The opinions or assertions contained herein are the private views of the authors and are not to be construed as official or as reflecting the views of the Department of the Army or the Department of Defense. This research was performed while the authors Alberto Mu&#241;iz, Ramesh R Kaini, Whitney A Greene and Jae-Hyek Choi held a National Research Council Postdoctoral Research Associateship at the USAISR. This work was supported by U.S. Army Clinical Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) and Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).

문화 시약 및 문화 플레이트 1. 준비 <ol><li> 줄기 세포 기초 배지 400㎖의 5 배의 무 혈청 보충 100 ㎖를 첨가하여 피더없는 줄기 세포 배양 배지를 준비한다. 매체는 최대 2 주 동안 4 ℃에서 6 개월 -20 ° C에서 안정적이다. </li><li> RHO 관련, 코일 코일 포함하는 단백질 키나제 (락) 억제제 (Y-27362)에 시중에서 판매하는 배아 체 (EB) 형성 매체의 10 μm의 솔루션을 추가합니다. </li><li> (둘 베코 변형 이글 보통 / 영양소 혼합물 F-12 0.1 밀리미터 β 머 캅토 에탄올, 0.1 mM의 비 필수 아미노산, 2 mM L- 글루타민, 10 % 녹아웃 혈청 교체 (KSR) 및 10 ㎍ / ml의 겐타 마이신을 첨가하여 DMEM을 분화 배지를 준비 / F12). </li><li> 1X N1 보충제, 0.1 mM의 비 필수 아미노산, 250 ㎍ / ml의 타우린 13 NG / ㎖ triiodo-L-로닌 나트륨 염, 20 NG / ㎖의 하이드로 코르티손, 5 ㎍ / ml의 겐타 마이신, 및 15 %를 첨가하여 만능-RPE 미디어를 준비 소 태아 혈청 (FBS) &lt;SUP&gt; 최소 필수 중간 이글 (MEM) 21. 7.4 pH를 조정합니다. </li><li> triiodo-L-티 로닌 나트륨 염 주식 솔루션을 준비합니다. 부드럽게 선회하여 1 N 수산화 나트륨에 triiodo-L-로닌 나트륨 염 1mg을 녹인다. MEM 49 ㎖를 triiodo-L-로닌 나트륨 염을 50ml의 20 ㎍ / mL로. 분취 량을 준비하고 필요할 때까지 -20 ° C에서 동결. 최종 배지에서 원하는 농도를 달성하기 위해 적절한 양을 사용한다. </li><li> 하이드로 주식 솔루션을 준비합니다. 교반과 100 % 에탄올 1 ㎖에 1 mg의 하이드로 코르티손을 가용화. MEM 19 ㎖를 20 ㎖ 하이드로 코르티손 원액 ㎍ / ㎖의 (50)을 추가합니다. -20 ° C에서 나누어지는 및 동결이 필요할 때까지. 최종 배양액의 목적하는 농도를 달성하기 위해 적절한 양을 사용한다. </li><li> DMEM / F12 1 ㎎ / ㎖의 디스 파제의 작업 솔루션을 준비합니다. </li><li> 매트릭스 코팅 된 플레이트의 제조 <ol><li> Engelbreth-홀름 - 스웜 (EHS)에서 추출한 단백질 매트릭스 양해 각서 (MOU)를 준비0.08 ㎎ / ㎖에 DMEM / F12에서 자체 육종 세포. 매트릭스 코트 액 1 mL를 6- 웰 플레이트의 각 웰. 1 시간 동안 실온에서 코팅 된 플레이트를 인큐베이션. </li><li> 1 시간 배양 후, 여분의 DMEM / F12를 대기음. 웰의 건조를 방지하기 위하여 피더없는 줄기 세포 배양액 0.5ml를 추가. 매트릭스 코팅 된 플레이트를 사용할 준비가되었습니다. </li></ol></li><li> DMEM / F12 2 ㎖ 잘 각을 세척하여, 마이크로 웰 플레이트를 준비합니다. DMEM / F12를 제거하고 각 잘하는 락 억제제와 보충 EB 형성 매체의 0.5ml를 추가합니다. 5 분 모든 공기 방울을 제거하기 위해 2000 XG에 플레이트를 원심 분리기. </li><li> 인산 완충 식염수 (PBS)에 아 지드 화 나트륨을 2 % FBS를 혼합하여 FACS 염색 버퍼를 준비하고, 0.09 %. pH가 7.4로 버퍼를 조정합니다. </li><li> DMEM / F12, 10 % FBS를 첨가함으로써 트립신 중화 용액을 준비한다. </li></ol> 2. 만능 문화 <ol><li> 유도 만능 줄기 세포 파종하기 전에 따뜻한 공급 장치가없는 줄기 세포 배양 37 ° C 중간, 그리고 엄마가TRIX 판을 준비 코팅. </li><li> 빠르게 37 ° C의 물을 욕조에 IMR90-1 만능 줄기 세포를 해동. 그런 다음 물을 욕조에서 극저온 유리 병을 제거하고 70 % 에탄올로 유리 병을 닦습니다. 세포 덩어리의 파괴를 최소화하기 위해 2 ㎖의 피펫을 사용하여 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. </li><li> 적가 따뜻한 피더 세포에 무 줄기 세포 배양 배지 5 ㎖를 첨가하고 부드럽게 혼합한다. RT에서 5 분 300 XG에서 세포를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. </li><li> 조심 피더없는 줄기 세포 배양 배지 2 ㎖로 세포를 재현 탁하고 덩어리 매트릭스 코팅 플레이트의 웰에 세포 덩어리를 시드. 5 % CO 2, 95 % 습도가 37 ° C를 인큐베이터에 접시를 놓습니다. </li><li> 매일 만능 줄기 세포 배양 배지를 변경합니다. 파종 후 미분화 식민지에게 5-7일을 준수하십시오. 광학 현미경 아래로 (고밀도 센터와 식민지)에 대한 준비가 미분화 식민지를 확인합니다. </li></ol> 유도 만능 줄기 세포의 3과 Passaging <ol><li> 처음으로 통과하기 전의 IPS 세포는 수욕 중에서 37 ° C로 디스 파제 용액, DMEM / F12 및 피더없는 줄기 세포 배양 배지를 가온. </li><li> 유도 만능 줄기 세포를 계대하기 전에 지역을 긁고 매체를 흡입하여 차별화의 영역을 제거합니다. 조심스럽게 2 ml의 DMEM / F12와 유도 만능 줄기 세포를 씻어. </li><li> / ㎖ 디스 파제 각 웰에 1 mg을 1 ㎖를 추가하고 7 분 37 ° C에서 품어. 디스 파제를 대기음 부드럽게 DME​​M / F12 두 배의 2 ml의 세포 식민지를 씻어. 세척 후, 각 웰에 무 피더 줄기 세포 배양액 2 ㎖를 추가한다. </li><li> 5 ㎖의 피펫을 사용하여 부드럽게 세포 덩어리를 형성하기 위해 판의 식민지를 긁어. 15 ML 원뿔 관에 분리 된 세포 덩어리를 전송합니다. 세포의 다음 구절을 시드하는 충분한 공급이없는 줄기 세포 배양 배지를 추가합니다. </li></ol> 마이크로 웰 플레이트를 사용하여 사채의 4 세대 <ol><li> IPS 세포의 단일 세포 현탁액의 제조 <ol><li> mediu 제거유도 만능 줄기 세포로부터 m과 DMEM / F12의 2 ml로 유도 만능 줄기 세포를 씻어. 6 웰 플레이트에서 유도 만능 줄기 세포에 accutase 750 μl를 추가합니다. 셀 플레이트 (약 5-10 분)에서 분리 할 수 있도록 37 ° C, 5 % CO 2에서 세포를 배양한다. </li><li> 부드럽게 남아있는 세포를 해리 피펫을 사용하고 플레이트 표면에 남아있는 세포를 분리. 50 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. DMEM / F12 5 ㎖와 함께 접시를 씻어 원뿔 튜브에 세포를 세척 DMEM / F12을 결합한다. 가능한 잔여 세포 덩어리를 제거하기 위해 40 μm의 셀 스트레이너를 통해 세포 현탁액을 전달합니다. </li><li> accutase을 제거하기 위해 RT에서 5 분 동안 300 XG에서 세포를 원심 분리기. 세포 농도가 약 0.5 내지 1.0 × 10 7 세포 / ㎖가되도록 EB 형성 매질에서 세포 펠렛을 재현 탁. </li><li> 트립 판 블루 및 혈구와 세포를 계수하여 생존 세포의 수를 결정한다. </li></ol></li><li> Adjustin마이크로 웰 g의 셀 밀도는 크기 제어 사채를 형성 <ol><li> EB 원하는 크기를 생성하는 마이크로 웰 플레이트의 각 웰에 셀의 수를 조정한다. 균등 부드럽게 세포를 여러 번 피펫 팅하여 세포를 분산 단계에서 제조 된 1.9 마이크로 웰 플레이트에 셀을 추가한다. 참고 : 잘 당 마이크로 웰의 EB의 X 번호 당 세포의 잘 당 필요한 세포의 수 = 원하는 번호. </li><li> 2.0 ml의 최종 부피로 우물에 바위 억제제와 보충 EB 형성 매체를 조정합니다. 부드럽게 각 피펫 팅 잘하여 세포를 재분배. 3 분 동안 100 XG에서 마이크로 웰 플레이트를 원심 분리기. 5 % CO 2, 24 시간 동안 95 %의 습도가 37 ° C에서 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. </li></ol></li><li> 마이크로 웰 플레이트에서 수확 사채 <ol><li> 잘 사채의 대부분을 제거하는 1 ml의 micropipettor와 상하 매체를 피펫 팅 마이크로 웰에서 수확 사채. 역 40 μm의 세포를 통해 EB 서스펜션 전달50 ML 원뿔 튜브의 상단에 스트레이너는 하나의 세포를 제거합니다. </li><li> 모든 사채를 제거하는 DMEM / F12의 1 ml의 마이크로 웰 플레이트 5 회 반복한다. 세척을 수집하고 반전 셀 스트레이너를 통해 전달합니다. 새로운 50 ML 원뿔 튜브까지 셀 스트레이너 오른쪽으로 돌립니다. EB 형성 매체로 세척하여 사채를 수집합니다. 수율을 결정하기 위해 사채를 계산합니다. </li></ol></li></ol> 5. 도금 사채 및 초기화 차별화 <ol><li> &lt;1000 사채 /의 밀도에 잘 EB 형성 매체 플러스 10 μM 바위 억제제 (단계 1.8.1에서와 같이) 여섯 잘 접시를 코팅 단백질 매트릭스에 사채 플레이트. 5 % CO 2, 24 시간 동안 95 %의 습도가 37 ° C에서 사채를 품어. </li><li> 24 시간 EB 도금 후, 분화를 시작하기 위해 차별화 매체로 교체합니다. 세포가 추가 분석을 위해 수집 될 때까지 매일 분화 매체의 절반을 변경합니다. </li><li> RT-PCR을 수행하기 위해 6 일, 17, 29 및 60 ℃에서 샘플을 수집, IMMunocytochemistry 및 FACS는 특성 RPE 유전자와 단백질의 발현을 확인합니다. </li></ol> 6. RNA 추출 및 PCR <ol><li> 시중에서 판매되는 키트에 제공된 지침에 따라 EB 샘플에서 RNA를 추출합니다. 분광 광도계를 사용하여 RNA 농도를 측정. </li><li> cDNA를 역 전사 키트 시판 RNA에 따라 총 RNA 100 NG에 역전사를 수행합니다. </li><li> cDNA를 10 μmol / 10 NG의 농도 10ng의 cDNA를 다음의 프라이머를 사용하여 (표 1)로 PCR을 수행한다. 다음과 같이 PCR을 설정 : 5 분 동안 95 ° C에서 DNA를 변성, 72 ℃에서 최종 사이클 뒤에 30 초, 1 분, 72 ° C에 대해 15 초 동안 95 ° C에서 35 사이클과 60 ° C를 증폭 10 분간 C. 1 % 아가로 오스 겔에 PCR 제품을 실행합니다. </li></ol> 7. 면역 세포 화학 <ol><li> RT에서 PBS로 2 회 교환 사채를 씻으십시오. 4 % paraformald에 실온에서 EBS을 (를) 수정10 분 동안 ehyde. RT 한 번 PBS로 씻어. 4 ° C에서 PBS에 보관 샘플 염색에 사용되는 때까지. </li><li> 염색 날, 고정 및 투과성으로 시약 고정 된 세포를 취급합니다. RT에서 1 시간 동안 (투과성으로 용액에 10 % 염소 혈청) 차단 용액과 샘플을 인큐베이션. </li><li> 표시된 희석에서 다음 일차 항체를 사용하여 투과성으로 용액에 10 % 염소 혈청으로 면역 화학을 수행 안티 PAX6을 (1:10), 안티 RX (1 : 200), 안티 MITF (1:30)을 수행하고, 항 - ZO1 (1 : 100). 4 ° C에서 항체 O / N 대응과 샘플을 품어. </li><li> 다음날, 세포로부터 차 항체를 제거하고 PBS로 세 번 샘플을 헹군다. 실온에서 1 시간 동안 형광 접합 된 이차 항체와 샘플을 품어. </li><li> 세포에서 차 항체를 제거하고 PBS에서 샘플을 세 번 헹군다. 커버가 장착 매체를 포함 DAPI와 유리 슬라이드에 미끄러 져 마운트 및 샘플 어두운 챔버에서 O / N을 설정할 수 있습니다.염색을 시각화하기 위해 형광 현미경을 사용합니다. </li></ol> FACS 분석 8. 염색 <ol><li> PBS에 두 번 배양 사채을 씻으십시오. 단일 세포 현탁액을 5 ~ 10 분 동안 0.25 % 트립신 0.5 mL를 사채를 품어. 트립신 중화 용액 트립신 (1 ㎖ / 웰)을 중화. </li><li> 10 분 동안 600 XG에 15 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 단일 세포 현탁액을 전송합니다. </li><li> 상층 액을 제거하고 튜브에 세포를 DMEM / F12 10 ㎖를 추가합니다. 부드럽게 세포를 섞어 반전. 600 × g에서 원심 분리기. 원심 분리 후, 상청액을 폐기하고 FACS 염색 버퍼에 세포를 재현 탁. </li><li> 세포의 총 수를 계산. 10 분 동안 600 XG에 원심 분리기. 원심 분리 폐기 뜨는 후. 즉시 4 % 파라 포름 알데히드 0.5ml를 첨가하여 세포를 고정. 부드러운 소용돌이로 교반하여 잘 섞는다. 20 분 동안 4 ° C에서 세포를 품어. </li><li> 10 분 동안 600 XG에 원심 분리기 및 제거상층 액. 소용돌이 부드럽게 세포 펠렛을 방해합니다. 냉장 된 투과성으로 용액 1 ㎖를 첨가하여 세포를 Permeabilize 하시려면. 소용돌이 부드럽게 섞어 30 분 동안 얼음에 품어. </li><li> 10 분 동안 600 XG에서 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. FACS 염색 버퍼에 resuspend 3 ㎖를 추가합니다. 한 번 더에 대해이 단계를 반복합니다. 5 × 106 세포 / ml의 최종 농도 FACS 염색 버퍼에 세포를 재현 탁. </li><li> 각각의 미세 원심 튜브에 세포 현탁액 (0.5 × 10 6 세포)의 100 μl를 전송하고 차 항체의 권장 용량을 추가 할 수 있습니다. PAX6를 들어, 세포 현탁액 100 ㎕에 PE 방지 PAX6의 5 μl를 추가합니다. MITF를 들어, 세포 현탁액 100 ㎕에 방지 MITF의 5 μl를 추가합니다. </li><li> 혼합하고 60 분 동안 실온에서 배양한다. FACS 염색 버퍼의 3 ML을 추가합니다. 10 분 동안 600 XG에서 혼합하고 원심 분리기. 상층 액을 제거하고 두 개의 추가 회 8.16를 반복합니다. </li><li> MITF 염색의 경우, 보조 antibo에서 세포를 배양DY, 하나의 희석에 염소 항 - 마우스 알렉사 형석 488 : 4 ° C에서 1 시간 동안 2000. PAX6 염색의 경우,이 단계를 피할 수 있습니다. </li><li> 10 분 동안 600 XG에서 FACS 염색 버퍼와 원심 분리기의 5 ml의 세포를 씻으십시오. 두 번 더에 대해이 과정을 반복합니다. </li><li> 세포 펠렛을 방해 부드럽게 FACS 염색 버퍼 및 500 μl의 소용돌이에 세포를 재현 탁. 샘플은 유세포 분석을위한 준비가되어 있습니다. </li></ol> 9. 만능 줄기-RPE의 분리 및 문화 <ol><li> 하루에 29에서주의 깊게 200 μL 피펫 팁을 사용하여 배양 용기에서 선택한 색소 식민지 주위에 잘라. 15 ML 원뿔 튜브에 떠있는 식민지를 전송합니다. 실온에서 10 분 동안 600 XG에 식민지를 원심 분리기와 뜨는을 제거합니다. </li><li> 10 분 동안 600 XG에 DMEM / F12 원심 10ml에 세포를 재현 탁 콜로니. 상층 액을 제거합니다. </li><li> 7-10 분 동안 37 ℃에서 0.25 % 트립신과 2 ml의 콜로니를 배양하여 단일 세포 현탁액을 제조. 조심스럽게 식민지를 해리 세포 현탁액을 소용돌이. </li><li> 만능-RPE 배지 2 ㎖를 첨가하여 트립신을 중화. 10 분 동안 600 XG에 원심 분리기 상층 액을 버린다. 만능-RPE 배지 2 ㎖로 단일 세포를 재현 탁. 37 ° C, 5 % CO 2 및 95 % 습도 인큐베이터에서 단백질 기질 코팅 6- 웰 플레이트 제자리 세포 이동. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

세포 치료 용 다 능성 줄기 세포의 전체 약속을 실현하기 위해서는, 일관되고 재생 가능한 방법으로 분화를 조절하는 것이 필요하다. 이 보고서는, 마이크로 웰 플레이트 기술을 사용하여 크기 조절 사채를 형성 RPE으로 분화를 시작하고 RPE의 단백질과 유전자 마커를 식별하기 위해 프로토콜을 설명합니다. 체외 분화를 동기화하려면, 사채의 균일 한 크기는 강제로 집계하여 마이크로 웰 플...

유도 된 다 능성 줄기 (IPS) 세포 외적 요인으로 성인 1 셀 재 프로그래밍에 의해 도출 된 다 능성 줄기 세포의 유형이다. 대조적으로, 배아 줄기 세포 (는 ESC), 다 능성 줄기 세포의 다른 유형은, 2-3 배반포의 내부 세포 덩어리로부터 생성된다. 서로 다른 기원에도 불구하고, 유도 만능 줄기 세포와는 ESC는 체외에서 어떤 세포 유형 4-5로 분화하는 능력에 복제 할 수있는 자신의 무제한 용량의 비교입니다. 유도 만능 줄기 세포의 이러한 특성은 그들에게 개인화 된 재생 의학의 애플리케이션에 이상적 후보를합니다. 최근의 연구 노력은 망막 색소 상피 (RPE) 6-11 포함 전문 성인 세포를 제조하기위한 강력한 분화 프로토콜 개발에 초점을 맞추고있다. 만능 줄기 세포 유래의 잠재적 임상 적용의 경우, 특정 세포 유형에 대한 지시 분화 필수적이다. 여러 가지 방법이 있습니다효율성 6-7, 12-16으로 크게 변화 RPE에 모두는 ESC와 유도 만능 줄기 세포의 직접 분화 발표했다. 우리는 여전히 개발 또는 분화하는 동안 세포 / 조직의 운명을 지배하는 분자 이벤트의 많은 모른다. 최근 몇년 최대한 학적 개발을 모방 할 수 분화 프로토콜을 개발하기위한 노력이 이루어지고있다. 배반포 단계에서 줄기 세포의 커밋되지 않은 인구는 세 가지 차원 미세 환경에서 함께합니다. 따라서, 다양한 전략이 함께 조립 ESC / 만능 줄기 세포를 만들어 입체적으로 그들을 성장에 적용되었다. 이러한 줄기 세포 집합체는 배아 체 (사채)이라고합니다. 연구는 줄기 세포의 분화 EB는 배아 발달의 초기 단계를 모사하고 자발적 외면에 원시 내배엽을 야기 할 수 있음을 보여 주었다. EB 개발이 진행됨에 따라 나중에 세 생식 계통의 분화 된 세포의 표현형은 17 ~ 18이 나타납니다. 목erefore, 사채를 기반으로 차별화 프로토콜은 ESC / 유도 만능 줄기 세포의 체외 분화에 대한 많은 관심을 끌었다 및 다 능성 줄기 세포 (13)에서 RPE 생성을위한 좋은 후보입니다했다. 사채는 ESC / IPS 세포에서 여러 가지 방법을 사용하여 제조 될 수있다. 처음에는 사채가 부착 식민지를 긁어 및 비 부착 서스펜션 문화를 유지함으로써 이루어졌다. 그러나이 방법은 낮은 재현성이 발생 사채의 이기종 인구를 산출한다. 매달려 드롭 세포 배양 및 마이크로 웰 기반 사채 형성은 매우 재현성 정의 크기의 균일 한 사채를 얻을 사채 형성을위한 다른 인기있는 기술이다. 또한, 마이크로 웰 기법은 적은 노력으로 많은 수의 집합체를 얻을 수있다. 사채 내에서 세포의 분화는 세포와 세포 내 미세 환경에서 형태 형성 큐의 멀티 플렉스에 의해 조절된다. 월의 차별화는 대조적으로olayer 형식, 교환 사채는 세포의 복잡한 어셈블리 (17)를 발생하는 세포 간 신호 전달을위한 플랫폼을 제공합니다. 흥미롭게도, 개별 EB를 만드는 데 사용 능성 줄기 세포의 수는 세포의 운명에 영향을 관찰 하였다. 1000 셀 EB는 적혈구 계보 (20)을 향해 밀어 반면 예를 들어, 인간는 ESC의 조혈 분화 연구에서, 그것은 500 셀 EB는 골수 계통으로 분화를 촉진하는 것이 관찰되었다. 또 다른 연구에서, 작은 사채는 신경 외배엽 분화 (11), (17)으로 승진 큰 사채 반면 내배엽 분화를 선호. 이러한 과거의 연구는 개개의 EB를 강하게 만드는 데 사용 ESC / IPS 세포의 수는 임의의 유형의 세포로 분화를 기반에 영향을 사채 제안. 그러나, 우리의 지식, RPE으로 차별화하기 위해 성향에 사채 크기의 영향을 규명 한 전류 연구는 없다. 본 연구의 목표의 영향을 특성화하는 것이다망막 색소 상피 세포 (IPS-RPE) 분화 및 망막 색소 상피 혈통을 지향 차별화 사채을 할 수있는 최적의 세포 수를 확인하는 - 유도 만능 줄기 (IPS) 세포에 EB 크기입니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="722">
	<tbody>
		<tr height="36">
			<td height="36" style="height:36px;width:239px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:183px;">Company</td>
			<td style="width:140px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:161px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">mTeSR1 media + 5X supplement</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Y-27632 (Rock Inhibitor)</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>72304</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/F12</td>
			<td>Life Technologies</td>
			<td>11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">M-7154</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Non essential amino acids</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH30853.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Knockout serum replacement</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Gentamicin&#160;</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">15750-060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">L-Glutamine</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">MEM media</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:140px;">10370-021</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">N1 supplement</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">N-6530-5ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Taurine</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">T-8691-25G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Hydrocortisone</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">H0888-1G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Fetal bovine serum</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>SH3008803HI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Triiodo-l-thyronine sodium&#160; salt</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">T6397</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:183px;">Sigma</td>
			<td style="width:140px;">S5881</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Dispase</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td>17105-041</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Matrigel</td>
			<td style="width:183px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:140px;">354277</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Phosphate buffered saline</td>
			<td style="width:183px;">Hyclone(Fisher)</td>
			<td>10010-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Aggrewell 400 plate</td>
			<td style="width:183px;">Stem Cell Technologies</td>
			<td>27940</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">AggreWell medium</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>5893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Accutase</td>
			<td>Stem Cell Technologies</td>
			<td>7920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:239px;">BD Cytofix/Cytoperm Fixation/Permeabilization Kit</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>554714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Mouse Anti-PAX6 antibody</td>
			<td colspan="2">Developmental Studies Hybridoma Bank</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit Anti- RX antibody</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>Ab23340</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Mouse&#160; Anti-MITF antibody</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>MS-772-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">Rabbit Anti-ZO-1 antibody</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>40-2200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">RNeasy plus mini kit</td>
			<td>Qiagen</td>
			<td>74134</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">PCR master mix</td>
			<td>promega</td>
			<td>M7502</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:239px;">High capacity RNA to c DNA kit</td>
			<td style="width:183px;">Life Technologies</td>
			<td>4387406</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

deriving retinal pigment epithelium (rpe) from induced pluripotent stem (ips) cells by different sizes of embryoid bodies

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of techniques to reprogram somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells has generated interest and excitement towards the possibility of customized personal regenerative medicine. However, the efficiency of stem cell differentiation towards a desired lineage remains low. The purpose of this study is to describe a protocol to derive retinal pigment epithelium (RPE) from iPS cells (iPS-RPE) by applying a tissue engineering approach to generate homogenous populations of embryoid bodies (EBs), a common intermediate during in vitro differentiation. The protocol applies the formation of specific size of EBs using microwell plate technology. The methods for identifying protein and gene markers of RPE by immunocytochemistry and reverse-transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) are also explained. Finally, the efficiency of differentiation in different sizes of EBs monitored by fluorescence-activated cell sorting (FACS) analysis of RPE markers is described. These techniques will facilitate the differentiation of iPS cells into RPE for future applications.

이 실험에서, 유도 만능 줄기 세포는 배양 및 사채의 망막 색소 상피 계보로 분화. 제어 된 크기의 마이크로 웰 플레이트는 EB를 이용하여 형성 하였다. 도 1 EB 형성에서 보이는 바와 같이 마이크로 웰 플레이트에서 균일했다. 이러한 사채 후 (도 2)를 수집하고, 6 웰 플레이트에 플레이 팅 하였다. RPE는 RPE 마커들은 고전 육각 형태, 착색 및 발현에 의해...

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Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

이 보고서의 목적은 배아 체의 다른 크기를 이용하여 유도 된 다 능성 줄기 (IPS) 세포로부터 망막 색소 상피 (RPE)를 도출하는 프로토콜을 기술한다.

배아의 몸의 다른 크기에 의해 유도 다 능성 줄기에서 망막 색소 상피 세포 (RPE)를 도출 (IPS) 세포

Pluripotent stem cells possess the ability to proliferate indefinitely and to differentiate into almost any cell type. Additionally, the development of ...

deriving-retinal-pigment-epithelium-rpe-from-induced-pluripotent-stem

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Deriving Retinal Pigment Epithelium (RPE) from Induced Pluripotent Stem (iPS) Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

10.5K 조회수.  U.S. Army Institute of Surgical Research.  이 보고서의 목적은 배아 체의 다른 크기를 이용하여 유도 된 다 능성 줄기 (IPS) 세포로부터 망막 색소 상피 (RPE)를 도출하는 프로토콜을 기술한다. 

비디오: Deriving Retinal Pigment Epithelium RPE from Induced Pluripotent Stem iPS Cells by Different Sizes of Embryoid Bodies

Efficient Derivation of Retinal Pigment Epithelium Cells from Stem Cells

No cure has been discovered for age-related macular degeneration (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex multifactorial disease with an unknown etiology, although it is largely thought to occur due to death or dysfunction of the retinal pigment epithelium (RPE), a monolayer of cells that underlies the retina and provides critical support for photoreceptors. RPE cell replacement strategies may hold great promise for providing therapeutic relief for a large subset of AMD patients, and RPE cells that strongly resemble primary human cells (hRPE) have been generated in multiple independent labs, including our own. In addition, the uses for iPS-RPE are not limited to cell-based therapies, but also have been used to model RPE diseases. These types of studies may not only elucidate the molecular bases of the diseases, but also serve as invaluable tools for developing and testing novel drugs. We present here an optimized protocol for directed differentiation of RPE from stem cells. Adding nicotinamide and either Activin A or IDE-1, a small molecule that mimics its effects, at specific time points, greatly enhances the yield of RPE cells. Using this technique we can derive large numbers of low passage RPE in as early as three months.

Stem cell-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells may be used for multiple applications including cell-based therapies for retinal degeneration, disease modeling, and drug studies. Here we present a simple protocol for reproducibly deriving RPE from stem cells.

줄기 세포에서 망막 색소 상피 세포의 효율적인 유도

No cure has been discovered for age-related macular degeneration  (AMD), the leading cause of vision loss in people over the age of 55. AMD is complex ...

연구

발생학

Analysis of Retinoic Acid-induced Neural Differentiation of Mouse Embryonic Stem Cells in Two and Three-dimensional Embryoid Bodies

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for studying early embryonic development. In the absence of leukemia inhibitory factor (LIF), ESCs differentiate by default into neural precursor cells. They can be amassed into a three dimensional (3D) spherical aggregate termed embryoid body (EB) due to its similarity to the early stage embryo. EBs can be seeded on fibronectin-coated coverslips, where they expand by growing two dimensional (2D) extensions, or implanted in 3D collagen matrices where they continue growing as spheroids, and differentiate into the three germ layers: endodermal, mesodermal, and ectodermal. The 3D collagen culture mimics the in vivo environment more closely than the 2D EBs. The 2D EB culture facilitates analysis by immunofluorescence and immunoblotting to track differentiation. We have developed a two-step neural differentiation protocol. In the first step, EBs are generated by the hanging-drop technique, and, simultaneously, are induced to differentiate by exposure to retinoic acid (RA). In the second step, neural differentiation proceeds in a 2D or 3D format in the absence of RA.

We describe a technique for using murine embryonic stem cells for generating two or three dimensional embryoid bodies. We then explain how to induce neural differentiation of the embryoid body cells by retinoic acid, and how to analyze their state of differentiation by progenitor cell marker immunofluorescence and immunoblotting.

두와 입체 배아 체에서 마우스 배아 줄기 세포의 레티노 산에 의한 신경 분화 분석

Mouse embryonic stem cells (ESCs) isolated from the inner mass of the blastocyst (typically at day E3.5), can be used as in vitro model system for ...

Differentiating Chondrocytes from Peripheral Blood-derived Human Induced Pluripotent Stem Cells

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an integration-free method. Following embryoid body (EB) formation and fibroblastic cell expansion, the iPSCs are induced for chondrogenic differentiation for 21 days under serum-free and xeno-free conditions. After chondrocyte induction, the phenotypes of the cells are evaluated by morphological, immunohistochemical, and biochemical analyses, as well as by the quantitative real-time PCR examination of chondrogenic differentiation markers. The chondrogenic pellets show positive alcian blue and toluidine blue staining. The immunohistochemistry of collagen II and X staining is also positive. The sulfated glycosaminoglycan (sGAG) content and the chondrogenic differentiation markers COLLAGEN 2 (COL2), COLLAGEN 10 (COL10), SOX9, and AGGRECAN are significantly upregulated in chondrogenic pellets compared to hiPSCs and fibroblastic cells. These results suggest that PBCs can be used as seed cells to generate iPSCs for cartilage repair, which is patient-specific and cost-effective.

We present a protocol to generate a chondrogenic lineage from human peripheral blood (PB) via induced pluripotent stem cells (iPSCs) using an integration-free method, which includes embryoid body (EB) formation, fibroblastic cells expansion, and chondrogenic induction.

말초 혈액 유래 인간 유래 다 능성 줄기 세포에서 연골 세포 분화

In this study, we used peripheral blood cells (PBCs) as seed cells to produce chondrocytes via induced pluripotent stem cells (iPSCs) in an ...

Chondrogenic Pellet Formation from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. Currently, efforts are being made to regenerate damaged cartilage with ex vivo expanded chondrocytes or bone marrow-derived mesenchymal stem cells (BMSCs). However, the restricted viability and instability of these cells limit their application in cartilage reconstruction. Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) have received scientific attention as a new alternative for regenerative applications. With unlimited self-renewal ability and multipotency, hiPSCs have been highlighted as a new replacement cell source for cartilage repair. However, obtaining a high quantity of high-quality chondrogenic pellets is a major challenge to their clinical application. In this study, we used embryoid body (EB)-derived outgrowth cells for chondrogenic differentiation. Successful chondrogenesis was confirmed by PCR and staining with alcian blue, toluidine blue, and antibodies against collagen types I and II (COL1A1 and COL2A1, respectively). We provide a detailed method for the differentiation of cord blood mononuclear cell-derived iPSCs (CBMC-hiPSCs) into chondrogenic pellets.

Here, we propose a protocol for chondrogenic differentiation from cord blood mononuclear cell-derived human induced pluripotent stem cells.

제대혈 유래 다 능성 줄기 세포로부터 연골 형성 펠렛 형성

Human articular cartilage lacks the ability to repair itself. Cartilage degeneration is thus treated not by curative but by conservative treatments. ...

Rapid, Directed Differentiation of Retinal Pigment Epithelial Cells from Human Embryonic or Induced Pluripotent Stem Cells

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing a detailed and thorough protocol is to clearly demonstrate each step and to make this readily available to researchers in the field. This protocol results in a homogenous layer of RPE with minimal or no manual dissection needed. The method presented here has been shown to be effective for induced pluripotent stem cells (iPSC) and human embryonic stem cells. Additionally, we describe methods for cryopreservation of intermediate cell banks that allow long-term storage. RPE generated using this protocol might be useful for iPSC disease-in-a-dish modeling or clinical application.

This protocol describes how to produce retinal pigment epithelial cells (RPE) from pluripotent stem cells. The method uses a combination of growth factors and small molecules to direct the differentiation of stem cells into immature RPE in fourteen days and mature, functional RPE after three months.

인간의 배아 또는 유도 만능 줄기 세포에서 망막 안료 상피 세포의 급속 한, 감독 차별화

We describe a robust method to direct the differentiation of pluripotent stem cells into retinal pigment epithelial cells (RPE). The purpose of providing ...

Engineering Transplantation-suitable Retinal Pigment Epithelium Tissue Derived from Human Embryonic Stem Cells

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms of retinitis pigmentosa (RP) and age-related macular degeneration (AMD). Cell therapy is one of the most promising therapeutic strategies proposed to cure these diseases, with already encouraging preliminary results in humans. However, the method of preparation of the graft has a significant impact on its functional outcomes in vivo. Indeed, RPE cells grafted as a cell suspension are less functional than the same cells transplanted as a retinal tissue. Herein, we describe a simple and reproducible method to engineer RPE tissue and its preparation for an in vivo implantation. RPE cells derived from human pluripotent stem cells are seeded on a biological support, the human amniotic membrane (hAM). Compared to artificial scaffolds, this support has the advantage of having a basement membrane that is close to the Bruch&#39;s membrane where endogenous RPE cells are attached. However, its manipulation is not easy, and we developed several strategies for its proper culturing and preparation for grafting in vivo.

We describe a method to engineer a retinal tissue composed of retinal pigment epithelial cells derived from human pluripotent stem cells cultured on top of human amniotic membranes and its preparation for grafting in animal models.

인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 이식 적합 한 망막 색소 상피 조직 공학

Several pathological conditions of the eye affect the functionality and/or the survival of the retinal pigment epithelium (RPE). These include some forms ...

Generation of Human Primordial Germ Cell-like Cells at the Surface of Embryoid Bodies from Primed-pluripotency Induced Pluripotent Stem Cells

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent epiblast cells by orchestrated exposures to cytokines, including bone morphogenetic protein 4 (Bmp4). In human embryos, the earliest PGCs have been identified on the endodermal wall of yolk sac around the end of the 3rd week of gestation, but little is known about the process of human PGC specification and their early development. To circumvent the technical and ethical barriers of studying human embryonic PGCs, surrogate cell culture models have been recently generated from pluripotent stem cells. Here, we describe a 13-day protocol for robust production of human PGC-Like Cells (hPGCLCs). Human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) maintained in the primed pluripotency state are incubated in the 4i na&#239;ve reprogramming medium for 48 hours, dissociated to single cells, and packed into microwells. Prolonged maintenance of hiPSCs in the na&#239;ve pluripotency state causes significant chromosomal aberrations and should be avoided. hiPSCs in the microwells are maintained for an additional 24 hours in the 4i medium to form embryoid bodies (EBs), which are then cultured in low-adherence plasticware under a rocking condition in the hPGCLC induction medium containing a high concentration of recombinant human BMP4. EBs are further cultured for up to 8 days in the rocking, non-adherent condition to obtain maximum yields of hPGCLCs. By immunohistochemistry, hPGCLCs are readily detected as cells strongly expressing OCT4 in almost all EBs exclusively on their surface. When EBs are enzymatically dissociated and subjected to FACS enrichment, hPGCLCs can be collected as CD38+ cells with up to 40-45% yield.

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of both sperm and eggs. Human embryonic PGCs are specified from pluripotent epiblast cells through interactions of cytokines. Here, we describe a 13-day protocol of inducing human cells transcriptomally resembling PGCs at the surface of embryoid bodies from primed-pluripotency induced pluripotent stem cells.

액 pluripotency에서 Embryoid 몸의 표면에 인간의 원시 생식 세포와 같은 세포의 생성 유도 만능 줄기 세포

Primordial germ cells (PGCs) are common precursors of all germline cells. In mouse embryos, a founding population of ~40 PGCs are induced from pluripotent ...

Generation of 3D Skin Organoid from Cord Blood-derived Induced Pluripotent Stem Cells

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily functions. Biomimetics is the imitation of the models, systems, and elements of nature for the purpose of solving complex human problems1. Skin biomimetics is a useful tool for in vitro disease research and in vivo regenerative medicine. Human induced pluripotent stem cells (iPSCs) have the characteristic of unlimited proliferation and the ability of differentiation to three germ layers. Human iPSCs are generated from various primary cells, such as blood cells, keratinocytes, fibroblasts, and more. Among them, cord blood mononuclear cells (CBMCs) have emerged as an alternative cell source from the perspective of allogeneic regenerative medicine. CBMCs are useful in regenerative medicine because human leukocyte antigen (HLA) typing is essential to the cell banking system. We provide a method for the differentiation of CBMC-iPSCs into keratinocytes and fibroblasts and for generation of a 3D skin organoid. CBMC-iPSC-derived keratinocytes and fibroblasts have characteristics similar to a primary cell line. The 3D skin organoids are generated by overlaying an epidermal layer onto a dermal layer. By transplanting this 3D skin organoid, a humanized mice model is generated. This study shows that a 3D human iPSC-derived skin organoid may be a novel, alternative tool for dermatologic research in vitro and in vivo.

We propose a protocol that shows how to differentiate induced pluripotent stem cell-derived keratinocytes and fibroblasts and generate a 3D skin organoid, using these keratinocytes and fibroblasts. This protocol contains an additional step of generating a humanized mice model. The technique presented here will improve dermatologic research.

코드 혈액 파생에서 3D 피부 Organoid의 생성 유도 만능 줄기 세포

The skin is the body&#8217;s largest organ and has many functions. The skin acts as a physical barrier and protector of the body and regulates bodily ...

In Vitro Generation of Somite Derivatives from Human Induced Pluripotent Stem Cells

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give rise to multiple cell types, including the myotome (MYO), sclerotome (SCL), dermatome (D), and syndetome (SYN), which in turn develop into skeletal muscle, axial skeleton, dorsal dermis, and axial tendon/ligament, respectively. Therefore, the generation of SMs and their derivatives from human induced pluripotent stem cells (iPSCs) is critical to obtain pluripotent stem cells (PSCs) for application in regenerative medicine and for disease research in the field of orthopedic surgery. Although the induction protocols for MYO and SCL from PSCs have been previously reported by several researchers, no study has yet demonstrated the induction of SYN and D from iPSCs. Therefore, efficient induction of fully competent SMs remains a major challenge. Here, we recapitulate human SM patterning with human iPSCs in vitro by mimicking the signaling environment during chick/mouse SM development, and report on methods of systematic induction of SM derivatives (MYO, SCL, D, and SYN) from human iPSCs under chemically defined conditions through the presomitic mesoderm (PSM) and SM states. Knowledge regarding chick/mouse&#160;SM development was successfully applied to the induction of SMs with human iPSCs. This method could be a novel tool for studying human somitogenesis and patterning without the use of embryos and for cell-based therapy and disease modeling.

We present here a protocol for the differentiation of human induced pluripotent stem cells into each somite derivative (myotome, sclerotome, dermatome, and syndetome) in chemically defined conditions, which has applications in future disease modeling and cell-based therapies in orthopedic surgery.

인간 유도에서 Somite 파생 상품의 체 외 발생에서 만능 줄기 세포

In response to signals such as WNTs, bone morphogenetic proteins (BMPs), and sonic hedgehog (SHH) secreted from surrounding tissues, somites (SMs) give ...

Hemogenic Endothelium Differentiation from Human Pluripotent Stem Cells in A Feeder- and Xeno-free Defined Condition

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous transplants to treat hematological and malignant disorders. Hemogenic endothelium (HE) is an amenable platform to produce functional HSPCs by transcription factors or to induce lymphocytes in a robust manner. However, current methods to derive HE are either costly or variable in yield. In this protocol, we established a cost-effective and precise method to derive HE within 4 days in a feeder- and xeno-free defined condition. The resultant HE underwent an endothelial-to-hematopoietic transition and produced CD34+CD45+ clonogenic hematopoietic progenitors. The potential capacity of our platform for generating functional HSPCs will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

Here, we present a protocol to precisely form hemogenic endothelium from human pluripotent stem cells in a feeder- and xeno-free condition. This method will have broad applications in disease modeling and screening for therapeutic compounds.

피더 및 제노 프리 정의 상태에서 인간 다능성 줄기 세포에서 혈생 내피 분화

Deriving functional hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) from human pluripotent stem cells (PSCs) have been an elusive goal for autologous ...