Name: microfluidic dry-spinning and characterization of regenerated silk fibroin fibers
Uploaded: 2017-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers at JoVE.com

이 작품은 주최 국립 자연 과학 재단의 중국 (21674018), 국가 핵심 연구 및 중국의 개발 프로그램 (2016YFA0201702 /2016YFA0201700), 그리고 "Shuguang 프로그램" 상하이 교육 개발 지원 재단과 상하이 시 교육 위원회 (15SG30), 상해시 영 교수 프로그램 (A201302), 중앙 대학 및 111 프로젝트 (No.111-2-04)에 대 한 근본적인 연구 자금을 구별.

주의: 사용 하기 전에 모든 관련 물질 안전 데이터 시트를 참조 하십시오. 성형을 준비에 사용 되는 화학 물질의 일부는 심하게 독성이 있습니다. 개인 보호 장비 (안전 안경, 장갑, 실험실 코트, 전장 바지 및 폐쇄 발가락 신발)를 사용 하십시오.
 1. 미세 회전의 RSF 용액 <li>준비의 RSF 마약 회전 수성 4 , 15 , <ol> 16 <ol><li>Degumming 누의 <ol><li>Degum 누에나방 고치 나 2 CO 3 수성 솔루션 (물에 0.5 wt %)에 두 번 30 분 각, 100 ° C에서 누에고치 및 다음 제거 하는 이온된 수와 실크를 씻는 sericin.</li>
		</ol></li> <li>Dissolving 반죽 누 누에고치의 <ol><li>건조 한 공기에 반죽 누에고치 실크; 다음 9.0 M LiBr 수 용액 1:10 (w/v) 40 ° C에서 2 h의 비율에 반죽 누에고치 실크 분해. 예를 들어 1 그램 실크 ( 그림 1a) 당 10 mL LiBr 추가.</li>
		</ol></li> <li>Centrifuging와 필터링 <ol><li>RSF 솔루션 1.5 배 이온을 제거 된 물에 의해 희석. 원심 분리기 및 불순물을 제거 하는 필터 1,234.8 x g.에서 10 분 원심 분리기 4 ° C에서 250 mL 병에 RSF 솔루션 RSF 솔루션 20 µ m 필터와 진공 펌프를 사용 하 여 필터링 합니다. 더블 필터 종이 침대는 실험 효과 고려 하는 것이 좋습니다.</li>
		</ol></li> <li>Dialyzing <ol><li>룰 반 투과성 멤브레인을 사용 하 여 3 일 동안 5 ° C에서 이온된 수에 RSF 솔루션 Dialyze (MWCO: 14000 ± 2000). RSF 솔루션의 전체 볼륨은 약 1 L, 4 투 석 가방에 로드. 이 투 석 가방 양동이에 넣어는 10 L 역삼 투 (RO)으로 가득 저온. 
			참고: 이온된 수의 pH 값을 집중 과정에서 겔 화를 피하기 위해 6 보다 높아야 한다. 이 프로토콜에 대 한 이온된 수의 pH 조정을 요구 하지 않았다.</li>
		</ol></li> <li>집중 <ol><li>응축 RSF 20 wt % 용액 5 ° C. 추가 3 M CaCl 2 수성 해결책에서 강제적인된 공기에 의해 1.0 mmol/g 캘리포니아 2 + 최종 농도; RSF 솔루션 다음 강제적인된 공기에 의해 집중 38-47 wt % 흐름.</li>
			<li>유리 슬라이드에 한 방울 RSF 솔루션의 무게와 다음 오븐 105에서 2 h 동안 건조 ° c. 
			참고: 무게 백분율 남은 고체 단백질과 CaCl 2의 총 농도 건조 하기 전에 드롭의 무게에 비해. RSF 농도 CaCl 2의 질량의 공제 후 파생 됩니다. 적어도 4 개의 반복 측정 수행 했다. 우리의 이전 연구의 캘리포니아 2 + 농도 크게 유 변 학적 특성 및 RSF 수성 해결책의 spinnability 영향을 보여주었다. 한편, 캘리포니아 2 +의 추가 β 시트의 제한 형성과 RSF 17의 집계 라는 메시지가 나타납니다. 기본 회전 마약 CaCl 2 회전 하는 회전 하기 전에 겔 화를 피하기 위해 마약의 저장 하는 동안 중요 한 역할을 간주 됩니다. 18</li></ol></li></ol></li> <li>미세 칩의 준비 8 , 19 <ol><li>포토 마스크를 준비 <ol><li>에 마이크로 채널을 디자인 한 CAD 프로그램입니다. 고해상도 투명도 19를 생산 하기 위해 CAD 파일 인쇄.</li>
		</ol></li> <li>금형 준비 <ol><li>청소 유리 슬라이드 <ol><li>화학 후드에 끓인 뜨거운 접시에 집중된 한 황산의 혼합된 솔루션 및 30 vol % 과산화 수소 솔루션 (10:1) 20 분 동안 유리 슬라이드. 
				주의: 황산과 과산화 수소 증기는 매우 유독.</li>
			</ol></li> <li>세척 유리 슬라이드 <ol><li>이온된 수를 사용 하 여 유리 슬라이드를 세척 하 고 건조 고 순도 질소로 불어.</li>
			</ol></li> <li>코팅 필름 <ol><li>SU-8 포토 레지스트 코팅 바의 아래쪽 면과 유리의 위 표면 사이 100 µ m의 간격으로 맞춤식 코팅 장치에 의해 유리 슬라이드에 코트.</li>
			</ol></li> <li>스핀 코팅 <ol><li>30 40.3 x g에서 spin coater를 사용 하 여 균일 한 필름을 형성 하기 위하여 유리 슬라이드에 포토 레지스트를 확산 s. 균일 한 필름의 두께 약 85 µ m.</li>
			</ol></li> <li>응고 <ol><li>프로그램 제어 온도 오븐에 포토 레지스트를 공고히. 실 온에서 2 ° C/min에서 65 ° C에 온도 상승 고 잡고 2 분 계속 65 ° C에서 열에 65 ° C ~ 95 ° C에서에서 누른 95 ° C 오븐과 멋진 15 분 회전에서 자연스럽 게 방 오븐에 온도.</li>
			</ol></li> <li>자외선 빛 노출 <ol><li>노출 유리의 측 12 자외선에는 포토 레지스트와 슬라이드 사진 평판 19는 포토 마스크로 투명도 사용 하 여 s. 
				참고: 자외선의 wavenumber는 365 nm와 노출 에너지는 273.6 mJ/cm 2. 
				주의: UV 빛 및 오븐 작업 하는 동안 적절 한 안전 조치를 취할.</li>
			</ol></li> <li>1.2.2.5 단계에서 설명한 대로 포토 레지스트를 공고히.</li>
			<li>개발 <ol><li>30 미 세척 소 프로 파 놀과 유리 슬라이드에 없습니다 강 수 있을 때까지 둘 사이 번갈아 하는 개발자에 의해 유리 슬라이드에 대 한 개발자 솔루션에 초음파 레지스트 청소.</li>
			</ol></li> <li>프로그램 제어 온도 오븐에 포토 레지스트를 공고히. 실 온에서 2 ° C/min에서 170 ° C 온도 상승 하 고 170 ° C 오븐과 멋진 30 분 설정에서 자연스럽 게 실내 온도에 오븐을.</li>
		</ol></li> <li>소프트 리소 그래피 <ol><li>형과 65 ° C에서 30 분 동안 치료 8.8 g 액체입니다 (PDMS) 사전 폴리머 붓는 고 80 ° C. 액체 PDMS 사전 폴리머에서 15 분 PDMS와 경화제 (10:1 (w/w))에서 일반적으로 이루어져 있다.</li>
		</ol></li> <li>펀치 <ol><li>드릴 여 채널의 시작 부분에서 PDMS 복제를 통해 구멍을 펀치. 드릴의 직경은 1.2 m m.</li>
		</ol></li> <li>씰링 <ol><li>두 PDMS 층의 표면에는 산소 플라즈마 처리에 의해 패턴 없이 평면 PDMS 레이어 채널 PDMS 복제 인감. 
			참고: 칩의 전반적인 준비 과정은 약 72 h.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>RSF의 제조 섬유 <ol><li>마약 회전의 주입 <ol><li>아닌 2 µ L/분으로 마약 주사기 펌프에 의해 회전 하는 RSF 주사.</li>
		</ol></li> <li>환경 규제 <ol><li>조정 40 ± 5 상대 습도 RH % 또는 50 ± 5 가습기를 사용 하 여 RH %. 40 ± 5 RH에서 %로-돌 다 섬유 경화 50 ± 보다 더 빨리 5 RH %.</li>
		</ol></li> <li>생산의 RSF 섬유 <ol><li>미세 채널의 출구에 정확 하 게에 의해 RSF 드롭 터치, RSF 섬유 공기, 그리고 다음 ( 그림 1b 3 cm/s의 속도로 10 cm 공기 차이 통해 롤러에 릴 ).</li>
		</ol></li> <li>24 헤에 대 한 봉인된 desiccator에 RSF 섬유를 저장</li>
		<li>섬유 후 처리 <ol><li>80 vol %ethano 0.9 m m s -1에서 4 번으로 늘인 섬유를 그릴사용자 컴퓨터 및 다음 계속 그려진된 섬유에 의해 l 솔루션 고정 하 고 1 시간에 대 한 솔루션에 섬유를 담가. 이 치료 때문에 섬유의 길이 60 m m로 원래 15 m m에서 변경 되었습니다.</li>
		</ol></li> <li>특성화에 대 한 샘플 준비 <ol><li>10 mm 게이지 길이와 사후 처리 섬유 종이 프레임에 수정. 적어도 20 섬유 측정, 인장 시험, SEM, FTIR, WAXS에서 포함에 대 한 필요는. 이후 그려진된 섬유 범위 5에서 10 µ m. 그림 1의 직경의 섬유 생산 및 WAXD 특성화 회로도 보여준다. RSF 섬유의 기계적 성질 (25 ± 2) ° C 소재 테스트 시스템 및 (45 ± 5) % 상대 습도 의해 시험 되었다. 확장 속도 및 게이지 길이 2 mm/min와 1 ㎝를 각각 했다.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 2. 싱크 로트 론 방사선 특성의 결정 구조의 RSF 섬유 <ol><li>싱크 로트 론 방사선 특성 4 , 13 , 17 <ol><li>beamline <ol><li>의 조정 조정 엑스레이 및 0.07746 nm을 2, 3 x 2 µ m 크기의 파장 각각. 
			참고: 프로토콜 BL15U1 beamline 상해 싱크 로트 론 방사선 시설에서 사용 하 여 수행 됩니다.</li>
		</ol></li> <li>X 선 스팟의 위치 <ol><li>x 선 스팟의 위치 찾기. 
			참고: x 선 스팟의 위치는 싱크 로트 론 방사선 시설에서 실험실 기술자에 의해 조정 됩니다.</li>
		</ol></li> <li>표준 샘플의 테스트: 세 륨 산화물 (CeO 2) <ol><li>표준 샘플 CeO 2 분말을 테스트. 원 센터와 검출기에는 샘플에서 거리를 계산 하기 위해 CeO 2 분말 특징 이었다.</li>
		</ol></li> <li>샘플 준비 <ol><li>10mm 게이지 길이 종이 프레임에 서로 병행에서 RSF 필 라 멘 트를 수정. 테스트 단계에 종이 프레임 접착제. 
			참고: 섬유를 수평 유지.</li>
		</ol></li> <li>SR WAXD 테스트 <ol><li>셔터를 열고 <ol><li>방에 아무 사람은 확인 후 beamline 역의 문을 닫습니다. X 선 빔 소스의 셔터를 열고.</li>
			</ol></li> <li>초점 <ol><li>초점에 때까지 약간 섬유를 이동. X, y, z 방향 ( 그림 1c) 소프트웨어를 통해 원격으로 섬유의 위치 조정.</li>
			</ol></li> <li>노출 샘플 <ol><li>이동 섬유 아래로 원격으로 소프트웨어를 통해 때까지 x 선 자리에. 20 x 선 beamline에 섬유를 노출 하는 소프트웨어에 시작 버튼을 누르면 s ( 그림 1c).</li>
			</ol></li> <li>회절 배경 <ol><li>테스트는 소프트웨어를 통해 원격으로 20 s. 이동 x 선 자리에서 섬유의 노출 시간 공기 배경의 회절. 보도 &#34; 시작 &#34;에 x 선 beamline 노출 소프트웨어에 단추 &#34; 공기 매체 &#34; 20 s.</li>
			</ol></li></ol></li></ol></li> <li>SR WAXD 데이터 처리 13 <ol><li>소프트웨어 보정 <ol><li>FIT2D (V12.077)를 사용 하 여 WAXD 데이터 처리. 원 센터와 샘플-검출기-CeO 2 분말의 회절 데이터를 사용 하 여 거리를 보정.</li>
		</ol></li> <li>2 차원 회절 패턴 <ol><li>FIT2D (V12.077)를 사용 하 여 섬유 회절 패턴에서 공기 배경 빼기.</li>
		</ol></li> <li>화도 및 crystallite 크기 <ol><li>산란 각도 2θ의 기능으로 회절 강도 통합. 자동된 피크 분리 소프트웨어 (버전 4.12) 12 deconvolution 강도 통합을 수행 합니다. 화도, c, x의 정도 관계에서 추정 되었다: <img alt="Equation" src="/files/ftp_upload/56271/56271eq1.jpg" /> , 어디 내가 c 결정 봉우리와의 통합된 강렬의 합계는 비정 질 헤일로 4 , 11의 통합된 강도 이다. WAXD 패턴의 통합 [200]의 피크 폭을 보여주었다, [020], [002] 반사. 이 봉우리의 FWHM 따라 crystallite 크기를 결정 하는 데 사용 했다는 a, b 및 c 축 Scherrer를 사용 하 여 &#39; s 수식 4.</li>
		</ol></li> <li>Crystallite 방향 결정 <ol><li>는 crystallite의 방향을 계산 하 고 비정 질 (020)의 방위 통합 및 (210) 봉우리 11. 결정 방향 허먼 따라 양적으로 계산할 수 있다 &#39; s 방향. 여기, 모두 (020) 및 (210) 봉우리 두 가우스 기능을 장착 했다. 좁은 한 결정 방향 이며 다른 광범위 한 지향된 비정 질 소재 13입니다. 여기, RSF 섬유의 crystallite 방향 방위 통합 (002) 피크의 절반 최대 (FWHM)에 전체 너비를 사용 하 여 비교 했다.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Asakura, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+the+structure+and+function+of+the+spinning+apparatus+in+the+silkworm+Bombyx+mori.">Some observations on the structure and function of the spinning apparatus in the silkworm Bombyx mori.</a> Biomacromolecules. 8 (1), 175-181 (2007).</li><li>Vollrath, F., Knight, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Liquid+crystalline+spinning+of+spider+silk.">Liquid crystalline spinning of spider silk.</a> Nature. 410 (6828), 541-548 (2001).</li><li>Zhou, G. Q., Shao, Z. Z., Knight, D. P., Yan, J. 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RSF 솔루션의 투 석 동안 pH 값이 다음 농도 과정에 대 한 중요 합니다. 이온된 수의 pH 값이 6 보다 작은, RSF 솔루션 집중 과정에서 젤 쉬울 것 이다. 겔 화를 피하기 위해, CaCl2 RSF 솔루션에 추가 됩니다. CaCl2 의 농도 1 mmol RSF의 무게 당.
우리의 이전 작품의 미세 드라이-8RSF 수성 해결책 가능성을 보여주었다. 미세 채널의 형상을 단순화 된 단일 ?...

거미 및 누 주위 온도 압력에서 수성 단백질 해결책에서 뛰어난 실크 섬유를 생산할 수 있다. 전단 및 extensional 흐름 실크 동맥1액정 텍스처의 형성을 유도할 수 있다. 최근 몇 년 동안, 고 강도 인공 섬유를 생산 하기 위해서는 거미의 회전 과정을 흉내 낸에 큰 관심이 되었습니다. 그러나, 거미 실크 단백질의 대량 수 없습니다 효율적이 고 경제적으로 의해 생산 농업 식인 풍습으로 인해 거미. 상당한 양의 누 실크는 농업에 의해 쉽게 얻어질 수 있다. 그렇지 않으면, 누와 거미 유사한 회전 과정과 아미노산 성분이 있다. 따라서 누 실크 fibroin 선택 대신 인공 동물 실크 스핀 많은 연구자에 의해.
거미 및 누에에서 섬유에 그들의 회전 덕트를 통해 단백질 해결책을 압출 성형. 가장 가능성이 회전 덕트를 따라 생성 높은 스트레스 힘 더 확장 구조2실크 fibroin 분자 스트레칭. 인공 실크 섬유 기존의 젖은 회전 및 회전 건조 프로세스3,4, 고려 하지 않는 사용 하 여 회전 된 유체 힘 회전 덕트에서 생성 된 계정.
첫째, 미세 접근 실크 단백질5,6의 어셈블리를 조사 하기 위해 사용 되었다. 다음, RSF의 미세 제조 전단 및 extensional 세력7,8모델링을 통해 연구 했다. 영의 계수 및 RSF 섬유의 직경이 미세 젖은 회전에 의해 조정 될 수 있다 하지만 그려진된 섬유의 인장 강도 100 MPa7. 마지막으로, 고 강도 RSF 섬유 미세 드라이 회전 메서드를 사용 하 여 성공적으로 준비 하지만 섬유의 직경은 2 µ m8만. 최근, 미세 젖은 회전 강도 재조합 거미 실크 섬유의 생산에서 성공적으로 사용 되었다. 공기에서 후 회전 그리기9인공 섬유 표면 및 내부 결함 개선.
이 연구에서는 향상 된 미세 회전 RSF 섬유에 대 한 과정 소개 된다. 그것은 회전 마약, 전단 세력, 그리고 드라이 회전 과정을 포함 하 여 누 실크 회전 과정을 모방 하는 것을 목표로. 이 회전 방법은 고 강도 인공 실크 섬유를 생산할 수 있다 뿐만 아니라 또한 섬유의 직경을 조정할 수 있습니다. 첫째, RSF 마약 회전 전단 이었고 두 번째 순서 지 수 감퇴와 biomimic 채널에 길쭉한. 둘째, 섬유 형태와 속성에 상대 습도 (RH)의 영향 미세 드라이 회전 과정10에서 공부 했다. 기존의 회전 spinneret에 비해, 우리의 미세 시스템 높은 생체 모방 이며 건조 하 여 주위 온도에 솔루션에서 고 강도 섬유를 생산 또는 회전 방법 젖은 사용할 수 있습니다.
때문에 고해상도, 고휘도, 고 에너지 싱크 로트 론 방사선 미소 초점 x 선의를 사용할 수 있습니다 몇 마이크로미터4,11 의 직경을 가진 단 하나 섬유의 미세 하 , 12 , 13 , 14. 여기, SR WAXD 기술은 화도, crystallite 크기 및 RSF 섬유의 결정 방향 계산에 사용 되었다.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;B. mori&lt;/em&gt; Cocoons</td><td>Farmer in Tongxiang, Zhejiang Province, China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sodium carbonate, anhydrous, 99.8%</td><td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Lithium bromide, 99.1%</td><td>Shanghai China Lithium Industrial Co., Ltd., China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Calcium chloride, anhydrous, 96.0%</td><td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Ethanol, anhydrous, 99.7%</td><td>Sinopharm Group Chemical Reagent Co.,Ltd., China</td><td>10009218</td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>SU-8 photoresist</td><td>MicroChem Corp., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Developing solution</td><td>MicroChem Corp., USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184</td><td>Dow Corning, USA</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol</td><td>Shanghai Lingfeng Chemical Reagent Co., Ltd., China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Concentrated sulfuric acid</td><td>Pinghu Chemical Reagent Factory, China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>30 vol% hydrogen peroxide</td><td>Shanghai Jinlu Chemical reagent Co., Ltd., China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Shanghai Zhengxing Chemical Reagent Factory, China</td><td></td><td>Analytically Pure</td></tr><tr><td>Oxygen plasma treatment</td><td>DT-01, Suzhou Omega Machinery Electronic Technology Co., Ltd., China</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Syringe pump</td><td>&amp;nbsp;KD Scientific, USA</td><td></td><td>KDS 200P</td></tr><tr><td>Humidifier</td><td>SEN electric</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Driller</td><td>Hangzhou Bo Yang Machinery Co., Ltd., China</td><td></td><td>bench drilling machine Z406c</td></tr><tr><td>Material testing system</td><td>Instron, USA</td><td></td><td>Model: 5565</td></tr><tr><td>PeakFit</td><td>Systat Software, Inc., USA</td><td></td><td>Version 4.12</td></tr></tbody></table>

microfluidic dry-spinning and characterization of regenerated silk fibroin fibers

프로토콜 누의 회전 과정을 흉내 낸에 대 한 메서드를 보여 줍니다. 기본 회전 과정에서 계약 회전 덕트 실크 단백질을 콤팩트 하 고 전단 및 신장 힘에 의해 정렬 될 수 있습니다. 여기, biomimetic 미세 채널 누의 회전 덕트의 특정 기하학을 모방 하도록 설계 되었습니다. 재생성 된 실크 fibroin (RSF) 회전 높은 농도, 첨가 온도 압력에서 드라이 스핀 섬유 아닌 통해 돌출 했다. 사후 처리 과정에서로 냈 지 섬유 했다 그려지고 에탄올 용액에 저장 됩니다. 싱크 로트 론 방사선 광각 x 선 회절 (SR-WAXD) 기술은 RSF 섬유 축 x-레이의 microbeam에 샘플 홀더를 고정 하는 단일 RSF 섬유의 미세를 조사 하기 위해 사용 되었다. 화도, crystallite 크기 및 결정 방향 섬유의 WAXD 데이터에서 계산 했다. 2 차원 WAXD 패턴의 적도 근처 회절 호 사후 처리 RSF 섬유 높은 방향 정도 나타냅니다.

고 강도 RSF 섬유 미세 회전 메서드를 사용 하 여 성공적으로 생산 되었다. 응력-변형 곡선 및 뻗어 RSF 섬유 C44R40의 SEM 이미지는 그림 2에 표시 됩니다. 적어도 10 섬유는 인장 시험에서 측정 되었다. 응력-변형 곡선 섬유의 주요 스트레스와 긴장의 평균 값에 따라 선택 되었다. 섬유의 WAXD 데이터는 그림 3에 나와 있습니다. 화도 및...

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Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

미세 드라이 회전 및 재생성된 실크 Fibroin 섬유의 특성

미세 회전 및 재생성된 실크 fibroin monofilament의 미세 특성화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

The protocol demonstrates a method for mimicking the spinning process of silkworm. In the native spinning process, the contracting spinning duct enables ...

microfluidic-dry-spinning-characterization-regenerated-silk-fibroin

Research

JoVE Journal

Chemistry

9.7K 조회수.  Donghua University. 미세 회전 및 재생성된 실크 fibroin monofilament의 미세 특성화에 대 한 프로토콜 제공 됩니다.

비디오: Microfluidic Dry-spinning and Characterization of Regenerated Silk Fibroin Fibers

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment 1,2 . These materials are desirable because they possess highly controllable dimensional and material characteristics, are biocompatible and promote cell adhesion, can be modified through topographic patterning or by chemically altering the surface, and can be used as a depot for biologically active molecules for drug delivery related applications 3-8 . In addition, silk films are relatively straightforward to custom design, can be designed to dissolve within minutes or degrade over years in vitro or in vivo, and are produce with the added benefit of being transparent in nature and therefore highly suitable for imaging applications 9-13. The culture system methodology presented here represents a scalable approach for rapid assessments of cell-silk film surface interactions. Of particular interest is the use of surface patterned silk films to study differences in cell proliferation and responses of cells for alignment 12,14 . The seeded cultures were cultured on both micro-patterned and flat silk film substrates, and then assessed through time-lapse phase-contrast imaging, scanning electron microscopy, and biochemical assessment of metabolic activity and nucleic acid content. In summary, the silk film in vitro culture system offers a customizable experimental setup suitable to the study of cell-surface interactions on a biomaterial substrate, which can then be optimized and then translated to in vivo models. Observations using the culture system presented here are currently being used to aid in applications ranging from basic cell interactions to medical device design, and thus are relevant to a broad range of biomedical fields.

Silk Film Culture System for in vitro Analysis and Biomaterial Design

Silk films are a novel class of biomaterials readily customizable for an array of biomedical applications. The presented silk film culture system is highly adaptable to a variety of in vitro analyses. This system represents a biomaterial design platform offering in vitro optimization before direct translation to in vivo models.

위한 실크 영화 문화 시스템 체외에서 분석 및 Biomaterial 디자인

Silk films are promising protein-based biomaterials that can be fabricated with high fidelity and economically within a research laboratory environment ...

연구

생체공학

Synthetic Spider Silk Production on a Laboratory Scale

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation biomaterials with high performance properties. The development of these new structural materials must be rapid, cost-efficient and involve processing methodologies and products that are environmentally friendly and sustainable. Spiders spin a multitude of different fiber types with diverse mechanical properties, offering a rich source of next generation engineering materials for biomimicry that rival the best manmade and natural materials. Since the collection of large quantities of natural spider silk is impractical, synthetic silk production has the ability to provide scientists with access to an unlimited supply of threads. Therefore, if the spinning process can be streamlined and perfected, artificial spider fibers have the potential use for a broad range of applications ranging from body armor, surgical sutures, ropes and cables, tires, strings for musical instruments, and composites for aviation and aerospace technology. In order to advance the synthetic silk production process and to yield fibers that display low variance in their material properties from spin to spin, we developed a wet-spinning protocol that integrates expression of recombinant spider silk proteins in bacteria, purification and concentration of the proteins, followed by fiber extrusion and a mechanical post-spin treatment. This is the first visual representation that reveals a step-by-step process to spin and analyze artificial silk fibers on a laboratory scale. It also provides details to minimize the introduction of variability among fibers spun from the same spinning dope. Collectively, these methods will propel the process of artificial silk production, leading to higher quality fibers that surpass natural spider silks.

Despite the outstanding mechanical and biochemical properties of spider silks, this material cannot be harvested in large quantities by conventional means. Here we describe an efficient strategy to spin artificial spider silk fibers, which is an important process for investigators studying spider silk production and their use as next-generation biomaterials.

실험실 규모의 합성 거미의 실크 생산

As society progresses and resources become scarcer, it is becoming increasingly important to cultivate new technologies that engineer next generation ...

Air Filter Devices Including Nonwoven Meshes of Electrospun Recombinant Spider Silk Proteins

Based on the natural sequence of Araneus diadematus Fibroin 4 (ADF4), the recombinant spider silk protein eADF4(C16) has been engineered. This highly repetitive protein has a molecular weight of 48kDa and is soluble in different solvents (hexafluoroisopropanol (HFIP), formic acid and aqueous buffers). eADF4(C16) provides a high potential for various technical applications when processed into morphologies such as films, capsules, particles, hydrogels, coatings, fibers and nonwoven meshes. Due to their chemical stability and controlled morphology, the latter can be used to improve filter materials. In this protocol, we present a procedure to enhance the efficiency of different air filter devices, by deposition of nonwoven meshes of electrospun recombinant spider silk proteins. Electrospinning of eADF4(C16) dissolved in HFIP results in smooth fibers. Variation of the protein concentration (5-25% w/v) results in different fiber diameters (80-1,100 nm) and thus pore sizes of the nonwoven mesh.
Post-treatment of eADF4(C16) electrospun from HFIP is necessary since the protein displays a predominantly &alpha;-helical secondary structure in freshly spun fibers, and therefore the fibers are water soluble. Subsequent treatment with ethanol vapor induces formation of water resistant, stable &beta;-sheet structures, preserving the morphology of the silk fibers and meshes. Secondary structure analysis was performed using Fourier transform infrared spectroscopy (FTIR) and subsequent Fourier self-deconvolution (FSD).
The primary goal was to improve the filter efficiency of existing filter substrates by adding silk nonwoven layers on top. To evaluate the influence of electrospinning duration and thus nonwoven layer thickness on the filter efficiency, we performed air permeability tests in combination with particle deposition measurements. The experiments were carried out according to standard protocols.

Spider silk fibers display extraordinary mechanical properties. Engineered Araneus diadematus Fibroin 4 (eADF4) can be processed into nonwoven meshes using electrospinning. Here, the eADF4 nonwoven meshes are used to improve the performance of air filtering devices.

전기 방사 재조합 거미 실크 단백질의 부직포 메쉬를 포함하여 공기 정화 장치

Based on the natural sequence of Araneus diadematus Fibroin 4 (ADF4), the recombinant spider silk protein eADF4(C16) has been engineered. This highly ...

Designing Silk-silk Protein Alloy Materials for Biomedical Applications

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, nanomedicine, tissue regeneration, and drug delivery. Designing materials based on the molecular-scale interactions between these proteins will help generate new multifunctional protein alloy biomaterials with tunable properties. Such alloy material systems also provide advantages in comparison to traditional synthetic polymers due to the materials biodegradability, biocompatibility, and tenability in the body. This article used the protein blends of wild tussah silk (Antheraea pernyi) and domestic mulberry silk (Bombyx mori) as an example to provide useful protocols regarding these topics, including how to predict protein-protein interactions by computational methods, how to produce protein alloy solutions, how to verify alloy systems by thermal analysis, and how to fabricate variable alloy materials including optical materials with diffraction gratings, electric materials with circuits coatings, and pharmaceutical materials for drug release and delivery. These methods can provide important information for designing the next generation multifunctional biomaterials based on different protein alloys.

Blending is an efficient approach to generate biomaterials with a broad range of properties and combined features. By predicting the molecular interactions between different natural silk proteins, new silk-silk protein alloy platforms with tunable mechanical resiliency, electrical response, optical transparency, chemical processability, biodegradability, or thermal stability can be designed.

바이오 메디컬 응용 프로그램에 대한 실크 실크 단백질 합금 재료 설계

Fibrous proteins display different sequences and structures that have been used for various applications in biomedical fields such as biosensors, ...

Reactive Inkjet Printing and Propulsion Analysis of Silk-based Self-propelled Micro-stirrers

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The resulting devices are an example of self-propelled objects capable of generating motion without external actuation and have potential applications in medicine and environmental sciences for a variety of purposes ranging from micro-stirring, targeted therapeutic delivery, to water remediation (e.g., cleaning oil spills). This method employs reactive inkjet printing to generate well-defined small-scale solid silk structures by converting water soluble regenerated silk fibroin (silk I) to insoluble silk fibroin (silk II). These structures are also selectively doped in specific regions with the enzyme catalase in order to produce motion via bubble generation and detachment. The number of layers printed determines the three-dimensional (3D) structure of the device, and so here the effect of this parameter on the propulsive trajectories is reported. The results demonstrate the ability to tune the motion by varying the dimensions of the printed structures.

This protocol demonstrates the ability to utilize reactive inkjet printing to print self-motile biocompatible and environmentally friendly micro-stirrers for use in biomedical and environmental applications.

실크 기반 자기 추진 마이크로 교 반기에 대 한 반응성 잉크젯 프린팅 및 추진 분석

In this study, a protocol for using reactive inkjet printing to fabricate enzymatically propelled silk swimmers with well-defined shapes is reported. The ...

화학

Material Formation of Recombinant Spider Silks through Aqueous Solvation using Heat and Pressure

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order to reproduce the remarkable mechanical properties of spider silks, they must be produced in heterologous hosts as spiders are both territorial and cannibalistic. The synthetic analogs of spider silk also tend to be insoluble in aqueous solutions. Thus, a large percentage of research in recombinant spider silks rely upon organic solvents that are detrimental to large scale production of materials. Our group&#8217;s method forces the solvation of these recombinant spider silks into water. Remarkably, when these proteins are prepared using this method of heat and pressure, a wide range of material forms can be prepared from the same solution of recombinant spider silk proteins (rSSp) including: films, fibers, sponge, hydrogel, lyogel, and adhesives. This article demonstrates the production of the solvated rSSp and material forms in a manner that is more easily understood than from written materials and methods alone.

Here, we present a protocol to produce water soluble recombinant spider silk protein solutions and the material forms that can be formed from those solutions.

열과 압력을 이용한 수성 용 매 화를 통한 재조합 거미 실크의 재료 형성

Many spiders produce seven types of silks. Six of the silks are fiber in form when produced by the spiders. These fibers are not water soluble. In order ...

Procedure for Fabricating Biofunctional Nanofibers

Electrospinning is an effective processing method for preparing nanofibers decorated with functional groups. Nanofibers decorated with functional groups may be utilized to study material-biomarker interactions i.e. act as biosensors with potential as single molecule detectors. We have developed an effective approach for preparing functional polymers where the functionality has the capacity of specifically binding with a model protein. In our model system, the functional group is 2,4-dinitrophenyl (DNP) and the protein is anti-DNP IgE (Immunoglobulin E). The functional polymer, &alpha;,&omega;-bi[2,4-dinitrophenyl caproic][poly(ethylene oxide)-b-poly(2-methoxystyrene)-b-poly(ethylene oxide)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP), is prepared by anionic living polymerization. The difunctional initiator utilized in the polymerization was prepared by electron transfer reaction of &alpha;-methylstyrene and potassium (mirror) metal. The 2-methoxystyrene monomer was added first to the initiator, followed by the addition of the second monomer, ethylene oxide, and finally the living polymer was terminated by methanol. The &alpha;,&omega;-dihydroxyl polymer [HO-PEO-P2MS-PEO-OH] was reacted with N-2,4-DNP-&isin;-amino caproic acid, by DCC coupling, resulting in the formation of &alpha;,&omega;-bi[2,4-dinitrophenylcaproic][poly(ethyleneoxide)-b-poly(2-methoxystyrene)-b-poly(ethylene oxide)] (CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP). The polymers were characterized by FT-IR, 1H NMR and Gel Permeation Chromatography (GPC). The molecular weight distributions of the polymers were narrow (1.1-1.2) and polymers with molecular weights greater than 50,000 was used in this study. The polymers were yellow powders and soluble in tetrahydrofuran. A water soluble CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP/ DMEG (dimethoxyethylene glycol) complex binds and achieves steady state binding with solution IgE within a few seconds. Higher molecular weight (water insoluble i.e. around 50,000) CDNP-PEO-P2MS-PEO-CDNP polymers, containing 1% single wall carbon nanotubes (SWCNT) were processed into electroactive nanofibers (100 nm to 500 nm in diameter) on silicon substrate. Fluorescence spectroscopy shows that anti-DNP IgE interacts with the nanofibers by binding with the DNP functional groups decorating the fibers. These observations suggest that appropriately functionalized nanofibers hold promise for developing biomarker detection device.

An efficient approach for preparing nanofibers decorated with functional groups capable of specifically interacting with proteins is described. The approach first requires the preparation of a polymer functionalized with the appropriate functional group. The functional polymer is fabricated into nanofibers by electrospinning. The effectiveness of the binding of the nanofibers with a protein is studied by confocal microscopy.

Biofunctional Nanofibers를 제조 절차

Electrospinning is an effective processing method for preparing nanofibers decorated with functional groups. Nanofibers decorated with functional groups ...

생물학

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical methods for manipulating and monitoring the activity of neurons in vivo. These types of experiments rely on two main components: 1) implantable devices that provide optical access to the brain, and 2) light-sensitive proteins that change neuronal excitability or provide a readout of neuronal activity. There are a number of ways to express light-sensitive proteins, but stereotaxic injection of viral vectors is currently the most flexible approach because expression can be controlled with genetic, anatomical, and temporal precision. Despite the great utility of viral vectors, delivering the virus to the site of optical implants poses numerous challenges. Stereotaxic virus injections are demanding surgeries that increase surgical time, increase the cost of studies, and pose a risk to the animal's health. The surrounding tissue can be physically damaged by the injection syringe, and by immunogenic inflammation caused by the abrupt delivery of a bolus of high-titer virus. Aligning injections with optical implants is especially difficult when targeting small regions deep in the brain. To overcome these challenges, we describe a method for coating multiple types of optical implants with films composed of silk fibroin and Adeno-associated viral (AAV) vectors. Fibroin, a polymer derived from the cocoon of Bombyx mori, can encapsulate and protect biomolecules and can be processed into forms ranging from soluble films to ceramics. When implanted into the brain, silk/AAV coatings release virus at the interface between optical elements and the surrounding brain, driving expression precisely where it is needed. This method is easily implemented and promises to greatly facilitate in vivo studies of neural circuit function.

In Vivo Targeted Expression of Optogenetic Proteins Using Silk/AAV Films

Here, we present a method for delivering viral expression vectors into the brain using silk fibroin films. This method allows targeted delivery of expression vectors using silk/AAV coated optical fibers, tapered optical fibers, and cranial windows.

Vivo에서 실크/AAV 영화를 사용 하 여 Optogenetic 단백질의 표적으로 표현

The quest to understand how neural circuits process information in order to drive behavioral output has been greatly aided by recently-developed optical ...

신경과학

<meta charset="utf8"></head><body>세포 배양 삽입물에 대한 FN-Silk Membranes의 형성 및 부착

Nanofibrillar Basement Membrane Mimic Made of Recombinant Functionalized Spider Silk in Custom-Made Tissue Culture Inserts

Replicating tissue barriers&#160;is critical for generating relevant in vitro models for evaluating novel therapeutics. Today, this is commonly done using tissue culture inserts with a plastic membrane, which generates an apical and a basal side. Besides providing support for the cells, these membranes come far from emulating their native counterpart, the basement membrane, which is a nanofibrillar, protein-based matrix. In this work, we show a simple way to considerably improve the biological relevance of the tissue culture inserts by replacing the plastic membrane with one made from a pure recombinant functionalized spider silk protein. The silk membrane forms through self-assembly and will spontaneously adhere to a membrane-free tissue culture insert, where it can provide support for cells. Custom-designed tissue culture inserts can be printed using a standard 3D printer, following the instructions provided in the protocol, or commercial ones can be purchased and used instead. This protocol shows how the culture system with silk membranes in inserts is set up and, subsequently, how the same cell culturing techniques that are used with traditional, commercially available inserts can be implemented.

<meta charset="utf8"></head><body>저자 스포트라이트: Enhancing In Vitro Cell Culture Models with Recombinant Functionalized Spider Silk Membranes

Tissue culture inserts with plastic membranes are the golden standard in cell culture labs as permeable supports to establish cell layers and models of barrier tissues. Herein, we present a simple method to replace the plastic membrane with a more biologically relevant membrane made from a recombinant functionalized spider silk protein.

맞춤형 조직 배양 인서트에 재조합 기능성 거미줄로 만든 Nanofibrillar 기저막 모방

Replicating tissue barriers&#160;is critical for generating relevant in vitro models for evaluating novel therapeutics. Today, this is commonly done using ...

미세 드라이 회전 및 재생성된 실크 Fibroin 섬유의 특성

요약

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이 비디오의 챕터

위한 실크 영화 문화 시스템 체외에서 분석 및 Biomaterial 디자인

실험실 규모의 합성 거미의 실크 생산

전기 방사 재조합 거미 실크 단백질의 부직포 메쉬를 포함하여 공기 정화 장치

바이오 메디컬 응용 프로그램에 대한 실크 실크 단백질 합금 재료 설계

실크 기반 자기 추진 마이크로 교 반기에 대 한 반응성 잉크젯 프린팅 및 추진 분석

열과 압력을 이용한 수성 용 매 화를 통한 재조합 거미 실크의 재료 형성

Biofunctional Nanofibers를 제조 절차

Vivo에서 실크/AAV 영화를 사용 하 여 Optogenetic 단백질의 표적으로 표현

맞춤형 조직 배양 인서트에 재조합 기능성 거미줄로 만든 Nanofibrillar 기저막 모방

맞춤형 조직 배양 인서트에 재조합 기능성 거미줄로 만든 Nanofibrillar 기저막 모방