질량에 민감한 입자 추적을 통해 우리는 지질 막에 확산되는 개별 생체 분자를 관찰하고 실시간으로 역학을 정량화 할 수 있으며 모두 완전히 라벨이 없습니다. 라벨이 필요하지 않기 때문에 생체 분자의 동적 행동을 방해 할 위험이 없습니다. 이 방법의 또 다른 장점은 질량 민감성으로, 이는 우리가 막 결합 된 올리고머 상태를 결정할 수있게 해줍니다.
다재다능하기 때문에이 방법을 모든 멤브레인 관련 시스템에 적용 할 수 있습니다. 특히, 리간드-유도된 수용체 복합체의 형성을 연구하는데 사용될 수 있다. PTFE 홀더에 동일한 수의 현미경 슬라이드를 배포하여 시작하십시오.
PTFE 홀더를 비커로 옮기십시오. 초순수를 넣고 실온에서 15 분 동안 초음파 처리하십시오. 핀셋을 사용하여 홀더를 옮겨 비커를 청소하고 초순수 이소프로판올을 추가하십시오.
다시 15분 동안 초음파 처리한 다음, 다시 이소프로판올을 초순수로 교체하고, 홀더를 함유하는 비커를 15분 동안 초음파 처리한다. 비커에서 홀더를 제거하고 질소 가스 또는 압축 공기의 일정한 흐름 하에서 홀더의 현미경 슬라이드를 불어 건조시킵니다. 대형 현미경 슬라이드가 들어있는 말린 홀더를 플라즈마 클리너에 넣고 전원을 켭니다.
평평한 판지를 알루미늄 호일로 감싸십시오. 청소 된 24 밀리미터를 24 밀리미터 현미경 슬라이드를 알루미늄 호일에 펼쳐 서로 충분한 거리로 퍼뜨립니다. 그런 다음 양면 테이프 스트립을 슬라이드의 위쪽 및 아래쪽 가장자리에 부착합니다.
각 현미경 슬라이드를 메스로 절제하여 알루미늄 호일에서 제거 할 수 있도록하십시오. 각 슬라이드에는 슬라이드의 위쪽 및 아래쪽 가장자리에 양면 테이프 줄무늬가 부착되어 있어야 합니다. 그런 다음 두 개의 양면 테이프 스트립이 있는 슬라이드를 친수화된 슬라이드에 부착합니다.
이것은 더 작은 현미경 슬라이드와 더 큰 현미경 슬라이드 사이의 흐름 경로를 형성합니다. 갓 압출 된 작은 unilamellar 소포 또는 SUV를 필요한 반응 완충액에서 밀리리터 당 0.4 밀리그램의 최종 농도로 희석하십시오. 선택적으로, 소포 파열을 촉진하기 위해, 소포 현탁액에 두 밀리몰 염화칼슘을 첨가한다.
유량실을 질량 광도계 스테이지에 장착합니다. 25 마이크로리터의 베시클 현탁액을 유동 챔버 내로 플러시하고, 챔버를 2분 동안 인큐베이션한 다음, 매번 200 마이크로리터의 반응 버퍼로 유동 챔버의 반복 세척을 통해 융합되지 않은 소포를 제거하였다. 지질 막에 융합되지 않은 소포가 없으면 관심있는 단백질 50 마이크로 리터를 샘플 챔버에 첨가하십시오.
다음으로 획득 소프트웨어에서 시야각의 크기, 노출 시간, 프레임 속도 및 획득 시간과 같은 이미징 조건을 설정합니다. 초점을 자동으로 조정합니다. 필요한 경우 측면 제어를 사용하여 시야를 균일 한 멤브레인이있는 위치로 이동하십시오.
프로젝트 폴더를 만들고 동영상 녹화를 시작합니다. 녹음이 완료되면 획득 소프트웨어가 프롬프트하는 대화 상자에서 파일 이름을 지정하십시오. 동영상은 후속 분석을 위해 MP 파일로 프로젝트 폴더에 자동으로 저장됩니다.
녹화된 비디오를 분석하려면 Jupyter 노트북 앱을 실행합니다. 나타나는 폴더 목록에서 MSPT 분석이 수행되는 위치로 이동합니다. ipy 노트북 파일이 저장되고 파일을 클릭하십시오.
Jupyter 노트북에서 코드는 셀로 구성되며 단계별로 실행할 수 있습니다. 셀 옆에 있는 작은 재생 단추를 클릭하거나 셀을 선택하고 Shift Enter 키를 눌러 셀을 실행합니다. 먼저 분석에 필요한 모든 패키지를 가져옵니다.
다음 셀을 실행하여 파일 프롬프트를 시작합니다. 분석할 MP 비디오 파일이 하나 또는 여러 개 포함된 폴더를 선택하고 폴더 선택을 누릅니다. 선택한 파일 목록이 셀 아래에 인쇄됩니다.
픽셀 단위 배경 추정 알고리즘을 사용하여 빛의 지배적 정적 산란을 제거하려면 매개변수 모드의 연속 중앙값 옵션을 선택하고 슬라이딩 중앙값 창에 적절한 길이를 설정합니다. 선택적으로 배경 제거 후 동영상을 True로 설정save_processed_movies여 파티클 감지 및 궤적 연결에 사용하여 동영상을 저장합니다. GPU에서 처리하기 위해 병렬 True 및 GPU False를 설정하거나 GPU에서 처리하기 위해 그 반대로 설정해야 합니다.
파티클과 각각의 위치는 영화 전체에서 식별되고 국부화됩니다. 입자 검출의 감도를 이미지 이진화에 의해 후보 스팟을 강조하는 데 사용되는 임계값 파라미터로 조정하십시오. 다양한 임계값 매개 변수가 Movie 시각화라는 별도의 노트북에서 스팟 감지 감도에 미치는 영향을 검사합니다.
ipy 노트북. 동영상을 프레임 뷰어에 로드한 후 임계값 슬라이더를 사용하여 파티클 감지 임계값을 조정하고 적절한 설정을 찾습니다. 다른 노트북으로 돌아가서 Python 패키지 trackpy를 사용하여 연속적인 프레임의 파티클을 궤적에 연결하는 세 가지 매개 변수를 선택합니다.
최대 예상 확산 속도에 따라 한 프레임에서 다음 프레임으로 파티클의 최대 변위를 설정합니다. 파티클이 사라지고 다시 나타날 수 있지만 여전히 동일한 파티클로 간주될 수 있는 최대 프레임 수를 선택합니다. 점이 너무 적은 궤적은 계수는 확산 계수의 보다 강력한 결정을 위해 파라미터 minimum_trajectory_length을 사용하여 제거될 수 있습니다.
셀의 모든 매개 변수를 실행하여 수정합니다. 다음 셀을 실행하여 선택한 매개 변수로 선택한 모든 비디오를 분석합니다. 각 처리 단계의 진행률 표시줄이 셀 아래에 나타납니다.
이 작업은 비디오 길이, 매개 변수 설정 및 하드웨어에 따라 다소 시간이 걸릴 수 있습니다. 다음 단계에서 소프트웨어는 점프 거리 분포와 평균 제곱 변위 분석을 기반으로 이전 섹션에서 발견 된 궤적에 대한 확산 계수를 결정합니다. 먼저 동영상 frame_rate를 지정하고 pixel_size합니다.
셀을 실행하여 수정 한 다음 다음 셀을 실행하고 trackpy에서 생성 된 모든 CSV 파일이 포함 된 상위 디렉토리를 선택하십시오. 검색된 CSV 파일 목록이 셀 아래에 인쇄됩니다. 다음 셀에서 결과가 저장되는 HDF5 컨테이너의 이름을 선택하고 실행합니다.
마지막으로 셀 C.4를 실행하여 확산 분석을 수행합니다. 셀 C.5에서 질량 보정 라인 파라미터에 대한 대비를 입력하는데, 이는 알려진 질량의 샘플을 사용하여 결정된 기울기 및 오프셋을 의미하고 모든 입자 대비를 분자 질량으로 변환하기 위해 이를 실행합니다. 셀 C.6을 실행하여 멤브레인 상의 겉보기 입자 밀도를 평가하고, 이는 검출된 입자의 관점에서 중앙값 밀도 값을 반환하고, 데이터 프레임의 추가 컬럼으로서 각 프레임 동안 궤적을 존재시킨다.
질량과 확산 계수의 상관 관계에 대한 최종 플롯을 생성하려면 셀 D.1을 실행하여 파일 프롬프트를 로드하고 MSPT 결과가 포함된 HDF5 파일을 지정한 다음 단일 비디오에서 D.2 셀에 플롯할 데이터 세트를 선택하거나 셀 D.3을 실행하여 여러 비디오의 데이터를 단일 데이터 프레임으로 결합합니다. 이 예제에서는 모든 비디오가 동일한 샘플의 복제물이므로 데이터 집합이 풀링됩니다. 마지막으로 D.4 셀을 실행하여 2D 커널 밀도를 플로팅합니다.
만족하면 D.5 셀의 PDF 파일에 플롯을 저장하고 실행할 위치를 지정합니다. 무손상 지지된 지질 이중층, 및 SLB 상에 재구성된 예시적인 단백질의 지지된 지질 이중층의 형성 동안 유리 커버 슬라이드의 표면 거칠기의 대표적인 이미지가 여기에 도시되어 있다. 네 가지 예제 모두 기본 모드로 표시되며, 측정 자체에서 액세스할 수 있으며 중앙값 기반 배경 제거 후 처리된 비율계량 이미지로 표시됩니다.
콘트라스트를 분자 질량으로 변환하는 교정은 알려진 질량의 생체 분자를 비오틴-스트렙타비딘-비오틴 복합체를 통해 SLB에 부착함으로써 달성될 수 있다. 예시적인 전략으로서, 소 혈청 알부민, 단백질 A, 알칼리성 포스파타제, 및 피브로넥틴의 비오티닐화 변이체를 사용할 수 있는데, 이는 그 자체가 막 내의 비오틴-함유 지질에 결합되는 스트렙타비딘에 결합한다. 이들 예시적인 거대분자들의 점점 더 뚜렷한 대조는 각각의 비오티닐화 표준물질의 증가된 분자량을 반영한다.
콘트라스트 히스토그램의 각 피크를 표준 단백질의 올리고머 상태의 상응하는 질량에 할당함으로써, 콘트라스트와 질량 사이의 선형 관계가 밝혀지고 후속적으로 알려지지 않은 거대분자 시스템의 분석에 사용될 수 있다. 비오티닐화 알돌라제와 복합체 또는 비오틴-변형된 염소 항-토끼 IgG 항체와의 복합체에서 4가 스트렙타비딘의 질량 및 확산 계수 둘 다의 2D 커널 밀도 추정이 여기에 제시된다. 대표적인 이미지는 사가 스트렙타비딘의 복합체에 대한 결정된 올리고머 질량과 비오틴-개질된 알돌라제 또는 IgG 및 예상 분자량의 비교를 보여준다.
MSPT를 사용하면 지질 막에서 직접 생체 분자를 추적하고, 어떤 질량을 가지고 있는지, 어떻게 움직이는지, 어떻게 상호 작용하는지 결정할 수 있습니다. 나는이 기술이 멤브레인 안팎에서 생물학적 과정에 대한 우리의 이해를 변화시킬 것이라고 확신합니다.
