저자는 고 든과 베티 무어 재단 보조금 4037 4038 자금이 작품에 대 한 캘리포니아 기술 연구소를 인정 합니다.

1. 성장과 열거형의 박테리아 참고: 이것은 적절 한 매체 36에서 자란 거의 모든 세균성 긴장에 적용 됩니다. 우리의 예제에서 우리는 세 사용: Serratia marcescens 일반적인, 쉽게 식별 연구소 스트레인;로 그리고 작은, 높게 운동 환경 부담, Shewanella oneidensis 미스터-1. 비교의 비 운동 세포, 비 운동 Shewanella 돌연변이, Δ 대 운동 FlgM, 또한 사용 된다 비교 37. 모든 변종 lysogeny 국물 (파운드)에서 재배 됩니다.
<li>준비 <ol>살 균 파운드 매체 (증류수의 리터 당: 10 g bacto tryptone, 10 g NaCl bacto 효 모 5 g, 필터 또는 오토 클레이 브). 표준 100mm 직경 파운드-한 천 격판덮개 (동일한 매체 플러스 리터 당 15 g 한 천 제조 법, 오토 클레이 브 (121 ° C, 20 분) 소독을 때 충분히 처리할 멋진 부)를 준비 합니다. 냉장고에 매체 및 접시를 저장.</li>
	<li>실험 전날 씨앗의 5-6 mL &#34; 마스터 &#34; 살 균 그리고 biosafety 기법을 사용 하 여 신선한 세균성 식민지에서 문화 매체. 30 ° C에 (120 rpm) 통에 품 어 ~ 12 헤 보육 시간 긴장과 성장 속도에 의존 될 것입니다. 우리의 실험에 Shewanella 긴장은 인 큐베이 팅 12 시간; 그러나, Serratia 문화 중간 로그 성장을 전시 되도록 8 시간 후 수확 이다.</li>
	<li>실험의 하루가지고 박테리아의 spectrophotometric 읽기 (OD 600) 마스터 문화, 0.6 0.7의 범위에 있을 것으로 예상 된다. 그것은 (로 이전 결정) 대 수 성장 단계에 있어야 한다. 경우 중간의 5 mL으로, 하위 100 µ L 중간 로그 단계 세포의 성장을 허용.</li>
	<li>걸릴 샘플 마스터의 문화 및 챔버 Petroff 하우서 계산를 사용 하 여 직접 셀. 이 라이브 및 죽은 세포를 열거 합니다.
	<ol><li>Micropipette와 챔버로 전송 undiluted 문화 10 µ L 샘플을 추출.</li>
		<li>40 X (63 X 나 0.7-0.8) 높은 건조 객관적인 현미경 이미지 단계 대조를 사용 하 여.</li>
		<li>계산 20 사각형에 평균 박테리아. 
		참고: 사각형만 그 건너 상단 왼쪽된 경계 (또는 아래쪽 그리고 당신이 선호 하는 경우에 오른쪽) 내에서 전적으로 박테리아만을 계산 합니다. 사각형은 여러 줄으로 구분 됩니다, 하나를 경계로 선택.</li>
		<li>20의 평균으로 계산 농도 희석 요인 x 사각형. 직접 수 농도 위해 잘 작동 하지 않습니다 참고 &#60; 10 7 / mL.</li>
	</ol></li> <li>식민지 형성의 계산에 대 한 문화의 직렬 희석 하 게 단위 (CFU). 이 라이브 셀만을 열거 합니다.
	<ol><li>만들어 살 균 0.9% 식 염 수와 함께 선택한 세균 샘플의 각각의 직렬 희석 솔루션. 20 µ L 세균성 솔루션의 전송 및 180 µ L 식 염 수로 희석. 가장 낮은 농도 10 ~ 3 셀/mL 때까지 반복.</li>
		<li>희석 제안 하는 적어도 2 걸릴 100 µ L 10은 3과 10 4 /mL &#8212; 및 적절 한 고체 미디어 접시에 접시. 살 균 분산기로 퍼졌다. 각 희석의 3 복제 수행.</li>
		<li>하룻밤 또는 식민지 성장 때까지 당신의 박테리아에 대 한 적절 한 온도에서 품 어.</li>
		<li>식민지 고 콜로 니 형성 단위 (CFU) (# x 희석 요소 식민지)에 따라 계산 / 볼륨 도금 CFU/mL =. CFU는 복제 평균.</li>
	</ol></li></ol> 2. DHM 높은 희석 샘플의 준비 DHM와 게시물 DHM의 계산에 대 한 마스터의 <ol><li>확인 직렬 희석 문화 파운드 미디어 판에 콜로 니 형성 단위 (참조 1.4.1-1.4.4). 이 이중 맹 검을 수행 하므로 사람이 녹음을 하 고는 각 측정 샘플에서 농도의 인식 하지 못합니다.
	<ol>셀의 농도 실험 기간 동안 분명 변경 되지 않습니다 있도록 <li>적절히 운동 장려 되지만 세포 분열을 억제 하는 최소한의 매체의 10-15 mL에 박테리아를 희석. 이 0.9% 식 염 수 또는 좀 더 구체적인 운동 성 매체 수 있습니다. 예를 들어 대장균에 사용 하 여, 운동 성 매체 EDTA 38를 포함 해야 합니다. 이러한 예제에 대 한 우리는 0.9% 식 염 수를 사용.</li>
	</ol></li></ol> 3. DHM 비디오 <ol><li>관심의 희석의 약 10 mL에 당겨 멸 균 주사기를 사용 하 여,.</li>
	<li>살 균이 음 쇠를 사용 하 여 및 튜브 DHM 샘플 챔버에 주사기를 연결. 
	참고: 맞춤 미세 챔버 악기의 광학 경로 통해 샘플의 일관 된 흐름을 허용 하기 위하여 건설 되었다. 자세한 내용은 결과 섹션을 참조. 실험 전에 압력가 마로 소독에 의해 시료 챔버의 모든 구성 요소를 소독.</li>
	<li>흐름 지속적으로 주사기 펌프를 사용 하 여 샘플 챔버를 통해 주사기에서 샘플. 
	참고: 적절 한 유량 유체 채널 크기, 원하는 처리량 뿐만 아니라 데이터 수집 제한에 따라 다릅니다.</li>
	<li>샘플 샘플 챔버를 통해 흘러 서 적절 한 프레임 속도로 연속적으로 홀로그램을 획득 합니다. 시간 스탬프 파일 데이터 분석 (프로토콜 섹션 4) 동안 나중에 사용할 수 있는 로그 각 이미지의 시간 캡처 생성 됩니다. 상 온 (23 ° C)에서 모든 홀로그램을 얻을. 카메라 제조업체에서 제공 하는 미리 작성 된 c + + 실행 파일을 실행 하 여 홀로그램 기록. 
	참고: 적절 한 프레임 속도 선택 흐름 속도 따라 다릅니다. 이 실험에 대 한 것이 좋습니다 그런 박테리아의 이미지를 만든 것 이다 프레임 속도 사용 하 여 &#62; 악기에 걸쳐 여행으로 2 회 &#39; s 시야.</li>
	<li>는 DHM 통해 이동 하는 샘플의 전체 10 mL에 대 한 충분 한 시간.</li>
	<li>박테리아 성장 하지 또는 접종 실험을 하는 동안 죽어 농축 보낸된 미디어 게시물 DHM 이미지 캡처의 100 µ L 미디어 접시. 살 균 분산기와 확산 하 고 24 시간;에 대 한 적절 한 온도에서 품 어 현재 식민지 계산.</li>
</ol> 4. 셀 밀도 및 검출 한계의 계산 <ol><li>박테리아의 존재에 대 한 데이터를 분석 하는 인수 홀로그램 동영상.
	<ol><li>홀로그램의 시계열에 대 한 중간 픽셀 값 계산 다음 홀로그램에 고정 제거할 각 각 픽셀에서이 중간 값을 뺍니다. 이 ImageJ에서 다음 단계를 수행 하 여 수행할 수 있습니다: <ol><li>32-비트 (이미지-형식-32 비트) 변환</li> <li>계산 (이미지-스택-Zproject-중간) 중간</li> <li>스택 (의 나머지 부분에서 평균을 뺍니다 Process-ImageCalculator-Subtract)</li></ol></li> <li>보이는 공기 반지 및 초점에서 셀의 개수 수동으로. ImageJ에 이렇게 포인트 도구로 개체를 가르키고.</li>
		<li>홀로그램의 각 시리즈 (홀로그램 수집의 시간에서 기록 된) 시간 스탬프 파일을 동반 될 것 이다. 사용 시간 스탬프 파일을 계산 하는 샘플의 총 양을 펌핑 당시 이미지 체포 됐다.</li>
	</ol></li> <li>샘플 이미지의 전체 볼륨에 의해 감지 하는 세포의 총 수를 나누어 세포 밀도 계산. 정확한 통계에 대 한 5-10 프레임 평균.</li>
</ol> 5. 진폭 및 위상 재건 이미지 프레임 당 10-200 셀 <ol><li>선택 대표 동영상. 재구성 소프트웨어에 원시 (중간 감 하지) 홀로그램을 로드 (예: ImageJ 숫자 전파 39; [GitHub] 샴푸).
	<ol><li>ImageJ를 사용 하 여, OD 숫자 전파 숫자 회절 이동.</li>
		<li>프롬프트에서 푸리에 마스크 실제 또는 가상 이미지를 선택 하 고 모든 정현파 잡음 기능 제거를 그립니다.</li>
		<li>재건 거리를 입력 하 여 진폭과 위상 적절 한 z-단계에서 재구성.</li>
	</ol></li> <li>Median 진폭 데이터 4.1.1에서 소음을 줄이기 위해 빼기.</li>
	<li>3D 플롯 데이터 큐브 또는 프로젝션. 플러그인에가 서 &#8212; 볼륨 뷰어.</li>
</ol>

<ol>
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K., Ramphal, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+functional+characterization+of+flgM,+a+gene+encoding+the+anti-sigma+28+factor+in+Pseudomonas+aeruginosa.">Identification and functional characterization of flgM, a gene encoding the anti-sigma 28 factor in Pseudomonas aeruginosa.</a> J Bacteriol. 184, 1514-1521 (2002).</li><li>Adler, J., Templeton, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+environmental+conditions+on+the+motility+of+Escherichia+coli.">The effect of environmental conditions on the motility of Escherichia coli.</a> Journal Gen Microbiol. 46, 175-184 (1967).</li><li>Piedrahita-Quintero, P., Castaneda, R., Garcia-Sucerquia, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+wave+propagation+in+Image+J.">Numerical wave propagation in Image J.</a> Appl Opt. 54, 6410-6415 (2015).</li><li>Schnars, U., J&#252;ptner, W. 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저자는 공개 없다.

홀로그램의 수치 재건: 홀로그램의 숫자 재건, 각도 스펙트럼 방법 (ASM) 사용 됩니다. 이 DHM의 그린의 기능으로 홀로그램의 회선을 포함 한다. 특정 초점면에서 이미지의 복잡 한 wavefront 푸리에 회선 정리를 다음과 같이 채용 하 여 계산할 수 있다:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq2.jpg">(1)
어디 <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq3.jpg"> 는 푸리에 변환 연산자 <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq4.jpg"> 홀로그램 매트릭스와 <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq5.jpg"> 은 그린의 기능으로 정의 되는 DHM의:
<img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq6.jpg">(2)
어디 <img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq7.jpg"> 개축 될 원하는 초점 비행기의 광학 축 거리는 <img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq8.jpg"> 조명 파장은 <img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq9.jpg"> 및 <img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq10.jpg"> x에서 픽셀의 수와 y 방향 각각, 및 <img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq11.jpg"> 와 <img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq12.jpg"> </img>x 및 y 방향, 각각40픽셀 크기 (검출기 평면)에 있는.
복잡 한 파도 앞에서 강도 크기의 제곱에 의해 산출 될 수 있다 <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq13.jpg"> </img>, 위상의 가상 및 실제 부품 사이 몫의 아크탄젠트 값에 의해 얻어질 수 있다 <img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/56343/56343eq13.jpg"> </img>.
수정 및 문제 해결 스파스 세균 농도의 열거와 관련 된 실험 높게 오염, 잘못 된 반응과 거짓 제외를 따르게 됩니다. 이런이 이유로, 성장 및 박테리아의 열거, DHM 매우 희석 샘플의 준비가이 실험에서 중요 한 단계가 있습니다. 주의 환경 박테리아는 성장 하 고 열거를 신중 하 게 제어 하 여이 실험에서 오염 방지로 이동 해야 합니다. 적절 한 살 균 기술, 압력가 마로 소독를 포함 하 여를 사용 하면 오염 뿐만 아니라 잘못 된 반응에 대해 방지할 수 있습니다. 추가 방지 하기 위해 잘못 된 반응에 대 한 박테리아는 상대적으로 고유한 특성 (예를 들면, S. marcescens 는 경작 하는 때 매우 독특한 붉은 색)이이 실험에 대 한 선정 됐다. False 네거티브에 대 한 방지 하기 위해이 실험을 위해 선택 하는 박테리아는 풍부한 문화 접시에 성장 하 고 독특한 모양 또는 DHM 통해 식별 운동 패턴 수 선정 됐다. 그것은 주기적으로 샘플을 도금 고 접시 수는 박테리아를 측정 하 여 오염 및 예기치 않은 세포 성장에 대 한 테스트 해야 합니다.
이 실험을 실시, 샘플의 1 mL 당 약 2.4 g B의 데이터 크기 전망 이다. 이 수는 물론, 사용 하는 카메라와 파일 형식에 따라 달라 집니다. 보고 된 데이터 크기는 4 Mpx 검출기 및 표준 TIFF 파일 형식 사용입니다. 데이터의 후 처리 샘플의 1 mL 당 계산의 약 6 분 필요합니다. 이 처리 시간이 3.5 g h z와 RAM의 32 기가바이트 인텔 i7 8-코어 프로세서를 사용 하는 동안 관찰 되었다. 이러한 계산 크게 처리 시간이 감소 하지만 여기 다 되지 않았습니다 GPU를 병렬화 할 수 있습니다.
기술의 한계 DHM을 사용 하 여 박테리아의 매우 낮은 농도 검출 하는 것이 가능한 동안이 메서드는 관련 되지 않은. 혼자 형태학 세균성 긴장을 식별 하는 결정적인 수단 아니다. 진단 응용 프로그램 비 표적 세포 및 집계의 존재로 인해 구체적인 과제를 발표할 예정 이다. 그러나, 여기에 제시 된 듀얼 빔 악기의 장점은 상대적으로 탁 한 샘플 이미지 박테리아 수는 것. 임상 샘플 및 필요한 샘플의 전처리의 정도에서 박테리아를 감지 하는 능력 결정에 남아 있다.
프로토콜의 중요 한 단계 
2 단계: 정확한 희석 얻는 양적 열거형에 필수적 이다. 만든 모든 희석 접시 수를 백업 해야 합니다. 3 단계: 유량과 해당 프레임 속도 모든 셀은 볼 수 있도록 신중 하 게 이루어져야 합니다. 펌프 매개 변수 조정 한다 검출 실험의 한계를 수행 하기 전에 신중 하 게 조정 됩니다. 4 단계: 매우 낮은 세균 농도, 그것 감지의 자신감 충분 한 데이터를 캡처 중요 하다. 그것은 특정 셀, 그리고 하지 파편을 볼 되 고 있습니다를 일부 데이터를 재구성 해야 합니다. 극단적인 경우, 솔루션의 10 mL 이상 필요할 수 있습니다. 비 운동 긴장 운동 긴장 보다 모호한 될 가능성이 더 높습니다. 5 단계: 데이터에 어떤 모호한 경우 재건 홀로그램 셀 나타내고 하지 파편을 입증 하는 데 도움이. 고해상도 개조 전형적인 세포 형태학, 표시 됩니다 그리고 운동 성 운동 긴장의 트랙에서 볼 수 있습니다.

매우 희석 샘플에 정확한 세균의 결정은 많은 응용 프로그램에서 중요 한: 몇 가지 예는 물과 식품 품질 분석1,,23; 혈액, 중추 신 경계, 또는 래4,5;에 병원 균의 검출 메 마른 물6;를 포함 하 여 제약 제품의 생산 그리고 오픈 바다와 퇴적 물7,,89같은 oligotrophic 환경에서 환경 지역 사회 분석. 또한 목성과 토성, 특히 유로 파10,11 , Enceladus12,13, 의 얼음 위성에 가능한 현존 미생물 생명의 검출에 대 한 관심 증가 14, 표면 액체 바다를 알려져 있습니다. 1978 년에서 바이킹 이후 아무 미션이 다른 행성에 현존 생활을 찾을 하려고, 때문에 기술 및 세균성 식별 및 공간 임무15동안 계산을 위한 계기의 한정 된 개발이 되었습니다.
판 수의 전통적인 방법의 찾을 culturable 셀만, 때로는 환경 긴장에 종의 소수를 표현할 수 있는 &#60; 116. 플레이트 일 또는 외피의 주 변형에 따라 최대 성공을 위해 필요 합니다. Epifluorescence 현미경 검사 법은 신속 하 고 정확한 미생물 열거형에 대 한 황금 표준으로 크게 접시 계산을 대체 했다. 핵 산 라벨 형광 염료 4, 6-diamidino-2-phenylindole dihydrochloride (DAPI), SYBR 녹색 또는 acridine 오렌지 같은 핵 산을 바인딩하는 일반적인 염료 사용17,,1819 하지만 많은 연구를 사용 하 여 그램의 형광 표시기 서명20,,2122,,2324. ML 당 10 ~5 셀의 검출 (Lod)의 한계를 이끌어 전 농도 단계 없이 이러한 방법을 사용 하 여. LoD 향상 된 여과 사용 하 여 가능 하다입니다. 액체 샘플 막, 일반적으로 폴 리 카보 네이트를 이상적으로 줄이기 위해 배경 검정에 진공 필터링입니다. 저 배경 염료와 같은 위에서 언급 한 DNA 얼룩 필터25에 직접 적용할 수 있습니다. 눈으로 정확한 계산에 대 한 10 ~5 셀 필터, mL 당 10 ~5 셀 보다 더 희석 샘플에 대 한 즉 당 필요한, 중요 한 샘플 볼륨을 수집 하 고 필터링 해야 합니다. 레이저 검사 장치 필터의 모든 영역을 체계적으로 탐구 하 고 따라서 mL26당 10 ~2 셀 아래로 탐지의 한계를 밀고, 계산에 필요한 셀의 수를 줄이기 위해 개발 되었습니다. 그러나, 이들은 대부분 실험실에서 사용할 수 있습니다 그리고 정교한 하드웨어 뿐 아니라 소프트웨어 전문가 확인 입자를 관찰 하는 허용 하 고 박테리아와 파편 하지.
참고로, 패 혈 증으로 성인 보통 시작에서 증상을 보여주는 &#60; 셀/100ml의 혈액, 및에서 유아 &#60; 10 셀/mL. 성인에서 혈액 무승부 소요 10 mL, 유아, 1 mL에서. PCR 기반 방법 인간과 비 병원 성 식물 DNA의 존재에 의해 및 혈액27,28구성 요소 PCR 억제 저해 됩니다. 다양 한 새로운 기술에도 불구 하 고 문화 전원 지역 또는 개발 도상 국가에서 특히 혈 류 감염의 진단에 대 한 황금 표준 남아 있습니다. 다른 행성에 생활의 탐지, 열역학 계산 생활을 따라서 예상된 가능한 바이오 매스 에너지 예산을 추정할 수 있다. 1-100 셀/mL 유로 파29에 열역학으로 합리적인 것으로 예상 된다. 그것은 쉽게 이러한 숫자에서 볼는 수성 해결책의 다량에 있는 세포의 아주 작은 숫자의 발견은 중요 한 미해결된 문제를 수 있습니다.
이 논문에서는, 10의 농도에서 Serratia marcescens 및 Shewanella oneidensis (야생 형 및 비 운동 돌연변이)의 탐지 설명5, 104, 103및 꺼짐-축을 사용 하 여 100 셀/mL 디지털 홀로그램 현미경 (DHM) DHM의 주요 장점은 전통적인 가벼운 현미경 검사 법은 높은 해상도에서 두꺼운 샘플 볼륨의 동시 영상-이 구현에서 샘플 챔버는 0.8 m m 두께. 이러한 샘플 챔버는 소프트-리소 그래피입니다 (PDMS) 정밀 가공 알루미늄 몰드에서의 허용 오차는 ± 50 µ m에 의해 건설 되었다. 이 고 전력 가벼운 현미경 검사 법을 통해 필드의 깊이에 약 100 개선을 나타냅니다. 또한 DHM 광학 경로 길이 (굴절률과 두께의 제품)의 측정에 대 한 허용 하 양적 위상 정보를 제공 합니다. DHM와 유사한 기술을 사용 되었습니다 모니터링 박테리아와 효 모 세포 주기 및 세균 건조 질량30,,3132;의 계산 산란 차이점도 세균성 긴장33을 차별화 하는 데 사용할 수 있습니다.
우리가 사용 하는 악기 이전 게시34,35, 미생물와 함께 사용 사용자 이며 그것의 디자인 및 건축 시연 및 설명. 수성 솔루션 통해 주사기 펌프; 0.25 µ L 볼륨 샘플 챔버에 지속적으로 공급 된다 흐름 율은 전체 샘플 볼륨의 이미지를 보장 하기 위해 카메라 프레임 속도 의해 결정 됩니다. 통계 계산 주어진된 농도에서 세포의 상당수를 탐지 하기 위해 몇 군데 해야 합니다 샘플 볼륨의 수를 예측 합니다.
셀-감지 응용 프로그램 진폭 및 위상 이미지에 홀로그램의 재건은 필요; 분석은 원시 홀로그램에서 수행 되었다. 이 저장 계산 리소스 및 디스크 공간: 500mb 홀로그램 비디오 1-2 결핵 때 재건 될 것입니다. 그러나, 우리는 홀로그램 원하는 종 나타내는 확인 하는 샘플의 깊이 통해 재건 논의 할. DHM의 중요 한 기능 강도 및 이미지의 단계를 모니터링 하는 기능입니다. 강도 (예: 대부분의 생물 세포)에 거의 투명 한 유기 단계에서 명확 하 게 표시 됩니다. 그것은 레이블 없는 기술, 아니 염료 사용 됩니다. 이 한가능한 우주 비행 용, 염료는 임무의 조건을 살아날 수 있습니다 이후 dvantage 및-더 중요 한 것은-외계 생물, 인코딩에 대 한 DNA 또는 RNA를 사용 하지 않을 수 있습니다 작업으로 간주 될 수 없습니다. 북극과 남극, 염료 원격 위치를 데 려 어려울 수 있습니다 및 저장 시 저하 될 수 있습니다 같은 극한 환경에서 작업에 대 한 장점 이기도 합니다. 위상 및 진폭으로 이미지의 개조는 우리가 만든 사용할 수 GitHub (샴푸)에 오픈 소스 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 또는 ImageJ를 사용 하 여 수행 됩니다.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Bacto Yeast</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>212750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Tryptone</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>211705</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium chloride</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>7710</td>
			<td>Many options for purchase</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>214010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 cm Petri dishes</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10053-704</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15 mL culture tubes</td>
			<td>Falcon (Corning Life Sciences)</td>
			<td>352002</td>
			<td>Loose-capped</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Petroff-Hauser chamber</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>3920</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10 mL syringes</td>
			<td>BD Biosciences</td>
			<td>309604</td>
			<td>Luer-Lok tip not necessary</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male Luer to 1/16&#8221; barbed fitting</td>
			<td>McMaster-Carr</td>
			<td>51525K291</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Autoclavable 1/16&#8221; ID PVC tubing for flow</td>
			<td>Nalgene</td>
			<td>8000-0004</td>
			<td>Sold by length, purchase accordingly</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe pump</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>PHD 2000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sample Chamber</td>
			<td>Custom</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See Materials Section</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Holographic Microscope</td>
			<td>Custom</td>
			<td>n/a</td>
			<td>See Wallace et al.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Open-source software</td>
			<td>Custom</td>
			<td>https://github.com/bmorris3/shampoo</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

quantifying microorganisms at low concentrations using digital holographic microscopy (dhm)

정확 하 게 감지 하 고 스파스 세균 샘플 세 의료 진단, 및 로봇 식 임무를 다른 행 성과 태양계의 위성에 의해 생활 탐지에 대 한 음식, 음료, 제약 공업, 많은 응용 프로그램 있다. 현재, 스파스 세균 샘플은 문화 도금 또는 epifluorescence 현미경 검사 법에 의해 계산 됩니다. 문화 접시 필요 오래 부 화 시간 (주 일) 하며 epifluorescence 현미경 광범위 한 얼룩 및 샘플의 농도. 여기, 꺼짐-축 디지털 홀로그램 현미경 (DHM)를 사용 하 여 매우 희석 문화 (100-104 셀/mL)에 박테리아를 열거 하는 방법을 보여 줍니다. 첫째, 사용자 지정 DHM의 건설 건물 저가 악기에 자세한 지침과 함께 설명 되어 있습니다. 홀로 그래피의 원리를 설명 하 고 통계 모델 동영상 해야 얼마나 오래 추정 하는 데 사용은 악기의 광학 성능 특성 및 세균 솔루션 (표 2)의 농도에 따라 셀을 검출 하 . 10 셀의 비디오 검색5, 104, 103및 100 셀/mL 유엔 재건된 홀로그램을 사용 하 여 실시간으로에서 설명 된다. 진폭 및 위상 이미지의 개조는 오픈 소스 소프트웨어 패키지를 사용 하 여 보여 줍니다.

결과 DHM로 매우 낮은 수준에서 생활 하 고 죽은 박테리아를 감지 하는 능력을 표시 해야 합니다. 계산 하는 박테리아의 수는 Petroff 하우저 세 실과 접시 수를 사용 하 여 얻은 결과와 일관 되어야 합니다. 표준 통계 방법을 다양 한 세균성 농도에서 다른 검출 방법의 정확성에 대 한 정보를 제공합니다.
그림 1 에서는 세포의 직접 열거형에 사용 되는 세 실의 미세 뿐만 아니라 사용 Petroff 하우서 세 챔버. 그림 2A 보여줍니다 충분 한 허용 된 전형적인 풍부한 문화 접시 S. marcescens 식민지 (상 온에서 16 시간) 성장에 대 한 시간. 그림 2B 사용 하는 모든 종자에 대 한 성장 곡선을 보여 줍니다. OD600 와 식민지 수 사이의 관계 선형 분 광 광도 계;의 신뢰할 수 있는 범위 내에서 해야 정확한 분 광 광도 측정 다, 우리가 측정 ~ OD600 = 0.1 ~ 108/mL으로. 직접 Petroff 하우서 계산 하 고 식민지 수 셀까지 10% 매출 성장 곡선에 의해 본 죽을 시작 하기로 한다.
그림 3 사용자 지정 샘플 챔버의 설계를 보여준다. 사용자 지정 미세 챔버 홀로그램 현미경의 시야를 통해 샘플의 지속적인 흐름을 허용 하도록이 실험을 위해 사용 되었다. 표준 미세 기술과 재료 샘플 챔버의 건설에 사용 되었다. 무뚝뚝한 스쳐 스테인리스 바늘 남성 루어 록 피팅 샘플 챔버에 입구 및 출구 포트를 제공 하기 위해 미세 장치에 삽입 했다. 미세 채널 형상입니다 (PDMS) 알루미늄 프레임을 통해 압축 된, 가공된 알루미늄 마스터 몰드를 사용 하 여 두 개의 광학 질 유리 창문 사이 소프트 리소 그래피에 의해 설립 되었다. PDMS 흐름 채널 형상 설정으로 보호 하는 피하 주사 바늘, 유체 수송 흐름 채널에서 제공 하는. 이러한 샘플 챔버 PDMS를 사용 하 여 흐름 채널 기하학을 확립 하 고 따라서 악기의 광학 경로에 아무 PDMS를 포함에. 꺼짐-축 홀로그램 현미경의 광학 특성, 두 개의 마이크로 채널 성형 했다 참고 서로 평행 하 게 샘플 실에서. 이 간섭계 ('표본'과 '참조' 팔 라고 함)의 두 팔 사이의 광 경로 길이 맞게 것입니다. 참고 채널 메 마른 매체, 포함 하 고 흐름에 따라 해서는 안.
그림 4 는 실험실 구현에는 회로도 디지털 홀로그램 현미경의 이미지를 보여준다. 그것은 카메라와 함께 제공 하는 소프트웨어에 의해 운영 한다. 그림 5 에서는 세균성 열거와 보기의 필드 당 셀의 예상된 번호와 그들의 통신 대표 DHM 데이터. 재건, 없이 원시 홀로그램에서 보고 하 고 중간 빼기와 수동 추적 셀 가능 하다. 이 크게에 비해 모든 z-비행기, 재구성 원시 홀로그램 챔버의 깊이 걸쳐 셀 표시 계산 부담을 줄일 수 있습니다. 다른 농도 격판덮개 조사 및 Petroff 하우저 카운트와 그들의 통신에서 문화의 모양을 표시 됩니다. 총 셀 개수는 셀 이미지가 포함 된 볼륨의 총 수에 각 샘플의 볼륨에 본 수를 평균 하 여 결정 됩니다. 탐지의 한계는 몇 군데 샘플 볼륨의 총 수에 의해 결정 됩니다. 이 실험에서 우리는 10ml 단위로 0.25 µ L (샘플 당 40000 이미지의 총) 몇 군데 샘플의 최대 총이 값에 최대 한도 설정 합니다. 셀은 20 프레임의 시리즈를 통해 각 프레임에서 명확 하 게 관찰 하는 경우 최대 총 볼륨 이루어집니다 전에 녹음 중지 됩니다. 이전에 신문에서 우리 보고 샘플 볼륨 1-105 셀/mL (표 1)에서 배열 하는 농도에서 50%의 신뢰도에서 박테리아를 검출 하는 데 필요한 수 추정에 대 한 수식. 이 견적을 바탕으로, 모든 40000 프레임의 검사 허용 합니다 1/mL에서 세포의 검출이 계산은 계산 집약적 이지만.
그림 6 개조 소프트웨어 (피지)39의 사용을 보여준다. 단일 홀로그램 열리고 소프트웨어 "OD 숫자 전파 숫자 회절" 실행 됩니다. 이미지 매개 변수 대화 상자;에 부여 됩니다. 진폭, 강도 및 위상 수 있습니다 모두 개축 될. 하나의 z 평면을 선택할 수 있습니다, 또는 일괄 개조 전체 깊이 재구성 하는 데 사용할 수 있습니다.
그림 7 선택 된 샘플에서 다른 깊이 진폭 및 위상 이미지 복원을 보여준다. 생성 된 복원 하는 데 사용 하는 푸리에 마스크 중간 감 강도 이미지, 단계 이미지, 위상 스택을 통해 최대 투영 및 강도 스택의 볼륨 투영 표시 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56343/56343fig1.jpg"> 
그림 1: 세균성 세포의 세 직접. 셀/mL에서 세균 농도 챔버를 세 고 그 숫자 회계 Petroff 하우저 상공 20만 포함 되어 있다는 사실에 대 한 확장에서 박테리아의 총 수를 계산 하 여 계산 됩니다 샘플의 nL. (A)는 Petroff 하우서 챔버를 계산. (B) 계산의 이미지 상자 서로 다른 크기의 다양 한 크기의 셀을 열거 하는 데 유용 보여주는 단계 대조, X 10에서 미세 챔버. S. marcescens 세 챔버 작은 상자; 내에서 (C) 외관 단계 대조 X 40입니다. (D) 메서드는 계산에 대 한 셀 위쪽 및 오른쪽 가장자리 (N), 하지만 하지 아래쪽과 왼쪽 가장자리 (Y)에 떨어지는 제외 합니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56343/56343fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56343/56343fig2.jpg"> 
그림 2: 셀 식민지 성장 및 광학 밀도 계산. (A) S. marcescens 16 시간 동안 실 온에서 incubated. 올바른 희석에 문화 접시 해야정확한 계산 및 통계에 대 한 20-200 식민지 있다. 표시 된 접시는 다소 너무 신뢰할 수 있는 계산을 위해 혼잡. (B) 성장 곡선 사용 3 변종에 대 한. ~ 108 셀/mL, 0.1의 광학 밀도 일치 하지만 정확한 값은 악기에 따라 다. 직접 Petroff 하우저 카운트 선형 성장 범위 내에서 10% 이내를 판 수에 동의합니다. 오차 막대는 5 독립 샘플의 표준 편차를 나타냅니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56343/56343fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56343/56343fig3.jpg"> 
그림 3: 챔버 디자인 샘플. (A) 미세 도식 (견본 및 참조 microchannels 표시). (B) 완벽 하 게 조립된 샘플 챔버. (C) 폭발 CAD를 샘플 챔버의 구성 요소를 보여주는 볼. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56343/56343fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56343/56343fig4.jpg"> 
그림 4: 회로도 및 디지털 홀로그램 현미경의 이미지. (A) 회로도 보여주는 4 가지 주요 요소: 소스, 샘플 (견본 경로 규격 표시와 참조 경로 참고 표시 됩니다), 현미경, 그리고 센서. (B)는 하드웨어의 솔리드 모델. 섬유 공급 소스 어셈블리, 하단 이며 이미징 카메라 맨은. 두 개의 비구 면 렌즈 및 릴레이 렌즈-구성-현미경 광학 300mm 긴 렌즈 튜브 안에 포함 되어 있습니다. 소스 사이 3 축 단계 현미경 광학의 연구에서 표본 쉬운 수동 조작을 제공합니다. (C)는 실험실에서 악기의 사진. 눈금 막대는 이미지의 하단 부분에 1 인치를 나타냅니다. 설계도에서 월 러 스 그 외 여러분 다시 그려집니다. 34. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56343/56343fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56343/56343fig5.jpg"> 
그림 5: 성장 곡선 및 대표 DHM 데이터. (A) 예측 365 µ m x 365 µ m의 샘플 볼륨 기반 보기의 필드 당 세포 1 m m x. DHM 열거형에 대 한 최적의 범위는 사각형에 표시 됩니다 및 실제 샘플 (B)로 표시 됩니다 및 (C). Shewanella 의 (B) DHM 홀로그램 문화 8 × 105 셀/mL Petroff 하우저 하 여 측정 및 7.7 x 10에5 셀/mL 격판덮개 조사;에 의해 측정 된 이 이미지는 110 셀, 우수한 맞춤 예측을 보여줍니다. Shewanella 문화 2.0 ± 0.1 x 105 셀/mL Petroff 하우저와 2.0 ± 0.3 x 105 셀/mL 격판덮개 조사;에 의해 측정 된 측정에서 (C) DHM 홀로그램 이 이미지는 27 셀을 보여 줍니다. 눈금 막대 = 35 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56343/56343fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56343/56343fig6.jpg"> 
그림 6: 복원 수행. (A) 오픈 피지에 홀로그램. (B) 실행 숫자 전파 파장 및 이미지 크기를 입력 하십시오. 시작 하는 0에 가까운 z 거리를 선택 합니다. (C) 그릴 푸리에 마스크 실제 또는 가상 이미지를 선택 하 라는 메시지가 나타나면. (D) 목욕 처리 볼륨에 걸쳐 개조에 대 한 수 있습니다. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56343/56343fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56343/56343fig7.jpg"> 
그림 7: 개조의 모습. 10 ~6 셀/mL에서 Serratia 문화 이미지. (A) 원시 홀로그램입니다. (B) 푸리에 변환. 원 내부 영역은 영역을 사용할 수; 나머지는 마스크. (C) 단일 z-평면에서 진폭 재건. (D) 하나의 z-비행기;에 재건 단계 눈금 막대도에서 위상 변화를 보여준다. (E) 최대 단계 스택의 모든 z-비행기를 통해 강도 프로젝션. (F) 볼륨 전체 진폭 스택 (800 µ m x 365 x 365)의 볼. 눈금 막대 = 35 µ m. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56343/56343fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>농도 [mL 당 셀]</td>
			<td>프레임 필요</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.00E + 00 시</td>
			<td>6,686</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.00E + 01</td>
			<td>669</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.00E + 02 월</td>
			<td>67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.00E + 03 월</td>
			<td>7</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.00E + 04</td>
			<td>1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1.00E + 05 년</td>
			<td>1</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 1: DHM (50%의 탐지 신뢰)에 의해 박테리아 검출에 필요한 샘플 볼륨의 최소 번호.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>속성</td>
			<td>값</td>
			<td>단위</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>운영 파장</td>
			<td>405</td>
			<td>nm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>객관적인 숫자 조리개</td>
			<td>0.3</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>시스템 확대</td>
			<td>20</td>
			<td>-</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>수평 해상도</td>
			<td>0.7</td>
			<td>Μ m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>샘플 영상 볼륨</td>
			<td>360 x 360 x 800</td>
			<td>Μ m x μm x μm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>장비 길이</td>
			<td>400</td>
			<td>mm</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
표 2: 디지털 홀로그램 현미경에 대 한 광학 및 성능 사양.

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Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy DHM

디지털 홀로그램 현미경 (DHM) 이미징 샘플 50-100 X 초점 비교 해상도, 명시 야 현미경 보다 두꺼운 수행 후 처리를 허용 하는 체적 기술입니다. 여기 DHM 사용 됩니다 식별, 계산, 그리고 미생물에서 매우 낮은 밀도 추적과 광학 밀도 측정, 판 수, 및 직접 카운트와 비교.

디지털 홀로그램 현미경 (DHM)를 사용 하 여 낮은 농도에서 미생물 측정

Accurately detecting and counting sparse bacterial samples has many applications in the food, beverage, and pharmaceutical processing industries, in ...

quantifying-microorganisms-at-low-concentrations-using-digital

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Quantifying Microorganisms at Low Concentrations Using Digital Holographic Microscopy (DHM)

10.2K 조회수.  California Institute of Technology. 디지털 홀로그램 현미경 (DHM) 이미징 샘플 50-100 X 초점 비교 해상도, 명시 야 현미경 보다 두꺼운 수행 후 처리를 허용 하는 체적 기술입니다. 여기 DHM 사용 됩니다 식별, 계산, 그리고 미생물에서 매우 낮은 밀도 추적과 광학 밀도 측정, 판 수, 및 직접 카운트와 비교.

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Separating Beads and Cells in Multi-channel Microfluidic Devices Using Dielectrophoresis and Laminar Flow

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting and counting cells. However, manipulating the cell within the fluidic domain remains a challenge and requires complicated fabrication protocols for forming valves and electrodes, or demands specialty equipment like optical tweezers. Here, we demonstrate that conventional printed circuit boards (PCB) can be used for the non-contact manipulation of cells by employing dielectrophoresis (DEP) for bead and cell manipulation in laminar flow fields for bioactuation, and for cell and bead separation in multichannel microfluidic devices. First, we present the protocol for assembling the DEP electrodes and microfluidic devices, and preparing the cells for DEP. Then, we characterize the DEP operation with polystyrene beads. Lastly, we show representative results of bead and cell separation in a multichannel microfluidic device. In summary, DEP is an effective method for manipulating particles (beads or cells) within microfluidic devices.

Dielectrophoresis (DEP) is an effective method to manipulate cells. Printed circuit boards (PCB) can provide inexpensive, reusable and effective electrodes for contact-free cell manipulation within microfluidic devices. By combining PDMS-based microfluidic channels with coverslips on PCBs, we demonstrate bead and cell manipulation and separation within multichannel microfluidic devices.

멀티 채널 Microfluidic 장치에서 분리 비즈와 세포 Dielectrophoresis와 층류를 사용하여

Microfluidic devices have advanced cell studies by providing a dynamic fluidic environment on the scale of the cell for studying, manipulating, sorting ...

연구

생체공학

Low-Cost Cryo-Light Microscopy Stage Fabrication for Correlated Light/Electron Microscopy

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics and ultrastructure. First, cells can be imaged in a near native environment for both techniques. Second, due to the vitrification process, samples are
 preserved by rapid physical immobilization rather than slow chemical fixation. Third, imaging the same sample with both cryo-LM and cryo-EM provides correlation of
 data from a single cell, rather than a comparison of "representative samples". While these benefits are well known from prior studies, the widespread use of correlative 
 cryo-LM and cryo-EM remains limited due to the expense and complexity of buying or building a suitable cryogenic light microscopy stage. Here we demonstrate the 
 assembly, and use of an inexpensive cryogenic stage that can be fabricated in any lab for less than $40 with parts found at local hardware and grocery stores. This 
 cryo-LM stage is designed for use with reflected light microscopes that are fitted with long working distance air objectives. For correlative cryo-LM and cryo-EM 
 studies, we adapt the use of carbon coated standard 3-mm cryo-EM grids as specimen supports. After adsorbing the sample to the grid, previously established protocols 
 for vitrifying the sample and transferring/handling the grid are followed to permit multi-technique imaging. As a result, this setup allows any laboratory with a 
 reflected light microscope to have access to direct correlative imaging of frozen hydrated samples.

We demonstrate the fabrication of a low-cost cryogenic stage designed to fit most reflected light microscopes. This lab-built cryogenic stage enables efficient and reliable correlative imaging between cryo-light and cryo-electron microscopy.

상관 라이트 / 전자 현미경을위한 저가의 Cryo - 라이트 현미경 스테이지 제작

The coupling of cryo-light microscopy (cryo-LM) and cryo-electron microscopy (cryo-EM) poses a number of advantages for understanding cellular 
dynamics ...

Visualization of Cortex Organization and Dynamics in Microorganisms, using Total Internal Reflection Fluorescence Microscopy

TIRF microscopy has emerged as a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules in vitro and in living cells1. The optical phenomenon of total internal reflection occurs when light passes from a medium with high refractive index into a medium with low refractive index at an angle larger than a characteristic critical angle (i.e. closer to being parallel with the boundary). Although all light is reflected back under such conditions, an evanescent wave is created that propagates across and along the boundary, which decays exponentially with distance, and only penetrates sample areas that are 100-200 nm near the interface2. In addition to providing superior axial resolution, the reduced excitation of out of focus fluorophores creates a very high signal to noise ratios and minimizes damaging effects of photobleaching2,3. Being a widefield technique, TIRF also allows faster image acquisition than most scanning based confocal setups.
At first glance, the low penetration depth of TIRF seems to be incompatible with imaging of bacterial and fungal cells, which are often surrounded by thick cell walls. On the contrary, we have found that the cell walls of yeast and bacterial cells actually improve the usability of TIRF and increase the range of observable structures4-8. Many cellular processes can therefore be directly accessed by TIRF in small, single-cell microorganisms, which often offer powerful genetic manipulation techniques. This allows us to perform in vivo biochemistry experiments, where kinetics of protein interactions and activities can be directly assessed in living cells.
We describe here the individual steps required to obtain high quality TIRF images for Saccharomyces cerevisiae or Bacillus subtilis cells. We point out various problems that can affect TIRF visualization of fluorescent probes in cells and illustrate the procedure with several application examples. Finally, we demonstrate how TIRF images can be further improved using established image restoration techniques.

Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful approach to observe structures close to the cell surface at high contrast and temporal resolution. We demonstrate how TIRF can be employed to study protein dynamics at the cortex of cell wall-enclosed bacterial and fungal cells.

미생물에 접속 조직 및 역학 시각화, 총 내부 반사의 형광 현미경을 사용하여

TIRF microscopy has emerged as  a powerful imaging technology to study spatio-temporal dynamics of fluorescent molecules  in vitro and in living cells1. ...

Induction of Adhesion-dependent Signals Using Low-intensity Ultrasound

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from regulation of cell migration and proliferation, to secretion and even differentiation. The signals underlying each of these complex processes arise from the molecular interactions of extracellular matrix receptors on the surface of the cell. Integrins are the prototypic receptors and provide a mechanical link between extracellular matrix and the cytoskeleton, as well as initiating some of the adhesion-dependent signaling cascades. However, it is becoming increasingly apparent that additional transmembrane receptors function alongside the integrins to regulate both the integrin itself and signals downstream. The most elegant of these examples is the transmembrane proteoglycan, syndecan-4, which cooperates with &alpha;5&beta;1-integrin during adhesion to fibronectin. In vivo models demonstrate the importance of syndecan-4 signaling, as syndecan-4-knockout mice exhibit healing retardation due to inefficient fibroblast migration1,2. In wild-type animals, migration of fibroblasts toward a wound is triggered by the appearance of fibronectin that leaks from damaged capillaries and is deposited by macrophages in injured tissue. Therefore there is great interest in discovering strategies that enhance fibronectin-dependent signaling and could accelerate repair processes.
The integrin-mediated and syndecan-4-mediated components of fibronectin-dependent signaling can be separated by stimulating cells with recombinant fibronectin fragments. Although integrin engagement is essential for cell adhesion, certain fibronectin-dependent signals are regulated by syndecan-4. Syndecan-4 activates the Rac1 protrusive signal3, causes integrin redistribution1, triggers recruitment of cytoskeletal molecules, such as vinculin, to focal adhesions4, and thereby induces directional migration3. We have looked for alternative strategies for activating such signals and found that low-intensity pulsed ultrasound (LIPUS) can mimic the effects of syndecan-4 engagement5. In this protocol we describe the method by which 30 mW/cm2, 1.5 MHz ultrasound, pulsed at 1 kHz (Fig. 1) can be applied to fibroblasts in culture (Fig. 2) to induce Rac1 activation and focal adhesion formation. Ultrasound stimulation is applied for a maximum of 20 minutes, as this combination of parameters has been found to be most efficacious for acceleration of clinical fracture repair6. The method uses recombinant fibronectin fragments to engage &alpha;5&beta;1-integrin, without engagement of syndecan-4, and requires inhibition of protein synthesis by cycloheximide to block deposition of additional matrix by the fibroblasts., The positive effect of ultrasound on repair mechanisms is well documented7,8, and by understanding the molecular effect of ultrasound in culture we should be able to refine the therapeutic technique to improve clinical outcomes.

This protocol describes the stimulation of cultured fibroblasts with low-intensity pulsed ultrasound, which drives focal adhesion formation and Rac1 activation by mimicking engagement of the transmembrane matrix receptor, syndecan-4. This approach allows investigation of a successful clinical technique at the cellular level, thereby providing opportunities for refinement of the therapy.

낮은 강도의 초음파를 사용하여 접착 종속 신호의 유도

In multicellular organisms, cell behavior is dictated by interactions with the extracellular matrix. Consequences of matrix-engagement range from ...

Quantifying the Mechanical Properties of the Endothelial Glycocalyx with Atomic Force Microscopy

Our understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the mechanical properties of the endothelial surface layer. It is known that adhesion molecules on leukocytes are distributed non-uniformly relative to surface topography 3, that topography limits adhesive bond formation with other surfaces 9, and that physiological contact forces (&asymp; 5.0 &minus; 10.0 pN per microvillus) can compress the microvilli to as little as a third of their resting length, increasing the accessibility of molecules to the opposing surface 3, 7. We consider the endothelium as a two-layered structure, the relatively rigid cell body, plus the glycocalyx, a soft protective sugar coating on the luminal surface 6. It has been shown that the glycocalyx can act as a barrier to reduce adhesion of leukocytes to the endothelial surface 4. In this report we begin to address the deformability of endothelial surfaces to understand how the endothelial mechanical stiffness might affect bond formation. Endothelial cells grown in static culture do not express a robust glycocalyx, but cells grown under physiological flow conditions begin to approximate the glycocalyx observed in vivo 2. The modulus of the endothelial cell body has been measured using atomic force microscopy (AFM) to be approximately 5 to 20 kPa 5. The thickness and structure of the glycocalyx have been studied using electron microscopy 8, and the modulus of the glycocalyx has been approximated using indirect methods, but to our knowledge, there have been no published reports of a direct measurement of the glycocalyx modulus in living cells. In this study, we present indentation experiments made with a novel AFM probe on cells that have been cultured in conditions to maximize their glycocalyx expression to make direct measurements of the modulus and thickness of the endothelial glycocalyx.

The mechanical characteristics of endothelial glycocalyx were measured by indentation using micron sized spheres on AFM cantilevers. Endothelial cells were cultured in a custom chamber under physiological flow conditions to induce glycocalyx expression. Data were analyzed using a thin film model to determine the glycocalyx thickness and modulus.

원자 힘 현미경과 내피 Glycocalyx의 기계적 성질을 정량화

Our  understanding of the interaction of leukocytes and the vessel wall during  leukocyte capture is limited by an incomplete understanding of the ...

A Novel Method for Localizing Reporter Fluorescent Beads Near the Cell Culture Surface for Traction Force Microscopy

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When the substrate is coated with an extracellular matrix protein, cells adhere to the gel and apply forces, causing the gel to deform. The deformation depends on the cell traction and the elastic properties of the gel. If the deformation field of the surface is known, surface traction can be calculated using elasticity theory. Gel deformation is commonly measured by embedding fluorescent marker beads uniformly into the gel. The probes displace as the gel deforms. The probes near the surface of the gel are tracked. The displacements reported by these probes are considered as surface displacements. Their depths from the surface are ignored. This assumption introduces error in traction force evaluations. For precise measurement of cell forces, it is critical for the location of the beads to be known. We have developed a technique that utilizes simple chemistry to confine fluorescent marker beads, 0.1 and 1 &#181;m in diameter, in PA gels, within 1.6 &#956;m of the surface. We coat a coverslip with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent beads. PA gel solution is then sandwiched between the coverslip and an adherent surface. The fluorescent beads transfer to the gel solution during curing. After polymerization, the PA gel contains fluorescent beads on a plane close to the gel surface.

Traditional techniques for fabricating polyacrylamide (PA) gels containing fluorescent probes involve sandwiching a gel between an adherent surface and a glass slide. Here, we show that coating this slide with poly-D-lysine (PDL) and fluorescent probes localizes the probes to within 1.6 &#181;m from the gel surface.

견인 힘 현미경의 세포 배양 표면 근처 지역화 기자 형광 구슬을위한 새로운 방법

PA gels have long been used as a platform to study cell traction forces due to ease of fabrication and the ability to tune their elastic properties. When ...

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix (aECM) Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins that have incorporated functional domains derived from nature (or created de novo) have been reported. In particular, artificial extracellular matrix (aECM) proteins have been developed; these aECM proteins consist of biological domains taken from fibronectin, laminins and collagens and are combined with structural domains including elastin-like repeats, silk and collagen repeats. To date, aECM proteins have been widely investigated for applications in tissue engineering and wound repair. Recently, Tjin and coworkers developed integrin-specific aECM proteins designed for promoting human skin keratinocyte attachment and propagation. In their work, the aECM proteins incorporate cell binding domains taken from fibronectin, laminin-5 and collagen IV, as well as flanking elastin-like repeats. They demonstrated that the aECM proteins developed in their work were promising candidates for use as substrates in artificial skin. Here, we outline the design and construction of such aECM proteins as well as their purification process using the thermo-responsive characteristics of elastin.

Design and Construction of Artificial Extracellular Matrix aECM Proteins from Escherichia coli for Skin Tissue Engineering

Recombinant technologies have enabled material designers to create novel artificial proteins with customized functionalities for tissue engineering applications. For example, artificial extracellular matrix proteins can be designed to incorporate structural and biological domains derived from native ECMs. Here, we describe the construction and purification of aECM proteins containing elastin-like repeats.

설계 및 인공 세포 외 기질의 건설 (aECM) 단백질에서<em&gt; 대장균</em&gt; 피부 조직 공학

Recombinant technology is a versatile platform to create novel artificial proteins with tunable properties. For the last decade, many artificial proteins ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular level in the chemical and biomedical sciences. Although commercial SIM systems are available, systems that are custom designed in the laboratory can outperform commercial systems, the latter typically designed for ease of use and general purpose applications, both in terms of imaging fidelity and speed. This article presents an in-depth guide to building a SIM system that uses total internal reflection (TIR) illumination and is capable of imaging at up to 10 Hz in three colors at a resolution reaching 100 nm. Due to the combination of SIM and TIRF, the system provides better image contrast than rival technologies. To achieve these specifications, several optical elements are used to enable automated control over the polarization state and spatial structure of the illumination light for all available excitation wavelengths. Full details on hardware implementation and control are given to achieve synchronization between excitation light pattern generation, wavelength, polarization state, and camera control with an emphasis on achieving maximum acquisition frame rate. A step-by-step protocol for system alignment and calibration is presented and the achievable resolution improvement is validated on ideal test samples. The capability for video-rate super-resolution imaging is demonstrated with living cells.

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

여러 색상과 고속에서 구조화 조명 TIRF 현미경에 가이드

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Circulating MicroRNA Quantification Using DNA-binding Dye Chemistry and Droplet Digital PCR

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been linked to a disease state and has the potential to be used as disease biomarker. A sensitive and accurate method for circulating microRNA quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology has been recently developed. Specifically, using Locked Nucleic Acid (LNA)-based miRNA-specific primers with a green fluorescent DNA-binding dye in a compatible droplet digital PCR system it is possible to obtain the absolute quantification of specific miRNAs. Here, we describe how performing this technique to assess miRNA amount in biological fluids, such as plasma and serum, is both feasible and effective.

A sensitive and accurate method for cell-free microRNAs quantification using a dye-based chemistry and droplet digital PCR technology is described.

마이크로 RNA 정량는 DNA 결합 염료 화학, 물방울 디지털 PCR을 사용하여 순환

Circulating (of cell-free) microRNAs (miRNAs) are released from cells into the blood stream. The amount of specific microRNAs in the circulation has been ...

Rod-based Fabrication of Customizable Soft Robotic Pneumatic Gripper Devices for Delicate Tissue Manipulation

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations at the point of contact. It can be achieved by complementing traditional rigid grippers with soft robotic pneumatic gripper devices. This manuscript describes a rod-based approach that combined both 3D-printing and a modified soft lithography technique to fabricate the soft pneumatic gripper. In brief, the pneumatic featureless mold with chamber component is 3D-printed and the rods were used to create the pneumatic channels that connect to the chamber. This protocol eliminates the risk of channels occluding during the sealing process and the need for external air source or related control circuit. The soft gripper consists of a chamber filled with air, and one or more gripper arms with a pneumatic channel in each arm connected to the chamber. The pneumatic channel is positioned close to the outer wall to create different stiffness in the gripper arm. Upon compression of the chamber which generates pressure on the pneumatic channel, the gripper arm will bend inward to form a close grip posture because the outer wall area is more compliant. The soft gripper can be inserted into a 3D-printed handling tool with two different control modes for chamber compression: manual gripper mode with a movable piston, and robotic gripper mode with a linear actuator. The double-arm gripper with two actuatable arms was able to pick up objects of sizes up to 2 mm and yet generate lower compressive forces as compared to elastomer-coated and non-coated rigid grippers. The feasibility of having other designs, such as single-arm or hook gripper, was also demonstrated, which further highlighted the customizability of the soft gripper device, and it's potential to be used in delicate surgical manipulation to reduce the risk of tissue grip damage.

This protocol describes a rod-based approach, combining 3D-printing and soft lithography techniques for fabricating the soft gripper devices. This approach eliminates the need for an external air source by incorporating a chamber component and reduces the chance of occlusion during the sealing process, particularly for miniaturized pneumatic channels.

섬세한 조직 조작을위한 사용자 정의 소프트 로봇 공압 그리퍼 장치의로드 기반의 제조

Soft compliant gripping is essential in delicate surgical manipulation for minimizing the risk of tissue grip damage caused by high stress concentrations ...