개선 하 고 이러한 기술을 실제의 상태를 수정 하는 데 도움이 실험실의 이전 회원 감사 하겠습니다: 모라-닥터 셀 리아 마 르 티 네즈; 박사 안 나 Mrowiec, 닥터 카 탈리 나 루이즈-카나다와 닥터 안토니 아 Alcaraz-가르시아. 우리는 강력 하 게 이러한 기술의 개발을 지원 하기 위한 병원 Clínico 대학교 일 드 라 Arrixaca에 게 빚을입니다. 또한 기관 드 건배 카를로스 III, Fondo 드 Investigaciones Sanitarias. Estatal 계획 나 + D + 어 Instituto de 건배 카를로스 III-Subdirección 일반 드 Evaluación y Fomento 드 라 Investigación (허가 번호: PI13/00794); www.isciii.es. 자금 페더 "Una 마네 드 대처해 유로 파". 우리 또한 감사 IMIB Arrixaca, 대학 드 무르시아, FFIS 행정 지원 및 지원. 마지막으로, 우리 특별 한 닥터 이사벨 마르티네스-Argudo 고은 Facultad 드 Ciencias Ambientales y Bioquímica, 캠퍼스 Tecnológico 드 라 디렉터리 드 무기, 대학 카스 티 야 라만 차, 톨레도 기꺼이 넘겨주는에 그들의 종류 지원에 대 한 감사를 주고 싶어 여 의학 및 생명 공학 연구소가이 종이의 촬영된 부분을 가능 하 게

1. 인공 상처 스크래치 분석 결과 양적 연구
<ol>
	<li>세포 단층 준비
	<ol>
		<li>무 균 조건 하에서 작업, 씨 그리고 혈 청-보충 매체를 사용 하 여 문화 플라스 크에 Mv1Lu 또는 HaCaT 상피 세포 성장. 한 번 모든 24-48 h 매체를 새로 고침 합니다. 셀 도달 80% 합류, 후는 적절 한 방법, 즉, trypsinization9를 사용 하 여 셀을 분리 합니다. 참고: Mv1Lu 및 EMEM 및 DEMEM 문화 매체를 사용 하 여 상피 세포를 교양 HaCaT 각각 2 m L-글루타민, 보완 및 5% CO2의 제어 분위기 37 ° C에서 알을 품. 모든 셀 라인 셀 농도 전체 confluency를 도달 하는 데 필요한 타이밍을 결정 하기 위해 철저 하 게 분석 해야 합니다. 일반적으로 Mv1Lu 또는 HaCaT 세포에 대 한 2-4 x 104 또는 4-6 x 104 셀/글쎄, 각각은 시드 175 cm2 문화 플라스 크에 고 합류 하 80%에서 최대 35 x 106 Mv1Lu 또는 1 x 107 HaCaT 세포 생성 합니다.</li>
		<li>12 잘 또는 24-잘 문화 접시에 각 잘 셀의 2 mL에에서 씨. 일단 모든 24-48 h. 확인 셀 숫자는 2 ~ 3 일 후 100% 합류에 도달 충분히 높은 매체를 새로 고침 합니다.</li>
		<li>셀 도달 합류, 후 혈 청-보충 매체를 제거 하 고 신선한 혈 청 무료 매체와 두 번 세척. 긁 적 전에 24 h에 대 한 혈 청 자유로운 매체에 셀을 계속. 참고: Mv1Lu 또는 HaCaT 세포 하지 않아도 특별 한 기판 요구 사항; 그러나, 셀 라인 세럼 무료 조건에서 저절로 분리에 취약, 사전 코팅 폴 리-L-리 신 솔루션을 사용 하 여 문화 접시 표면의 고려 되어야 한다10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>단층 긁 적
	<ol>
		<li>메 마른 환경에서 working, 단단히 20 µ L 또는 원하는 스크래치 폭에 따라 200 µ L 살 균 micropipette 팁의 좁은 끝을 드래그 하 여 문화 단층 스크래치. 팁 유지 간격 동질성을 극대화 하기 위해 문화 표면에 수직.<ol>
			<li>명확 하 게 셀 단층을 모니터링 하는 어두운 표면 문화 접시를 놓습니다. 필요한 경우 각 잘 4 마이그레이션 분야까지 공부에 두 수직 흠집 (십자가 모양)을 수행 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>부드럽게 문화 매체와 부드럽게 추가 신선한 혈 청 무료 매체를 제거 하 여 분리 된 세포를 씻어. 두 번, 반복 또는 가장 첨부 되지 않은 세포 제거 되었습니다 때까지.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>실험 절차 및 데이터 수집
	<ol>
		<li>잘 사용 하 여 각 CCD 카메라를 통합 하는 반전된 단계 대조 현미경에서 스크래치 간격을 중심으로 최대 4 전처리 참조 이미지를 가져가 라. 스크래치의 인접 한 교차점으로 현미경 필드의 가장자리를 정렬 하 여 관심 영역을 선택 합니다. 참고: 일반적으로, 이미지는 인수 10 배 확대와 1280 x 1024 픽셀 이미지 크기를 사용 하 여. 쉽게 지역화 및 잘 당 최대 4 측정의 유효성 검사에 대 한 도움이 됩니다 위에서 설명한 대로 관심 영역을 선택 합니다.</li>
		<li>일단 모든 이미지는 인수 지정 치료 우물; 선택 된 치료 포함 된 신선한 매체와 우물에서 매체를 교환 합니다. 참고: 또는, 화학 제품, 문화 매체 동질성을 방해 하지 않는 화합물에 대 한 치료 수 수 주사 문화 매체에 직접.</li>
		<li>관측 범위 90% 스크래치 간격 폐쇄 조건까지 긁힌된 플레이트 (37 ° C 5% CO2를 포함 하는 제어 분위기)를 품 어. 완전 폐쇄를 하지 마십시오. 참고: 총 간격 폐쇄 무효화 치료 후 사진 모음 참조 영역 감지 되지 않습니다 하 고 갭 닫는 시간 참조를 설정할 수 없습니다. Mv1Lu 또는 HaCaT 세포의 경우 16-19 h 90% 합류에 도달 해야 합니다.</li>
		<li>셀; 수정 하 여 셀 마이그레이션 중지 부드럽게 실험적인 문화 매체 1 mL PBS에 4% 포 르 말린의 대체. 실시간에서 15 분 동안 품 어</li>
		<li>초과 말린;를 제거 하는 세포를 씻어 부드럽게 신선한 PBS 우물에 솔루션 대체. 두 번 이상 반복 합니다. 참고:이 단계에서 씰링, 후 접시 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 무기한.</li>
		<li>긁 적 후 캡처한 원본 참조 영역에서 각의 후 처리 참조 이미지를 가져가 라. 사용 하 여 동일한 장비 (거꾸로 광학 단계 대조 현미경 통합 CCD 카메라)와 일치 그림 설정 (확대 및 디지털 해상도/밀도). 참고: 개별적으로 마이그레이션 하 고 일관 된 정면 (예를 들어, MDA-MB-231 유방암 인간의 세포)의 형성에 관계 없이 공백을 채울 셀에 대 한 시간 코스 이미지는 개별 셀 마이그레이션 속도의 계산을 수 있습니다.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>이미지 분석 및 마이그레이션의 정량화
	<ol>
		<li>이미지 프로세싱 소프트웨어 (예를 들어, ImageJ)를 사용 하 여 스크래치 간격 한계를 정의 하 고 치료 전 사진에 최대 4 개의 측정 간격 표면 결정. "표면 전처리 격차"로 데이터 기록 (PREGAP). 치료 후 사진에 대 한 동일한 절차를 반복 합니다. "후 처리 간격 표면"으로 데이터를 기록 (POSTGAP).<ol>
			<li>ImageJ를 사용 하 여 기록 된 이미지를 엽니다. "이미지" 메뉴에서 이미지 형식 8 비트 설정. "프로세스" 메뉴에서 "필터" 메뉴에가 고 "분산" 필터링 적용.</li>
			<li>"이미지" 메뉴에서 "조정" 하위 메뉴 및 설정된 임계값 흑인과 백인을 입력 (B &#38; W), "어두운 배경"을 선택 하지 않은 있는지 확인 하십시오. "프로세스" 메뉴에서 "바이너리" 하위 메뉴에가 고 "구멍 채우기"를 선택 합니다.</li>
			<li>"분석" 메뉴에서 "측정 설정"을 선택 하 고 "지역"를 활성화 합니다. 다음 따라서 격차를 구분 마이그레이션 가장자리 윤곽을 따라 측정 영역을 그립니다.</li>
			<li>"분석" 메뉴에서 "입자 분석"을 선택 하 고 그려진된 영역 표면에 대 한 "전체 영역" 값을 기록 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>PREGAP 및 POSTGAP 총 면적 값 간격 표면 측정의 차이 개별 샘플의 각 집합에 대 한 절대 마이그레이션 척도를 스프레드시트에 소개: PREGAP − POSTGAP [임의 단위]. 또한, 각 조건 제어 샘플의 절대 마이그레이션 데이터를 정상화: (샘플 / 제어) * 100 [%]. 참고: 셀을 개별적으로 마이그레이션할 일관 된 정면, (예를 들어, MDA-MB-231 유방암 인간의 세포)의 형성에 관계 없이 공백을 채울, 절대 마이그레이션 산출 될 수 있다 계산 셀 중앙에 침입 하 여 스트립에 컨트롤 또는 치료 샘플입니다.</li>
		<li>( 그림 1참조) 부 량 출력을 플롯 합니다. 필요한 경우 통계 분석을 수행 합니다.</li></ol></li></ol>비교 하는 두 가지 조건 또는 더 많은 수의 조건에 대 한 분산 분석 테스트 스튜던트 t-검정을 고려 하십시오.
	
	

2. 인공 마이그레이션 지형 연구에 대 한 전면 분석 결과
<ol>
	<li>세포 단층 준비
	<ol>
		<li>무 균 조건에서 작업 플레이트의 표면이 완전히 덮여 때까지 빈 문화 접시에 소독된 라운드 coverslips의 1 개의 층을 놓습니다. 참고: 12와 33 coverslips까지에 맞게 5 cm, 10 cm 직경 접시, 각각.</li>
		<li>문화 접시에 2 ~ 3 일 후 100% 합류를 허용 하는 농도에서 세포의 적절 한 볼륨을 씨앗 부드럽게. 아니 coverslip 겹치는 인접 coverslips 다는 것을 확인 하 고 살 균 micropipette 팁 부드러운 압력을 적용 하 여 부동에서 coverslips를 방지 합니다. 모든 24-48 h 매체를 새로 고칩니다. 참고: 모든 셀 라인 셀 농도 전체 confluency를 도달 하는 데 필요한 타이밍을 결정 하기 위해 철저 하 게 분석 될 해야 합니다. 일반적으로 Mv1Lu 또는 HaCaT 세포에 대 한 2-3 x 106 또는 2.5-4 x 106 세포/10 cm 직경 접시, 각각은 시드. 작은 접시에 대 한 셀 숫자 축소 되어야 합니다.</li>
		<li>셀 도달 합류, 후 혈 청-보충 매체를 제거 하 고 신선한 혈 청 무료 매체를 바꿉니다. 인위적인 상처를 수행 하기 전에 셀 24 h에 대 한 혈 청 자유로운 매체에 계속. 참고: Mv1Lu 또는 HaCaT 세포 하지 않아도 특별 한 기판 요구 사항; 그러나, 셀 라인 세럼 무료 조건에서 저절로 분리의 취약, 사전 코팅 폴 리-L-리 신 솔루션을 사용 하 여 문화 표면의 고려 되어야 한다10.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>단층 부상
	<ol>
		<li>깨끗 한 10 cm 접시 신선한 혈 청 무료 매체를 포함 하는 coverslip 이동 조심 스럽게 멸 균 핀셋을 사용 하 여. 핀셋으로 주변에는 coverslip를 눌러는 단층을 손상 하지 마십시오. Coverslip 파손에서 발생할 수 있는 과도 한 압력을 피하십시오.</li>
		<li>coverslips의 중심에 가로 라인에 소독된 면도날을 끌어 인공 상처를 만듭니다. 뒤로-및-앞뒤, 완전히 중앙 단층 스트립을 제거 하려면 3-4 m m를 끕니다. 아무 셀 파편 계속 부상된 가장자리에 연결 되어 있는지 확인 합니다. 참고: 12 m m 직경에 coverslip, 라운드 절 개에서 이루어집니다는 중반에 coverslip의. 셀의 충분히 큰 메인 전면 반대 (적어도 2 m m 폭)의 다음 단계에 coverslip 기울이기 피하기 위해 행진을 두고 있는지 확인 합니다.</li>
		<li>깨끗 한 6 잘 플레이트 포함 최소 2 mL 신선한 혈 청 자유로운 매체를, 직면 하는 세포와 부상된 coverslips를 전송 합니다. 최대 4 부 coverslips/잘 맞습니다.</li>
		<li>부드럽게 씻어 두 번 사용 하 여 신선한 혈 청 자유로운 매체 분리 된 세포를 제거 하.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>실험 절차 및 샘플링
	<ol>
		<li>부드럽게 선택한 치료 포함 된 신선한 매체와 우물에서 매체를 교환 합니다. 참고: 또는, 화학 제품, 문화 매체 동질성을 방해 하지 않는 화합물에 대 한 치료 수 수 주사 문화 매체에 직접. 어떤 잠재적인 세포 분리를 피하기 위해 주의 함께 진행 합니다.</li>
		<li>원하는 실험 타이밍에 대 한 (37 ° C, 5% CO2) 셀 인큐베이터 안에 접시를 유지.</li>
		<li>셀; 수정 하 여 셀 마이그레이션 중지 부드럽게 실험적인 문화 매체 1 mL PBS에 4% 포 르 말린의 대체. 실시간에서 15 분 동안 품 어 참고: 시간 과정 실험, 문화 접시에서 샘플을 제거 하 고 다른, 지속적인 실험 조건에 영향을 주는 포 르 말린 가스를 피하기 위해 별도 접시에 그들을 수정.</li>
		<li>초과 말린;를 제거 하는 세포를 씻어 부드럽게 신선한 PBS 우물에 솔루션 대체. 두 번 이상 반복 합니다. 참고:이 단계에서 씰링, 후 접시 저장할 수 있습니다 4 ° C에서 무기한.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>면역 형광 검사 (IF) 및 토폴로지 분석
	<ol>
		<li>만약 얼룩이 수행 하 고 영상으로 개별 coverslips에 설명 다른3,,411.<ol>
			<li>PBS에서 0.3% 트라이 톤 X-100 솔루션에서 coverslips를 immersing 하 여 10 분 동안 permeabilize.</li>
			<li>다음 차단 솔루션을 사용 하 여 30 분 동안 블록: 0.3% 소 혈 청 알 부 민; 10% 태아 둔감 한 혈 청; 5% 탈지 우유; 0.3 PBS에서 % 트라이 톤 X-100 솔루션. 참고: 우유 없이 솔루션 차단 사전에 준비 하 고 수-20 ° c.에 저장</li>
			<li>1 차적인 항 체 우유 무료 차단 솔루션에 희석 된 촉촉한 챔버 내부 실내 온도에서 1 h에 대 한 품 어. 거꾸로 15 µ L 항 체 솔루션을 적절 한 배포에는 coverslips를 놓습니다. 참고: 항 체 작업 희석 변수 이며 사용에서 항 체에 따라 달라 집니다. 예를 들어 토끼 6 월 안티-c 항 체는 1/100 희석이 필요합니다.</li>
			<li>PBS에는 0.1% 트라이 톤 X-100 솔루션에서 coverslips을 찍기로 세 번 세척.</li>
			<li>30 분 동안 우유 무료 차단 버퍼에 희석 이차 항 체에 coverslips를 품 어. 참고: 항 체 작업 희석 변수 이며 사용에서 항 체에 따라 달라 집니다. 예를 들어 염소-안티-토끼 (488) 최적 해상도 대 한 1/400 희석을 요구 한다. Phalloidin, Hoechst 33258 등 다른 표기 시 약이이 단계에서 인큐베이션 버퍼에 추가할 수 있습니다.</li>
			<li>PBS에서 0.1% 트라이 톤 X-100 솔루션에서 coverslips을 찍기로 세 번 세척.</li>
			<li>Coverslips는 10 µ L 장착 미디어 드롭 (예, Vectashield)는 현미경 슬라이드에 배치에 거꾸로 탑재 합니다. 장착 매체 강화 위해 하룻밤 실 온에서 어둠 속에서 슬라이드를 둡니다. 나중에, 어둠 속에서 4 ° C에서 무기한 저장 합니다.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Epifluorescence 또는 마이그레이션 앞쪽 가장자리에서 발생 하는 구조 변경의 confocal 현미경 이미지를 얻을. 참고: 토폴로지 연구 기와 내부 단층 마이그레이션 앞에서 사진을 하 여 수행할 수 있습니다. 반 양적 연구는 로컬 형광 강렬에 소프트웨어를 기반으로 분석 하 여 가능 합니다.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol>
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W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+using+silicone+elastomer+masks+for+quantitative+analysis+of+cell+migration+without+cellular+damage+or+substrate+disruption.">A simple method for using silicone elastomer masks for quantitative analysis of cell migration without cellular damage or substrate disruption.</a> Cell Adh Migr. 7 (6), 469-475 (2013).</li><li>Dennis, E. A., Rhee, S. G., Billah, M. M., Hannun, Y. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+phospholipase+in+generating+lipid+second+messengers+in+signal+transduction.">Role of phospholipase in generating lipid second messengers in signal transduction.</a> FASEB J. 5 (7), 2068-2077 (1991).</li><li>Lampugnani, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+migration+into+a+wounded+area+in+vitro.">Cell migration into a wounded area in vitro.</a> Methods Mol Biol. 96, 177-182 (1999).</li></ol>

저자는 충돌의 관심은 선언 합니다.

피부 또는 점 막 파열, 수많은 종류의 세포, 섬유 아 세포 또는 상피와 면역 세포를 포함 하 여 행동에 의해 장벽 기능 복원 됩니다. 이 세포는 복잡 한을 받아야 하는 conjointly, apoptosis, 확산, 차별화, 그리고 중요 한 것은, 섬유 관련 된 프로세스 및 상피 세포 궁극적인 메커니즘 방해 조직의 복원에 대 한 책임은 마이그레이션 및 표면 상피 간격1,12 따라서...

셀 이동은 상피 갭의 최종 폐쇄와 방해 표면1의 복원에 대 한 책임은 상처 치유, 필요 합니다. 생리 적인 조건2근처에이 복잡 한 과정의 복제 동물 모델에서 인위적인 상처를 수행 할 수 있습니다. 그러나,이 방법은 종종 비용과 복잡 한 실험 절차, 잠재적으로 상처 치유 과정의 복잡 한 특성으로 인해 개별 프로세스의 연구에 대 한 정밀 부족 발생 합니다.
상피 세포의 생체 외에서 문화는 역할이이 세포에 상처 치유와 셀 철새 행동 치료의 효과 연구를 위한 동물 모델에 대 한 유용한 대안을 제공 합니다. 상피 세포의 생리는 종종 비 합칠 문화3,4,,56;를 사용 하 여 분자 기술로 공부 그러나, 상피 무결성 중단 일반적으로 정밀한 기계 절 개 함으로써 이루어집니다. 세포 배양에서이 셀의 무시할 수 상처 격차에 노출 될 수 있습니다 그리고 그들은 분자 생물학 기술에 대 한 너무 작은 샘플을 나타내는 의미 합니다. 그러나, 이러한 병 변 밍 크 폐 상피 세포 (Mv1Lu) 또는 자발적으로 불멸 하 게 인간의 keratinocyte (HaCaT) 셀 등 일부 상피 세포 라인의 타고 난 철새 속성의 활용, 미세한 규모에서 공부 될 수 있다 라인입니다.
여기 우리는 상처 치유3,4,,78의 맥락에서 상피 세포의 마이그레이션에 양적 데이터를 얻기 위해 적당 한 현미경 검사 법에 대 한 방법을 설명 합니다. 또한, 우리는 마이그레이션 중 상피 monolayers에 발생 질적으로 분자와 형태학 상 변화를 공부 도움이 되는 추가 방법을 제시. 전반적으로, 이러한 메서드는 상처 치유 하는 동안 역학과 상피 세포 행동 및 치료에 대 한 응답으로 관련 된 형태학 상 변화를 공부 하는 프레임 워크를 제공 합니다.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&amp;rsquo;s Modified Eagle Medium (DMEM)</td><td>Biowest, Nuaill&amp;eacute;, France</td><td>L0102-500</td><td>Optional 10 % FBS supplement</td></tr><tr><td>Eagles&amp;rsquo;s Minimum Essential Medium (EMEM)</td><td>Lonza</td><td>BE12 -662F</td><td>Optional 10 % FBS supplement</td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Lonza</td><td>BE17-605E</td><td>Use at 2 mM</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA USA</td><td>DE17603A</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>T4049</td><td>Dilute as appropriate</td></tr><tr><td>Poly-L-Lysine</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>P9155</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&#039;s Phosphate Buffered Saline (DPBS) (10x)</td><td>Gibco by Life Technologies</td><td>14200-067</td><td>Dilute to 1x</td></tr><tr><td>24-well culture plates</td><td>BD FALCON//SARSTED</td><td>734-0020</td><td></td></tr><tr><td>6-well culture plates</td><td>SARSTEDT</td><td>83-3920</td><td></td></tr><tr><td>Epidermal Growth Factor (EGF)</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>E9644</td><td>Used 10 ng/mL</td></tr><tr><td>Round cover glass</td><td>MENZEL-GL&amp;Auml;SER</td><td>MENZCB00120RA020</td><td>SHORT DEPTH OF FIELD</td></tr><tr><td>Reinforced razor blade no. 743</td><td>Martor (through VWR)</td><td>MARO743.50</td><td></td></tr><tr><td>200 &amp;micro;l sterile aerosol pipet tips</td><td>VWR</td><td>732-0541</td><td></td></tr><tr><td>20 &amp;micro;l sterile aerosol pipet tips</td><td>VWR</td><td>732-0528</td><td></td></tr><tr><td>Digital camera coupled phase contrast microscope</td><td>Motic Spain</td><td>Moticam camera 2300 3.0 M Pixel USB 2.0; Motic Optic AE31</td><td></td></tr><tr><td>Confocal microscope</td><td>ZEISS Microimaging, Germany</td><td>LSM 510 META</td><td></td></tr><tr><td>10 cm Culture dish</td><td>BD FALCON</td><td>353003</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit polyclonal anti c-Jun antibody</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-1694</td><td>Used 1:100</td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG (polyclonal goat ) AF 488</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td>Used 1:400</td></tr><tr><td>Hoechst-33258</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>14530</td><td>Used 1:1000</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 594 phalloidin (in methanol) (red)</td><td>Invitrogen</td><td>A12381</td><td>Used 1:100</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumin</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>SC-2323</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich, St Louis, MO, USA</td><td>T9284</td><td></td></tr><tr><td>Skim milk</td><td>BD DIFCO</td><td>232100</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td>National Institutes of Health, USA</td><td>Release 1.50i</td><td></td></tr><tr><td>Zen LSM 510 image processing software</td><td>ZEISS Microimaging, Germany</td><td>Release 5.0 SP 1.1</td><td></td></tr></tbody></table>

microscopy based methods for the assessment of epithelial cell migration during in vitro wound healing

셀 이동은 상처 치유에 대 한 의무적 측면 이다. 인공 생성 상처 연구 동물 모델에 비용과 복잡 한 실험 절차에 자주 결과 정밀도에서 잠재적으로 부족 한 동안. 상피 세포의 생체 외에서 문화는 상처 치유와이 세포에 치료의 영향에 셀 철새 행동 연구를 위한 적합 한 플랫폼을 제공 합니다. 상피 세포의 생리는 종종 비 합칠 조건;에서 공부 그러나,이 방법은 자연 상처 치유 조건 닮은 하지 않을 수 있습니다. 기계적 방법으로 상피 무결성을 방해 현실적인 모델을 생성 하지만 분자 기술 응용 프로그램을 방해 수 있습니다. 따라서, 현미경 기반 기술을 상피 세포 이동 공부에 대 한 최적의 생체 외에서. 여기 우리는 두 가지 구체적인 방법, 인공 상처 스크래치 분석 결과 및 인공 마이그레이션 전면 분석 결과, 상피 세포의 이동 성능에 각각, 양적 및 질적 데이터를 얻을 수 있는 선발.

양적 연구에 대 한 인공 상처 스크래치 분석 결과: 마이그레이션의 표 피 성장 인자 (EGF) 승진 평가:
EGF는 상피 세포 확산 및 마이그레이션, 그리고 이렇게 측정 마이그레이션 프로 모션에 대 한 긍정적인 통제의 유명한 유도. Mv1Lu 및 HaCaT 세포 monolayers 상처 스크래치 분석 실험에서 사용 되었다 고 치료 전 사진을 입수 했다. 10 ng/mL...

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Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

이 원고 방법 절 개 같은 병 변 배양된 상피 세포 monolayers에 편리 하 게 모델 치료 생체 외에서이미징 confocal 의해 상처 또는 레이저 스캔 현미경, 고는 높은 품질을 제공할 수 있습니다. 공부 셀 동작 및 마이그레이션에 관련 된 메커니즘에 대 한 양적 및 질적 데이터입니다.

현미경 기반 방법을 생체 외에서 상처 치유 중 상피 세포 이동의 평가 대 한

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

microscopy-based-methods-for-assessment-epithelial-cell-migration

Research

JoVE Journal

Medicine

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

9.2K 조회수.  IMIB-Arrixaca. 이 원고 방법 절 개 같은 병 변 배양된 상피 세포 monolayers에 편리 하 게 모델 치료 생체 외에서이미징 confocal 의해 상처 또는 레이저 스캔 현미경, 고는 높은 품질을 제공할 수 있습니다. 공부 셀 동작 및 마이그레이션에 관련 된 메커니즘에 대 한 양적 및 질적 데이터입니다.

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Live-imaging of Breast Epithelial Cell Migration After the Transient Depletion of TIP60

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the beginning and end of an experiment using a phase-contrast microscope, and the migration abilities of cells are evaluated by the closure of wounds. However, cell movement is a dynamic phenomenon, and a conventional method does not allow for tracking single-cell movement. To improve current wound-healing assays, we use live-cell imaging techniques to monitor cell migration in real time. This method allows us to determine the cell migration rate based on a cell tracking system and provides a clearer distinction between cell migration and cell proliferation. Here, we demonstrate the use of live-cell imaging in wound-healing assays to study the different migration abilities of breast epithelial cells influenced by the presence of TIP60. As cell motility is highly dynamic, our method provides more insights into the processes of wound healing than a snapshot of wound closure taken with the traditional imaging techniques used for wound-healing assays.

Here, we present the real-time monitoring of cell migration in a wound-healing assay using TIP60-depleted MCF10A breast epithelial cells. The implementation of live-cell imaging techniques in our protocol allows us to analyze and visualize single-cell movement in real time and across time.

TIP60의 과도 한 소모 후 유 방 상피 세포 이동의 라이브 영상

The wound-healing assay is efficient and one of the most economical ways to study cell migration in vitro. Conventionally, images are taken at the ...

연구

암 연구학

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

A Simple Migration/Invasion Workflow Using an Automated Live-cell Imager

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great significance. Migration assays provide basic insight of cell movement at a 2D level, whereas invasion assays are more physiologically relevant, mimicking in vivo cancer cell dislodgment from the original site and invading through the extracellular matrix. The current protocol provides a single workflow for migration and invasion assays. Together with the integrated automated microscopic camera for real-time HD images and built-in analysis module, it gives researchers a time-efficient, simple and reproducible experimental option. This protocol also includes substitutions for the consumables and alternative analysis methods for users to choose from.

The current protocol describes an integrated method investigating cancer cell migration and invasion on a single platform in real-time, providing an easily reproducible and time-efficient option to study cell mobility and morphology.

자동된 라이브 셀 이미징 사용 하 여 간단한 마이그레이션/침공 워크플로

Cancer cell mobility is crucial for the initiation of metastasis. Therefore, investigation of the cell movement and invasive capacity is of great ...

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into changes in clinical standards used for treating wounds and decreasing morbidity and mortality for patients. Wound healing is a complex process that requires strategic cell and tissue interaction and function. One of the many critically important functions of wound healing is individual and collective cellular migration. Upon injury, various cells from the blood, surrounding connective, and epithelial tissues rapidly migrate to the wound site by way of chemical and/or physical stimuli. This migration response can largely dictate the outcomes and success of a healing wound. Understanding this specific cellular function is important for translational medicine that can lead to improved wound healing outcomes. Here, we describe a protocol used to better understand cellular migration as it pertains to wound healing, and how changes to the cellular environment can significantly alter this process. In this example study, dermal fibroblasts were grown in media supplemented with fetal bovine serum (FBS) as monolayer cultures in tissue culture flasks. Cells were aseptically transferred into tissue culture treated 12-well plates and grown to 100% confluence. Upon reaching confluence, the cells in the monolayer were vertically scratched using a p200 pipet tip. Arsenic diluted in culture media supplemented with FBS was added to individual wells at environmentally relevant doses ranging 0.1-10 &#956;M. Images were captured every 4 hours (h) over a 24 h period using an inverted light microscope to observe cellular migration (wound closure). Images were individually analyzed using image analysis software, and percent wound closure was calculated. Results demonstrate that arsenic slows down wound healing. This technique provides a rapid and inexpensive first screen for evaluation of the effects of contaminants on wound healing.

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

This study focuses on an in vitro model of wound healing (scratch assay) as a mechanism for determining how environmental contaminants such as arsenic influence cellular migration. The results demonstrate that this in vitro assay provides rapid and early indications of changes to cellular migration prior to in vivo experimentation.

생체 외에서 피부 세포 마이그레이션에 비소의 효과 설명 하기 위해 분석 결과 스크래치

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

환경과학

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

생체공학

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to stimulate cell migration. Importantly, cell migration is a rate-limiting event during the wound-healing process to re-establish the integrity and normal function of tissue layers after injury. The advantage of this method over the classical assay, which is based on a manually made scratch in a cell monolayer, is the usage of special silicone culture inserts providing two compartments to create a cell-free pseudo-wound field with a well-defined width (500 &#956;m). In addition, due to an automated image analysis platform, it is possible to rapidly obtain quantitative data on the speed of wound closure and cell migration. More precisely, the effect of two frog-skin AMPs on the migration of bronchial epithelial cells will be shown. Furthermore, pretreatment of these cells with specific inhibitors will provide information on the molecular mechanisms underlying such events.

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Here, we present a protocol to evaluate the effect of peptides on the migration of bronchial epithelial cells. This method allows for the rapid and highly reproducible obtainment of quantitative data on the speed of cell migration and wound closure.

상처 치유 분석 결과 셀 마이그레이션 평가 하는 새로운 체 외에

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

면역학 및 감염병학

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

생물학

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

스크래치 마이그레이션 분석 및 등갈 피부 접기 챔버 에서 생체 외 및 상처 치유의 생체 내 분석

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

의학

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for developing methods to study the migration. The scratch assay has long been the most common in vitro method to test compounds with anti- and pro-migration properties because of its low cost and simple procedure. However, an often-reported problem of the assay is the accumulation of cells across the edge of the scratch. Furthermore, to obtain data from the assay, images of different exposures must be taken over a period of time at the exact same spot to compare the movements of the migration. Different analysis programs can be used to describe the scratch closure, but they are labor intensive, inaccurate, and forces cycles of temperature changes. In this study, we demonstrate an optimized method for testing the migration effect, e.g. with the naturally occurring proteins Human- and Bovine-Lactoferrin and their N-terminal peptide Lactoferricin on the epithelial cell line HaCaT. A crucial optimization is to wash and scratch in PBS, which eliminates the aforementioned accumulation of cells along the edge. This could be explained by the removal of cations, which have been shown to have an effect on keratinocyte cell-cell connection. To ensure true detection of migration, pre-treating with mitomycin C, a DNA synthesis inhibitor, was added to the protocol. Finally, we demonstrate the automated optical camera, which eliminates excessive temperature cycles, manual labor with scratch closure analysis, while improving on reproducibility and ensuring analysis of identical sections of the scratch over time.