수있는 내열 용기를 채우어 컨테이너의 절반을 잠수함합니다. 느슨하게 비등 할 때까지 압력 밥솥과 열 뚜껑을 연결합니다. </li><li> 장소 슬라이드 구연산 나트륨 버퍼에 랙 단단히 압력 밥솥의 뚜껑을 고정합니다. 일단 가압, 3 분 동안 끓여 할 수 있습니다. </li><li> 압력 밥솥의 압력을 감소하고 내부 용기를 제거합니다. 슬라이드를 실온에서 10 분 동안 시트르산 나트륨 완충액 식히. </li><li> 세척을 5 분 동안 정제수를 함유하는 욕에서 슬라이드. </li><li> 소수성 장벽 펜을 사용하는 섹션을 둘러싸. </li><li> 5 분 동안 PBS에 잠수하여 슬라이드를 씻으십시오. </li></ol></li><li> 내생 퍼 옥시 다제 및 비 특정 바인딩 차단 <ol><li> 실온에서 30 분간 가온 챔버 내에 정제수에 희석 3 % 과산화수소와 섹션을 인큐베이션. 주의 : 과산화수소가 눈, 피부 및 섭취에 크게 자극을 일으킬 수 있습니다. 적절한 개인 보호구를 착용 할 것. </li><li> 과량의 과산화수소 용액을 누르고 SLI 씻어DES는 두 번 트리스에 잠수하여 2 분마다 식염수 (TBS)을 버퍼. </li><li> 마우스 면역 글로불린은 제조업체의 지침에 따라 제조 마우스 키트에 마우스에서 시약을 차단에 섹션을 품어. </li><li> 워시는 2 분마다 두 번 TBS에서 슬라이드. </li></ol></li><li> 부드러운 근육 굴지의 면역 <ol><li> (키트에 제공됨) 항체 희석액을 제조하고, 실온에서 5 분 동안 배양 섹션, 또는 제조자의 지시에 따라. </li><li> 희석 1 : 항체 희석액 100 마우스 항 - 인간 평활근 액틴 (DAKO M0851). 최종 면역 글로불린 농도가 두 솔루션에 해당하는 것을 보장 항체 희석액 마우스의 IgG2a 아이소 타입 컨트롤을 희석. </li><li> 희석 항체 또는 이소 제어 솔루션 중 하나와 초과 항체 희석액과 덮개 부분을 누릅니다. 실온에서 30 분간 가온 챔버 내에 배양한다. </li><li> 워시에 대한 TBS에 두 번 슬라이드2 분마다. </li><li> 비 오티 닐화 항 - 마우스 이차 항체를 희석하고, 실온에서 10 분 동안 배양 섹션, 또는 제조자의 지시에 따라. </li><li> 워시는 각각 2 분 동안 한 번 각 TBS와 PBS로 슬라이드. </li><li> 제조업체의 지침에 따라 3,3&#39;- 디아 미노 (DAB) 솔루션을 준비합니다. DAB 용액 부분을 커버하고 과량의 발색을 방지 섹션을 모니터링하도록 보장까지 4 분 동안 배양한다. 주의 : DAB 가연성과의 접촉과 흡입을 통해 독성이 의심되는 발암 물질이다. 취급시 적절한 개인 보호구를 착용 할 것. </li><li> 염색의 원하는 강도에 도달하면 정제 물에 슬라이드를 담가. </li><li> 20 초 동안 50 %의 길 3 번 헤 마톡 실린과 Counterstain과 물이 맑은 실행될 때까지 수돗물 흐르는 염색 통에 씻는다. </li></ol></li><li> 탈수 및 설치 <ol><li> 흄 후드 내에서 순차적으로 70 % ETH를 포함하는 화장실에 슬라이드를 담가anol, 95 % 에탄올 및 5 분마다 100 % 에탄올. </li><li> 10 분 동안 자일 렌을 포함하는 목욕에 슬라이드를 담가. </li><li> 마운트 크실렌 계 장착 매체를 이용하여 커버 슬립. 종래 현미경 슬라이드를 시각화에 흄 후드에서 가로와 완전히 건조 </li></ol></li></ol>

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	<li>Burton, G. J., Woods, A. W., Jauniaux, E., Kingdom, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rheological+and+physiological+consequences+of+conversion+of+the+maternal+spiral+arteries+for+uteroplacental+blood+flow+during+human+pregnancy.">Rheological and physiological consequences of conversion of the maternal spiral arteries for uteroplacental blood flow during human pregnancy.</a> Placenta. 30 (6), 473-482 (2009).</li><li>Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Hanssens, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uterine+spiral+arteries+in+human+pregnancy:+facts+and+controversies.">The uterine spiral arteries in human pregnancy: facts and controversies.</a> Placenta. 27 (9-10), 939-958 (2006).</li><li>Ashkar, A. A., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon-gamma+contributes+to+the+normalcy+of+murine+pregnancy.">Interferon-gamma contributes to the normalcy of murine pregnancy.</a> Biol Reprod. 61 (2), 493-502 (1999).</li><li>Ashkar, A. A., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functions+of+uterine+natural+killer+cells+are+mediated+by+interferon+gamma+production+during+murine+pregnancy.">Functions of uterine natural killer cells are mediated by interferon gamma production during murine pregnancy.</a> Semin Immunol. 13 (4), 235-241 (2001).</li><li>Ashkar, A. A., Di Santo, J. P., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interferon+gamma+contributes+to+initiation+of+uterine+vascular+modification,+decidual+integrity,+and+uterine+natural+killer+cell+maturation+during+normal+murine+pregnancy.">Interferon gamma contributes to initiation of uterine vascular modification, decidual integrity, and uterine natural killer cell maturation during normal murine pregnancy.</a> J Exp Med. 192 (2), 259-270 (2000).</li><li>Ashkar, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+requirements+for+IL-15+and+IFN+regulatory+factors+in+uterine+NK+cell+differentiation+and+function+during+pregnancy.">Assessment of requirements for IL-15 and IFN regulatory factors in uterine NK cell differentiation and function during pregnancy.</a> J Immunol. 171 (6), 2937-2944 (2003).</li><li>Barber, E. M., Pollard, J. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+uterine+NK+cell+population+requires+IL-15+but+these+cells+are+not+required+for+pregnancy+nor+the+resolution+of+a+Listeria+monocytogenes+infection.">The uterine NK cell population requires IL-15 but these cells are not required for pregnancy nor the resolution of a Listeria monocytogenes infection.</a> J Immunol. 171 (1), 37-46 (2003).</li><li>Colucci, F., Boulenouar, S., Kieckbusch, J., Moffett, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+does+variability+of+immune+system+genes+affect+placentation.">How does variability of immune system genes affect placentation.</a> Placenta. 32 (8), 539-545 (2011).</li><li>Pijnenborg, R., Vercruysse, L., Brosens, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deep+placentation.">Deep placentation.</a> Best Pract Res Clin Obstet Gynaecol. 25 (3), 273-285 (2011).</li><li>Colucci, F., Kieckbusch, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+uterine+natural+killer+cells+nurture+fetal+growth:+in+medio+stat+virtus.">Maternal uterine natural killer cells nurture fetal growth: in medio stat virtus.</a> Trends Mol Med. 21 (2), 60-67 (2015).</li><li>Hanna, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Decidual+NK+cells+regulate+key+developmental+processes+at+the+human+fetal-maternal+interface.">Decidual NK cells regulate key developmental processes at the human fetal-maternal interface.</a> Nat Med. 12 (9), 1065-1074 (2006).</li><li>Xiong, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+uterine+NK+cell-activating+receptor+KIR2DS1+enhances+placentation.">Maternal uterine NK cell-activating receptor KIR2DS1 enhances placentation.</a> J Clin Invest. 123 (10), 4264-4272 (2013).</li><li>Croy, B. A., Zhang, J., Tayade, C., Colucci, F., Yadi, H., Yamada, A. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+uterine+natural+killer+cells+in+mice.">Analysis of uterine natural killer cells in mice.</a> Methods Mol Biol. 612, 465-503 (2010).</li><li>Kieckbusch, J., Gaynor, L. M., Moffett, A., Colucci, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MHC-dependent+inhibition+of+uterine+NK+cells+impedes+fetal+growth+and+decidual+vascular+remodelling.">MHC-dependent inhibition of uterine NK cells impedes fetal growth and decidual vascular remodelling.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li><li>Zhang, J., Chen, Z., Smith, G. N., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Natural+killer+cell-triggered+vascular+transformation:+maternal+care+before+birth.">Natural killer cell-triggered vascular transformation: maternal care before birth.</a> Cell Mol Immunol. 8 (1), 1-11 (2010).</li><li>Adamson, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interactions+between+trophoblast+cells+and+the+maternal+and+fetal+circulation+in+the+mouse+placenta.">Interactions between trophoblast cells and the maternal and fetal circulation in the mouse placenta.</a> Dev Biol. 250 (2), 358-373 (2002).</li><li>Colucci, F., Soudais, C., Rosmaraki, E., Vanes, L., Tybulewicz, V. L. J., Di Santo, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+NK+cell+development+using+a+novel+alymphoid+mouse+model:+Investigating+the+role+of+the+c-abl+proto-oncogene+in+murine+NK+cell+differentiation.">Dissecting NK cell development using a novel alymphoid mouse model: Investigating the role of the c-abl proto-oncogene in murine NK cell differentiation.</a> J Immunol. 162 (5), 2761-2765 (1999).</li><li>Hu, D., Cross, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ablation+of+Tpbpa-positive+trophoblast+precursors+leads+to+defects+in+maternal+spiral+artery+remodeling+in+the+mouse+placenta.">Ablation of Tpbpa-positive trophoblast precursors leads to defects in maternal spiral artery remodeling in the mouse placenta.</a> Dev Biol. 358 (1), 231-239 (2011).</li><li>Zhang, J. H., Croy, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+Ultrasonography+to+Define+Fetal-Maternal+Relationships:+Moving+from+Humans+to+Mice.">Using Ultrasonography to Define Fetal-Maternal Relationships: Moving from Humans to Mice.</a> Comparative Med. 59 (6), 527-533 (2009).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

여기에 제시된 프로토콜은 성공적인 임신에 필요한 혈관의 변화를 평가함으로써 재현 방법을 제공하도록 설계된다. 이 평가에 필수적인 조직 절편의 품질이다. 모두 정확하게 안정적으로 자궁 동맥 중요한 단계입니다 결찰뿐만 아니라 주입 사이트의 임신 주수를 결정하는 단계를 포함한다. 등의 고정 시간, 조직 처리 프로토콜, 같은 파라미터에서의 변화는 결과에 영향을 미칠 수있다. 바이어스 stereological 평가, 각 이식 장소에서 용기의 동일한 수를 측정하는 것이 중요하다. 그것은 주입 사이트와 세중의 각 주입 사이트 당 5 혈관을 측정하는 것이 좋습니다. 이 15 측정의 평균은 5 최대 규모의 선박의 평균 크기를 나타냅니다. - / - IL2rg - 또한 alymphoid Rag2의 데이터에 / - 마우스는 여기에 표시된, 우리는이 PROT 발견억제 NK 세포 (14) 중 하나를 포함 불충분 한 산모의 면역 기능의 모델의 숫자에 유용 ocol. 동맥 리모델링에 결함이 또한 장애인 영양막 세포의 침윤 (18)의 모델에 표시되어 있고 여기에 설명 된 기술은 이러한 경우에 혈관을 평가하는 데 도움이 될 수 있습니다. 우리는 최적화 된 마우스의 중간 임신에서 탈락 혈관 재 형성의 조사를 위해이 프로토콜을 검증하지만, 다른 모델 시스템 (예 : 쥐) 또는 다른 기관에서 작동하는이 프로토콜을 적용하는 것도 생각할 수있다. 우리가 북한에 의존 리모델링이 견고 gd9.5에서 평가 될 수 있음을 발견하지만, 이러한 산모의 혈관이 완전히 개조되어 gd12.5, 다른 시점에 대한 개정 될 수있다. 이 시점에서, 혈관 영양막 침입 깊이는 16이며,이 시점은 혈관 변화 영양막의 역할을 조사 더 적합 할 수있다. 추가 양적 판독이 요구되는 경우,조사자는 또한 SMA 스테인드 섹션들의 수를 증가시키고, 각각의 주입 부위에서 부분적으로 개조 된 선박의 백분율을 평가할 수있다. 이 프로토콜의 제한은 조직 학적 검사의 기술적 인 성격이다. 기능 분석은, 그러나, 단지 느리게 (예 도플러 초음파로 19) 가능 해지고있다. 이러한 기술 및 전문 기술을 획득하고 유지하기위한 장치를 더 높은 비용을 필요로하지만, 조직 학적으로 관찰 할 수있는 변화의 효과를 생체 내에서 판독 길이를 제공하는 장점이있다. 모든 stereological 시험의 가능한 단점은 연구자의 주관입니다. 이를 위해, 모든 샘플을 개별적으로 분석하는 두 개의 독립적 인 시험관을 사용하여이 문제를 피하는 것을 도울 수있다. 여기에 설명 된 프로토콜이 많은 혈액 것을 말하고, 인터페이스에 도달하는 방법에 대한 통찰력을 주지만, 그것은 COMPL 함께 결합하는 것이 유리할 수있다플라스틱을 통해 맥관 구조에서 임의의 주어진 시간에 혈액의 총량을 평가하는 방법은 16 ementary 캐스트. 이 프로토콜의 강도는 두 개의 독립적 인 접근 방식을 결합한 것입니다. 혈관 변화는 제 Stereology를 정량적으로 평가되고, 결과는 다음을 사용하여 면역 조직 화학 질적 검증된다. 결과의 신뢰성을 추가로 샘플을 랜덤으로 강화 될 수있다. 이 프로토콜 작성된 샘플은 쉽게 또한 엄격 midgestation에서 임신 표현형을 평가하기 위해, 이러한 decidualisation 임신 (MLAp) 또는 관심의 세포 면역의 mesometrial 림프 골재의 개발과 같은 임신의 다른 매개 변수를 조사하기 위하여 사용될 수있다. 동맥 리모델링 여성과 이러한 변화의 실패 복잡하지 않은 임신을위한 중요한 단계는 큰 산과 증후군 (GOS), 즉 전자 간증, 태아 성장 제한 및 토대입니다사산. 우리는 신중하게 GOS의 병태 생리의 일부 특성을 모방 마우스 모델에서 임신 표현형을 평가하기 위해 여기에 기술을 제시한다.

eutherian 임신 동안 영양소, 가스 및 노폐물의 교환은 태반에 의해 매개된다. 여성의 생식 기관에서 자궁 동맥 자궁에 혈액의 주요 도관이다. 주입 후, 전문 선박에이 지점 fetoplacental 유닛으로 탈락의 basalis를 통해 코일 나선형 동맥을했다. 직경 특히 자궁 자연 살해 (UNK) 세포, 백혈구에 의해 둘러싸여있다 이러한 나선형 동맥의 탄력성, 태반 1, 2에 볼륨을 사용할 수 혈액의 속도를 지시. 나선형 동맥의 리모델링의 결과로 올바른 혈역학 적 변화는 임신 성공을 위해 중요하다. 기전은 인간과 생쥐 사이 임신 상세히 다르지만, 두 종의 리모델링 과정의 최종 결과는 평활근 층을 잃게 팽창 높은 컨덕턴스 혈관이다. 마우스에서, UNK의 (IF 인터페론 세포 유래N-) γ 주위 중반 임신 3-5에서 이러한 변화를 유도하는 것이 필요하다. NK 세포 또는 IFN-γ의 신호 전달 경로의 구성 요소 중 하나가 결여 된 마우스에서는 이러한 변화를 겪게 못하고 이는 fetoplacental 부에 적절한 혈액 공급의 중요성을 강조하고, 감소 된 태아 성장 -6,7-와 연관된다. 초기 인간 임신 중, 간질 및 혈관 extravillous 영양막 세포의 침략과 UNK 세포와의 상호 작용은 혈관의 변화를 유도하고 태아의 성장 8-10을 촉진하기위한 중요하다. UNK 세포는 과립구 대 식세포와 같은 사이토 카인 및 케모카인 (11)를 통해 인간 영양막 세포 침윤을 조율 할 수있다 - 콜로니 자극 인자 (GM-CSF) 12. 얕은 영양막 세포의 침윤이 같은 자간전증 9 감소 동맥 리모델링과 임신 합병증과 연관되어 있습니다. 이 프로토콜은 중요한을 설명 앤 Croy의 선구적인 작업을 기반으로면역 조직 화학 염색과 우아한 전송 실험 5,13 통해 성공적인 혈관 재에 대한 면역 체계, 특히 북한에서 파생 된 IFN-γ의 역할. 여기에서 우리는 나선형 동맥의 리모델링 상태를 평가하는 빠르고 경제적 인 방법을 설명합니다. 우리 연구실은 정기적으로 중간 임신 (임신 일 (GD) 9.5) 14이 평가되지만, 리모델링 과정은 gd8.5 12.5 (15) 사이에 발생한다. 자동 슬라이드 스캐너의 출현은 크게 섹션에서 용기 루멘 영역의 평가를 촉진하고 우리는이 혈관 직경을 측정보다 더 재현 방법이 될 것을 알았다. SMA의 면역 검출의 추가는 stereological 평가에서 얻은 결과의 직접적인 확인이 가능합니다. 모든 stereological 기술과 같이, 적어도 두 개의 시험관 맹검 실험으로 평가를 수행 할 것을 권장한다. 직렬로 절단 할 때이를 위해 랜덤 단계를 도입 할 수있다팅은 샘플 슬라이드를 평가하는 연구자가 샘플을 제공하는 실험 그룹에서 알고하지 않도록. 이 프로토콜의 전반적인 목적은 신중 임신 관련 합병증의 마우스 모델의 문맥에서 정의 부계 및 모계 유전형을 가진 마우스에서 나선형 동맥의 재 형성을 평가하기 위해 신뢰할 수있는 도구를 제공하는 것이다. 결과는 정상적인 태아 성장에 필수적인이 프로세스의 UNK 세포에 의존을 강조한다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="704">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">C57BL/6 mice (8-12 weeks old)</td>
			<td style="width:99px;">Charles River</td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td style="width:283px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Dental floss</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Polystyrene</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for holding tissue in place</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Straight dissection scissors</td>
			<td style="width:99px;">EMS</td>
			<td style="width:111px;">72940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">25G needles</td>
			<td style="width:99px;">BD&#160;</td>
			<td style="width:111px;">300600</td>
			<td>Used for holding tissue in place</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">50 ml conical tubes</td>
			<td style="width:99px;">Falcon</td>
			<td style="width:111px;">352070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Formalin solution, neutral buffered, 10%</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">HT501128-4L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">P3813-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Ethanol</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">32221-2.5L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Paraffin</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">327204-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Xylene</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">X/0250/17</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Automated tissue processor</td>
			<td style="width:99px;">Sakura</td>
			<td style="width:111px;">6032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Microtome</td>
			<td style="width:99px;">Leica</td>
			<td style="width:111px;">RM2245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide rack</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">Z710989</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Coplin jar</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">S5891</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Purified water</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hematoxylin solution, Gill No. 3</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">GHS332-1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Eosin Y solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">HT110116-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Fume hood</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Xylene-based mounting media</td>
			<td style="width:99px;">VWR</td>
			<td style="width:111px;">361254D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide scanner</td>
			<td style="width:99px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:111px;">NanoZoomer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Slide scanner software</td>
			<td style="width:99px;">Hamamatsu</td>
			<td style="width:111px;">NDP viewer</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Sodium citrate tribasic dihydrate</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">32320</td>
			<td>Make 10 mM solution and adjust pH to 6</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Pressure cooker</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Heating plate</td>
			<td style="width:99px;"></td>
			<td style="width:111px;"></td>
			<td>Used for antigen retrieval</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Hydrophobic barrier pen</td>
			<td style="width:99px;">Vector</td>
			<td style="width:111px;">H-4000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hydrogen peroxide</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">H/1800/15</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Tris buffered saline</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">T6664-10PAK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Mouse on mouse kit</td>
			<td style="width:99px;">Vector</td>
			<td style="width:111px;">BMK-2202</td>
			<td>Significantly reduces background</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Mouse anti-human smooth muscle actin</td>
			<td style="width:99px;">DAKO</td>
			<td style="width:111px;">M0851</td>
			<td>Cross-reacts with mouse</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">IgG2a isotype control</td>
			<td style="width:99px;">DAKO</td>
			<td style="width:111px;">X0943</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:212px;">Humidified chamber</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">H6644</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">3,3&#8217;-Diaminobenzidine solution</td>
			<td style="width:99px;">Sigma</td>
			<td style="width:111px;">D4293-5SET</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:212px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:99px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:111px;">H/1050/PB17</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

assessment of maternal vascular remodeling during pregnancy in the mouse uterus

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the maternal circulation. The maternal uterine vasculature needs to adapt to this temporary demand and the success of this arterial remodeling process has implications for fetal growth. Cells of the maternal immune system, especially natural killer (NK) cells, play a critical role in this process. Here we describe a method to assess the degree of remodeling of maternal spiral arteries during mouse pregnancy. Hematoxylin and eosin-stained tissue sections are scanned and the size of the vessels analysed. As a complementary validation method, we also present a qualitative assessment for the success of the remodeling process by immunohistochemical detection of smooth muscle actin (SMA), which normally disappears from within the arterial vascular media at mid-gestation. Together, these methods enable determination of an important parameter of the pregnancy phenotype. These results can be combined with other endpoints of mouse pregnancy to provide insight into the mechanisms underlying pregnancy-related complications.

Rag2 - / - IL2rg - / - 마우스는 NK 세포 (17)를 포함하여 모든 성숙 림프구를, 부족, 자신의 자궁 동맥 중순 임신 5,14 주위에 congenic 야생형 C57BL / 6 (WT) 쥐에서 볼 수있는 혈관의 변화를 받아야하지. 마우스 stereologically H &amp; E 염색 부분에 시각화 및 정량화 할 수있다 전반적으로 작은 혈관을 나타내는 상당히 작은 내강 표면 영역, (그림 2) 표시 - / - / - - IL2rg이 감소 리모델링 Rag2의 결과. 또한, (루멘 비율 용기)의 상​​대 두께는 혈액 공급의 감소 및 높은 혈액 유속을 시사 이들 마우스에서 나선형 동맥 높다. 이 양적 평가는 SMA의 면역 검출을 이용하여 확인 하였다. WT 마우스는 혈관 내에 미디어 SMA의 대부분을 잃게하는 것이 특징 인중반 임신에 의한 나선형 동맥의. 이 NK 세포 기반 프로세스가 수행되지 않는 경우, SMA는 혈관에 남아있는 미디어 용이 혈관 (도 3) 주위에 링으로 면역 검출 할 수있다. <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig1.jpg" /> 그림 1 : gd9.5에서 마우스 자궁, 자궁 뿔, 자궁 경부 (파란색)의 상대적 위치를 보여주는 개략도 그리기 및 주요 자궁 동맥 (빨간색).. 자궁 뿔 (화살표)와 결찰 포인트 (점선 화살표)의 긴 축이 있습니다 지적했다. 면역 조직 화학 염색에 대한 부분은 뷰의 평면을 따라 절단한다. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/53534/53534fig2.jpg" /> 그림 2 :. 중반 임신에서 동맥 리모델링의 Stereological 평가 (A) 예 ASSE탈락의 basalis의 중앙 2/4의 내강과 (WT)의 여성에서 H &amp; E 염색 섹션에 총 선박 분야의 ssment gd9.5에서 (수직 검정에 의해 경계가는 점선). 높은 배율에서 혈관, 적색 라인은 총 용기 영역, 황색 점선은 루멘을 획정 영역을 획정 점선. 막대 = 500 μm의 (왼쪽), 50㎛의 (오른쪽). 자궁의 장축 방향이 수평 라인이다. WT (C57BL / 6) 및 Rag2에서 총 선박 지역 (오른쪽 패널)에 내강 영역 (왼쪽 패널) 및 내강 면적의 비율 (B) 정량 - / - Il2rg - / - 생쥐 (C57BL / 6 배경에). 각각의 데이터 포인트는 15 측정 (섹션 당 5 측정, 주입 사이트 당 3 절)의 평균을 나타냅니다. 바 그룹 당 n = 4 임신에서 11-13 주입 사이트의 의미 나타냅니다; 두 개의 꼬리, 짝 맨 - 휘트니 테스트에서 p- 값. WT : 야생형. <img alT = &quot;그림 3&quot;SRC = &quot;/ 파일 / ftp_upload / 53534 / 53534fig3.jpg&quot;/&gt; 그림 3 :. 탈락의 basalis의 평활근 액틴의 면역 검출 (WT) (위)과 Rag2에 대표 SMA 염색 - / - IL2rg - / - gd9.5에서 (C57BL / 6 배경에, 아래) 마우스. 바 = 100 μm의. WT : 야생형.

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Assessment of Maternal Vascular Remodeling During Pregnancy in the Mouse Uterus

This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry.

마우스 자궁에서 임신 기간 동안 산모의 혈관 재 평가

The placenta mediates the exchange of factors such as gases and nutrients between mother and fetus and has specific demands for supply of blood from the ...

assessment-maternal-vascular-remodeling-during-pregnancy-mouse

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

13.0K 조회수.  University of Cambridge. This protocol describes a technique to assess changes in the maternal vasculature during pregnancy in mice. Using stereological methods, remodeling of the decidual spiral arteries is assessed quantitatively and the results confirmed qualitatively using immunohistochemistry. 

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Visualizing the Interrenal Steroidogenic Tissue and Its Vascular Microenvironment in Zebrafish

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying differentiated steroidogenic tissues through chromogenic histochemical staining of 3-&#946;-Hydroxysteroid dehydrogenase /&#916;5-4 isomerase (3&#946;-Hsd) activity-positive cells is critical for monitoring the morphology and differentiation of adrenocortical and interrenal tissues in mammals and teleosts, respectively. In the zebrafish model, the optical transparency and tissue permeability of the developing embryos and larvae allow for whole-mount staining of 3&#946;-Hsd activity. This staining protocol, as performed on transgenic fluorescent reporter lines marking the developing pronephric and endothelial cells, enables the detection of the steroidogenic interrenal tissue in addition to the kidney and neighboring vasculature. In combination with vibratome sectioning, immunohistochemistry, and confocal microscopy, we can visualize and assay the vascular microenvironment of interrenal steroidogenic tissues. The 3&#946;-Hsd activity assay is essential for studying the cell biology of the zebrafish interrenal gland because to date, no suitable antibody is available for labeling zebrafish steroidogenic cells. Furthermore, this assay is rapid and simple, thus providing a powerful tool for mutant screens targeting adrenal (interrenal) genetic disorders as well as for determining disruption effects of chemicals on steroidogenesis in pharmaceutical or toxicological studies.

The interrenal gland in zebrafish is the teleostean counterpart of the mammalian adrenal gland. This protocol introduces how to perform the 3-&#946;-hydroxysteroid dehydrogenase (&#916;5-4 isomerase; 3&#946;-Hsd) enzymatic activity assay, which detects differentiated steroidogenic cells in the developing zebrafish.

Interrenal Steroidogenic 조직 및 제브라 피쉬의 혈관 미세 시각화

This protocol introduces how to detect differentiated interrenal steroidogenic cells through a simple whole-mount enzymatic activity assay. Identifying ...

연구

발생학

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into the developing oocyte. Because these events rely on maternal products which typically act very soon after fertilization-that preexist inside the egg, standard approaches for expression and functional reduction involving the injection of reagents into the fertilized egg are typically ineffective. Instead, such manipulations must be performed during oogenesis, prior to or during the accumulation of maternal products. This article describes in detail a protocol for the in vitro maturation of immature zebrafish oocytes and their subsequent in vitro fertilization, yielding viable embryos that survive to adulthood. This method allows the functional manipulation of maternal products during oogenesis, such as the expression of products for phenotypic rescue and tagged construct visualization, as well as the reduction of gene function through reverse-genetics agents.

Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish

An optimized protocol for the in vitro maturation of zebrafish oocytes used for the manipulation of maternal gene products is presented here.

사용 모성 유전자 제품의 기능 조작<em&gt; 체외</em제브라 피쉬&gt; 난자의 성숙

Cellular events that take place during the earliest stages of animal embryonic development are driven by maternally derived gene products deposited into ...

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

A Novel Mammary Fat Pad Transplantation Technique to Visualize the Vessel Generation of Vascular Endothelial Stem Cells

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper vessel development and homeostasis. However, studies on endothelial lineage hierarchy remain elusive due to the lack of tools to gain access as well as to directly evaluate their behavior in vivo. To address this shortcoming, a new tissue model to study angiogenesis using the mammary fat pad has been developed. The mammary gland develops mostly in the postnatal stages, including puberty and pregnancy, during which robust epithelium proliferation is accompanied by extensive vascular remodeling. Mammary fat pads provide space, matrix, and rich angiogenic stimuli from the growing mammary epithelium. Furthermore, mammary fat pads are located outside the peritoneal cavity, making them an easily accessible grafting site for assessing the angiogenic potential of exogenous cells. This work also describes an efficient tracing approach using fluorescent reporter mice to specifically label the targeted population of vascular endothelial stem cells (VESCs) in vivo. This lineage tracing method, coupled with subsequent tissue whole-mount microscopy, enable the direct visualization of targeted cells and their descendants, through which the proliferation capability can be quantified and the differentiation commitment can be fate-mapped. Using these methods, a population of bipotent protein C receptor (Procr) expressing VESCs has recently been identified in multiple vascular systems. Procr+ VESCs, giving rise to both new ECs and pericytes, actively contribute to angiogenesis during development, homeostasis, and injury repair. Overall, this manuscript describes a new mammary fat pad transplantation and in vivo lineage tracing techniques that can be used to evaluate the stem cell properties of VESCs.

This work demonstrates a novel approach to assess the proliferation, differentiation, and vessel-forming potential of vascular endothelial stem cells (VESCs) through mammary fat pad transplantation followed by whole-mount tissue preparation for microscopic observation. A lineage tracing strategy to investigate the behavior of VESCs in vivo is also presented.

혈관 내피 줄기 세포의 혈관 생성을 시각화하기위한 유방 팻 패드 이식 기술

Endothelial cells (ECs) are the fundamental building blocks of the vascular architecture and mediate vascular growth and remodeling to ensure proper ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

Mouse Secondary Palate Fusion의 라이브 이미징

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

A Novel Use of Three-dimensional High-frequency Ultrasonography for Early Pregnancy Characterization in the Mouse

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is routinely used as an in vivo model to study embryo implantation and pregnancy progression. Unfortunately, such murine studies require pregnancy interruption to enable follow-up phenotypic analysis. To address this issue, we used three-dimensional (3-D) reconstruction of HFUS imaging data for early detection and characterization of murine embryo implantation sites and their individual developmental progression in utero. Combining HFUS imaging with 3-D reconstruction and modeling, we were able to accurately quantify embryo implantation site number as well as monitor developmental progression in pregnant C57BL6J/129S mice from 5.5 days post coitus (d.p.c.) through to 9.5 d.p.c. with the use of a transducer. Measurements included: number, location, and volume of implantation sites as well as inter-implantation site spacing; embryo viability was assessed by cardiac activity monitoring. In the immediate post-implantation period (5.5 to 8.5 d.p.c.), 3-D reconstruction of the gravid uterus in both mesh and solid overlay format enabled visual representation of the developing pregnancies within each uterine horn. As genetically engineered mice continue to be used to characterize female reproductive phenotypes derived from uterine dysfunction, this method offers a new approach to detect, quantify, and characterize early implantation events in vivo. This novel use of 3-D HFUS imaging demonstrates the ability to successfully detect, visualize, and characterize embryo-implantation sites during early murine pregnancy in a non-invasive manner. The technology offers a significant improvement over current methods, which rely on the interruption of pregnancies for gross tissue and histopathologic characterization. Here we use a video and text format to describe how to successfully perform ultrasounds of early murine pregnancy to generate reliable and reproducible data with reconstruction of the uterine form in mesh and solid 3-D images.

Mice are widely used to study gestational biology. However, pregnancy termination is required for such studies which precludes longitudinal investigations and necessitates the use of large numbers of animals. Therefore, we describe a non-invasive technique of high-frequency ultrasonography for early detection and monitoring of post-implantation events in the pregnant mouse.

마우스에서 초기 임신 특성에 대 한 3 차원 높은-주파수 초음파의 새로운 사용

High-frequency ultrasonography (HFUS) is a common method to non-invasively monitor the real-time development of the human fetus in utero. The mouse is ...

Ovarian Tissue Culture to Visualize Phenomena in Mouse Ovary

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, regulation occurs at the hypothalamic-pituitary-gonadal axis level and on developing follicles in the ovary. Despite active studies, follicle development mechanisms are not clear because of the several steps involved from the dormant primordial follicle activation to ovulation, and because of the regulation complexity that differs at each follicular stage. To investigate the mechanisms of follicle development, and the dynamics of follicles throughout the estrus cycle, we developed a mouse ovarian tissue culture model that can be used to observe follicle development using a microscope. Systematic follicle development, periodical ovulation, and follicle atresia can all be reproduced in the cultured ovary model, and the culture conditions can be experimentally modulated. Here, we demonstrate the usefulness of this method in the study of the regulatory mechanisms of follicle development and other ovarian phenomena.

Ovarian tissue cultures can be used as models of follicle development, ovulation, and follicle atresia and indicate regulatory mechanisms of dynamic ovarian processes.

난소 조직 문화 현상을 마우스 난소에서 시각화 하

Mammalian females periodically ovulate an almost constant number of oocytes during each estrus cycle. To sustain such regularity and periodicity, ...

Assessment of Ultrastructural Neuroplasticity Parameters After In Utero Transduction of the Developing Mouse Brain and Spinal Cord

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ultrastructural parameters in unambiguously identified topographical structures, affected by a protein of interest that is introduced into the organism via viral transfer. This combined approach allows for a smooth transition from macrostructural to ultrastructural identification by following topographical navigation maps in a tissue atlas. High-resolution electron microscopy of the in-utero-transduced tissue reveals the fine ultrastructure of the neuropil and its plasticity parameters, such as cross-sectioned synaptic bouton areas, the number of synaptic vesicles and mitochondria within a bouton profile, the length of synaptic contacts, cross-sectioned axonal areas, the thickness of myelin sheaths, the number of myelin lamellae, and cross-sectioned areas of mitochondria profiles. The analysis of these parameters reveals essential insights into changes of ultrastructural plasticity in the areas of the nervous system that are affected by the viral transfer of the genetic construct. This combined method can not only be used for studying the direct effect of genetically engineered biomolecules and/or drugs on neuronal plasticity but also opens the possibility to study the in utero rescue of neuronal plasticity (e.g., in the context of neurodegenerative diseases).

The combination of transmission electron microscopy and in utero transduction is a powerful approach for studying morphological changes in the fine ultrastructure of the nervous system during development. This combined method allows deep insights into changes in structural details underlying neuroplasticity with respect to their topographical representation.

평가의 개발 쥐의 뇌와 척수의 Utero 변환 후 Ultrastructural Neuroplasticity 매개 변수

The present study combines in utero transduction with transmission electron microscopy (TEM) aiming at a precise morphometrical analysis of ...

Vascular Casting of Adult and Early Postnatal Mouse Lungs for Micro-CT Imaging

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and behave by observing the surface of a tissue. This method provides a means to visualize the complex 3-dimensional vascular architecture of the lung.
To accomplish this, a catheter is inserted into the pulmonary artery and the vasculature is simultaneously flushed of blood and chemically dilated to limit resistance. Lungs are then inflated through the trachea at a standard pressure and the polymer compound is infused into the vascular bed at a standard flow rate. Once the entire arterial network is filled and allowed to cure, the lung vasculature may be visualized directly or imaged on a micro-CT (&#181;CT) scanner.
When performed successfully, one can appreciate the pulmonary arterial network in mice ranging from early postnatal ages to adults. Additionally, while demonstrated in the pulmonary arterial bed, this method can be applied to any vascular bed with optimized catheter placement and endpoints.

The aim of this technique is ex vivo visualization of pulmonary arterial networks of early postnatal and adult mice through lung inflation and injection of a radio-opaque polymer-based compound via the pulmonary artery. Potential applications for casted tissues are also discussed.

Micro-CT 화상 진찰을 위한 성인 및 초기 산후 마우스 폐의 혈관 주조

Blood vessels form intricate networks in 3-dimensional space. Consequently, it is difficult to visually appreciate how vascular networks interact and ...

Defining the Program of Maternal mRNA Translation during In vitro Maturation using a Single Oocyte Reporter Assay

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that take place in the cytoplasm in preparation for fertilization and acquisition of totipotency. During oocyte maturation, changes in gene expression depend exclusively on the translation and degradation of maternal messenger RNAs (mRNAs) rather than on transcription. Execution of the translational program, therefore, plays a key role in establishing oocyte developmental competence to sustain embryo development. This paper is part of a focus on defining the program of maternal mRNA translation that takes place during meiotic maturation and at the oocyte-to-zygote transition. In this method paper, a strategy is presented to study the regulation of translation of target mRNAs during in vitro oocyte maturation. Here, a Ypet reporter is fused to the 3&#39; untranslated region (UTR) of the gene of interest and then micro-injected into oocytes together with polyadenylated mRNA encoding for mCherry to control for injected volume. By using time-lapse microscopy to measure reporter accumulation, translation rates are calculated at different transitions during oocyte meiotic maturation. Here, the protocols for oocyte isolation and injection, time-lapse recording, and data analysis have been described, using the Ypet/interleukin-7 (IL-7)-3&#39; UTR reporter as an example.

This protocol describes a reporter assay to study the regulation of mRNA translation in single oocytes during in vitro maturation.

단일 난사 기자 분석기를 사용하여 체외 성숙 중 모성 mRNA 번역 프로그램 정의

Events associated with oocyte nuclear maturation have been well described. However, much less is known about the molecular pathways and processes that ...