이 작품은 건강의 국가 학회 (1R21NS094061-01A1) (NIH 1R01EB012874-01)에서 교부 금에 의해 지원 되었다 (S10RR031637), 그리고 국립 과학 재단 (협력 계약 번호 DMR-1157490) UF와 플로리다의 상태에 국가 높은 자기장 실험실 (NHMFL) 고급 자기 공명 분광학 (AMRIS) 시설을 통해.

설명 하는 모든 동물 실험 과학의 국가 아카데미에 명시 된 지침에 따라 &#39; 관리 및 실험 동물의 사용에 대 한 가이드 및 검토 하 고 프로 리 다의 대학에 의해 승인 했다 &#39; s 제도 동물 보호와 사용 위원회 (IACUC) 모든 적용 가능한 규칙 및 규정을 준수 하는 동물 주제 연구에 종사 하는 때.
 1. 유지 보수의 중앙 신경 조직에 대 한 Perfusate의 준비 <ol><li>신선한 인공 척수 (실제) 확인.
	<li>생성 중 탄산염 버퍼 실제 perfusate의 2 리터, 물 4 L 플라스 크에 의해 두 배 증 류 법 또는 역삼 투 정화의 1500 mL 측정 <ol>. 플라스 크에 자석 저 어 바 하 고 저 어 접시를 사용 하 여 액체를 선동.</li>
		<li>순화 된 물으로 분해 다음 양의 소금: 염화 나트륨 14.03 g (120 m m), 4.37 g (26mm) 나트륨 중 탄산염, 0.41 g (1.5 m m) 이수소 칼륨 인산 염, 0.69 g (1.4 m m) 황산 마그네슘 heptahydrate, 0.59 g (2mm) 칼슘 이 염화 수화물, 0.45 g (3mm) 칼륨 염화 물, 그리고 3.6 g (10 mM) 포도 당. 
		참고:는 perfusate의 화학 내용을 조직과 실험의 원하는 조건 특정 신진 대사 요구 사항에 따라 달라 집니다.</li>
		<li>모든 염 해산 할 때까지이 솔루션을 철저 하 게 혼합. 2 l 추가 순화 된 물을 사용 하 여 볼륨을 조정 합니다.</li>
		<li>실제 어는 점 우울증 osmometer를 사용 하 여의 osmolality를 테스트 합니다. 300 조정 mOsm/kg sorbitol을 사용 하 여. 299 mOsm/kg 실제 perfusate의 2 l 324 mg sorbitol의 추가 300 mOsm/kg (324 밀리 그램 당 약 1 mOsm) osmolality 늘어난다. 
		참고:는 실제 24 h. 초과 하지 기간에 대 한 밀폐, 밀봉 된 병에 4 ° C에서 저장 될 수 있다</li>
	</ol></li></ol> 2. 설정를 관류 시스템 <ol><li>준비 실제 perfusate.
	<ol><li>평형 온도 (~ 23 ° C) 이상 1 헤에 대 한 직접 버블링을 통해 95 %carbogen (95% O 2, 5% CO 2, 1/16 L/min)와 가스 동안에 실제 
		참고: 다른 조직 유형 또는 원하는 실험 조건 perfusate 온도 또는 가스 내용을 조정을 해야 합니다. 녹은 가스 콘텐츠는 perfusate에 대 한 원하는 조건을 정확 하 게 공급 가스 ( 그림 1)의 개별 구성 요소의 백분율 농도 변화 하 여 제어할 수 있습니다.</li>
		<li>는 실제에 필요한 온도 및 carbogen 채도, 도달 pH 생리 범위 (7.3-7.4)에 제공 하는지 확인 합니다. 계속 거품 가스 perfusate 저수지 (1/16 L/min)에 직접 실험의 과정을 통해 적절 한 녹은 산소 함유량과 pH 조건 건강 한 조직 대사에 도움이 유지.</li>
	</ol></li> <li>관류 라인 프라임.
	<ol><li>입구 튜브 준비 실제 (300 mOsm, pH 7.3-7.4, 지속적으로 기름)에 연동 마이크로 펌프에 연결 하는 Submerge.</li>
		<li>패스는 oxygenator 장치 ( 그림 2)와 둘 다를 통해 관류 라인 자석 구멍 그리고 그라데이션 코일 스택 (위에서 아래로) 프로브 어셈블리까지 옆으로 코일을 설정. 어떤 실제 폐수를 잡으려고 비 커 위에 oxygenator 꽉. 
		참고: MRI 시스템 디자인 따라 관류 라인 실제 시스템과 못쓰게 이전 기본 자석 구멍 및 그라데이션 코일 또는 프로브 본체 통해 전달 되도록 할 수 있습니다. 그 관류 라인 배치 프로브 본체 또는 못쓰게 절차를 시작 하기 전에 구멍에 프로브 삽입의 어셈블리 간섭 하지 것입니다 확인.</li>
		<li>의도 유량 (2 mL/min) 선택 확인 하 고 펌프에 의해 관류 라인을 작성 시작.</li>
		<li>실제 공기 안에 포함 된 치환 됩니다 있도록 빈, 인라인 거품 트랩 반전.</li>
		<li>는 oxygenator 연결 &#39; s 포트 carbogen (는 매니폴드 또는 보조 carbogen 실린더)의 두 번째 소스에 가스와 1/16 L/분의 유량을 설정</li>
		<li>그 carbogen는 oxygenator 통해 흐르는 확인 &#39; s 가스 교환 막 물으로는 oxygenator 위에 배기 포트를 담거 서.</li>
		<li>실제 관류 상공에서 떨어지는 감지 되 면 일단 모든 보이는 가스 거품에서에서 깨끗이 유입 라인 수동 동요에 의해.</li>
		<li>는 oxygenator 산소 전극 관류 상공에서 흐르는 실제에서 잠수 하 여 제대로 작동 확인. 
		참고: 산소 미터에 읽기 제공 된 가스 내에 포함 된 산소의 비율이 비슷해야.</li>
	</ol></li></ol> 3. 조직 준비 <ol><li>안락사 <ol><li>장소 4 분 대 1 L/min의 속도로 가스 마 취 기계와 산소 캐리어에 4 %isoflurane 폭로의 유도 챔버로 쥐 (125-150 g)</li>
		<li>마 취 약 실에서 의식이 쥐 제거.</li>
		<li>부정사 위치에 쥐를 두어서 righting 반사 테스트를 수행 합니다. 모든 움직임에 대 한 확인 &#8212; 머리도, 다리 운동, 척추 중 유연, 등 &#8212; 동물의 뱃속에도 지표.</li>
		<li>면봉을 사용 하 여 동물의 오픈 눈으로 눈 깜박임 반사 테스트를 수행 합니다. 어떤 응답에 대 한 확인 &#8212; 폐쇄, 근육 경련, 등 뚜껑 &#8212;이 감각 입력에.</li>
		<li>마지막으로, 수행을 쥐의 발가락 사이 피부를 곤란 하 게 하 여 반사 테스트 사지 철회할 &#39; s hemostats 또는 핀셋을 사용 하 여 다시 다리를 뻗은. 다리의 굴곡에 대 한 확인 
		참고: 경우 긍정적인 재귀 테스트 결과, 안락사를 진행 하지 마십시오.</li>
		<li>3 반사 테스트 중 하나라도 응답을 elicits, 그 쥐를 마 취 약 실에 즉시 반환 하 고 4 %isoflurane 노출의 추가 2 분 동안 허용.</li>
		<li>전체에서에 모든 3 개의 반사 테스트를 수행합니다. 필요에 따라 2 분 마 취 노출을 반복 하 고 모든 3 재귀 테스트 응답의 완전 한 부족은 관찰 한 번만 진행.</li>
		<li>단두대 잘린 통해 쥐를 안락사.</li>
	</ol></li> <li>뇌 절제술 <ol><li>심한 해 부에 의해 쥐 뇌를 제거. 경향이 위치에 머리와 함께 시작 합니다. 가 위를 사용 하 여 rostrally 코에는 목의 뒤쪽에서 피부를 통해 잘라내어 두개골 노출.</li>
		<li>무딘 프로브 두개골의 표면에서 부드러운 조직 제거.</li>
		<li>꼬리 끝에서 작업 제거 후 두, 정수 리, 정면 뼈 rongeurs를 사용 하 여 두개골의.</li>
		<li>마이크로 위는 fissure 따라 절단 하 고 두 반구에서 레이어를 다시 박 리 하 여 경질을 철회.</li>
		<li>부정사 위치로 머리를 선회 하 고 복 부 측에 두개골 신경을 severing 하 여 두개골에서 뇌를 제거.</li>
	</ol></li> <li>슬라이스 격리 <ol><li>경향이 위치에 두뇌를 반환 하 고 모든 조직을 가로 균열에 꼬리는 fimbria rostral 제거 하 여 해 마를 포함 하는 중앙 부분을 분리. 직선형 면도기와 가로 평면 (즉 코로나 조각) 두 컷 확인.</li>
		<li>두뇌 부착 &#39; cyanoacrylate 접착제를 사용 하 여 vibratome 절단 목욕의 센터에 s 꼬리 대부분 비행기.</li>
		<li>Carbogen 부풀어 실제 vibratome 절단 목욕 하 고 내부 나일론 보존 하드웨어, 얼음 처럼 차가운 추가.</li>
		<li>반구 (총 6-8) 당 3 ~ 4 사용 가능한 슬라이스 준비를 잘라 300 μ m 두꺼운 조각.</li>
		<li>해 마 나 대뇌 피 질의 섹션 1 개 반구에서 분리 하 고는 microcoil 안에 맞도록 조각 트림 &#39; s 5 m m 직경 조직을 잘.</li>
	</ol></li></ol> 4. 위치 및 관류 시스템 어셈블리 <ol><li><ol><li>채우기 mi 준비 코일crocoil &#39;는 vibratome에서 산소 실제와 s 조직 챔버 &#39; 전송 피 펫을 사용 하 여 s 절단 목욕.</li>
		<li>트림된 뇌 샘플 고 관심 영역을 위치 (예:. 피라미드 셀 레이어) 해 범위를 사용 하 여 microcoil 이상의.</li>
		<li>삽입 조직 고정 장치 (나일론의 메쉬 나일론 세탁기에 부착 된 그물) 이미징 실험을 통해 샘플 위치를 유지 하. 
		참고: 샘플 위치 강렬한 빛에 노출을 최소화 하는 절차를 신속 하 게 진행 합니다. 전송 피 펫을 사용 하 여 필요에 따라 추가 산소 실제 제공.</li>
	</ol></li> <li>조립 구멍에 oxygenator, microcoil 및 프로브 <ol><li>수정된 microcoil 어셈블리 ( 그림 3) 테이블 클램프에 고정 하 고 삽입 하 여 구멍에 oxygenator 장치를 부착 합니다 코일 위에 구멍에 아 세 탈 지원 못.</li>
		<li>관류 챔버는 microcoil에 배치 하 여 인감 관류 시스템 &#39; s 조직 잘하고 cinching 소형 케이블 타이 사용 하 여 함께 2.</li>
		<li>트림 와이어 절단기를 사용 하 여 케이블 타이에서 초과 길이. 
		참고: 성공적인 씰링 시 perfusate 관찰 해야 유출 선을 통해 서 종료 하 고 누설 관류 챔버의 실리콘 물개 주위 분명 해야한다. 프로브 조립 전에 이러한 조건을 확인 하는 실패는 하드웨어 이미징에 심각한 손상 될 수 있습니다.</li>
		<li>실제 폐기물 저수지로 떨어지는 볼 수 있습니다, microcoil 그리고 oxygenator 및 이미징 프로브 본체의 상단에 연결할 어셈블리.</li>
		<li>는 어셈블리에 대해 그라데이션 스택을 조사 위에 그라데이션 좌석. 사진 상대적 배치 및 코일의 적절 한 연결, oxygenator 및 프로브 하드웨어 구성 요소 ( 그림 4) 제공 됩니다.</li>
	</ol></li></ol> 5. 미스터 이미지 컬렉션 수행 <ol><li>자석으로 조립된 프로브 구멍 삽입 <ol><li>장소는 분석기에 가까운 근접에서 프로브 본체 아래쪽 자석의 오프닝 보어.</li>
		<li>자석의 상단에 열 구멍을 통해 관류 라인의 초과 길이 철회.</li>
		<li>프로브 본체 진출 자석 구멍의 상단에서 관류 라인에서 더 많은 여유를 동시에 제거 하는 동안 기지에 구멍 모두 사용할 수 있는 여유의 관류 라인에서 채택 되는, 일단.</li>
		<li>심 스택의 해당 슬롯에 탐사선의 기지에서 2 개의 고정 나사를 스레드.</li>
		<li>계속 하기 전에 확인을 관류 라인 또는 슬쩍 했다 폐기물 저수지로 실제 유출 확인 하 여 프로브 삽입 눌릴. 
		참고: 실패 perfusate 유출 관류 라인과 위험 치명적인 손상 미스터 하드웨어 이미징 영구 손상 될 수 있습니다 확인.</li>
		<li>아무 perfusate 폐기물 저수지에 반환 라인 종료 볼 경우 프로브 본체를 제거 하 고 perfusate 흐름 reinsertion을 시도 하기 전에 갔는 확인 합니다. 조립된 관류 및 이미징 시스템 분석기의 도식 레이아웃 되었습니다 설명한 8.</li>
	</ol></li> <li>프로브 바디 연결 <ol><li>그라데이션 냉각기에서 유입 및 유출 수 라인을 연결.</li>
		<li>그라데이션 냉각기에 대 한 펌프를 켜고 물 온도 설정 (19 ° C)를 확인 하십시오.</li>
		<li>호스 클램프를 사용 하 여 프로브 본체를 공기 냉각기 장치에서 공기 호스를 연결.</li>
		<li>흐름 손잡이 공기 냉각기 단위 설정에서 &#34; 1 &#34; 위치.</li>
		<li>프로브 본체를 열전대 와이어 연결.</li>
		<li>무선 주파수 (RF) 프로브 본체에 입력/출력은 프리 앰프에서 동축 케이블 연결 &#39; s 양성자 (H) 채널.</li>
		<li>프로브 본체를 그라데이션 앰프에서 전원 케이블을 연결.</li>
		<li>내부에 RF 캐비닛, B0 보상 단위, 모든 3 개의 그라데이션 앰프 (x, y, z)을 마스터 장치 전원을 켭니다</li>
	</ol></li> <li>준비는 분석기 <ol><li>콘솔에서 가변 온도 조정 모듈을 사용 하 여 원하는 구멍 온도 설정.</li>
		<li>(임피던스) 일치 하 고 프로브 내 가변 커패시터를 조정 하 여 (주파수)는 RF 회로 조정. 이 프로브 본체의 기지에서 지팡이 조작 하 여 수행 됩니다.</li>
		<li>는 분석기에 대 한 현재 설정을 조정 &#39; 샘플에 자기장 동질성을 최대화 하기 위해 s 심 코일.</li>
	</ol></li> <li>시작 이미지 컬렉션 <ol><li>파일럿 이미지 자석 내 샘플의 공간 위치 보어 결정를 수집. 2에 대 한 일반 매개 변수 차원 그라데이션 에코는 다음과 같습니다 (TR/테 100/4 ms, 평균 = = 1, 펄스 각도 = 30 o, 시간 6 초, 매트릭스 = = 64 x 64, 보기의 필드 = 0.3 x 0.3 c m, 해상도 = 47 x 47 μ m).</li>
		<li>해당 하는 경우 적절 한 스캔 형상과 조직 위치를 확인 하기 위해 확산 중 조종사를 수집 합니다. 2에 대 한 일반 매개 변수 차원 확산 중 파일럿 검사는 다음과 같습니다 (TR/테 = 2000/11.6 ms, 시간 = 4.3 분, Δ 6 ms, δ = 1 = ms, 평균 = 1, b 1200 (1860 효과적인) = s/m m 2, 매트릭스 = 64 x 64, 보기의 필드 = 0.2 x 0.2 m 해상도 = 31 μ m).</li>
		<li>급성 슬라이스 준비의 안정성 특성을 결정 하 보급 가중치 시계열을 수집 합니다. 2 차원 확산 중된 이미지에 대 한 일반 매개 변수는 다음과 같습니다 (TR/테 = 2000/11.6 ms, 시간 1.5 h, Δ = 6 ms, δ = 1 = ms, 평균 = 42, b = 1200 s/m m 2, 매트릭스 = 64 x 64, 보기의 필드 = 0.2 x 0.2 m, 해상도 = 31 μ m). 참고: 시스템에 안정성을 특성화 달라질 미스터 대비 고용 (T1, T2, 확산, 민감성)와 같은 요인에 따라 설명된 프로토콜에서 물리 섭 동, 고 단위 시간 당 MR 신호 변화 유래 했다 섭 동.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
	<li>Aguayo, J. B., Blackband, S. J., Schoeniger, J., Mattingly, M. A., Hintermann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nuclear+magnetic+resonance+imaging+of+a+single+cell.">Nuclear magnetic resonance imaging of a single cell.</a> Nature. 322, 190-191 (1986).</li><li>Schoeniger, J. S., Aiken, N., Hsu, E., Blackband, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relaxation-time+and+diffusion+NMR+microscopy+of+single+neurons.">Relaxation-time and diffusion NMR microscopy of single neurons.</a> J. Magn. Reson. B. 103, 261-273 (1994).</li><li>Flint, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+microscopy+of+mammalian+neurons.">Magnetic resonance microscopy of mammalian neurons.</a> Neuroimage. 46, 1037-1040 (2009).</li><li>Flint, J. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Magnetic+resonance+microscopy+of+human+and+porcine+neurons+and+cellular+processes.">Magnetic resonance microscopy of human and porcine neurons and cellular processes.</a> Neuroimage. 60, 1404-1411 (2012).</li><li>Kamman, R. L., Go, K. G., Stomp, G. P., Hulstaert, C. E., Berendsen, H. J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+of+Relaxation+times+T1+and+T2+in+rat+tissues+after+biopsy+and+fixation.">Changes of Relaxation times T1 and T2 in rat tissues after biopsy and fixation.</a> Magn. Reson. Imag. 3, 245-250 (1985).</li><li>Shepherd, T. M., Thelwall, P. E., Stanisz, G. J., Blackband, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+fixative+solutions+alter+the+water+relaxation+and+diffusion+properties+of+nervous+tissue.">Aldehyde fixative solutions alter the water relaxation and diffusion properties of nervous tissue.</a> Magn. Reson. Med. 62, 26-34 (2009).</li><li>Massin, C., Boero, G., Vincent, F., Abenhaim, J., Besse, P. -. A., Popovic, R. 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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+diffusion+MRI+measurements+from+multiple+perfused+rat+hippocampal+slices.">Simultaneous diffusion MRI measurements from multiple perfused rat hippocampal slices.</a> Magn. Reson. Med. 48, 565-569 (2002).</li><li>Henry, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Experiments+on+the+quantity+of+gases+absorbed+by+water,+at+different+temperatures,+and+under+different+pressures.">Experiments on the quantity of gases absorbed by water, at different temperatures, and under different pressures.</a> Phil. Trans. R. Soc. Lond. 93, (1803).</li><li>Bui, J. D., Buckley, D. L., Phillips, M. I., Blackband, S. J., Bl&#252;mler, P., Bl&#252;mich, B., Botto, R., Fukushima, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+perfused+brain+slices+with+MR+microscopy.">Studies of perfused brain slices with MR microscopy.</a> Spatially Resolved Magnetic Resonance. , 337-343 (1998).</li><li>Moseley, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+detection+of+regional+cerebral+ischemia+in+cats:+Comparison+of+diffusion-+and+T2-weighted+MRI+and+spectroscopy.">Early detection of regional cerebral ischemia in cats: Comparison of diffusion- and T2-weighted MRI and spectroscopy.</a> Magn. Reson. Med. 14 (2), 330-346 (1990).</li><li>Moseley, M. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diffusion-weighted+MR+imaging+of+acute+stroke:+Correlation+with+T2-weighted+and+magnetic+susceptibility-enhanced+MR+imaging+in+cats.">Diffusion-weighted MR imaging of acute stroke: Correlation with T2-weighted and magnetic susceptibility-enhanced MR imaging in cats.</a> Am. J. Neuroradiol. 11, 423-429 (1990).</li></ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

현재 프로토콜 자기 공명 현미경 검사를 받고 급성 뇌 슬라이스 준비의 표준 대사 유지 관리에 필요한 절차를 설명 합니다. 이 절차는 유일한 방법은 현재 사용할 수 있는 해상도에서 씨와 생활 포유류 직물의 시각화를 셀을 해결 할 수 있도록 합니다. Perfusate 조건 설명 맞게 조정 됩니다 구체적으로 중앙 신경 조직, 프로토콜 널리 어떠한 방식으로 생활의 적응력은 perfusate와 가스 성분의 관류 흐름 율 조정을 통해 조직 준비 그리고 온도입니다.
가장 일반적인 문제를 설명한 절차 중 발생할 수 가능성이 실패 대사 산물 공급에 관련 된 포함 됩니다. 칼슘 염의 강 수는 실제 내부 시스템 버퍼링 중 탄산염에서 실패의 결과로 가스 부족 하는 동안 발생할 수 있습니다. 이러한 침전 관류 라인을 방해할 하 고 심각한 하드웨어 손상 될 수 있습니다. 소금 침전 물 조사 어셈블리를 다음과 같은 perfusate에서 관찰 된다, 중단 관류 흐름 즉시 연동 펌프를 해제 하 여. 공급 가스 및 저수지와 oxygenator carbogen 가스 흐름 (1/16 L/min)에서 perfusate, CO2 수준 (5.0%)에 충분 한 나트륨 중 탄산염 수준 (4.37 g/2 L)의 존재를 확인 합니다. 마지막으로, 확인 전화 수준의 생리 범위 (7.3-7.4)에 안정 됩니다. 산소 가스와 pH 레벨은 여전히 통제 되지 적절 하 게, 가스 교환 막 대체 되어야 한다.
조각 의도 실험 시간-과정을 통해 신호 안정성을 전시 하지 않습니다, 경우 올바른 화학 성분 실제 혼합물에 존재 하 고 올바른 osmolality (300 mOsm) 및 (7.3-7.4) pH 유지 됩니다 확인 합니다. Carbogen 가스 perfusate 저수지와 oxygenator 1/16 L/분에 공급 되는 확인 하십시오. 이 단계는 perfusate 조건 해결 되지 않습니다, 가스 교환 막의 교체 조언 된다. 조직 안정성은 하지 perfusate 조건 문제 해결 후 경우, 조직 수확 및 관류 응용 프로그램 사이의 시간 간격을 최소화에 중점을 두고 수술 프로토콜의 세련미를 고려 하십시오.

자기 공명 영상 (MRI) 시스템 꾸준히 진행 하 고 있으므로 적 높은 분야 강점, 구성 및 조직 생활의 상태에 대 한 자세한 내용은 뚜렷한 되고있다. 이러한 하드웨어 발전에도 불구 하 고 직물의 세포질 구조를 시각화 하는 충분 한 해상도에서 이미징 미스터 병원에서 아직 사용할 수 없습니다입니다. 그 결과, 임상 검사의 내용을 고려할 때 조직의 세포 수준 특성을 유추 해야 합니다. 이러한 유추는 직접 관찰 될 수 있는 모델 시스템에서 가져온 데이터에서 얻은 동등한 프로세스의 지식이 필요 합니다. 전통적으로,이 모델 Xenopus laevis oocyte Aplysia californica L7 신경1,2등 수생 생물에서 세포 포함. 이들은 관찰 미스터 방법 그들의 예외적인 큰 크기 때문에 사용할 수 있는 첫 번째 동물 세포 중: 약 1000 μ m 및 300 μ m 직경, 각각. 더 최근에, 하드웨어 디자인에 진보 포유류 세포의 가장 큰 예제 중 하나에 대 한 허용-α-모터 신경-고정된 조직3,4미스터 현미경 검사 법 기술을 사용 하 여 이미지 수를. 이러한 연구 시연 씨를 사용 하 여 포유류 세포 물질의 직접적인 시각화, 고정된 샘플 고용 살아있는 조직에서 그들의 미스터 속성에 크게 차이가 고 동등한 대표 모델5, 따라서 역할 수 없습니다. 6. 더 중요 한 것은, 복잡 한 생물 학적 과정을 콘서트에서 발생 하는 미스터 대비 변화 관찰 불안정 하 고 이미징 실험의 과정을 통해 측정 될 수 있는 생활 샘플을 필요 합니다.
생활 조직에 미스터 현미경 연구를 촉진 하기 위하여 프로토콜 상업 microimaging 하드웨어7 하는 목적, 미스터 호환, 구멍에서 oxygenator 관류 장치 앞에서 설명한8 인터페이스를 포함 하 여은 . 이 디자인의 독특한 장점을 포유류 조직 및 녹은 가스 콘텐츠 및 조직 관류의 사이트에서 pH 정밀 제어에 세포 수준의 해상도 기능을 포함합니다. 또한, 관류 흐름 유물을 피하기 위해 이미지 수집 동안 인터럽트는 explant 미스터 연구의 대부분과 달리이 디자인의 생리 적인 상태를 개선 하기 위해 표시 되었습니다 데이터 수집 하는 동안 지속적인 관류를 사용 하 여 지원 절연 조직9,10. 마지막으로, 모션 아티팩트는 동안 발생할 수 있는 가능성을 줄이는 닫힌된 녹음 실과 슬라이스 고정 하드웨어 원조는 이미지 컬렉션을 연장.
현재 프로토콜 급성 hippocampal 및 대뇌 피 질의 조각으로 사용 하기 위해 적절 한 절차를 설명 합니다, 하는 동안 perfusate 대사 산물 정밀 하 게 제어 다양 한 다양 한 조직 유형 및 실험 조건에 맞게이 시스템을 수 있습니다. 멀티 슬라이스 관류 챔버11; 비교 샘플 처리량에서 감소를 포함 하는이 디자인의 한계 그러나,이 제한 미래에 멀티 코일 배열을 사용 하 여 극복할 수 있습니다.
또한, 설명된 시스템 수평 또는 수직 구성에서 채택 될 수 있다, 하는 동안 현재 프로토콜 세로 방향된, 600 MHz 분석기 사용을 갖추고 있습니다. 미스터 microimaging 연구의 모든 시스템-일반적으로 좁은 구멍 (≤6 cm), 높은 분야 (≥500 m h z) 분석기-설명 oxygenator 및 살포 장비를 수용할 것입니다. 그러나, 이미징 코일, 그라데이션, 프로브 시스템 변경, 또는 다른 필수 이미징 하드웨어 고용 관류 장비와 미스터 스캔 매개 변수를 변경 해야 수 있습니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Perfusate Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Osmette A</td>
			<td>Precision Systems Inc.</td>
			<td>5002</td>
			<td>freezing point depression osmometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stir Plate Type 1000</td>
			<td>Barnstead/Thermodyne</td>
			<td>SPA1025B</td>
			<td>magnetic stir plate with heating element</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Accumet Basic pH Meter</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>AB15</td>
			<td>pH Meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pH Probe</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>13-620-AP61</td>
			<td>probe for pH measurement</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Meter</td>
			<td>Microelectrodes Inc.</td>
			<td>OM-4</td>
			<td>meter for sampling the oxygen content of gasses or the disolved oxygen content of liquid perfusates</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Electrode</td>
			<td>Microelectrodes Inc.</td>
			<td>MI-730</td>
			<td>microprobe for the oxygen meter</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scale</td>
			<td>Denver Instrument Co.</td>
			<td>A-160</td>
			<td>microscale for weighing chemical components</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slice Preparation</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lancer Vibratome</td>
			<td>Ted Pella Inc.</td>
			<td>Series 1000</td>
			<td>vibratory tissue slicer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disecting Microscope</td>
			<td>Carl Zeiss Inc.</td>
			<td>OPMI 1-FC</td>
			<td>tabletop, binocular disecting microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Perfusion System</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Masterflex L/S</td>
			<td>Cole-Parmer</td>
			<td>7523-50</td>
			<td>peristaltic micro perfusion pump</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Oxygen Regulators x 2</td>
			<td>Victor Medical</td>
			<td>VMG-05LY</td>
			<td>device for regulating gas flow</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>e-sized carbogen cylinders x 2</td>
			<td>Airgas</td>
			<td></td>
			<td>gas tanks containing carbogen gas</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>in-bore oxygenator</td>
			<td>developed in house</td>
			<td></td>
			<td>device responsible for pH and oxygen regulation in the perfusate</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Name</td>
			<td>Company</td>
			<td>Catalog Number</td>
			<td>Comments</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>MR Imaging Hardware</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro Surface Coil (200mm dia., modified)</td>
			<td>Bruker Biospin</td>
			<td>B6371/0001</td>
			<td>four-turn micro (200mm dia) surface-style radiofrequency coil</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro 5 probe body</td>
			<td>Bruker Biospin</td>
			<td>Z3395</td>
			<td>microimaging probe used in the 600 MHz spectrometer</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro 5 gradient coils</td>
			<td>Bruker Biospin</td>
			<td>M81111</td>
			<td>gradient coil stack used with micro 5 probe body</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>600 MHz Spectrometer</td>
			<td>Oxford Instruments</td>
			<td></td>
			<td>superconducting magnet (14.1T) used for MR image generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Imaging Console</td>
			<td>Bruker Biospin</td>
			<td>Avance III</td>
			<td>support and control hardware including gradient amplifiers, preamps, &#38; workstation used for MR image generation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Air Blower</td>
			<td>Bruker Biospin</td>
			<td>BCU-II, -80/60</td>
			<td>Air chiller unit used in conjunction with the probe&#39;s heating coil to regulate temperature inside the magnet bore</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gradient Chiller</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>Neslab Merlin M33</td>
			<td>Water chiller used to disipate heat generated by the gradient coils</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

metabolic support of excised, living brain tissues during magnetic resonance microscopy acquisition

이 프로토콜의 자기 공명 (MR) 현미경 데이터 수집 중 급성 뇌 슬라이스 준비의 정상적인 신진 대사 기능을 지 원하는 데 필요한 절차를 설명 합니다. 생활, 삭제 포유류 조직에 씨 컬렉션을 수행할 수 있지만, 이러한 실험 해상도 제한에 의해 제한 된 전통적으로 있다 하 고 따라서 조직 미세를 시각화 할 수 있다. 반대로, 미세한 이미지 해상도 달성 한 미스터 프로토콜 긴 검사 시간 동안 정적, 변하지 않는 조건에 대 한 필요성에 맞게 고정된 샘플의 사용을 해야 합니다. 현재 프로토콜 미세한 해상도에서 생활, 포유류 조직 샘플의 이미지를 가능 하 게 첫 번째 사용 가능한 미스터 기법을 설명 합니다. 이러한 데이터는 어떻게 병 리 기반 대비 변화 미세한 수준 영향에서 발생 병원에서 사용 하는 등 거시적인 미스터 검사의 내용 이해에 매우 중요. 일단 이러한 이해, 더 큰 감도 정확도와 진단 방법을 개발할 수 있습니다, 이전 질병 치료, 더 정확한 치료 모니터링 및 향상 된 환자 결과를 직접 번역할 수 있는 실현 된다.
설명된 방법론 뇌 조각 준비에 초점을 맞추고, 하는 동안 프로토콜은 어떤 삭제 조직 조각에 주어진 조직의 대사 요구에 맞게 가스 perfusate 준비 변경. 프로토콜의 성공적인 실행 15.5 h까지 동안 미스터 확산 신호 안정성을 전시 하는 생활, 급성 슬라이스 준비 발생 한다. 다른 미스터 호환 관류 기구에는 현재 시스템의 주요 장점은 높은 해상도 이미지와 신중 하 게와 일정, 중단 흐름을 제공 하는 능력을 달성 하는 데 필요한 미스터 현미경 하드웨어와의 호환성 규제 perfusate 조건입니다. 하나의 조직 조각을 한 번에 몇 군데 있습니다 감소 샘플 처리량이 설계 고려 사항입니다.

Perfusate 준비
구멍에 산소 장치의 성공적인 고용 시 가스 공급된 carbogen에 실제 perfusate 내에서 100% 포화 상태에 도달 한다. 이 제공 된 가스의 산소 농도 변화 챔버 내에 관류 산소 미터 (그림 1)8를 사용 하 여 실제 perfusate에서 녹은 산소 함유량에 있는 변화를 측정 하 여 설명 될 수 있다. 헨리의 법, 평형 액체 샘플에 있는 녹은 가스의 양을 그 가스의 부분 압력에 직접 비례 온도 상수12를 유지 합니다. 이 지식과 정밀 가스 표준을 사용 하 여, 설명 된 대로 실제 샘플에 포함 된 용 존된 산소의 양을 계량 가능 하다. 이것은 알려진된 구성의 가스에 노출 되는 실제의 포화 솔루션 (1 시간 이상 부풀어 직접)를 사용 하 여 산소 미터 보정에 의해 달성: carbogen (95% O2) 등 낮은 산소와 다른 높은 산소 농도와 한 가스 질소 (0% O2) 같은 농도. 그 후, 측정 샘플으로 산소 전극의 끝을 물속으로 취할 수 있습니다. 보어 oxygenator 제대로 작동 하 고 있는지 확인은 관류에서 폐수를 잘 측정 하 여 얻을 수 있습니다. 산소 측정기로 측정 된 백분율 녹은 산소 공급 가스에 전달 하는 산소의 백분율 농도 일치 해야 합니다. 측정된 된 값 공급 가스에 그 보다 낮은 경우에,이 조직 조각에 신진 대사 불충분으로 이어질 수 있는 하드웨어 실패 좋을 것.
샘플 모양 및 동작
급성 슬라이스 준비 필요한 대사 산물을 공급 하 고 곧 신진 대사 폐기물을 멀리 운반 하는 충분 한 관류를 수신 하는 상대 안정성의 상태에 도달 합니다. 그 시점에서 급성 조각 외부 섭 동을 받게 될 수 있습니다 하 고 이러한 변화에 대 한 답변은 과학적 연구에 대 한 측정 될 수 있다. 미스터 실험에 대 한 시간이 지남에 따라 관심의 신호를 추적 급성 슬라이스 준비13의 상대적인 안정성을 설명 하기 위해 일반적으로 사용 되 연습 이다. 보급이 중 신호는 변화는 조직 물 이동성, 콘텐츠 및 배포에 특히 민감한 경색 뇌경색14,15감지 하이 콘트라스트 메커니즘의 사용에 의해 평가 될 수 있다. 조직 분리를 달성 후 급성 대뇌 피 질의 조각 다양 한 관류 조건에서 유지 시간이 지남에 정규화 된 확산 신호를 플로팅 상대적으로 안정성 (2 ± 3% 이상 15.5 h) 설명 (그림 5). 관류 조건 (간헐적 또는 지속적인) 또는 MRI 스캔 길이에 확산 신호 안정성 유지 되었다 (짧은 [4 분] 또는 long [1.5 h])8. 조각 관류, 받지 못한 생활 피 질에 날카로운 확산 신호 증가 같은 시간 신호 안정성을 전시 하지 않습니다 경우이 차선 실험 조건의 암시입니다. 섭 동 실험 하지 슬라이스 준비에 안정적인 신호 조건의 확인에 앞서 시도 한다.
신호 안정성 뿐만 아니라 올바른 샘플 위치는 이미지 컬렉션의 시간에 확인 되어야 한다. 비록 샘플 위치 해 현미경에서 조직 배치 하는 동안 제어는, 샘플 위치에 교대 코일 또는 자석에 삽입 하기 전에 프로브의 취급 부주의 또는 관류 장치에의 조립 하는 동안 발생할 수 있습니다. 적절 한 hippocampal 배치의 확인 짧은 수집 하 여 달성 될 수 있다 (2 분), 조종사 확산 대비 (그림 6)를 사용 하 여 검색. 피라미드 셀 레이어 인접 hippocampal 하기 보다 확산 가중치에 더 민감한 때문에,이 구조 확산 중 이미지에서 어두운 밴드로 표시 됩니다. 이 특징을 표시 하지 않는 설정 오프 센터 샘플을 포함 하 고 반복 해야 합니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56282/56282fig1.jpg"> 
그림 1: % O2 콘텐츠 공급 가스에서의 기능으로 실제 perfusate의 산소 함유량을 녹였다. Carbogen 혼합물 산소 (95%, 60% 및 19%)의 가변 농도 포함 하는 공급 가스로 고용 된다. 백분율 녹은 산소 수치는 관류에서 잘 찍은 다음 이며 두 알려진된 컨트롤에 비해: perfusate 저수지 직접 carbogen (95% O2), 그리고 대기 조건 (23 %O2 노출 perfusate 저수지 부풀어 ). 각 경우에, O2 농도 사용 carbogen 혼합물 내에서 조직 관류 접근 100%의 사이트에 백분율 산소 포화. 오차 막대의 샘플 표준 편차 같습니다. 그림은 원래 제8에서 허가로 재현. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56282/56282fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56282/56282fig2.jpg"> 
그림 2: 드로잉에 보어 oxygenator 및 관류 챔버의 도식. 이 다이어그램의 이러한 중요 한 장치 기능에 대 한 책임 설계 요소를 보여 줍니다. 거품 트랩을 통해 펌핑 되어 신선한 perfusate 10mm NMR 튜브의 상단을 통해 oxygenator를 입력 합니다. 이렇게, 그것은 높은 가스 전환 침투성 실리콘 튜브 (블루 세그먼트) 오픈, 5mm NMR 관 주위에 코일을 중첩. Carbogen 가스 5mm 튜브의 상단을 통해 제공 오픈 하단을 통해 챔버를 입력 하 고 10 m m 튜브 뚜껑에 환기 구멍을 통해 oxygenator를 종료 하기 전에 코일된 실리콘 튜브를 통과. 이 노출 중 실리콘 튜브를 통해 흐르는 perfusate 제공 된 가스 혼합물의 화학 구성 요소와 함께 포화 된다. oxygenator를 종료할 때 perfusate 폐기물 수집 저수지로 이어지는 반환 라인에 들어가기 전에 관류 챔버에 직접 전달 합니다. 이 디자인에 중요 한 다른 구성 요소 포함 수정된 RF microcoil, oxygenator의 관류 챔버 사이 액체 단단한 물개를 형성 하는 실리콘 세탁기 (빨간 반지) 위에 수직으로 서 서 oxygenator를 수 있는 아 세 탈 지원 못 하 고 이 가역 물개를 형성 하는 데 사용 하는 케이블 타이의 배치를 수용 하는 microcoil의 조직, 그리고 케이블 타이 노치 이 그림은 수정 하 고 원래 제8에서 허가로 복제. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56282/56282fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56282/56282fig3.jpg"> 
그림 3: 구멍에 oxygenator를 인터페이스를 허용 하는 microcoil 어셈블리에 대 한 수정. 두 홈 3.0 m m x 1.5 m m (검은 화살표) 관류 챔버를 봉인 하는 데 사용 하는 케이블 타이의 폭을 수용 하는 어셈블리의 측면으로 절단 했다. 채널 (15 m m x 3 m m x 4 m m) 코일의 뒤 얼굴에 숲을 연결합니다. 2 나일론 공간 봉인 절차를 질 때 케이블 넥타이 머리에 대 한 catch로 채널 (빨간색 화살표) 행위의 측면에 배치. 코일 어셈블리 (노란색 arr의 상단에 교 련된 구멍 (2 x 14 mm)아야)는 아 세 탈을 조인 페그는 oxygenator 확보를 지원 합니다. 이 그림은 수정 하 고 원래 제8에서 허가로 복제. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56282/56282fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56282/56282fig4.jpg"> 
그림 4: 상대적 배치 및 적절 한 어셈블리의 microcoil, oxygenator, 프로브 몽타주 사진. 이러한 이미지에 구멍 oxygenator 및 microperfusion 장치의 주요 하드웨어 구성 요소 있으며 별도 부품 서로와 인터페이스 하는 방법을 설명 합니다. (A) 분해 뷰 사진 잘 조직의 씰링 하거나 프로브 본체의 조립 하기 전에 모든 구성 요소의 상대적 위치를 보여주는. 부품의 상대적 위치를 정확 하 게; 표시를 주의 되었습니다. 그러나, 관류 라인의 섹션에는 두 배로 되었습니다 다시이 시리즈에서 모든 구성 요소가 프레임 내에서 이미지를. (1 프로브 헤드, 2 = microcoil 어셈블리, 3 = 나일론 조직 보존 반지, 4 = 잘, 관류 = 5 = 케이블 타이, 6 구멍에 oxygenator, 7 = 그라데이션 코일, 8 = 거품 트랩 =). (B) 코일과 oxygenator 어셈블리를 다음과 같은 구성 요소입니다. 이 이미지에서 나일론 보존 반지 microcoil의 샘플을 확보 하기 위해 조직 잘 내 배치 하고있다. 아 세 탈 지원 못은 oxygenator의 기지에는 microcoil 위에 해당 구멍에 확보 되었습니다. 관류의 오픈 끝에 실리콘 가스 켓 잘 조직 잘 배치 되었습니다 그리고 케이블 타이 관류 챔버를 봉인 하기 위해 이러한 부품 주변 강화 되었습니다. 마지막으로,는 microcoil의 프로브 헤드의 상단에 연결 되었습니다. (C) 구성 요소 프로브 어셈블리를 다음과 같은. 마지막 패널에 케이블 타이에서 초과 길이 microcoil와 플러시 손질 되어 있다. 그라데이션 코일 스택 다음 신중 하 게 초과 관류 라인, oxygenator, 및 microcoil의 빈 센터에 통과 하는 동안 프로브로 실린더를 전진 하 여 위치에 올랐다는. 그래디언트는 프로브 헤드에 연결 되어, 일단 그들은 프로브에는 기온 변화도의 스레드 기반 위에 고정 고리를 속이 고에 의해 장소에서 개최 거 야. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56282/56282fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56282/56282fig5.jpg"> 
그림 5: superfused 급성 대뇌 피 질의 조각에 확산 신호 안정성. (A) 다른 superfusion 패러다임에 들어서는 4 급성 조각에서 정규화 확산 신호 값 최대 21.5 h 안락사를 다음의 기간에 대 한 시간이 지남에 따라 그려집니다. 조각 남아 15.5 h superfusion 여부에 관계 없이 안락사를 다음의 기간에 대 한 그들의 초기 확산 신호 측정의 ± 5% 이내 이며 지속적 또는 간헐적으로 미스터 스캔 길이 (1.5 h 또는 4 분)의 독립. 신호 녹음 포름알데히드 고정 피 질에서 가져온 긍정적인 통제 역할 (n = 1) 고정된 조직 샘플의 정적, 변하지 않는 특성상 안정성에 대 한. 반대로 확산 신호 측정 superfusion 지원의 결 석 라이브 슬라이스 (n = 1) 대사 결핍에 대 한 제어로 제공. 다른 superfusion의 실험 매개 변수는 다음과 같습니다: 연속 (항상 정시, 스캔 당 superfusion = 1.5 h), 간헐적으로 (검사, 사이 10 분 간격에 superfusion 스캔 당 시간 = 1.5 h), 긴 간격, 긴 검사 (superfusion에 스캔 하지만 스캔, 사이 10 분 동안 일시 중지 된 동안 스캔 당 시간 = 1.5 h), 긴 간격, 짧은 검사 (검사, 사이 1.5 h 간격에 superfusion 스캔 당 시간 = 4 분). (B) Analyzed 데이터 표시 그룹 패널 (A)에서 4 개의 라이브 슬라이스 superfusion 실험의 의미합니다. 확산 신호 프로필에서 그룹화, 반면 (2 ± 3% 이상 15.5 h) 시간이 지남에 약간 변화를 전시 하는 superfused 대뇌 피 질의 조각 끼얹는다 비 제어 (n = 1) 극적인 신호 불안정 초기 실험 6.5 h (15%)에 전시. 이 그림은 수정 하 고 원래 제8에서 허가로 복제. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56282/56282fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56282/56282fig6.jpg"> 
그림 6: 확인 hippocampal 조각 배치의 파일럿 영상 중. 확장된 미스터 현미경 세션을 실행 하기 전에 정확한 샘플의 위치는 스캐너 시간 등의 리소스를 보장 하기 위해 중요 하 고 비싼 perfusate 첨가제 하지 낭비 된다. 해 마의 CA1 영역의 피라미드 세포 레이어 빠른 (4.3 분)에 구상 될 수 있다, 낮은 해상도 (31 μ x 31 μ m에서-비행기) 파일럿 검사 관심의 조직 마이크로 코일에 관하여 올바르게 배치 됩니다. 두 이미지를 일반적인 스캔 매개 변수는 다음과 같습니다: TR/테 2000/11.6 ms, Δ = 6 ms, δ = 1 = ms, 평균 = 1. (A) b = 0 (효과적인 227) s/m m2. 이 예비 검사에서 지층 pyramidale 단지 회색, 대각선 밴드 코일의 구동 프로필에 중심으로 표시 됩니다. (B) b = 1200 (효과적인 1,860) s/m m2. 높은 보급에 가중치, interlamellar 대비 증가 피라미드 셀 레이어 인접 하기에 조직 보다 더 어두운 된다 (위: 지층 oriens; 아래: 지층 radiatum). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56282/56282fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

대사 지원 Excised, 자기 공명 현미경 중 생활 뇌 조직

현재 프로토콜 있는 사용자가 자기 공명 현미경 데이터의 수집 하는 동안 급성 hippocampal 및 대뇌 피 질의 조각 준비의 유지할 수 있는 방법을 설명 합니다.

This protocol describes the procedures necessary to support normal metabolic functions of acute brain slice preparations during the collection of magnetic ...

metabolic-support-excised-living-brain-tissues-during-magnetic

Research

JoVE Journal

Bioengineering

6.0K 조회수.  University of Florida. 현재 프로토콜 있는 사용자가 자기 공명 현미경 데이터의 수집 하는 동안 급성 hippocampal 및 대뇌 피 질의 조각 준비의 유지할 수 있는 방법을 설명 합니다.

비디오: Metabolic Support of Excised, Living Brain Tissues During Magnetic Resonance Microscopy Acquisition

Magnetic Resonance Elastography Methodology for the Evaluation of Tissue Engineered Construct Growth

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use of destructive assessment is not acceptable. A proposed alternative is the use of an imaging process called magnetic resonance elastography. Elastography is a nondestructive method for determining the engineered outcome by measuring local mechanical property values (i.e., complex shear modulus), which are essential markers for identifying the structure and functionality of a tissue. As a noninvasive means for evaluation, the monitoring of engineered constructs with imaging modalities such as magnetic resonance imaging (MRI) has seen increasing interest in the past decade1. For example, the magnetic resonance (MR) techniques of diffusion and relaxometry have been able to characterize the changes in chemical and physical properties during engineered tissue development2. The method proposed in the following protocol uses microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE) as a noninvasive MR based technique for measuring the mechanical properties of small soft tissues3. MRE is achieved by coupling a sonic mechanical actuator with the tissue of interest and recording the shear wave propagation with an MR scanner4. Recently, &mu;MRE has been applied in tissue engineering to acquire essential growth information that is traditionally measured using destructive mechanical macroscopic techniques5. In the following procedure, elastography is achieved through the imaging of engineered constructs with a modified Hahn spin-echo sequence coupled with a mechanical actuator. As shown in Figure 1, the modified sequence synchronizes image acquisition with the transmission of external shear waves; subsequently, the motion is sensitized through the use of oscillating bipolar pairs. Following collection of images with positive and negative motion sensitization, complex division of the data produce a shear wave image. Then, the image is assessed using an inversion algorithm to generate a shear stiffness map6. The resulting measurements at each voxel have been shown to strongly correlate (R2&gt;0.9914) with data collected using dynamic mechanical analysis7. In this study, elastography is integrated into the tissue development process for monitoring human mesenchymal stem cell (hMSC) differentiation into adipogenic and osteogenic constructs as shown in Figure 2.

The procedure demonstrates the methodology of magnetic resonance elastography for monitoring the engineered outcome of adipose and osteogenic tissue engineered constructs through noninvasive local assessment of the mechanical properties using microscopic magnetic resonance elastography (&mu;MRE).

조직 평가에 대한 자기 공명 Elastography 방법론은 구조 성장하는 기술

Traditional mechanical testing often results in the destruction of the sample, and in the case of long term tissue engineered construct studies, the use ...

연구

생체공학

Magnetically-Assisted Remote Controlled Microcatheter Tip Deflection under Magnetic Resonance Imaging

X-ray fluoroscopy-guided endovascular procedures have several significant limitations, including difficult catheter navigation and use of ionizing radiation, which can potentially be overcome using a magnetically steerable catheter under MR guidance.
	The main goal of this work is to develop a microcatheter whose tip can be remotely controlled using the magnetic field of the MR scanner. This protocol aims to describe the procedures for applying current to the microcoil-tipped microcatheter to produce consistent and controllable deflections.
	A microcoil was fabricated using laser lathe lithography onto a polyimide-tipped endovascular catheter. In vitro testing was performed in a waterbath and vessel phantom under the guidance of a 1.5-T MR system using steady-state free precession (SSFP) sequencing. Various amounts of current were applied to the coils of the microcatheter to produce measureable tip deflections and navigate in vascular phantoms.
	The development of this device provides a platform for future testing and opportunity to revolutionize the endovascular interventional MRI environment.

Current applied to an endovascular microcatheter with microcoil tip made by laser lathe lithography can achieve controllable deflections under magnetic resonance (MR) guidance, which may improve speed and efficacy of navigation of vasculature during various endovascular procedures.

자기 공명 영상 아래에 자기 (磁 气)를 이용한 원격 제어 Microcatheter 팁 편향

X-ray fluoroscopy-guided  endovascular procedures have several significant limitations, including  difficult catheter navigation and use of ionizing ...

Measuring the Mechanical Properties of Living Cells Using Atomic Force Microscopy

Mechanical properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many biological processes including stem cell differentiation, tumor formation, and wound healing. Changes in stiffness of cells and ECM are often signs of changes in cell physiology or diseases in tissues. Hence, cell stiffness is an index to evaluate the status of cell cultures. Among the multitude of methods applied to measure the stiffness of cells and tissues, micro-indentation using an Atomic Force Microscope (AFM) provides a way to reliably measure the stiffness of living cells. This method has been widely applied to characterize the micro-scale stiffness for a variety of materials ranging from metal surfaces to soft biological tissues and cells. The basic principle of this method is to indent a cell with an AFM tip of selected geometry and measure the applied force from the bending of the AFM cantilever. Fitting the force-indentation curve to the Hertz model for the corresponding tip geometry can give quantitative measurements of material stiffness. This paper demonstrates the procedure to characterize the stiffness of living cells using AFM. Key steps including the process of AFM calibration, force-curve acquisition, and data analysis using a MATLAB routine are demonstrated. Limitations of this method are also discussed.

This paper demonstrates a protocol to characterize the mechanical properties of living cells by means of microindentation using an Atomic Force Microscope (AFM).

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

Mechanical  properties of cells and extracellular matrix (ECM) play important roles in many  biological processes including stem cell differentiation, ...

FIBS-enabled Noninvasive Metabolic Profiling

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be validated for predictive purposes. Ideally such systems would be low volume, which precludes sampling and destructive analyses when time course data are to be obtained. What is needed is an in situ monitoring tool which can report the necessary information in real-time and noninvasively. An interesting option is the use of fluorescent, protein-based in vivo biological sensors as reporters of intracellular concentrations. One particular class of in vivo biosensors that has found applications in metabolite quantification is based on F&#246;rster Resonance Energy Transfer (FRET) between two fluorescent proteins connected by a ligand binding domain. FRET integrated biological sensors (FIBS) are constitutively produced within the cell line, they have fast response times and their spectral characteristics change based on the concentration of metabolite within the cell. In this paper, the method for constructing Chinese hamster ovary (CHO) cell lines that constitutively express a FIBS for glucose and glutamine and calibrating the FIBS in vivo in batch cell culture in order to enable future quantification of intracellular metabolite concentration is described. Data from fed-batch CHO cell cultures demonstrates that the FIBS was able in each case to detect the resulting change in the intracellular concentration. Using the fluorescent signal from the FIBS and the previously constructed calibration curve, the intracellular concentration was accurately determined as confirmed by an independent enzymatic assay.

A description of how to calibrate F&#246;rster Resonance Energy Transfer integrated biological sensors (FIBS) for in situ metabolic profiling is presented.&#160;The FIBS can be used to measure intracellular levels of metabolites noninvasively aiding in the development of metabolic models and high throughput screening of bioprocess conditions.

비 침습 대사 프로파일 링에게 FIBS 지원

In the era of computational biology, new high throughput experimental systems are necessary in order to populate and refine models so that they can be ...

Custom-designed Laser-based Heating Apparatus for Triggered Release of Cisplatin from Thermosensitive Liposomes with Magnetic Resonance Image Guidance

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect resulting in significant reductions in systemic toxicity. Nonetheless, insufficient release of encapsulated drug from liposomes has limited their clinical efficacy. Temperature-sensitive liposomes have been engineered to provide site-specific release of drug in order to overcome the problem of limited tumor drug bioavailability. Our lab has designed and developed a heat-activated thermosensitive liposome formulation of cisplatin (CDDP), known as HTLC, to provide triggered release of CDDP at solid tumors. Heat-activated delivery in vivo was achieved in murine models using a custom-built laser-based heating apparatus that provides a conformal heating pattern at the tumor site as confirmed by MR thermometry (MRT). A fiber optic temperature monitoring device was used to measure the temperature in real-time during the entire heating period with online adjustment of heat delivery by alternating the laser power. Drug delivery was optimized under magnetic resonance (MR) image guidance by co-encapsulation of an MR contrast agent (i.e.,&#160;gadoteridol) along with CDDP into the thermosensitive liposomes as a means to validate the heating protocol and to assess tumor accumulation. The heating protocol consisted of a preheating period of 5 min prior to administration of HTLC and 20 min heating post-injection. This heating protocol resulted in effective release of the encapsulated agents with the highest MR signal change observed in the heated tumor in comparison to the unheated tumor and muscle. This study demonstrated the successful application of the laser-based heating apparatus for preclinical thermosensitive liposome development and the importance of MR-guided validation of the heating protocol for optimization of drug delivery.

AN MRI-compatible&#160;custom-designed laser-based heating apparatus has been developed to provide local heating of subcutaneous tumors in order to activate release of agents from thermosensitive liposomes specifically at the tumor region.

자기 공명 이미지 지침에 열성 리포좀에서 시스플라틴의 트리거 된 릴리스를위한 맞춤 설계 레이저 기반의 가열 장치

Liposomes have been employed as drug delivery systems to target solid tumors through exploitation of the enhanced permeability and retention (EPR) effect ...

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan electron-paramagnetic-resonance (RS-EPR), which can provide quantitative information under in vivo conditions on oxygen concentration, pH, redox status and concentration of signaling molecules (i.e., OH&#8226;, NO&#8226;). The RS-EPR technique has a higher sensitivity, improved spatial resolution (1 mm), and shorter acquisition time in comparison to the standard continuous wave (CW) technique. A variety of phantom configurations have been tested, with spatial resolution varying from 1 to 6 mm, and spectral width of the reporter molecules ranging from 16 &#181;T (160 mG) to 5 mT (50 G). A cross-loop bimodal resonator decouples excitation and detection, reducing the noise, while the rapid scan effect allows more power to be input to the spin system before saturation, increasing the EPR signal. This leads to a substantially higher signal-to-noise ratio than in conventional CW EPR experiments.

Rapid Scan Electron Paramagnetic Resonance Opens New Avenues for Imaging Physiologically Important Parameters In Vivo

A new electron paramagnetic resonance (EPR) method, rapid scan EPR (RS-EPR), is demonstrated for 2D spectral spatial imaging which is superior to the traditional continuous wave (CW) technique and opens new venues for in vivo imaging. Results are demonstrated at 250 MHz, but the technique is applicable at any frequency.

빠른 스캔 전자 스핀 공명 이미징 생리 학적으로 중요 매개 변수에 대한 새로운 길을 엽니 다<em&gt; 생체</em

We demonstrate a superior method of 2D spectral-spatial imaging of stable radical reporter molecules at 250 MHz using rapid-scan ...

Automated Slide Scanning and Segmentation in Fluorescently-labeled Tissues Using a Widefield High-content Analysis System

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. Unfortunately, many researchers spend large amounts of time and resources developing and optimizing workflows that are only relevant to their own experiments. In this article, we describe a protocol that can be used by those with access to a widefield high-content analysis system (WHCAS) to image any slide-mounted tissue, with options for customization within pre-built modules found in the associated software. Not originally intended for slide scanning, the steps detailed in this article make it possible to acquire slide scanning images in the WHCAS which can be imported into the associated software. In this example, the automated segmentation of brain tumor slides is demonstrated, but the automated segmentation of any fluorescently-labeled nuclear or cytoplasmic marker is possible. Furthermore, there are a variety of other quantitative software modules including assays for protein localization/translocation, cellular proliferation/viability/apoptosis, and angiogenesis that can be run. This technique will save researchers time and effort and create an automated protocol for slide analysis.

Here we describe a protocol for the automated segmentation of fluorescently labeled tissues on slides using a widefield high-content analysis system (WHCAS). This protocol has wide-ranging applications in any field which involves the quantitation of fluorescent markers in biological tissues including the biological sciences, medical engineering, and health sciences.

자동된 슬라이드 스캔 및 Widefield 하이 콘텐츠 분석 시스템을 사용 하 여 붙일 표시 된 조직에서 시장 세분화

Automated slide scanning and segmentation of fluorescently-labeled tissues is the most efficient way to analyze whole slides or large tissue sections. ...

Controlled Strain of 3D Hydrogels under Live Microscopy Imaging

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized in vitro stretching methods. Various available systems use 2D substrate-based stretchers, while the accessibility of 3D techniques to strain soft hydrogels, is more restricted. Here, we describe a method that allows external stretching of soft hydrogels from their circumference, using an elastic silicone strip as the sample carrier. The stretching system utilized in this protocol is constructed from 3D-printed parts and low-cost electronics, making it simple and easy to replicate in other labs. The experimental process begins with polymerizing thick (&#62;100 &#956;m) soft fibrin hydrogels (Elastic Modulus of ~100 Pa) in a cut-out at the center of a silicone strip. Silicone-gel constructs are then attached to the printed-stretching device and placed on the confocal microscope stage. Under live microscopy the stretching device is activated, and the gels are imaged at various stretch magnitudes. Image processing is then used to quantify the resulting gel deformations, demonstrating relatively homogenous strains and fiber alignment throughout the gel&#8217;s 3D thickness (Z-axis). Advantages of this method include the ability to strain extremely soft hydrogels in 3D while executing in situ microscopy, and the freedom to manipulate the geometry and size of the sample according to the user&#8217;s needs. Additionally, with proper adaptation, this method can be used to stretch other types of hydrogels (e.g., collagen, polyacrylamide or polyethylene glycol) and can allow for analysis of cells and tissue response to external forces under more biomimetic 3D conditions.

The presented method involves uniaxial stretching of 3D soft hydrogels embedded in silicone rubber while allowing live confocal microscopy. Characterization of the external and internal hydrogel strains as well as fiber alignment are demonstrated. The device and protocol developed can assess the response of cells to various strain regimes.

라이브 현미경 이미징 에서 3D 하이드로겔의 제어 변형

External forces are an important factor in tissue formation, development, and maintenance. The effects of these forces are often studied using specialized ...

Electric and Magnetic Field Devices for Stimulation of Biological Tissues

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, differentiation, morphology, and molecular synthesis. However, variables such stimuli strength and stimulation times need to be considered when stimulating either cells, tissues or scaffolds. Given that EFs and MFs vary according to cellular response, it remains unclear how to build devices that generate adequate biophysical stimuli to stimulate biological samples. In fact, there is a lack of evidence regarding the calculation and distribution when biophysical stimuli are applied. This protocol is focused on the design and manufacture of devices to generate EFs and MFs and implementation of a computational methodology to predict biophysical stimuli distribution inside and outside of biological samples. The EF device was composed of two parallel stainless-steel electrodes located at the top and bottom of biological cultures. Electrodes were connected to an oscillator to generate voltages (50, 100, 150 and 200 Vp-p) at 60 kHz. The MF device was composed of a coil, which was energized with a transformer to generate a current (1 A) and voltage (6 V) at 60 Hz. A polymethyl methacrylate support was built to locate the biological cultures in the middle of the coil. The computational simulation elucidated the homogeneous distribution of EFs and MFs inside and outside of biological tissues. This computational model is a promising tool that can modify parameters such as voltages, frequencies, tissue morphologies, well plate types, electrodes and coil size to estimate the EFs and MFs to achieve a cellular response.

This protocol describes the step-by-step process to build both electrical and magnetic stimulators used to stimulate biological tissues. The protocol includes a guideline to simulate computationally electric and magnetic fields and manufacture of stimulator devices.

생물학적 조직의 자극을 위한 전기 및 자기장 장치

Electric fields (EFs) and magnetic fields (MFs) have been widely used by tissue engineering to improve cell dynamics such as proliferation, migration, ...

Quantification of Mouse Heart Left Ventricular Function, Myocardial Strain, and Hemodynamic Forces by Cardiovascular Magnetic Resonance Imaging

Mouse models have contributed significantly to understanding genetic and physiological factors involved in healthy cardiac function, how perturbations result in pathology, and how myocardial diseases may be treated. Cardiovascular magnetic resonance imaging (CMR) has become an indispensable tool for a comprehensive in vivo assessment of cardiac anatomy and function. This protocol shows detailed measurements of mouse heart left ventricular function, myocardial strain, and hemodynamic forces using 7-Tesla CMR. First, animal preparation and positioning in the scanner are demonstrated. Survey scans are performed for planning imaging slices in various short- and long-axis views. A series of prospective ECG-triggered short-axis (SA) movies (or CINE images) are acquired covering the heart from apex to base, capturing end-systolic and end-diastolic phases. Subsequently, single-slice, retrospectively gated CINE images are acquired in a midventricular SA view, and in 2-, 3-, and 4-chamber views, to be reconstructed into high-temporal resolution CINE images using custom-built and open-source software. CINE images are subsequently analyzed using dedicated CMR image analysis software.
Delineating endomyocardial and epicardial borders in SA end-systolic and end-diastolic CINE images allows for the calculation of end-systolic and end-diastolic volumes, ejection fraction, and cardiac output. The midventricular SA CINE images are delineated for all cardiac time frames to extract a detailed volume-time curve. Its time derivative allows for the calculation of the diastolic function as the ratio of the early filling and atrial contraction waves. Finally, left ventricular endocardial walls in the 2-, 3-, and 4-chamber views are delineated using feature-tracking, from which longitudinal myocardial strain parameters and left ventricular hemodynamic forces are calculated. In conclusion, this protocol provides detailed in vivo quantification of the mouse cardiac parameters, which can be used to study temporal alterations in cardiac function in various mouse models of heart disease.

This study describes a comprehensive cardiovascular magnetic resonance imaging (CMR) protocol to quantify the left ventricular functional parameters of the mouse heart. The protocol describes the acquisition, post-processing, and analysis of the CMR images as well as assessment of different cardiac functional parameters.

심혈관 자기 공명 영상에 의한 마우스 심장 좌심실 기능, 심근 균주 및 혈역학력의 정량화

Mouse models have contributed significantly to understanding genetic and physiological factors involved in healthy cardiac function, how perturbations ...

대사 지원 Excised, 자기 공명 현미경 중 생활 뇌 조직

요약

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이 비디오의 챕터

조직 평가에 대한 자기 공명 Elastography 방법론은 구조 성장하는 기술

자기 공명 영상 아래에 자기 (磁气)를 이용한 원격 제어 Microcatheter 팁 편향

원자 힘 현미경을 사용하여 살아있는 세포의 기계적 특성을 측정

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생물학적 조직의 자극을 위한 전기 및 자기장 장치

심혈관 자기 공명 영상에 의한 마우스 심장 좌심실 기능, 심근 균주 및 혈역학력의 정량화

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