이 프로토콜은 해부학, 특히 신경 해부학 연구 분야에서 3D 스캐닝 기술을 최초로 도입했으며 매우 정확한 중복 성능을 달성했습니다. 3D 신경 포함 중복 또는 3D 신경 프로토콜은 마이크로 스케일 멸균 소켓을 거시적 규모의 뇌 이미지에 포함하고 이러한 다양한 공간 스케일을 원활하게 교개합니다. 우리는 또한 인간 MRI 및 사후 두뇌에 3D 신경 프로토콜을 적용해야 합니다.
중첩을 통해 질병과 관련된 알려진 MRI 대비 패턴을 식별할 수 있습니다. 3D 스캔 시스템은 추출된 생체 유기체를 둘러싼 물에 민감하므로 물을 매우 신중하게 닦는 것이 중요합니다. 또한 절차는 가능한 한 빨리 수행해야합니다.
텍스트 프로토콜에 설명된 대로 마우스 준비와 MRI 획득 및 장비 준비로 이 절차를 시작합니다. 둘째 날, 외과 가위를 사용하여 처진 봉합사를 따라 이전에 안락사 된 마우스의 두피를 잘라냅니다. 외과 가위를 사용하여 람다 지점에서 브레그마 앞의 지점까지 대각선 방향으로 두개골을 자른다.
그런 다음 곡선 핀셋을 사용하여 두개골을 뇌에서 부드럽게 벗겨냅니다. 주걱으로 뇌를 들어 올려 얼음 차가운 절단 용액으로 페트리 접시로 옮춥춥시게 합니다. 제어 된 회전 펌프 속도를 가진 외부 가스 폭탄을 사용하여 95 %의 산소와 5 %의 이산화탄소를 함유 한 유동 공기로 얼음 냉간 절단 용액에서 작은 거품을 생성합니다.
1~2분 후, 표면이 밀가루 체로 약간 덮여 있는 마이크로 화이버 천에 뇌를 놓습니다. 마이크로 화이버 천을 사용하여 뇌 표면에서 유체를 부드럽게 닦아냅니다. 등등 측면을 가진 뇌를 샘플 스탠드에 올려 놓습니다.
그런 다음 샘플 스탠드를 자동 턴테이블의 중앙에 놓습니다. 3D 스캔 중에 방을 어둡게 하고 턴테이블에 3D 스캔을 수행합니다. 3D 스캔이 잘 작동하는지 테스트하려면 두 샷 사이의 각도를 22.5로 선택하고 시작 각도를 0으로 선택하고 최종 각도를 360으로 선택하여 3D 스캔을 클릭합니다.
뇌를 페트리 접시로 옮기고 절단 용액에서 뇌를 약 10초 동안 거품을 낸다. 메스를 사용하여 관상 비행기 의 중간에 두 블록으로 뇌를 잘라. 그런 다음 두 뇌 블록을 외과 주걱을 사용하여 평평한 표면으로 부드럽게 이동합니다.
인스턴트 접착제를 사용하여 뇌 블록 베이스의 뇌 블록을 부착합니다. 마이크로 화이버 천을 사용하여 1 ~ 2 분 이내에 뇌 표면에서 유체를 부드럽고 조심스럽게 닦습니다. 그런 다음 3D 검사를 다시 수행합니다.
진동의 블레이드 홀더에 블레이드를 부착합니다. 뇌 블록 베이스의 중심을 덮는 검은 테이프를 절단 단계의 중앙에 부착하여 진동을 합니다. 절단 액액을 절삭 단계에 붓고 진동에 절단 단계를 설정합니다.
절삭 속도와 진폭을 조정합니다. 두 뇌 블록에서 두께 300 미크론의 2 ~ 5 개의 관상 슬라이스를 만듭니다. 가능하면 절삭 단계에 용액을 유지합니다.
속도의 경우 분당 12.7밀리미터, 주파수의 경우 87~88헤르츠, 스윙 폭의 0.8~1.0mm로 설정하여 시스템의 절삭 속도, 주파수 및 진동 진폭을 최적화합니다. 뇌 슬라이스를 자르는 동안 전방 후방 좌표, 반구 및 기타 조건을 포함하여 슬라이스 된 좌표를 형식으로 기록하십시오. 두꺼운 플라스틱 파이펫을 사용하여 미리 따뜻워진 ACSF로 채워진 비커로 뇌 슬라이스를 부드럽게 전달합니다.
1시간 동안 약 34도의 비커에 있는 뇌 슬라이스를 배양합니다. 이 시간 동안 절삭 단계에서 남은 뇌 블록의 3D 스캔을 수행합니다. 이제 기록 장치에 다중 전극 배열 또는 MEA 칩을 설정합니다.
두 개의 튜브를 사용하여 칩을 연동 펌프에 연결합니다. 하나의 튜브를 사용하여 동일한 ACSF를 MEA 칩과 다른 튜브로 안내하여 ACSF를 MEA 칩에서 유도합니다. 두 개의 튜브 끝에 연결된 두 개의 바늘을 MEA 칩 벽 의 상단에 부착합니다.
MEA 칩의 내부 벽에 따라 팁으로 위치를 수정합니다. ACSF의 유량을 4.1 RPM으로 설정합니다. 텍스트 프로토콜에 설명된 바와 같이 MRI 데이터 처리를 수행하여 피질 볼륨을 추출합니다.
MRI 이미지 프로세싱을 수행하려면 3D 슬라이서 무료 소프트웨어를 다운로드하십시오. 3D 슬라이서의 볼륨 렌더링 및 편집기 모듈을 사용하여 생성된 추출된 뇌의 MR 이미지를 엽니다. 모드를 편집기에서 볼륨 렌더링으로 변경하고 대상 버튼을 클릭하여 뇌의 이미지가 화면 중앙에 도달하도록 합니다.
MRT-2 뇌 모드를 선택하고 시프트 막대를 이동하여 임계값을 조정합니다. 그런 다음 볼륨 렌더링에서 편집기로 다시 이동하고 임계값 효과 버튼을 클릭합니다. 라벨 41, 대뇌 피질을 적용합니다.
그런 다음 양식 체크리스트에서 VTK에서 STL로 파일 형식을 변경하여 뇌 표면 데이터를 STL 파일로 저장합니다. 작은 불일치를 수정하기 위해 스캔 시퀀스 내에서 8개 또는 16개의 각도에서 촬영한 8개 또는 16개의 이미지 중 자동 공동 등록을 수행합니다. 이렇게 하려면 정렬 옵션에 포함된 전역 등록을 클릭하고 이미지를 통합합니다.
전체 뇌 표면을 얻기 위해 다른 각도에서 스캔을 반복합니다. 서로 다른 각도에서 스캔한 이미지 간의 통합이 성공적이지 않은 경우 수동 정렬을 클릭하고 고정 된 이미지와 움직이는 이미지 쌍을 선택합니다. 서로 다른 이미지에서 서너 개의 공통 점을 선택하여 이미지의 수동 정렬을 시작합니다.
그런 다음 확인을 클릭합니다. 최적화 알고리즘은 반복적 최측근 알고리즘이며 비선형 변형을 포함하지 않습니다. 모든 이미지를 선택하고 메시 생성 버튼을 클릭하여 정렬된 모든 이미지의 메시를 만듭니다. 그런 다음 옵션을 선택하여 작은 아티스틱 오브젝트를 선택하여 메시를 가장 높은 해상도로 가져옵니다.
이미지를 STL 바이너리 또는 ASCII 형식으로 저장합니다. 이제 MRI 표면을 열고 표면 처리 소프트웨어를 사용하여 3D 스캔 표면과 병합합니다. 이전과 같이 수동 정렬 프로세스를 수행합니다.
그런 다음 이러한 공동 등록된 표면 이미지를 다시 저장합니다. 필요한 경우, 특히 MRI 데이터의 경우 뇌 영역을 둘러싼 작은 소음을 삭제하고 특히 3D 스캔 데이터의 경우 구멍을 채우면 개별 표면 데이터를 청소하십시오. 마지막으로 MATLAB과 같은 데이터 분석 소프트웨어로 표면 데이터를 엽니다.
두 서피스 사이의 최소 거리의 히스토그램을 생성하고 평가합니다. 발췌한 뇌의 3D 스캔에서 얻은 MRI 부피와 표면을 제거하여 생성된 피질 표면 간의 거리를 평가하였다. 거리의 히스토그램의 모드 값은 55미크론에 불과합니다.
또한, 거리가 0과 같은 지점에서 히스토그램을 축적할 때 누적된 값은 약 300미크론에서 총 샘플 수의 90%에 도달합니다. 두 표면 사이의 거리의 마지막 히스토그램은 약 50 미크론의 전형적인 피크를 보였다. 거시적 관점에서 이 모드 값은 MRI의 복셀 크기에서 100미크론이었던 기하학적 제한에 해당합니다.
이 점은 MRI와 3D 스캔 사이의 중복 알고리즘이 훌륭하게 잘 작동했으며 MRI와 3D 스캔 모두의 노이즈 수준이 낮은 값으로 억제되었음을 간접적으로 시사합니다. 이 프로토콜은 스캐닝 기술을 통해 바이오 유기체로 가장 먼저 상승합니다. 이 기술은 원래 순수 엔지니어링 요구에 활용되었습니다.
이 기술을 의학에 적용하면 새로운 질문에 답할 수 있습니다. 3D 스캐닝 후, 우리는 칼슘 이미징 벽 패치 그램 레코딩을 사용하여 시간적 및 공간 적 해상도 및 기록 가능한 세포 수측면에서 상호 보완적인 지식을 얻을 수 있습니다. 이 프로토콜이 제공하는 매우 정확한 중복 성능은 해부학 적 공간 규모와 영 공간 규모 사이의 원활한 연결을 이전보다 더 사실적으로 만들 것입니다.
