수지상 또는 축삭 아버의 단일 세포 표지 및 시각화는 신경 형태 형성을 연구하는 데 필요합니다. 최소 침습적 방식으로 발달하는 arbors를 라벨링함으로써, 망막 조직은 건강하게 유지되고 장기간의 공초점 라이브 이미징에 적합합니다. 이 방법의 가장 큰 장점은 주사 후 나흘 이내에 다색 형광 단백질로 개별 arbors를 시각화 할 수 있다는 것입니다.
이것은 신생아 arbor 형태학을 연구하는 것을 가능하게합니다. 이 주사 이미징 및 분석 프로토콜은 중추 신경계 전반에 걸친 신경 형태를 연구하는 데 사용할 수 있습니다. 적절한 Cre 선택 및 주입 위치는 관심있는 세포 집단을 표적으로 하기 위해 결정되어야 한다.
먼저 Cre 마우스 라인을 선택하여 관심 있는 망막 세포 집단에 라벨을 붙인다. 형광 단백질을 코딩하는 재조합효소 의존성 AAV 바이러스를 얻는다. 미세 공정의 최적 표지를 위해, 원형질막을 표적화하는 변형된 형광 단백질을 발현하는 벡터를 선택하십시오.
얼음 상의 AAV 분취량을 위해, 멸균 식염수 또는 PBS를 사용하여 하나 내지 네 개의 AAV 희석액을 준비한다. 주사제를 시각화하려면 AAV 희석액 15 마이크로리터마다 약 1 마이크로리터의 0.02%Fast Green FCF 염료 용액을 첨가하여 용액을 파란색으로 채색하십시오. 주사 부위를 70 % 에탄올로 멸균하십시오.
마이크로사이린지를 사용하여 AAV 희석액으로 마이크로피펫을 백필한다. 스테레오 현미경으로 마이크로 피펫 팁을 30게이지 바늘로 부수어 팁의 밀봉을 풉니다. 신생아 마우스를 마취 한 후 30 게이지 바늘을 사용하여 문신 잉크로 발 패드를 문신하여 동물을 식별하십시오.
DNA 분리 및 유전자형을 위한 꼬리 클리핑을 수집합니다. 70 % 에탄올로 눈 위에 놓인 피부를 면도합니다. 30게이지 바늘을 사용하여 융합된 눈꺼풀을 열고 손가락으로 가벼운 압력을 가하여 눈을 뜨게 합니다.
각막 공막 접합부에서 각막을 통해 작은 구멍을 뚫습니다. 유리 마이크로 피펫을 구멍에 넣고 마이크로 인젝터 풋 페달을 두 번에서 네 번 눌러 AAV를 유리체내 공간에 주입하십시오. 마이크로피펫을 천천히 제거하고 동공에서 청색 염료를 시각화하여 AAV 주입을 확인하였다.
텍스트 원고에 기재된 바와 같이 망막 aCSF를 준비한 후, 최소 15분 동안 카르보겐으로 버블링하여 망막 aCSF를 산소화한 다음, pH를 7.4로 조정한다. 직경 60mm의 페트리 접시를 얼음 쟁반에 넣고 산소가 공급된 망막 aCSF로 채웁니다. 채워진 페트리 접시를 스테레오 현미경 아래에 놓습니다.
다음으로, 안락사된 마우스의 눈꺼풀 플랩을 절단하여 눈을 노출시킨다. 무딘 포셉을 사용하여 눈을 감싸고 스테레오 현미경 아래에 놓인 차가운 망막 aCSF로 옮깁니다. 스테레오 현미경으로 Dumont 번호 다섯 포셉을 사용하여 시신경을 쥐어 안고 30 게이지 바늘로 각막 중앙에 구멍을 뚫은 다음 마이크로 가위의 한 끝을 구멍에 삽입하여 구멍에서 각막 끝까지 절개하십시오.
반복하여 기본 방향으로 네 개의 슬라이스를 만들어 네 개의 플랩을 만듭니다. 인접한 두 플랩을 잡고 당겨 모든 각막 플랩에 대해 망막에서 공막을 부드럽게 벗겨냅니다. 그런 다음 포셉을 사용하여 망막 컵에서 렌즈를 제거하십시오.
마지막으로, 마이크로 가위를 사용하여 망막 가장자리에서 시신경쪽으로 네 개의 방사상 절개를 만들어 네 개의 동일한 꽃잎을 만듭니다. 장착에 직경이 큰 회색 MCE 멤브레인 필터를 사용하는 경우 디스크를 약 한 센티미터 높이의 사분면으로 자른 다음 MCE 디스크를 더 큰 흰색 필터 용지의 중앙에 놓습니다. 두 개의 크기 세 개의 제로 페인트 브러시를 사용하여 망막 신경절 세포 측면을 아래로 향하게하는 페인트 브러시에 하나의 망막 컵을 뒤집습니다.
aCSF에서 망막을 부드럽게 들어 올려 물 장력이 망막을 찢지 않도록하십시오. 망막이 있는 페인트 브러시를 계속 잡고 있는 상태에서 aCSF가 들어있는 페트리 접시를 움직이지 않고 MCE 멤브레인이 있는 흰색 여과지를 스테레오스코프 아래에 놓습니다. 전사 피펫을 사용하여 MCE 여과지의 중앙에 aCSF 액적을 놓습니다.
망막을 표면 장력에 의해 생성된 aCSF 액적 내로 띄우고 MCE 막을 충전한다. 페인트 브러시를 사용하여 망막 신경절 세포가 위로 향하게하여 액적 안에 망막을 놓은 다음 네 개의 꽃잎을 펼치십시오. 일단 위치하면, 물방울의 표면 장력을 깨기 위해 페인트 브러시와 흰색 여과지 사이에 물 다리를 만듭니다.
라이브 이미징 인큐베이션 챔버를 조립하고 산소화 된 aCSF로 채 웁니다. 펌프와 온도 컨트롤러를 켜고 온도가 섭씨 34도 이상으로 상승하지 않도록하십시오. 챔버 온도가 안정화되는 데 최대 한 시간이 걸릴 수 있습니다.
망막 해부를 시작하기 전에 인큐베이션 챔버를 설치하는 것이 좋습니다. 안정적인 챔버 온도는 샘플 드리프트를 줄이는 데 도움이됩니다. 망막 편평한 마운드를 관류 챔버로 옮기려면 펌프를 멈추고 챔버 내에 있는 aCSF를 제거하십시오.
그런 다음 망막 플랫 마운트가 있는 MCE 디스크를 인큐베이션 챔버에 넣습니다. 표면 장력을 깨기 위해 샘플 중량을 미리 적신 다음 플랫 마운트 위에 올려 놓고 샘플 중량이 MCE 용지에 배치되도록 하여 샘플 드리프트를 줄입니다. 따뜻한 aCSF로 챔버를 채우고 분당 약 한 밀리리터로 aCSF를 순환시킵니다.
25배의 물 담그기 목적으로 노즈피스를 이미징 챔버에 위치시킵니다. 에피형광광을 사용하여 관심있는 표지된 세포를 스크린하고, 관심 있는 수지상 특징을 포착하기 위해 이미징 부피를 조정한다. 과포화 픽셀과 과포화 픽셀을 모두 식별하는 조회 테이블을 사용하여 픽셀이 과포화되지 않도록 레이저 파워를 조정합니다.
3D 이미징 볼륨을 획득하고 원하는 프레임 속도로 수집을 반복합니다. 이미징 볼륨은 샘플 드리프트를 보상하기 위해 각 시점 사이에서 조정될 수 있다. 이미지 시리즈를 가져와서 이미지를 시간별로 분할합니다.
수동으로 또는 매크로 플러그인을 실행하여 모든 시간 포인트를 저장하십시오. 정확한 PSF를 만들려면 Defraction PSF 3D, 렌즈 숫자 조리개, 형광단 방출 파장, 픽셀 크기 및 Z-간격을 클릭하여 ImageJ 플러그인을 사용하여 이론적인 포인트 확산 함수를 만듭니다. 제공된 매크로를 사용하여 모든 시간대에 대해 배치 병렬 반복 디컨볼루션을 수행하려면 플러그인, 매크로 및 실행을 선택하십시오.
파일, 가져오기, 이미지 시퀀스를 클릭하여 모든 비convolved 시점을 스택으로 가져옵니다. 이미지, 하이퍼스택을 클릭한 다음 스택을 하이퍼스택으로 클릭하여 스택을 하이퍼스택으로 변환합니다. Z 슬라이스와 타임 프레임의 수를 추가 한 다음 올바른 3D 드리프트 플러그인을 사용하여 3D 드리프트를 수정하십시오.
3D 드리프트 보정된 하이퍼스택을 저장하고 이미지, 하이퍼스택, 하이퍼스택을 스택으로 클릭하여 이미지를 일반 스택으로 변환한 다음 이미지, 스택, 도구 및 스택 스플리터를 클릭하여 시점을 분할합니다. 분할할 서브스택의 수에 대해 시점 수를 입력합니다. 일괄 처리를 사용하여 모든 시점에 대한 최대 투영을 생성합니다.
파일, 가져오기, 이미지 시퀀스를 클릭하여 타임랩스 이미지 시퀀스를 가져옵니다. 그리고 디컨볼브 및 포스트 프로세싱된 이차원 비디오의 원하는 분석을 위해 기존의 ImageJ 툴을 사용하고, 스타버스트 셀 덴드라이트를 개발하는 고해상도 3D 비디오를 획득하고, 디컨볼브하고, 3D 드리프트에 대해 보정하였다. Z-평면 최대 프로젝션은 분석을 위해 2D 비디오를 제작하여 수지상 미세화 영역과 수지상 파생물 영역을 보여줍니다.
각 시점의 3D 디컨볼루션은 ImageJ와의 디컨볼루션 전후의 단일 P6 스타버스트 아마크린 셀의 미세한 필로포디아 프로젝션의 해상도를 증가시켰다. AAV 감염 기간이 길어도 주사 후 5일 및 11일째에 유사한 수준의 단백질 발현으로 나타나는 바와 같이 형광 신호 증가가 반드시 증가할 필요는 없다. 이미징 중 샘플 드리프트를 줄이는 것이 중요합니다.
드리프트는 일관된 이미징 온도를 유지하고 샘플 상에 중량을 적절하게 위치시킴으로써 최소화된다. 드리프트가 발생하는 경우, 시계열을 수동으로 획득하면 프레임 사이의 이미징 볼륨을 조정할 수 있습니다. 이렇게 하면 관심 있는 기능이 프레임에 남아 있습니다.
이 프로토콜은 신경돌기 발달에 대한 고해상도, 디컨볼루브 및 드리프트 보정 3D 비디오를 생성합니다. 이러한 비디오는 뉴런 배선에 대한 더 나은 이해로 이어지고 3D 형태 형성의 계산 분석 방법을 발전시키는 데 필요합니다. 뉴라이트 개발에 대한 높은 처리량 분석을 달성하기 위해서는 더 나은 자동 추적 및 추적 소프트웨어가 필요합니다.
