Name: synthesis and mass spectrometry analysis of oligo-peptoids
Uploaded: 2018-02-21T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 44 s
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저자는 마이클 코놀리 씨과 박사 로널드 Zuckermann (The 분자 주조, 로렌스 버클리 국립 연구소) peptoid 합성에서 기술 지원에 감사 하 고 싶습니다. 우리 인정 국립 과학 재단 (체-1301505)에서 지원 합니다. 모든 질량 분석 실험 대학 태평양에서 화학 질량 분석 시설에서 실시 했다.

1입니다. Peptoid의 합성
참고: 합성 수 지 수 지 붓기 고 보호 그룹을 제거 하 여 활성화로 시작 합니다. 이것은 성장 하는 단위체 추가 사이클을 반복을 통해 수 지에 peptoid 체인 옵니다. 수 지에 결합 하는 첫 번째 단량체 C 맨끝 잔류물 이다. peptoid은 N-말단에 C-말단에서 늘어난다. 일단 원하는 peptoid 시퀀스, 달성 수 지 떨어져 죽 습와 peptoid 제품을 정화.
<ol><li>시 약의 준비 참고: 액체 시 약은 micropipette를 사용 하 여 측정 하 고 고체 시 약 분석 균형을 사용 하 여 측정 됩니다.<ol>
<li>N, N의 6.2 mL를 섞어 '-diisopropylcarbodiimide (DIC)와 N, N-dimethylformamide DIC/DMF 솔루션의 0.8 M 준비 (DMF)의 43.8 mL.</li>
		<li>0.8 M BMA/DMF 솔루션을 준비 하는 DMF의 50.0 mL에 BMA의 5.56 g을 분해.</li>
		<li>2 mL piperidine (Pip)와 8 mL 20 %Pip / DMF 솔루션을 달성 하기 위하여 DMF의 혼합.</li>
		<li>1.9 mL Npe의 1.0을 달성 하기 위하여 DMF의 13.1 mL에 녹 M Npe/DMF.</li>
		<li>1.3 mL Nme의 13.7 mL 1.0을 달성 하기 위하여 DMF에 녹 M Nme/DMF.</li>
		<li>1.0을 달성 하기 위하여 DMF의 2 mL에 내의 0.32 mL를 해산 M 내/DMF. 주의: 합성에 사용 되는 화학 물질의 대부분은 위험한. Trifluoroacetic 산 (TFA), DIC, 핍, 그리고 BMA는 호흡기, 눈, 및 피부에 유해. DMF와 dichloromethane (DCM) 발암 물질 의심 됩니다. 모든 반응 증기 두건에서 수행 해야 하 고 적절 한 개인 보호 장비를 사용 해야 합니다. 합성에 사용 되는 모든 화학 물질의 물질 안전 데이터 시트 (MSDS)를 확인 하시기 바랍니다.</li>
	</ol></li>
	<li>수 지 활성화
	<ol>
<li>링크 아 미드 수 지 (수 지, 0.047 mmol, 로드 0.56 mmol/g)의 84 mg에 밖으로 측정 하 고 10 mL 폴 리 프로필 렌 고체 상 반응 배를 추가. 그릇에 플런저를 삽입 합니다.</li>
		<li>반응 배를 DMF의 2 개 mL를 추가 하 고 혈관 압력 캡 모자. 통에 그릇을 놓고 뚜껑을 제거 하 고 반응 배의 플런저를 밀어 여 폐기물 컨테이너 약 12도 및 30 분 용액에 대 한 진동/분 385의 움직임의 각도에서 실내 온도에서 용기를 선동.</li>
		<li>선박 20 %Pip / DMF 용액 2 mL를 추가 하 고 그릇 뚜껑. 2 분, 쉐이 커에 선동 및 폐기물 컨테이너에 대 한 해결책을 드레인.</li>
		<li>선박 20 %Pip / DMF 용액 2 mL를 추가, 선박, 모자 및 모자를 12 분 제거에 대 한 실 온에서 교 반 및 폐기물 컨테이너 솔루션 드레인.</li>
		<li>DMF, 선박, 상한의 1 mL을 추가 하 여 수 지를 세척 하 고 배 교 반 1 분에 대 한 뚜껑 제거 및 드레인 솔루션 플런저를 밀어. 4 추가 시간에 대 한 DMF와 수 지를 세척.</li>
	</ol></li>
	<li>단량체 추가 및 N 맨끝 acetylation 참고: 두 개의 반응 단계, bromoacetylation 및 변위 각 단위체 추가 주기 포함 한다.<ol>
<li>양식 Nme-수 지를 첫 번째 단량체 추가 사이클을 실시 합니다.</li>
		<li>Bromoacetylation 반응을 수행 합니다. 0.8 M BMA/DMF 솔루션 및 1 mL 비 커에서 0.8 M DIC/DMF 솔루션의 1 mL를 혼합. 수 지를 포함 하는 반응 용기에 혼합물을 전송 하 고 그릇 뚜껑. 셰이 커에 배를 배치 및 모자를 20 분 제거에 대 한 실 온에서 교 반 및 폐기물 컨테이너에 대 한 해결책 드레인.</li>
		<li>DMF의 1 mL을 추가, 상한 그릇, 1 분 동안 교 반 및 플런저를 밀어 솔루션을 배출 하 여 수 지를 세척. DCM의 1 mL를 추가 하 고, 1 분, 배 교 반 솔루션을 배출 하 여 수 지를 세척. 한번 더, DCM와 수 지를 세척 하 고 두 번 DMF로 씻어.</li>
		<li>변위 반응을 수행 합니다. 추가 1.0 M Nme/DMF 용액 1 mL, 그릇 뚜껑, 선동 60 분 제거에 대 한 실 온에서 용기 뚜껑 하 고 플런저를 밀어 솔루션을 배수.</li>
		<li>1 mL DMF 추가 하 고 1 분 동안 배를 교 반 하 고, 플런저를 밀어 솔루션을 배출 하 여 수 지를 세척. 1 ml DCM, 1 분 동안 agitating 그리고 솔루션을 배출 하 여 수 지를 세척. DCM 한번 더, DMF 두 번 세척 뒤 씻는 다.</li>
		<li>1.3.2에 1.3.5 Nae-(Npe-Nme)4를 단계에서 단위체 추가 사이클을 반복-수 지. 변위 반응 (1.3.4)의 단계를 반복 하는 경우 peptoid 순서에 따라 특정 아민 솔루션을 사용 합니다. 참고: peptoid 체인은 늘어난다 C-말단에서 N-말단에 수 지에 바인딩된 C 맨끝 잔류물 함께.</li>
		<li>N 맨끝 acetylation Ac-Nae-(Npe-Nme)4를 수행-수 지.</li>
		<li>믹스 92 µ L의 아세트산 무수 물, N, N-diisopropylethylamine (DIPEA), 그리고 2 mL 비 커에 DMF의 acetylation의 약 2 mL 칵테일의 43.5 µ L.</li>
		<li>수 지를 포함 하는 선박 acetylation 칵테일의 2 개 mL를 추가 하 고 선박, 모자 60 분 뚜껑을 제거 하 고 플런저를 밀어 솔루션 드레인 실내 온도에 그것을 선동.</li>
		<li>DMF의 1 mL를 추가 하 고, 1 분, 배를 agitating 플런저를 밀어 솔루션을 배출 하 여 수 지를 세척. DCM의 1 mL를 추가 하 고, 1 분, 배 교 반 솔루션을 배출 하 여 수 지를 세척. 반복 세척 DCM과 수 지 한 번 더 다음 씻어 DMF 두 번 더.</li>
		<li>DCM의 1 mL를 추가 하 고, 1 분, 배를 agitating 플런저를 밀어 솔루션을 배출 하 여 수 지를 세척. DCM으로 세척 두 번 반복 합니다. 뚜껑을 제거 하 고 10 분 동안 반응 용기에 건조 하자 수 지.</li>
	</ol></li>
	<li>절단, 정화
	<ol>
<li>TFA, triisopropylsilane (팁)의 100 µ L 및 HPLC 급 H2O 비 커에 100 µ L 분열의 4 mL 칵테일의 3.8 mL를 혼합.</li>
		<li>4 mL의 갓 만든 분열 칵테일 수 지를 포함 하는 선박을 추가 하 고 선박, 모자 2 h에 대 한 실 온에서 교 반.</li>
		<li>뚜껑을 제거 하 고 50ml 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 관으로 filtrate 솔루션을 수집 합니다. 선박 TFA의 1 mL을 추가 하 고, 모자 1 분 같은 원심 분리기 튜브에 수집 filtrate 솔루션에 대 한 선동.</li>
		<li>약 1 mL 점성 솔루션은 남아 때까지 질소 가스의 흐름에 부드럽게 불어 TFA를 증발.</li>
		<li>나머지 솔루션 diethyl 에테르의 15 mL를 추가 하 고 원심 분리기 튜브 캡 하룻밤 2 h-20 ° C 냉동 고에서 품 어. 원유 peptoid 흰색 고체 침전 물.</li>
		<li>작은 10 분 제거에 대 한 4,427 x g에서 원심 분리기를 사용 하 여 고체 원심 분리기 튜브의 모자 하 고 가만히 따르다 diethyl 에테르 비 커에 신중 하 게 고체를 잃지 않고. 주의: Diethyl 에테르는 가연성 유기 용 매 이다. Diethyl 에테르 안전 원심 분리기를 사용 하십시오.</li>
		<li>세척 포함 하는 고체, 고체는 원심 분리기에 얼음 처럼 차가운 diethyl 에테르 10 mL을 추가 하 여 튜브 튜브, 상한 고는 원심 분리기에 넣습니다. 10 분 제거는 원심 분리기는 원심 분리기에서 튜브와 가만히 따르다 diethyl 에테르 비 커에 신중 하 게 고체를 잃지 않고 4,427 x g에서 원심 분리를 수행 합니다.</li>
		<li>부드럽게 부는 질소 가스의 흐름에 의해 고체를 건조.</li>
		<li>HPLC 급 H2O 말린된 고체 해산의 10 mL를 추가 합니다. 0.45 μ m의 기 공 크기와 나일론 주사기 필터를 통해 솔루션을 전달 하 고 미리가 중된 50 mL 폴 리 프로필 렌 원심 분리기 튜브에는 filtrate 수집.</li>
		<li>셸 배치 하 고 회전 하는 원심 분리기 튜브를 포함 하는 12 온스, 더블 스택 확장 된 폴리스 티 렌 컵 1/3에서에서 peptoid 솔루션 액체 질소로 가득 하 여 솔루션을 고정 합니다. 단단한 peptoid를 하룻밤 냉동된 솔루션을 lyophilize.</li>
		<li>단단한 peptoid HPLC 급 H2O의 10 mL에 용 해 하 여 동결은 한번 더 반복, 액체 질소에서 냉동 고 lyophilizing 하룻밤 껍질. 결과 peptoid 질량 분석에 의해 시퀀스 분석에 대 한 충분히 순수입니다.</li>
	</ol></li>
</ol>2. MS 측정 및 시퀀스 분석
참고: MS/MS 실험 분무 이온화 (ESI) 소스에 결합 한 트리플 4 극 자 질량 분석기에서 수행 됩니다. 데이터 수집 장비와 함께 데이터 수집 소프트웨어를 사용 하 여 제어 됩니다. 일반 절차 포함 1) 전체 스캔 질량 분석 실험을 수행 하 고 실험 2) 수행 CID MS/MS 질량 스펙트럼을 기록, 및 MS/MS 스펙트럼을 기록 하 고 3) 이론적으로 MS/MS 스펙트럼 데이터 비교 조각화 체계는 peptoid의 구조적 기능에 따라 예측.
<ol><li>샘플 솔루션의 준비
	<ol>
<li>3-5 mL 유리 유리병에 1.0-2.0 mg 단단한 peptoid 밖으로 무게. 해산 된 peptoid 이기와 물 (= / H2O, 1:1, v/v)의 1 mL를 혼합 용 매를 추가 합니다. 이 약 10-3 M의 농도와 재고 샘플 솔루션을 제공합니다.</li>
		<li>1.5 mL 원심 분리기 관으로 재고 솔루션의 20 µ L를 전송 하 고 = / h 조2O를 약 10-5 M의 희석된 샘플 솔루션의 1 mL를 혼합 용 매를 추가.</li>
		<li>Peptoid MS와 작업 솔루션으로 만들기 위해 튜브 3 분 전송 솔루션의 윗부분의 약 700 µ L 다른 1.5 mL 원심 분리기에 대 한 4,427 x g에서 원심 분리를 수행 하 여 희석된 샘플 솔루션에서 모든 가능한 불용 성 입자 제거 약 10-5 M의 농도.</li>
		<li>질량 분석 측정 중 관찰 된 신호 강도에 따라 MS 작업 솔루션의 농도 조정 합니다.</li>
		<li>0.20 μ m 주사기 필터를 통해 샘플 솔루션을 전달 하 고 솔루션을 만들고 MS peptoid 작업 약 10-5의 1.5 mL 원심 분리기 튜브에는 filtrate 수집 하는 것입니다 희석된 샘플 솔루션에서 모든 가능한 불용 성 입자를 제거 하는 다른 방법 M.</li>
	</ol></li>
	<li>질량 스펙트럼을 기록
	<ol>
<li>분무 이온화 (ESI) 소스를 통해 = / H2O (1:1, v/v)의 혼합된 용 매를 실행 하 고 표준 긍정적인 이온에 악기, 100-1500의 질량 대 전 비 (m/z) 범위 스캔 전체 질량 분석 모드를 설정 합니다. 참고: 전형적인 작동 매개 변수: ESI 바늘 전압, 5 kV 모 세관 전압, 40 V 건조 가스 (질소 가스) 온도, 200 ° c.</li>
		<li>500 µ L 또는 1 mL 주사기로 peptoid MS 작업 솔루션 (약 10-5 M)의 약 300 µ L을 추가 하 고 모 세관 폴 리 에테르 에테르 케 톤 (PEEK) 튜브를 사용 하 여 ESI 입구에 주사기를 연결. 주사기 펌프에 주사기를 놓고에서 ESI에 샘플 솔루션에 10 µ L/min 흐름 속도 설정 합니다.</li>
		<li>켜고 ESI 과정을 활성화 ESI 바늘 전압 검출기를 켭니다. 프로필 모드와 100-1500의 m/z 범위에 표시를 설정 합니다. 프로 파일 창에 표시 된 질량 스펙트럼 프로필 보기 M/z 1265 (1,264.6의 m/z로 표시)에서 피크 peptoid 이온 또는 protonated peptoid에 해당 합니다.</li>
		<li>2 분 동안 MS 스펙트럼을 기록 합니다. "방법 창"에서 "실행된 시간입니다."로 2 분 사용 기록 창을 열고 적절 한 파일 이름을 입력 하 고 스펙트럼을 기록 하기 시작. 참고: 결과 질량 스펙트럼은 그림 3에 표시 됩니다.</li>
		<li>1265의 m/z에서 피크의 강도 최적화 합니다. 1150-1350 m/z 범위 설정 하 고 프로 파일 창에 표시 하는 mV에 피크 강도 보면서 모 세관 전압을 조정 합니다. 예를 들어 50 V 모 세관 전압 증가 또는 높은 피크 강도의 변화를 볼. 최적의 피크 강도 150-200 mV. 참고:은 크게 특정 이온의 풍부로 변경할 수 있습니다 모 세관 전압 조정. 모 세관 전압을 증가 peptoid 이온의 강도 향상 시킬 수 있습니다. 그러나, 모 세관 고전압 수 있습니다 또한 이온 소스에 peptoid 이온의 분리를 유발 하 고 관찰 된 강도 감소. 1265, m/z에서 피크의 강도 향상 시킬 수 있습니다 건조 가스의 온도 조정 하지만 모 세관 전압을 조정 하는 것 보다 덜 효과적 이다. M/z 1265에서 피크 최적의 강도 도달 하지 않습니다, 경우 샘플 농도 (또는 MS 작업 솔루션의 농도 두 번 하는 등)를 조정 합니다.</li>
		<li>악기 MS/MS 모드로 전환 합니다. M/z 1265에 선구자 이온을 설정 하 고 MS/MS 질량 범위에서 100-1, 400의 m/z. "방법 창"에서 "1 분기 첫 미사"로 m/z 1265를 사용 하 고 "1 분기 마지막 질량"을 비워 둡니다. "3 분기 첫 미사"와 m/z 1400 m/z 100을 사용 하 여 "3 분기 마지막 미사"로 참고: MS/MS 모드, 선구자 이온으로 peptoid 이온을 분리 하는 질량 필터 첫번째 4 중 극 단위 (1 분기) 기능에에서 두번째 4 중 극 단위 (2 분기)는 충돌 세포, 그리고 세 번째 4 중 극 (Q3) 단위 기능 질량 분석기입니다.</li>
		<li>세트 40 eV에서 충돌 에너지와 충돌 가스 (아르곤,이 경우에서) 1.5 mTorr에서 압력.</li>
		<li>프로 파일 창에 표시 되는 질량 스펙트럼 프로필 보기 1265의 m/z에서 피크 peptoid 이온에 해당 하며 m/z 값 봉우리 peptoid 이온에서 파편을 나타냅니다.</li>
		<li>조각화 스펙트럼의 디스플레이 최적화 하려면 충돌 에너지를 조정 합니다. 예를 들어 45 eV에 충돌 에너지를 증가 하 고 스펙트럼 프로 파일의 변화를 볼. 참고: 일반적으로, 충돌 에너지를 증가 것입니다 강화 조각 이온의 풍부 하 고 peptoid 이온의 풍부를 감소. 충돌 가스 압력 또한 조각 이온의 풍부를 강화할 것 이다. 주의: 2 mTorr 넘어 충돌 가스 압력을 증가 하지 않습니다.</li>
		<li>2 분 동안 MS/MS 스펙트럼을 기록 합니다. "방법 창"에서 "실행된 시간입니다."로 2 분 사용 기록 창을 열고 적절 한 파일 이름을 입력 하 고 스펙트럼을 기록 하기 시작.</li>
		<li>1-2 회 녹화를 반복 합니다.</li>
	</ol></li>
	<li>Peptoid 시퀀스 분석 참고: CID 조건 peptoid 이온 것 조각 라는 B-이온, N 맨끝 파편의 일련과 Y 이온 라는 C 터미널 조각의 시리즈 생산 peptoid 등뼈를 따라 아 미드 유대에서<ol>
<li>왼쪽 및 오른쪽 면에 C-말단에 N-말단을 배치 하 여 acetylated peptoid의 화학 구조 그리고 그림 2a와 같이 조각화 구조를 생성 하기 위해 각 아 미드 유대에 파선을 그립니다. 양성자는 전 하 운반자를 나타내기 위해 점선 동그라미를 그립니다. 구조의 왼쪽에서 starting, B1, B2, B8N 맨끝 파편을 나타내는 파선에 레이블을 배치 합니다. 오른쪽에서 starting Y1, Y2Y8C 터미널 조각을 나타내는 파선에 레이블을 배치 합니다. 참고: 화학 드로잉 소프트웨어는 peptoid 구조를 그리는 데 활용할 수 있습니다.</li>
		<li>왼쪽에서 4번째 아 미드 유대에 조각화를 상상 하 고 N 맨끝 파편의 그림 2b에서 같이 적절 한 공식적인 유료 C 터미널 조각 구조를 그립니다. N 맨끝 파편에 B4 의 라벨을 놓고 C 터미널 조각에 Y5 의 레이블을 배치 합니다. 580의 값을 산출 하는 구조에 있는 요소의 명목상 대 중을 요약 하 여 B4 의 m/z 값을 계산 하 고 N 맨끝 파편에 m/z 580을 놓습니다. Y5 의 m/z 값을 계산 하 고 C 터미널 조각에 m/z 685 장소.</li>
		<li>모든 8 개의 B 이온 및 모든 8 Y 이온, m/z 값을 계산 하 고 표 1과 같이 테이블에서 그들을 조립. 참고: 파편의 m/z 값 계산할 수 있습니다 소프트웨어를 그리기 화학 물질을 사용 하 여.</li>
		<li>악기와 함께 데이터 검토 소프트웨어를 사용 하 여 peptoid의 기록 된 MS/MS 스펙트럼을 엽니다. 3% "이온 레이블 표시"를 라벨 환경 설정 및 레이블 임계값을 설정 합니다. 이 봉우리에 표시 하는 m/z 값으로 MS/MS 스펙트럼을 생성 합니다.</li>
		<li>MS/MS에서 CSV 텍스트 파일로 스펙트럼 데이터 형식과 데이터 처리 소프트웨어를 사용 하 여 스펙트럼을 재구성을 내보냅니다. 봉우리에 m/z 값을 배치 합니다. 결과 MS/MS 스펙트럼은 그림 4에 표시 됩니다. 참고: 일부 질량 분석기는 갖추고 데이터 처리 소프트웨어 MS/MS 스펙트럼을 생성. 이 경우에, MS/MS 스펙트럼 데이터를 내보낼 필요는 없습니다.</li>
		<li>해당 B-및 Y-이온을 식별 하기 위해 표 1 에 표시 된 것 MS/MS 스펙트럼에는 m/z 값을 할당 합니다. M/z 580에서 피크 B4로 식별 되는 예를 들어-이온 및 685 m/z는 Y5식별-이온. 그림 4와 같이 해당 B와 Y 기호는 스펙트럼에 봉우리를 레이블을 지정 합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
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K., Kodadek, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Submonomer+Synthesis+of+A+Hybrid+Peptoid-Azapeptoid+Library.">Submonomer Synthesis of A Hybrid Peptoid-Azapeptoid Library.</a> ACS Comb Sci. 14 (10), 558-564 (2012).</li><li>Li, X., Guo, L., Casiano-Maldonado, M., Zhang, D., Wesdemiotis, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Top-Down+Multidimensional+Mass+Spectrometry+Methods+for+Synthetic+Polymer+Analysis.">Top-Down Multidimensional Mass Spectrometry Methods for Synthetic Polymer Analysis.</a> Macromolecules. 44 (12), 4555-4564 (2011).</li><li>Figliozzi, G. M., Goldsmith, R., Ng, S. C., Banville, S. C., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthesis+of+N-substituted+glycine+peptoid+libraries.">Synthesis of N-substituted glycine peptoid libraries.</a> Methods Enzymol. 267, 437-447 (1996).</li><li>Zuckermann, R. N., Kerr, J. M., Kent, S. B. H., Moos, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+method+for+the+preparation+of+peptoids+[oligo(N-substituted+glycines)]+by+submonomer+solid-phase+synthesis.">Efficient method for the preparation of peptoids [oligo(N-substituted glycines)] by submonomer solid-phase synthesis.</a> J. Am. Chem. Soc. 114 (26), 10646-10647 (1992).</li><li>Utku, Y., Rohatgi, A., Yoo, B., Kirshenbaum, K., Zuckermann, R. N., Pohl, N. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Multistep+Synthesis+of+a+Bioactive+Peptidomimetic+Oligomer+for+the+Undergraduate+Laboratory.">Rapid Multistep Synthesis of a Bioactive Peptidomimetic Oligomer for the Undergraduate Laboratory.</a> J. Chem. Educ. 87 (6), 637-639 (2010).</li><li>Tran, H., Gael, S. L., Connolly, M. D., Zuckermann, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Solid-phase+submonomer+synthesis+of+peptoid+Polymers+and+their+self-assembly+into+highly-ordered+nanosheets.">Solid-phase submonomer synthesis of peptoid Polymers and their self-assembly into highly-ordered nanosheets.</a> J. Visualized Exp. (57), e3373 (2011).</li><li>Bolt, H. L., Cobb, S. L., Denny, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Efficient+Method+for+the+Synthesis+of+Peptoids+with+Mixed+Lysine-type/Arginine-type+Monomers+and+Evaluation+of+Their+Anti-leishmanial+Activity.">An Efficient Method for the Synthesis of Peptoids with Mixed Lysine-type/Arginine-type Monomers and Evaluation of Their Anti-leishmanial Activity.</a> J Vis Exp. (117), (2016).</li><li>Morishetti, K. K., Russell, S. C., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tandem+mass+spectrometry+studies+of+protonated+and+alkali+metalated+peptoids:+Enhanced+sequence+coverage+by+metal+cation+addition.">Tandem mass spectrometry studies of protonated and alkali metalated peptoids: Enhanced sequence coverage by metal cation addition.</a> Int. J. Mass Spectrom. 308 (1), 98-108 (2011).</li><li>Bogdanov, B., Zhao, X., Robinson, D. B., Ren, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+Capture+Dissociation+Studies+of+the+Fragmentation+Patterns+of+Doubly+Protonated+and+Mixed+Protonated-Sodiated+Peptoids.">Electron Capture Dissociation Studies of the Fragmentation Patterns of Doubly Protonated and Mixed Protonated-Sodiated Peptoids.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 25 (7), 1202-1216 (2014).</li><li>Ren, J., Tian, Y., Hossain, E., Connolly, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fragmentation+Patterns+and+Mechanisms+of+Singly+and+Doubly+Protonated+Peptoids+Studied+by+Collision+Induced+Dissociation.">Fragmentation Patterns and Mechanisms of Singly and Doubly Protonated Peptoids Studied by Collision Induced Dissociation.</a> J. Am. Soc. Mass Spectrom. 27 (4), 646-661 (2016).</li></ol>

저자는 공개 없다.

Nonamer peptoid, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, 제시 하는 프로토콜을 사용 하 여 합성 되어 있다. 합성 장치는 주사기 모양의 폴 리 프로필 렌 고체 상 반응 배 및 기계 통 포함 됩니다. 반응 선박 상업적으로 사용할 수 있으며 저렴 한 비용. 기계적인 통은 화학 실험실에서 일반적인 기구 이다. 주사기 같은 반응 배를 사용 하 여, 솔루션으로 그려진 고 플런저를 수동으로 이동 하 여 배를 밀어. 이 ?...

Peptoids는 펩 티 드의 구조를 흉내 낸 등뼈 구조와 시퀀스 제어 고분자의 클래스. Peptoids 수 수 합성 다양 한 아민에서 높은 가변 속성1,2전시 peptoids를 가능 하 게. Peptoids 생물 연구, 치료 대리인으로 간주 하 고 ligands 단백질3,4,,56으로 설계에 대 한 분자 모형으로 사용 되었습니다. Peptoids 다양 한 생물학적 활성 화합물, 안티 파울 링 및 항 체 모방 재료, 항균 성 대리인 및 효소 억제제7,,89등으로 개발 되었습니다. 매우 정렬 하 고 조정할 수 있는 자연과 peptoids 분자 정보 저장10의 유형으로의 생각 또한 있다. 이러한 다양 한 응용 프로그램의 시퀀스를 특성화 하기 위해 효율적인 분석 방법의 개발 및 peptoids의 구조에 대 한 호출 합니다. 탠덤 질량 분석 기반 기술을 포함 peptoids11,12,13, 시퀀스 제어 고분자의 시퀀스 속성을 분석 하기 위한 방법의 선택으로 약속으로 나타났습니다. , 1415. 그러나, peptoid 이온 조각화 패턴에서 결과 상호 연결 하는 체계적인 연구 질량 분석 연구 및 peptoids의 구조적 정보는 매우 제한 된.
Peptoids은 단단한 단계 메서드를 사용 하 여 쉽게 합성 수 있습니다. 잘 개발 된 방법은 2 단계 단위체 또한 사이클16,17의 반복을 포함 한다. 각 추가 주기에서 수 지 바인딩된 아민 haloacetic 산 (일반적으로 bromoacetic 산, BMA)에 의해 acetylated 그리고 이것은 1 차 아민으로 변위 반응 옵니다. Peptoids는 표준 화학 실험실16,,1819, 에서 우수한 수익률 수동으로 합성 수 자동된 합성 프로토콜 peptoid 합성에 정기적으로 적용 된, 있지만 20.
우리의 실험실 수동 peptoid 합성의 방법을 채택 있으며 기존의 방법에서 사용 하는 기구를 간소화 합니다. 우리는 이전 MS/MS 기술을21,,2223을 사용 하 여 peptoids의 일련의 분열 패턴을 공부 했다. 우리의 결과 peptoids 생산 특성 fragmentations 그들은 충돌 유도 된 분리 (CID)21,23 하 대상이 됩니다 또는 전자 붙 잡음 분리 (ECD)22 실험 할 때 표시 됩니다. 이 문서에서는, 어떻게 올리고 peptoids 표준 화학 실험실에서 종합 될 수, 트리플-사중 극 자 질량 분석기를 사용 하 여 CID 실험을 수행 하는 방법 및 스펙트럼 데이터를 분석 하는 방법을 보여 줍니다. 합성 하 여 특징 peptoid는 N 맨끝 acetylation와 C 터미널 amidation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2nonamer. peptoid의 구조는 그림 1에 표시 됩니다.

<table><tbody><tr><td>ESI-triple quadrupole mass spectrometer, Varian 320L</td><td>Agilent Technologies Inc.</td><td></td><td>The mass spectrometer was acquired from Varian, Inc.</td></tr><tr><td>Varian MS workstation, Version 6.9.2, a data acquisition and data review software</td><td>Varian Inc.</td><td></td><td>The software is a part of the Varian 320L package</td></tr><tr><td>Burrell Scientific Wrist-action shaker, Model 75 DD</td><td>Fisher Scientific International Inc.</td><td>14-400-126</td><td></td></tr><tr><td>Hermle Centrifuge, Model Z 206 A</td><td>Hermle Labortechnik GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solid phase reaction vessel, 10 mL</td><td>Torviq</td><td>SF-1000</td><td></td></tr><tr><td>Pressure caps for reaction vessels</td><td>Torviq</td><td>PC-SF</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters, pore size 0.2 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3B</td><td></td></tr><tr><td>Syringe filters, pore size 0.45 &amp;mu;m</td><td>Fisher Scientific Inc.</td><td>03-391-3A</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene centrifuge tuges, 50 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-626</td><td></td></tr><tr><td>Polypropylene centrifuge tuges, 15 mL</td><td>VWR International, LLC.</td><td>490001-620</td><td></td></tr><tr><td>ChemBioDraw, Ultra, Version 12.0</td><td>CambridgeSoft Corporation</td><td></td><td>CambridgeSoft is now part of PerkinElmer Inc.</td></tr><tr><td>Styrofoam cup, 12 Oz</td><td>Common Supermarket</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Rink amide resin</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>10619</td><td></td></tr><tr><td>Piperidine</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>02351</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>N, N&amp;rsquo;-diisopropylcarbodiimide</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00110</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>Bromoacetic acid</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>26843</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>2-Phenylethylamine</td><td>VWR International, LLC.</td><td>EM8.07334.0250</td><td></td></tr><tr><td>2-Methyoxyethylamine</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>241067</td><td></td></tr><tr><td>N-Boc-ethylenediamine</td><td>VWR International, LLC.</td><td>AAAL19947-06</td><td></td></tr><tr><td>Acetic anhydride</td><td>Sigma-Aldrich Co. LLC.</td><td>252845</td><td></td></tr><tr><td>N, N-dimethylformamide</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1117-4LG</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>N, N-diisopropylethylamine</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00141</td><td></td></tr><tr><td>Triisopropylsilane</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>01966</td><td></td></tr><tr><td>Trifluoroacetic acid</td><td>Chem-Impex International, Inc.</td><td>00289</td><td>Highly toxic</td></tr><tr><td>Millipore MILLI-Q Academic Water Purification System</td><td>Millipore Corporation</td><td>ZMQP60001</td><td>For generating HPLC grade water</td></tr><tr><td>HPLC-grade Water</td><td></td><td></td><td>Produced from Millipore MILLI-Q&amp;reg; Academic Water Purification System</td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Pharmco-Aaper</td><td>339USP/NF</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Fisher Scientific International, Inc.</td><td>A998-4</td><td>HPLC grade</td></tr><tr><td>Diethyl ether</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1121-19L</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>Dichloromethane</td><td>VWR International, LLC.</td><td>BDH1113-19L</td><td>Further distillation before use</td></tr><tr><td>Nitrogen gas</td><td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td><td>NIT 50-C-F</td><td>Ultra high purity, 99.9995%</td></tr><tr><td>Argon gas</td><td>Fresno Oxygen/Barnes Supply</td><td>ARG 50-C-F</td><td>Ultra high purity, 99.9995%</td></tr></tbody></table>

synthesis and mass spectrometry analysis of oligo-peptoids

Peptoids N-alkylated 글리신 단위의 구성 된 시퀀스 제어 펩 티 드를 흉내 낸 올리고 있습니다. 많은 잠재적인 응용 프로그램, peptoids 분자 정보 스토리지의 유형으로의 생각 되었다. 질량 분석 분석 시퀀싱 peptoids에 대 한 선택의 방법을 고려 하고있다. Peptoids 반복 2 단계 반응 사이클을 사용 하 여 단단한 단계 화학을 통해 합성 될 수 있다. 여기 우리는 수동으로 올리고 peptoids을 합성 하 고 탠덤 질량 분석 (MS/MS) 기술을 사용 하 여 peptoids의 시퀀스를 분석 하는 방법을 제시. 샘플 peptoid nonamer는 N-(2-aminoethyl) 글리신 (내) N-말단에 뿐만 아니라 N-(2-methyloxyethyl) 글리신 (Nme) 및 N-(2-phenylethyl) 글리신 (Npe), 교류의 구성 이다. peptoid의 시퀀스 수식이입니다 Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2, Ac는 아 세 틸 그룹. 합성은 상업적으로 사용할 수 있는 고체 상 반응 용기에 일어난다. 링크 아 미드 수 지는 C-말단에 아 미드 그룹 peptoid를 고체 지원으로 사용 됩니다. 결과 peptoid 제품 분무 이온화 소스에 결합 된 트리플-사중 극 자 질량 분석기를 사용 하 여 시퀀스 분석을 복종 된다. MS/MS 측정 된 peptoid의 분리에서 유래 파편 이온의 스펙트럼을 생성 합니다. 조각 이온 들의 질량 대 전 비 (m/z)의 값에 따라 밖으로 정렬 됩니다. 조각 이온의 m/z 값 peptoid 조각화의 계획에 따라 이론적으로 예측 된 조각 이온의 명목상 대 중에 대 한 비교 됩니다. 분석 된 peptoid의 조각화 패턴을 생성합니다. 조각화 패턴 중립 peptoid의 단위체 시퀀스에 상관 된다. 이와 관련, MS 분석은 peptoids의 시퀀스 정보를 읽습니다.

N 맨끝 acetylation, Ac-Nae-(Npe-Nme)4-NH2와 9-메 르 peptoid의 구조는 그림 1에 표시 됩니다. peptoid 단단한 단계 접근 방식을 통해 fritted 폴 리 프로필 렌 반응 용기에 수동으로 합성 했다. 링크 아 미드 수 지 (0.047 mmol, 로드 0.56 mmol/g 84 mg) amidated C terminus와 peptoid를 고체 지원으로 사용 됩니다. Peptoid 체인의 단위체 또한 여러 사이클에 의해 만들어?...

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Synthesis and Mass Spectrometry Analysis of Oligo-peptoids

합성 및 올리고 peptoids의 질량 분석 분석

프로토콜은 질량 분석에 의해 올리고 peptoids 시퀀스 분석 다음의 수동 합성에 설명 되어 있습니다.

Peptoids are sequence-controlled peptide-mimicking oligomers consisting of N-alkylated glycine units. Among many potential applications, peptoids have ...

synthesis-and-mass-spectrometry-analysis-of-oligo-peptoids

Research

JoVE Journal

Chemistry

10.6K 조회수.  University of the Pacific. 프로토콜은 질량 분석에 의해 올리고 peptoids 시퀀스 분석 다음의 수동 합성에 설명 되어 있습니다.

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Mass Spectrometric Approaches to Study Protein Structure and Interactions in Lyophilized Powders

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for characterizing lyophilized formulations of protein therapeutics. Labeling followed by suitable proteolytic digestion allows the protein structure and interactions to be mapped with peptide-level resolution. Since the protein structural elements are stabilized by a network of chemical bonds from the main-chains and side-chains of amino acids, specific labeling of atoms in the amino acid residues provides insight into the structure and conformation of the protein. In contrast to routine methods used to study proteins in lyophilized solids (e.g., FTIR), ssHDX-MS and ssPL-MS provide quantitative and site-specific information. The extent of deuterium incorporation and kinetic parameters can be related to rapidly and slowly exchanging amide pools (Nfast, Nslow) and directly reflects the degree of protein folding and structure in lyophilized formulations. Stable photolytic labeling does not undergo back-exchange, an advantage over ssHDX-MS. Here, we provide detailed protocols for both ssHDX-MS and ssPL-MS, using myoglobin (Mb) as a model protein in lyophilized formulations containing either trehalose or sorbitol.

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

질량 분석은 동결 건조 분말에서 단백질의 구조와 상호 작용을 연구하는 접근

Amide hydrogen/deuterium exchange (ssHDX-MS) and side-chain photolytic labeling (ssPL-MS) followed by mass spectrometric analysis can be valuable for ...

연구

화학

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical (Methylation) and Physical (Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance) Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans. De-starched wheat endosperm cell walls were isolated as an alcohol-insoluble residue (AIR)1 and sequentially extracted with water (W-sol Fr) and 1 M KOH containing 1% NaBH4 (KOH-sol Fr) as described by Ratnayake et al. (2014)2. Two different approaches (see summary in Figure 1) are adopted. In the first, intact W-sol AXs are treated with 2AB to tag the original RE backbone chain sugar residue and then treated with an endoxylanase to generate a mixture of 2AB-labelled RE and internal region reducing oligosaccharides, respectively. In a second approach, the KOH-sol Fr is hydrolyzed with endoxylanase to first generate a mixture of oligosaccharides which are subsequently labelled with 2AB. The enzymically released ((un)tagged) oligosaccharides from both W- and KOH-sol Frs are then methylated and the detailed structural analysis of both the native and methylated oligosaccharides is performed using a combination of MALDI-TOF-MS, RP-HPLC-ESI-QTOF-MS and ESI-MSn. Endoxylanase digested KOH-sol AXs are also characterized by nuclear magnetic resonance (NMR) that also provides information on the anomeric configuration. These techniques can be applied to other classes of polysaccharides using the appropriate endo-hydrolases.

Sequencing of Plant Wall Heteroxylans Using Enzymic, Chemical Methylation and Physical Mass Spectrometry, Nuclear Magnetic Resonance Techniques

This protocol describes the specific techniques used for the structural characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of heteroxylans by tagging the RE with 2 aminobenzamide prior to enzymatic (endoxylanase) hydrolysis and then analysis of the resultant oligosaccharides using mass spectrometry (MS) and nuclear magnetic resonance (NMR).

This protocol describes the specific techniques used for the characterization of reducing end (RE) and internal region glycosyl sequence(s) of ...

Detection of Protein Ubiquitination Sites by Peptide Enrichment and Mass Spectrometry

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ubiquitinated proteins, peptides with a diglycine remnant conjugated to the epsilon amino group of lysine (&#39;K-&#949;-diglycine&#39; or simply &#39;diGly&#39;) can be used to track back the original modification site. Efficient immunopurification of diGly peptides combined with sensitive detection by mass spectrometry has resulted in a huge increase in the number of ubiquitination sites identified up to date. We have made several improvements to this workflow, including offline high pH reverse-phase fractionation of peptides prior to the enrichment procedure, and the inclusion of more advanced peptide fragmentation settings in the ion routing multipole. Also, more efficient cleanup of the sample using a filter-based plug in order to retain the antibody beads results in a greater specificity for diGly peptides. These improvements result in the routine detection of more than 23,000 diGly peptides from human cervical cancer cells (HeLa) cell lysates upon proteasome inhibition in the cell. We show the efficacy of this strategy for in-depth analysis of the ubiquitinome profiles of several different cell types and of in vivo samples, such as brain tissue. This study presents an original addition to the toolbox for protein ubiquitination analysis to uncover the deep cellular ubiquitinome.

We present a method for the purification, detection, and identification of diGly peptides that originate from ubiquitinated proteins from complex biological samples. The presented method is reproducible, robust, and outperforms published methods with respect to the level of depth of the ubiquitinome analysis.

펩타이드 농축 및 질량 분광법에 의한 단백질 유비퀴틴화 부위 검출

The posttranslational modification of proteins by the small protein ubiquitin is involved in many cellular events. After tryptic digestion of ...

생화학

Synthesis and Structure Determination of &#181;-Conotoxin PIIIA Isomers with Different Disulfide Connectivities

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus highly important to avoid undesired disulfide bond formation during peptide synthesis, because it may result in a completely different peptide structure, and consequently altered bioactivity. However, the correct formation of multiple disulfide bonds in a peptide is difficult to obtain by using standard self-folding methods such as conventional buffer oxidation protocols, because several disulfide connectivities can be formed. This protocol represents an advanced strategy required for the targeted synthesis of multiple disulfide-bridged peptides which cannot be synthesized via buffer oxidation in high quality and quantity. The study demonstrates the application of a distinct protecting group strategy for the synthesis of all possible 3-disulfide-bonded peptide isomers of &#181;-conotoxin PIIIA in a targeted way. The peptides are prepared by Fmoc-based solid phase peptide synthesis using a protecting group strategy for defined disulfide bond formation. The respective pairs of cysteines are protected with trityl (Trt), acetamidomethyl (Acm), and tert-butyl (tBu) protecting groups to make sure that during every oxidation step only the required cysteines are deprotected and linked. In addition to the targeted synthesis, a combination of several analytical methods is used to clarify the correct folding and generation of the desired peptide structures. The comparison of the different 3-disulfide-bonded isomers indicates the importance of accurate determination and knowledge of the disulfide connectivity for the calculation of the three-dimensional structure and for interpretation of the biological activity of the peptide isomers. The analytical characterization includes the exact disulfide bond elucidation via tandem mass spectrometry (MS/MS) analysis which is performed with partially reduced and alkylated derivatives of the intact peptide isomer produced by an adapted protocol. Furthermore, the peptide structures are determined using 2D nuclear magnetic resonance (NMR) experiments and the knowledge obtained from MS/MS analysis.

Cysteine-rich peptides fold into distinct three-dimensional structures depending on their disulfide connectivity. Targeted synthesis of individual disulfide isomers is required when buffer oxidation does not lead to the desired disulfide connectivity. The protocol deals with the selective synthesis of 3-disulfide-bonded peptides and their structural analysis using NMR and MS/MS studies.

합성 및 다른 아 황산 연결 된 μ-Conotoxin PIIIA이 성체의 구조 결정

Peptides with a high number of cysteines are usually influenced regarding the three-dimensional structure by their disulfide connectivity. It is thus ...

Semi-Quantitative Analysis of Peptidoglycan by Liquid Chromatography Mass Spectrometry and Bioinformatics

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan structure are fairly conserved across all bacteria, there is also considerable variation between Gram-positives/negatives and between species. In addition, there are numerous known variations, modifications, or adaptations to the peptidoglycan that can occur within a bacterial species in response to growth phase and/or environmental stimuli. These variations produce a highly dynamic structure that is known to participate in many cellular functions, including growth/division, antibiotic resistance, and host defense avoidance. To understand the variation within peptidoglycan, the overall structure must be broken down into its constitutive parts (known as muropeptides) and assessed for overall cellular composition. Peptidoglycomics uses advanced mass spectrometry combined with high-powered bioinformatic data analysis to examine peptidoglycan composition in fine detail. The following protocol describes the purification of peptidoglycan from bacterial cultures, the acquisition of muropeptide intensity data through a liquid chromatograph&#8212;mass spectrometer, and the differential analysis of peptidoglycan composition using bioinformatics.

This protocol covers a detailed analysis of peptidoglycan composition using liquid chromatography mass spectrometry coupled with advanced feature extraction and bioinformatic analysis software.

액체 크로마토그래피, 질량 분석법 및 생물정보학에 의한 펩티도글리칸의 반정량 분석

Peptidoglycan is an important component of bacterial cell walls and a common cellular target for antimicrobials. Although aspects of peptidoglycan ...

Synthesis of Information-bearing Peptoids and their Sequence-directed Dynamic Covalent Self-assembly

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded oligomeric strands mediated by paired dynamic covalent interactions in a manner mimicking the thermal cycling commonly employed for the self-assembly of complementary nucleic acid sequences. Primary amine monomers bearing aldehyde and amine pendant moieties are functionalized with orthogonal protecting groups for use as dynamic covalent reactant pairs. Using a modified automated peptide synthesizer, the primary amine monomers are encoded into oligo(peptoid) strands through solid-phase submonomer synthesis. Upon purification by high-performance liquid chromatography (HPLC) and characterization by electrospray ionization mass spectrometry (ESI-MS), sequence-specific oligomers are subjected to high-loading of a Lewis acidic rare-earth metal triflate which both deprotects the aldehyde moieties and affects the reactant pair equilibrium such that strands completely dissociate. Subsequently, a fraction of the Lewis acid is extracted, enabling annealing of complementary sequence-specific strands to form information-encoded molecular ladders characterized by matrix assisted laser desorption/ionization mass spectrometry (MALDI-MS). The simple procedure outlined in this report circumvents kinetic traps commonly experienced in the field of dynamic covalent assembly and serves as a platform for the future design of robust, complex architectures.

A protocol is presented for the synthesis of information-encoded peptoid oligomers and for the sequence-directed self-assembly of these peptoids into molecular ladders using amines and aldehydes as dynamic covalent reactant pairs and Lewis acidic rare-earth metal triflates as multi-role reagents.

정보 베어링 펩토이드의 합성과 시퀀스 지향 동적 공유자 자체 조립

This protocol presents the use of Lewis acidic multi-role reagents to circumvent kinetic trapping observed during the self-assembly of information-encoded ...

Sample Preparation and Relative Quantitation using Reductive Methylation of Amines for Peptidomics Studies

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the peptide biomarkers of disease or environmental stress, identifying neuropeptides, hormones, and bioactive intracellular peptides, discovering antimicrobial and nutraceutical peptides from protein hydrolysates, and can be used in studies to understand the proteolytic processes. The recent advance in sample preparation, separation methods, mass spectrometry techniques, and computational tools related to protein sequencing has contributed to the increase of the identified peptides number and peptidomes characterized. Peptidomic studies frequently analyze peptides that are naturally generated in cells. Here, a sample preparation protocol based on heat-inactivation is described, which eliminates protease activity, and extraction with mild conditions, so there is no peptide bonds cleavage. In addition, the relative quantitation of peptides using stable isotope labeling by reductive methylation of amines is also shown. This labeling method has some advantages as the reagents are commercially available, inexpensive compared to others, chemically stable, and allows the analysis of up to five samples in a single LC-MS run.

This article describes a sample preparation method based on heat-inactivation to preserve endogenous peptides avoiding degradation post-mortem, followed by relative quantitation using isotopic labeling plus LC-MS.

펩티도믹스 연구를 위한 아민의 환원 메틸화를 이용한 샘플 준비 및 상대적 수량

Peptidomics can be defined as the qualitative and quantitative analysis of peptides in a biological sample. Its main applications include identifying the ...

Mass-Sensitive Particle Tracking to Characterize Membrane-Associated Macromolecule Dynamics

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take place, are inherently difficult to assess with standard biophysical methods. The introduction of mass-sensitive particle tracking (MSPT) constitutes an important step toward a thorough quantitative characterization of such processes. Technically, this was made possible through the advent of interferometric scattering microscopy (iSCAT)-based mass photometry (MP). When the background removal strategy is optimized to reveal the two-dimensional motion of membrane-associated particles, this technique allows the real-time analysis of both diffusion and molecular mass of unlabeled macromolecules on biological membranes. Here, a detailed protocol to perform and analyze mass-sensitive particle tracking of membrane-associated systems is described. Measurements performed on a commercial mass photometer achieve time resolution in the millisecond regime and, depending on the MP system, a mass detection limit down to 50 kDa. To showcase the potential of MSPT for the in-depth analysis of membrane-catalyzed macromolecule dynamics in general, results obtained for exemplary protein systems such as the native membrane interactor annexin V are presented.

This protocol describes an iSCAT-based image processing and single-particle tracking approach that enables the simultaneous investigation of the molecular mass and the diffusive behavior of macromolecules interacting with lipid membranes. Step-by-step instructions for sample preparation, mass-to-contrast conversion, movie acquisition, and post-processing are provided alongside directions to prevent potential pitfalls.

막과 관련된 거대분자 역학을 특성화하기 위한 질량 민감성 입자 추적

Short-lived or transient interactions of macromolecules at and with lipid membranes, an interface where a multitude of essential biological reactions take ...

OLIgo Mass Profiling (OLIMP) of Extracellular Polysaccharides

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is that they contain complex sugar moieties in form of glycoproteins, proteoglycans, and/or polysaccharides. Examples include the extracellular matrix of humans and animal cells consisting mainly of fibrillar proteins and proteoglycans or the polysaccharide based cell walls of plants and fungi, and the proteoglycan/glycolipid based cell walls of bacteria. All these glycostructures play vital roles in cell-to-cell and cell-to-environment communication and signalling.
An extraordinary complex example of an extracellular matrix is present in the walls of higher plant cells. Their wall is made almost entirely of sugars, up to 75% dry weight, and consists of the most abundant biopolymers present on this planet. Therefore, research is conducted how to utilize these materials best as a carbon-neutral renewable resource to replace petrochemicals derived from fossil fuel. The main challenge for fuel conversion remains the recalcitrance of walls to enzymatic or chemical degradation due to the unique glycostructures present in this unique biocomposite.
Here, we present a method for the rapid and sensitive analysis of plant cell wall glycostructures. This method OLIgo Mass Profiling (OLIMP) is based the enzymatic release of oligosaccharides from wall materials facilitating specific glycosylhydrolases and subsequent analysis of the solubilized oligosaccharide mixtures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight mass spectrometry (MALDI-TOF/MS)1 (Figure 1). OLIMP requires walls of only 5000 cells for a complete analysis, can be performed on the tissue itself2, and is amenable to high-throughput analyses3. While the absolute amount of the solubilized oligosaccharides cannot be determined by OLIMP the relative abundance of the various oligosaccharide ions can be delineated from the mass spectra giving insights about the substitution-pattern of the native polysaccharide present in the wall.
OLIMP can be used to analyze a wide variety of wall polymers, limited only by the availability of specific enzymes4. For example, for the analysis of polymers present in the plant cell wall enzymes are available to analyse the hemicelluloses xyloglucan using a xyloglucanase5, 11, 12, 13, xylan using an endo-&beta;-(1-4)-xylanase 6,7, or for pectic polysaccharides using a combination of a polygalacturonase and a methylesterase 8. Furthermore, using the same principles of OLIMP glycosylhydrolase and even glycosyltransferase activities can be monitored and determined 9.

OLIgo Mass Profiling OLIMP of Extracellular Polysaccharides

A rapid way is described to gain insights into the structure of polysaccharides in an extracellular matrix. The method takes advantage of the specificity of glycosylhydrolases and the sensitivity of mass spectrometry allowing minute amounts of materials to be analyzed. This technique is adaptable to be used directly on tissue itself.

세포외 다당류의 OLIgo 질량 프로파일 (OLIMP)

The direct contact of cells to the environment is mediated in many organisms by an extracellular matrix. One common aspect of extracellular matrices is ...

생물학

Quantification of Proteins Using Peptide Immunoaffinity Enrichment Coupled with Mass Spectrometry

There is a great need for quantitative assays in measuring proteins. Traditional sandwich immunoassays, largely considered the gold standard in quantitation, are associated with a high cost, long lead time, and are fraught with drawbacks (e.g. heterophilic antibodies, autoantibody interference, 'hook-effect').1 An alternative technique is affinity enrichment of peptides coupled with quantitative mass spectrometry, commonly referred to as SISCAPA (Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies).2 In this technique, affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution and detection by selected/multiple reaction monitoring mass spectrometry (SRM/MRM-MS) provides quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. SRM/MRM-MS is well established for accurate quantitation of small molecules 3, 4 and more recently has been adapted to measure the concentrations of proteins in plasma and cell lysates.5-7 To achieve quantitation of proteins, these larger molecules are digested to component peptides using an enzyme such as trypsin. One or more selected peptides whose sequence is unique to the target protein in that species (i.e. "proteotypic" peptides) are then enriched from the sample using anti-peptide antibodies and measured as quantitative stoichiometric surrogates for protein concentration in the sample. Hence, coupled to stable isotope dilution (SID) methods (i.e. a spiked-in stable isotope labeled peptide standard), SRM/MRM can be used to measure concentrations of proteotypic peptides as surrogates for quantification of proteins in complex biological matrices. The assays have several advantages compared to traditional immunoassays. The reagents are relatively less expensive to generate, the specificity for the analyte is excellent, the assays can be highly multiplexed, enrichment can be performed from neat plasma (no depletion required), and the technique is amenable to a wide array of proteins or modifications of interest.8-13 In this video we demonstrate the basic protocol as adapted to a magnetic bead platform.

Stable Isotope Standards and Capture by Anti-Peptide Antibodies (SISCAPA) couples affinity enrichment of peptides with stable isotope dilution mass spectrometry (MRM-MS) to provide quantitative measurement of peptides as surrogates for their respective proteins. Here we describe the protocol using magnetic particles in a partially automated format.