Name: assessment of blood-brain barrier permeability by intravenous infusion of fitc-labeled albumin in a mouse model of neurodegenerative disease
Uploaded: 2017-11-08T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 22 s
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이 작품 "피코 Neuromed"에 의해 지원 되었고 건강 V.M. 게 "검색 전류"의 이탈리아 정부에 의해 자금

IRCCS Neuromed 동물 관리 검토 위원회에 의해 그리고 동물에 대 한 모든 절차 승인 &#34; Istituto 레 디 Sanità &#34; (허가 번호: 1163/2015-홍보) EU 지시문 2010의 지침에 따라 했다 / 63/EU 동물 실험에 대 한.
 1. 경 정 맥에 주입 FITC 민 솔루션의 준비 참고: 모든 실험 했다 매니페스트 (11 주 된) HD R6/2 마우스에 고 나이에 날 라와 일치 하는 성별 야생-타입 (WT) 제어 littermates.
<ol><li>디졸브 FITC-알 부 민 분말 (재료의 표 참조) 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)에 10 mg/ml에서. 
	참고: 최적의 결과 얻으려면이 준비 되어야 한다 신선한 각 라벨 반응.</li>
</ol> 2. 수술에 동안 사용 장비의 준비 <ol><li>이전 압력가 수술 도구 (재료의 표 참조) 때 려 눕.</li>
	<li>알코올 (70% 에탄올 솔루션) 수술 벤치 청소. 외과 살 균 일회용 수건 드 레이프와 외과 영역 (45 x 45cm)를 준비 하 고 운영 stereomicroscope 설정.</li>
</ol> 3. 경 정 맥에 FITC 알 부 민 주입에 대 한 수술 <ol><li>마 취에 대 한 마우스 몸 무게 기록.</li>
	<li>케 타 민 (100mg/kg)-xylazine (10 mg/kg) 솔루션의 적절 한 복용량의 복 주사 (i.p)와 Anesthetize 마우스.</li>
	Walantus 외. 에서처럼 부드러운 발가락 핀치에 의해 <li>모니터 동물 진정 반사를 철회 11 , 12.</li> <li>보여지는 부정사 위치에 마 취 마우스를 놓고 접착 테이프로 수술 작업 대에 4 개의 다리와 꼬리를 수정.</li>
	<li>마우스 확보 후 신중 하 게 면도 전기 면도기와 함께 목에 적절 한 수술 여백 (재료의 표 참조) 및 povidone-요오드 솔루션 및 70% 에탄올으로 소독.</li>
	<li>면봉와 노출 된 면도 표면 건조.</li>
	<li>부드럽게 면도 피부를 당겨 하 고 1.5 cm 긴 세로 절 개를, 메스는 midclavicular에 의해 흉부에 중간 시작 하 고 바로 목 아래에 확장 라인.</li>
	<li>신중 하 게 외부 경 정 맥 노출 현미경 관찰 (5 배 확대)에서 집게와 떨어져 결합 조직 스트레칭.</li>
	<li>FITC 민 솔루션의 주입에 대 한 30½ G 바늘의 삽입을 촉진 하기 위하여 경 정 맥의 왼쪽 및 오른쪽에 충분 한 공간을 확인 하십시오.</li>
	<li>동물에 정 맥 주입 (오른쪽 경 정 맥) 천천히 (3 분 이상) 100 µ L 10 mL/kg FITC 알 부 민으로 30½ G 바늘을 사용 하 여.</li>
	<li>15 분 후, 잘린 여 마우스를 안락사, 급속 하 게 앞에서 설명한 13, 두개골에서 뇌를 제거 하 고 미리 냉장된 isopentane의 적어도 10 배 뇌 자체의 볼륨에서에서 15 분 담가.</li>
	<li>미리 냉장된 관으로 뇌를 냉동 isopentane 이동한 조직학 단면까지-80 ° C 냉동 고에 저장.</li>
</ol> 4. 조직학 단면의 뇌 주입 FITC 민 <ol><li>포함 복합 최적의 절삭 온도 (10 월)에 뇌를 냉동 (재료의 표 참조) 이전 cryostat 단면에.</li>
	<li>직렬는 cryostat와 20 µ m 두꺼운 부분, 뇌를 잘라 (재료의 표 참조), 현미경 유리 슬라이드에 탑재.</li>
	<li>는 FITC-알 부 민/laminin 공동 얼룩 특정 사용 하 여 수행 안티 laminin 항 체 (재료의 표 참조)으로 설명한 6.
	<ol><li>짧게, 밤에 주 항 체 안티 laminin (pAb 1:1000) 섹션을 품 어와 Cy3에 활용 된 적절 한 이차 항 체 진행.</li>
		<li>Coverslip 슬라이드 4를 포함 하는 설치 매체와 함께 &#39;, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) (흡수 피크 = 360 nm; 방출 피크 = 460 nm (재료의 표 참조).</li>
		<li>슬라이드 어둠 속에서 4 ° C에서 건조 하룻밤 떠나.</li>
		<li>형광 현미경으로 얼룩이 지기 형광 관찰 (재료의 표 참조) 두 FITC를 갖춘 20 배 확대에 (흡수 피크 = 495 nm; 방출 피크 = 525 nm) 및 Cy3 필터 (흡수 피크 = 550 nm; 방출 최대 = 570 nm).
		<ol><li>샘플은 얼룩 직후, 매니큐어를 사용 하 여 모서리에 coverslip 보안을 보고 (4.3.3) 이상으로 현미경 검사.</li>
		</ol></li></ol></li></ol> 5. 형광 현미경을 설정 하 고 컬러 이미지의 수집 <ol><li>형광 현미경을 다음과 같이 설정 합니다.
	<ol><li>차례 형광 램프에 사용 하기 전에 약 10 분. 현미경, 연결 된 컴퓨터와 디지털 카메라를 켭니다. 이미지 분석 소프트웨어 실행 (재료의 표 참조).</li>
		<li>최적의 신호 수집 및 공간 해상도 대 한 적절 한 목표를 사용 하 고 적절 한 필터를 선택 합니다.</li>
	</ol></li> <li>수집의 컬러 이미지 <ol><li>이미지 분석 소프트웨어에 [라이브] 명령을 선택 (테이블의 자료를 참조) 각 필터에 대 한 최적의 조명 매개 변수를 설정 하 고.</li>
		<li>단일 채널 컬러 이미지를 눈금 막대 추가 [고정] 명령을 선택 (&#39; 편집 &#62; 굽기 규모 &#39;)</li>
		<li>각 이미지에 저장 된 &#39;.tiff &#39; 형식.</li>
		<li>단일 이미지를 선택 하 여 채널 병합 &#39; 파일 &#62; 병합 채널 &#39;에서 그것을 저장 하 고는</li>
		<li>tiff &#39; 형식.</li>
		<li>취득 4 24 비트 컬러의 최소 뇌 조각 (6 섹션 슬라이드 당) 당 (2200 µ m x 3400 µ m)을 사진.</li>
	</ol></li></ol> 6. FITC 민 넘쳐 흐름의 평가 <ol><li>자유롭게 사용할 수 ImageJ 14 , 15를 사용 하 여 각 채널에 대 한 형광 강도 분석.</li>
	<li>FITC-알 부 민 각 이미지 마다 총 CY3 Laminin 형광 강도 의해 총 형광 신호 강도 정상화 하 고 녹색 형광 강도로 혈관 밖에 서 extravasated 알 부 민을 보고.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Obermeier, B., Verma, A., Ransohoff, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+blood-brain+barrier.">The blood-brain barrier.</a> Handb Clin Neurol. 133, 39-59 (2016).</li><li>Serlin, Y., Shelef, I., Knyazer, B., Friedman, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anatomy+and+physiology+of+the+blood-brain+barrier.">Anatomy and physiology of the blood-brain barrier.</a> Semin Cell Dev Biol. 38, 2-6 (2015).</li><li>Moretti, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+dysfunction+in+disorders+of+the+developing+brain.">Blood-brain barrier dysfunction in disorders of the developing brain.</a> Front Neurosci. 9, 40 (2015).</li><li>Zhao, Z., Nelson, A. R., Betsholtz, C., Zlokovic, B. 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J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-Brain+Barrier+Leakage+in+Patients+with+Early+Alzheimer+Disease.">Blood-Brain Barrier Leakage in Patients with Early Alzheimer Disease.</a> Radiology. 282 (2), 615 (2017).</li><li>Fernandez-Lopez, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+permeability+is+increased+after+acute+adult+stroke+but+not+neonatal+stroke+in+the+rat.">Blood-brain barrier permeability is increased after acute adult stroke but not neonatal stroke in the rat.</a> J Neurosci. 32 (28), 9588-9600 (2012).</li><li>Yang, Y., Rosenberg, G. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+breakdown+in+acute+and+chronic+cerebrovascular+disease.">Blood-brain barrier breakdown in acute and chronic cerebrovascular disease.</a> Stroke. 42 (11), 3323-3328 (2011).</li><li>Walantus, W., Castaneda, D., Elias, L., Kriegstein, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+utero+intraventricular+injection+and+electroporation+of+E15+mouse+embryos.">In utero intraventricular injection and electroporation of E15 mouse embryos.</a> J Vis Exp. (6), e239 (2007).</li><li>Szot, G. L., Koudria, P., Bluestone, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transplantation+of+pancreatic+islets+into+the+kidney+capsule+of+diabetic+mice.">Transplantation of pancreatic islets into the kidney capsule of diabetic mice.</a> J Vis Exp. (9), e404 (2007).</li><li>Gage, G. J., Kipke, D. R., Shain, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Whole+animal+perfusion+fixation+for+rodents.">Whole animal perfusion fixation for rodents.</a> J Vis Exp. (65), (2012).</li><li>McCloy, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Partial+inhibition+of+Cdk1+in+G+2+phase+overrides+the+SAC+and+decouples+mitotic+events.">Partial inhibition of Cdk1 in G 2 phase overrides the SAC and decouples mitotic events.</a> Cell Cycle. 13 (9), 1400-1412 (2014).</li><li>Burgess, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+human+Greatwall+results+in+G2+arrest+and+multiple+mitotic+defects+due+to+deregulation+of+the+cyclin+B-Cdc2/PP2A+balance.">Loss of human Greatwall results in G2 arrest and multiple mitotic defects due to deregulation of the cyclin B-Cdc2/PP2A balance.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (28), 12564-12569 (2010).</li><li>Krueger, M., Hartig, W., Reichenbach, A., Bechmann, I., Michalski, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood-brain+barrier+breakdown+after+embolic+stroke+in+rats+occurs+without+ultrastructural+evidence+for+disrupting+tight+junctions.">Blood-brain barrier breakdown after embolic stroke in rats occurs without ultrastructural evidence for disrupting tight junctions.</a> PLoS One. 8 (2), e56419 (2013).</li><li>Hirano, A., Kawanami, T., Llena, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+the+blood-brain+barrier+in+disease.">Electron microscopy of the blood-brain barrier in disease.</a> Microsc Res Tech. 27 (6), 543-556 (1994).</li></ol>

저자는 공개 충돌의 관심을가지고

우리는 여기에 설명 하는 기술 두뇌 질병 조건 하에서 BBB 누설을 탐지 하는 데 주로 유용 합니다. BBB 역 기능은 다양 한 신경학 적 장애4의 일반적인 기능으로 관심을 얻고 있다. 우리는 이전 HD6같은 희귀 신경 질환의 마우스 모델에서 BBB 무결성의 초기 혼란을 설명 하기 위해이 방법을 사용.
이 방법은 정확 하 고 신뢰할 수 있는 결과 제공 ?...

An erratum was issued for: <a href="https://www.jove.com/video/56389/assessment-blood-brain-barrier-permeability-intravenous-infusion-fitc">Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease</a>. One of the author&#39;s names was corrected from:
Maglione Vittorio
to:
Vittorio Maglione

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Erratum: Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

중앙 신경 조직 (CNS) 내의 항상성 적절 한 커뮤니케이션 및 신경 세포의 기능에 대 한 전제 조건입니다. CNS 실질은 단단히 봉쇄 주변에서는 내 피 혈액-뇌 장벽 (BBB), 주변 혈 류와 뇌 간의 인터페이스와이 두 지구1 사이 잡담에 중추적인 역할을 하 여 ,2. Bbb 등급은 복잡 하 고 동적 3 차원 구조는 주로 전문 마이크로-혈관 내 피 세포 (ECs) 세포 접합 단지-단단한 접속점 (TJs)-를 통해 서로 연결 하 고 pericytes에 의해 포위의 구성 신경 엔딩과 사이토 발 프로세스1,2.
생리 적인 조건 하에서 그대로 BBB의 매우 낮은 침투성 그리고 두뇌, 영양소와 다른 분자의 수송의 엄격한 규제를 보장 하 고 CNS에서 발생 하는 변화에서 독특한 보호를 제공 한다는 구성 및 가능성 주변에 대 한 신경 활동에 영향을 줄 수 있는 혈액의 모욕1,2,3.
그러나 BBB 무결성 및 그것의 향상 된 침투성의 많은 신경에 대 한 핵심 기능을 구성 하는 것 오랫동안 알려져 있다 및 신경 장애4 헌팅턴의 질병 (HD)5,6를 포함 하 여 이러한 장애 원인이 현상 여부 질병 과정에서 propagative 이벤트 아직 명확 하지 않습니다. 그러나 BBB 붕괴의 타이밍은 또한 애매 남아,, 우리의 그룹 및 다른 사람에 의해 증거 신흥 방해 BBB 무결성 늦은 이벤트를 질병의 진행, 하지만 오히려 초기 단계6에서,7 을 대표 하지 않는다 , 8, 장기 결과가 있을 수 있습니다.
이 염두에서에 두고, 그것은 성공적으로 대체 하 고 더 많은 타겟 개입의 수를 개발 하 고 질병의 진행 및 뇌 손상 예측에 유용한 전략을 개발 하기 위하여 조 neurodegeneration BBB 붕괴를 공개 하는 것이 중요 이러한 장애의 임상 결과 완화 BBB 장애의 신뢰할 수 있는 이미징, 그러므로, 실험 연구 및 뇌 질환의 임상 관리에 중요 한 중요성의 이다.
이 문서에서 우리는 높은 분자량 fluorescein isothiocyanate 표시-알 부 민 (FITC-알 부 민)을 사용 하 여 HD 마우스 모델에서 BBB 침투성의 평가 대 한 성공적이 고 간단한 절차를 설명 합니다. FITC-민, 일반적으로 뇌 실질에는 장벽을 교차 수 없습니다의 넘쳐 흐름 BBB 누설의 지표로 측정 되었다. 이 기술은 쉽게 적응할 수 있는 쥐 및 다른 병리학 조건 cerebrovasculature 장애9,10특징 이다.

<table><tbody><tr><td>Albumin-fluorescin isothiocyanate conjiugate</td><td>SIGMA</td><td>A9771-100MG</td><td></td></tr><tr><td>pAb anti-Laminin</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB300-144</td><td></td></tr><tr><td>CY3 anti-rabbit made in goat</td><td>MILLIPORE</td><td>AP132</td><td></td></tr><tr><td>SUPERFROST PLUS</td><td>Thermo Scientific</td><td>J1800AMNZ</td><td></td></tr><tr><td>Cover Slips 24 X 50 mm</td><td>Thermo Scientific (DIAPATH)</td><td>61050</td><td></td></tr><tr><td>Kilik Optimal Cutting Temperature (OCT) compound</td><td>Bio Optica</td><td>05-9801</td><td></td></tr><tr><td>VECTASHIELD Mounting Media</td><td>VECTOR</td><td>H-1500</td><td>Mounting media with DAPI</td></tr><tr><td>iNSu/Light Insulin Disposible Syringe</td><td>RAYS Health &amp;amp; Safety</td><td>INS1ML26G13</td><td></td></tr><tr><td>30G 1/2&quot;</td><td>BD Microlance</td><td>304000</td><td>Needle for Insulin disposible Syringe</td></tr><tr><td>Scalpel Handle</td><td>F.S.T.</td><td>91003-12</td><td></td></tr><tr><td>#22 Disposable Scalpel blads</td><td>F.S.T.</td><td>10022-00</td><td></td></tr><tr><td>Fine Iris scissors 10.5 cm</td><td>F.S.T.</td><td>14094-11</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps #5745 45&amp;deg; 0.10 x 0.06 mm</td><td>F.S.T.</td><td>11251-35</td><td></td></tr><tr><td>Graefe Forceps 10 cm</td><td>F.S.T.</td><td>11051-10</td><td></td></tr><tr><td>Dumont Forceps #5 0.1 X 0.06 mm</td><td>F.S.T.</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Medical patch</td><td>Medicalis</td><td>34788</td><td></td></tr><tr><td>Sterile disposable towel drape</td><td>Dispotech</td><td>TVO50VE</td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopic Microscope</td><td>NIKON</td><td>SMZ 745 T</td><td></td></tr><tr><td>Optic Illuminator LED light (C-FLED2)</td><td>NIKON</td><td>1003167</td><td>Optic Illuminator for Stereoscopic Micrscope</td></tr><tr><td>Eclipse Ni-U Microscope</td><td>Nikon</td><td>932162</td><td>Epifluorescence Microscope</td></tr><tr><td>Microscope digital Camera</td><td>Nikon</td><td>DS-Ri2</td><td>Microscope camera</td></tr><tr><td>Intenslight</td><td>Nikon</td><td>C-HGFI</td><td>Microscope lamp</td></tr><tr><td>NIS-Elements 64 bit</td><td>Nikon</td><td>AR 4.40.00</td><td>Analysis Software</td></tr><tr><td>Electric Razor</td><td>Gemei</td><td>GM-3007</td><td></td></tr></tbody></table>

assessment of blood-brain barrier permeability by intravenous infusion of fitc-labeled albumin in a mouse model of neurodegenerative disease

혈액-뇌 장벽 (BBB) 무결성의 중단은 다른 신경 및 신경 퇴행 성 질환에 대 한 일반적인 기능입니다. 교란된 BBB 항상성 및 뇌 질환의 병 인 사이 상호 작용 추가 조사 필요, 비록 개발 및 BBB 변경 정확 하 게 감지 하는 신뢰할 수 있는 프로시저의 유효성 검사 중요 한 그리고 유용한 도구를 대표 잠재적으로 질병을 예측에 대 한 진행 및 개발 대상 치료 전략.
여기, 우리는 그런 결함 BBB의 침투성에는 천재에 명확 하 게 감지할 수 있는 헌팅턴 질병의 전 임상 마우스 모델에서 발생 하는 신경 상태에서 BBB 누설을 평가 하기 위한 간단 하 고 효율적인 절차를 제시 질병입니다. 특히,는 높은 분자량 fluorescein isothiocyanate 표시 (FITC)-알 부 민, 장애인은 경우에 BBB를 교차 수 있는 마우스 경 정 맥 혈관 이나 parenchymal 지구에 그것의 배급에 심하게 융합은 다음 형광 현미경 검사 법에 의해 결정 됩니다.
뇌 실질에 녹색 형광 민의 축적 탈 BBB 침투성의 색인 기능 그리고 때 quantitated J 이미지 프로세싱 소프트웨어를 사용 하 여 그린 형광 강도로 보고 됩니다.

적절 한 주입 FITC 민의 BBB는 두뇌 parenchymawhen으로 혈 류에서 녹색 형광 추적 프로그램의 넘쳐 흐름에 경 정 맥 결과6손상. 생리 적인 조건 하에서 생긴된 형광 민의 뇌 혈관의 내부에 제한 된 이며 주변 혈관 주위 지역 및/또는 뇌 실질에 신호 감지 (그림 1A, 현미경에는 탑)입니다. 반대로, BBB 신경 병 적인 상황에서 손상 될 때 FITC 민 ?...

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Assessment of Blood-brain Barrier Permeability by Intravenous Infusion of FITC-labeled Albumin in a Mouse Model of Neurodegenerative Disease

이 연구에서 우리는 신경 퇴행 성 조건 하에서 혈액-뇌 장벽 장애를 평가 하기 위한 간단 하 고 효율적인 절차를 제시. 우리의 목표를 달성 하기 위해 우리는 높은 분자량 fluorescein isothiocyanate 표시 (FITC) 주입-마우스 경으로 알 부 민 정 맥 및 형광 현미경 검사 법에 의해 뇌 실질에 그것의 누설을 평가.

FITC 표시 된 알 부 민 신경 질환의 마우스 모델에서의 정 맥 주입에 의해 혈액-뇌 장벽 침투성의 평가

Disruption of blood-brain barrier (BBB) integrity is a common feature for different neurological and neurodegenerative diseases. Although the interplay ...

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9.8K 조회수.  IRCCS Neuromed. 이 연구에서 우리는 신경 퇴행 성 조건 하에서 혈액-뇌 장벽 장애를 평가 하기 위한 간단 하 고 효율적인 절차를 제시. 우리의 목표를 달성 하기 위해 우리는 높은 분자량 fluorescein isothiocyanate 표시 (FITC) 주입-마우스 경으로 알 부 민 정 맥 및 형광 현미경 검사 법에 의해 뇌 실질에 그것의 누설을 평가.

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In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs through the blood-brain barrier (BBB), causing difficulties for effective pharmacological therapies. In recent years, different strategies for promoting brain targeting have aimed to improve drug delivery and activity at this site, including innovative nanosystems for drug delivery across the BBB. In this context, an in vitro approach based on a simplified cellular model of the BBB provides a useful tool to investigate the effect of nanoformulations on the trans-BBB permeation of molecules. This study describes the development of a double-layer BBB, consisting of co-cultured commercially available primary rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes. A multiparametric approach for the validation of the model, based on the measurement of the transendothelial electrical resistance and the apparent permeability of a high molecular weight dextran, is also described. As proof of concept for the employment of this BBB model to study the effect of different nanoformulations on the translocation of fluorescent molecules across the barrier, we describe the use of fluorescein isothiocyanate (FITC), loaded into ferritin nanoparticles. The ability of ferritins to improve the trans-BBB permeation of FITC was demonstrated by flux measurements and confocal microscopy analyses. The results suggest this is a useful system for validating nanosystems for delivery of drugs across the BBB.

In Vitro Permeation of FITC-loaded Ferritins Across a Rat Blood-brain Barrier: a Model to Study the Delivery of Nanoformulated Molecules

A method to establish an in vitro model of blood-brain barrier based on a co-culture of rat brain microvascular endothelial cells and astrocytes is described and validated. This system proved to be a valid tool to study the effect of nanoformulation on the trans-barrier permeation of fluorescent molecules.

쥐 뇌 혈관 벽의 맞은 편에 FITC로드 Ferritins의 생체 외 투과 년 : 모델 Nanoformulated 분자의 배달을 공부하기

Brain microvascular endothelial cells, supported by pericytes and astrocytes endfeet, are responsible for the low permeation of large hydrosoluble drugs ...

연구

생체공학

Quantification of Neurovascular Protection Following Repetitive Hypoxic Preconditioning and Transient Middle Cerebral Artery Occlusion in Mice

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week protocol for repetitive hypoxic preconditioning (RHP) induces long-term protection against central nervous system (CNS) injury in a mouse model of focal ischemic stroke. RHP consists of 9 stochastic exposures to hypoxia that vary in both duration (2 or 4 hr) and intensity (8% and 11% O2). RHP reduces infarct volumes, blood-brain barrier (BBB) disruption, and the post-stroke inflammatory response for weeks following the last exposure to hypoxia, suggesting a long-term induction of an endogenous CNS-protective phenotype. The methodology for the dual quantification of infarct volume and BBB disruption is effective in assessing neurovascular protection in mice with RHP or other putative neuroprotectants. Adult male Swiss Webster mice were preconditioned by RHP or duration-equivalent exposures to 21% O2 (i.e. room air). A 60 min transient middle cerebral artery occlusion (tMCAo) was induced 2 weeks following the last hypoxic exposure. Both the occlusion and reperfusion were confirmed by transcranial laser Doppler flowmetry. Twenty-two hr after reperfusion, Evans Blue (EB) was intravenously administered through a tail vein injection. 2 hr later, animals were sacrificed by isoflurane overdose and brain sections were stained with 2,3,5- triphenyltetrazolium chloride (TTC). Infarcts volumes were then quantified. Next, EB was extracted from the tissue over 48 hr to determine BBB disruption after tMCAo. In summary, RHP is a simple protocol that can be replicated, with minimal cost, to induce long-term endogenous neurovascular protection from stroke injury in mice, with the translational potential for other CNS-based and systemic pro-inflammatory disease states.

This protocol describes repetitive hypoxic preconditioning, or brief exposures to systemic hypoxia that reduce infarct volumes and blood-brain barrier disruption following transient middle cerebral artery occlusion in mice. It also details dual quantification of infarct volume and blood-brain barrier disruption after stroke to assess the efficacy of neurovascular protection.

마우스의 반복 저산소 전처리 및 과도 중간 대뇌 동맥 폐쇄 후 신경 혈관 보호의 정량화

Experimental animal models of stroke are invaluable tools for understanding stroke pathology and developing more effective treatment strategies. A 2 week ...

의학

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains brain homeostasis. The principal sites of the barrier are endothelial cells of the brain capillaries whose barrier function results from tight intercellular junctions and efflux transporters expressed on the plasma membrane. This function is regulated by pericytes and astrocytes that together form the neurovascular unit (NVU). Several neurological diseases such as stroke, Alzheimer&#39;s disease (AD), brain tumors are associated with an impaired BBB function. Assessment of the BBB permeability is therefore crucial in evaluating the severity of the neurological disease and the success of the treatment strategies employed.
We present here a simple yet robust permeability assay that have been successfully applied to several mouse models both, genetic and experimental. The method is highly quantitative and objective in comparison to the tracer fluorescence analysis by microscopy that is commonly applied. In this method, mice are injected intraperitoneally with a mix of aqueous inert fluorescent tracers followed by anesthetizing the mice. Cardiac perfusion of the animals is performed prior to harvesting brain, kidneys or other organs. Organs are homogenized and centrifuged followed by fluorescence measurement from the supernatant. Blood drawn from the cardiac puncture just before perfusion serves for normalization purpose to the vascular compartment. The tissue fluorescence is normalized to the wet weight and serum fluorescence to obtain a quantitative tracer permeability index. For additional confirmation, the contralateral hemi-brain preserved for immunohistochemistry can be utilized for tracer fluorescence visualization purposes.

An In Vivo Blood-brain Barrier Permeability Assay in Mice Using Fluorescently Labeled Tracers

Here we present a mouse brain vascular permeability assay using intraperitoneal injection of fluorescent tracers followed by perfusion that is applicable to animal models of blood-brain barrier dysfunction. One hemi-brain is used for assessing permeability quantitatively and the other for tracer visualization/immunostaining. The procedure takes 5 - 6 h for 10 mice.

Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

Blood-brain barrier (BBB) is a specialized barrier that protects the brain microenvironment from toxins and pathogens in the circulation and maintains ...

신경과학

Visualizing Impairment of the Endothelial and Glial Barriers of the Neurovascular Unit during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis In Vivo

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with embedded pericytes, and the glia limitans composed by the parenchymal basement membrane and astrocytic end-feed embracing the abluminal aspect of central nervous system (CNS) microvessels. In addition to maintaining CNS homeostasis the NVU controls immune cell trafficking into the CNS. During immunosurveillance of the CNS low numbers of activated lymphocytes can cross the endothelial barrier without causing BBB dysfunction or clinical disease. In contrast, during neuroinflammation such as in multiple sclerosis or its animal model experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) a large number of immune cells can cross the BBB and subsequently the glia limitans eventually reaching the CNS parenchyma leading to clinical disease. 
Immune cell migration into the CNS parenchyma is thus a two-step process that involves a sequential migration across the endothelial and glial barrier of the NVU employing distinct molecular mechanisms. If following their passage across the endothelial barrier, T cells encounter their cognate antigen on perivascular antigen-presenting cells their local reactivation will initiate subsequent mechanisms leading to the focal activation of gelatinases, which will enable the T cells to cross the glial barrier and enter the CNS parenchyma. Thus, assessing both, BBB permeability and MMP activity in spatial correlation to immune cell accumulation in the CNS during EAE allows to specify loss of integrity of the endothelial and glial barriers of the NVU. 
We here show how to induce EAE in C57BL/6 mice by active immunization and how to subsequently analyze BBB permeability in vivo using a combination of exogenous fluorescent tracers. We further show, how to visualize and localize gelatinase activity in EAE brains by in situ zymogaphy coupled to immunofluorescent stainings of BBB basement membranes and CD45+ invading immune cells.

Here, we present protocols to investigate impairment of the neurovascular unit during experimental autoimmune encephalomyelitis in vivo. We specifically address how to determine blood-brain barrier permeability and gelatinase activity involved in leukocyte migration across the glia limitans.&#160;

Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

The neurovascular unit (NVU) is composed of microvascular endothelial cells forming the blood-brain barrier (BBB), an endothelial basement membrane with ...

면역학 및 감염병학

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier (BBB). Rats with induced ischemic stroke were established and used as in vivo models to investigate the functional integrity of the BBB. Spectrophotometric detection of Evans blue (EB) in the brain samples with ischemic injury could provide reliable justification for the research and development of novel therapeutic modalities. This method generates reproducible results, and is applicable in any laboratory without a need for special equipment. Here, we present a visualized and technical guideline on the detection of the extravasation of EB following induction of ischemic stroke in rats.

An In Vivo Assessment of Blood-Brain Barrier Disruption in a Rat Model of Ischemic Stroke

The overall goal of this procedure is to provide a highly reproducible technique for in vivo assessment of the blood-brain barrier disruption in rat models of ischemic stroke.

허 혈 성 뇌졸중의 쥐 모델에서 뇌혈관 장애의 비보에 평가

Ischemic stroke leads to vasogenic cerebral edema and subsequent primary brain injury, which is mediated through destruction of the blood-brain barrier ...

면역형광 염색을 통한 혈액-뇌장벽 모델 분석

Use of the MicroSiM (&#181;SiM) Barrier Tissue Platform for Modeling the Blood-Brain Barrier

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, the&#160;&#181;SiM provides experimentalists with new capabilities, including live cell imaging, unhindered paracrine signaling between &#39;blood&#39; and &#39;brain&#39; chambers, and the ability to directly image immunofluorescence without the need for the extraction/remounting of membranes. Here we demonstrate the basic use of the platform to establish monoculture (endothelial cells) and co-culture (endothelial cells and pericytes) models of the BBB using ultrathin nanoporous silicon-nitride membranes. We demonstrate compatibility with both primary cell cultures and human induced pluripotent stem cell (hiPSC) cultures. We provide methods for qualitative analysis of BBB models via immunofluorescence staining and demonstrate the use of the &#181;SiM for the quantitative assessment of barrier function in a small molecule permeability assay. The methods provided should enable users to establish their barrier models on the platform, advancing the use of tissue chip technology for studying human tissues.

저자 스포트라이트: 인체 조직 연구를 위한 조직 칩 기술의 사용 발전 

This report provides protocols for assembly, cell culture, and assays on the &#181;SiM platform for the construction of blood-brain barrier models.

혈액-뇌 장벽 모델링을 위한 MicroSiM(μSiM) 장벽 조직 플랫폼 사용

The microSiM (&#181;SiM) is a membrane-based culture platform for modeling the blood-brain barrier (BBB). Unlike conventional membrane-based platforms, ...

Measuring Post-Stroke Cerebral Edema, Infarct Zone and Blood-Brain Barrier Breakdown in a Single Set of Rodent Brain Samples

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke involves middle cerebral artery occlusion (MCAO). Infarct zone, brain edema and blood-brain barrier (BBB) breakdown are measured as parameters that reflect the extent of brain injury after MCAO. A significant limitation to this method is that these measurements are normally obtained in different rat brain samples, leading to ethical and financial burdens due to the large number of rats that need to be euthanized for an appropriate sample size. Here we present a method to accurately assess brain injury following MCAO by measuring infarct zone, brain edema and BBB permeability in the same set of rat brains. This novel technique provides a more efficient way to evaluate the pathophysiology of stroke.

This protocol describes a novel technique of measuring the three most important parameters of ischemic brain injury on the same set of rodent brain samples. Using only one brain sample is highly advantageous in terms of ethical and economic costs.

설치류 뇌 샘플의 단일 세트에서 뇌졸중 후 뇌 부종, 경색 영역 및 혈액 뇌 장벽 고장 측정

One of the most common causes of morbidity and mortality worldwide is ischemic stroke. Historically, an animal model used to stimulate ischemic stroke ...

<meta charset="utf8"></head><body>마우스의 혈액-뇌 장벽 파괴에 대한 형광 염료 기반 시각화

Evaluation of Blood-Brain Barrier Breakdown in a Mouse Model of Mild Traumatic Brain Injury

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is a complex process influenced by several factors, such as the concentration of dyes in the blood, permeability of brain vessels, duration of dye extravasation, and reduction in dye concentration in the tissue due to degradation and diffusion. In a mild traumatic brain injury model, exposure to blast-induced shock waves (BSWs) triggers BBB breakdown within a limited time window. To determine the precise sequence of BBB breakdown, Evans blue, and fluorescein isothiocyanate-dextran were injected intravascularly and intracardially into mice at various time points relative to BSW exposure. The distribution of dye fluorescence in brain slices was then recorded. Differences in the distribution and intensity between the two dyes revealed the spatiotemporal sequence of BBB breakdown. Immunostaining of the brain slices showed that astrocytic and microglial responses correlated with the sites of BBB breakdown. This protocol has broad potential for application in studies involving different BBB breakdown models.

<meta charset="utf8"></head><body>경미한 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 혈액-뇌 장벽 파괴 평가

A method was developed to visualize dye extravasation due to blood-brain barrier (BBB) breakdown by administering two fluorescent dyes to mice at different time points. The use of glycerol as a cryoprotectant facilitated immunohistochemistry on the same sample.

경미한 외상성 뇌 손상의 마우스 모델에서 혈액-뇌 장벽 파괴 평가

Fluorescent dyes are used to determine the extent of dye extravasation that occurs due to blood-brain barrier (BBB) breakdown. Labeling with these dyes is ...

FITC 표시 된 알 부 민 신경 질환의 마우스 모델에서의 정 맥 주입에 의해 혈액-뇌 장벽 침투성의 평가

요약

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쥐 뇌 혈관 벽의 맞은 편에 FITC로드 Ferritins의 생체 외 투과 년 : 모델 Nanoformulated 분자의 배달을 공부하기

마우스의 반복 저산소 전처리 및 과도 중간 대뇌 동맥 폐쇄 후 신경 혈관 보호의 정량화

Vivo에서 혈액-뇌 장벽 침투성 분석 결과 사용 하 여 마우스에 붙일 추적기 표시

Vivo에서 실험적인 자기 면역 뇌 중 Neurovascular 단위의 내 피와 폐해 장벽의 장애 시각화

허 혈 성 뇌졸중의 쥐 모델에서 뇌혈관 장애의 비보에 평가

혈액-뇌 장벽 모델링을 위한 MicroSiM(μSiM) 장벽 조직 플랫폼 사용

혈액-뇌 장벽 모델링을 위한 MicroSiM(μSiM) 장벽 조직 플랫폼 사용

혈액-뇌 장벽 모델링을 위한 MicroSiM(μSiM) 장벽 조직 플랫폼 사용

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