Name: a novel in vitro wound healing assay to evaluate cell migration
Uploaded: 2018-03-17T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 55 s
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이 작품에서 역사적인 대학 로마와 이탈리아 낭 성 섬유 증 연구 재단 (프로젝트 보기 #11/2014 FFC 대표단 시에 나, 손 드리 오 Valchiavenna, Cerea Il 소리 디 제니와 파 비아에서 채택) 자금에 의해 지원 되었다. 이 작품의 일부 FILAS 그랜트 보호 FILAS RU 2014 1020에 의해 지원 되었다.
우리는 제공 하는 기관지 상피 세포에 대 한 박사로 레 타 포 레 라 (U.O.C. Genetica 메 디카, Istituto Giannina Gaslini, 제노바, 이탈리아)에 감사.

1. 세포 준비
<ol><li>10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 항생제 (0.1 mg/mL 페니실린과 스의), 그리고 puromycin 플러스 2.5x106 셀 10 mL의 최소 필수 매체 (MEM) 2mm 글루타민 (MEMg), 보충에 씨앗 (0.5 µ g/l로 선택 및 유지 보수는 셀 라인) T75 플라스 크에. 2 일 동안 37 ° C, 5% CO2 플라스 크를 품 어. 시작 하기 전에 실험, 거꾸로 현미경 세포의 합류를 확인 하십시오. 참고: 실험을 위해 사용 하는 셀 불멸 하 게 인간의 기관지 상피 세포 lentiviral 벡터 puromycin 저항을 부여로 불리고 있습니다. 그들은 안정적으로 기능적인 CFTR14,15를 표현 한다.</li>
	<li>세포의 합류에는 90-100%에 도달 했습니다, 일단 플라스 크에서 매체를 발음 하 고 생물 안전 캐비닛 클래스 II에서 폐 병으로 그것을 폐기. 6 mL의 인산 염 버퍼와 셀 씻어 염 분 칼슘 및 마그네슘 (CMF-PBS) 없이. 부드럽게 플라스 크를 수동으로 바위와 CMF PBS를 삭제. 참고:을 피펫으로와 셀 단층을 건드리지 않도록 주의 해야 합니다.</li>
	<li>CMF PBS의 10 mL을 추가 하 고 10 분 동안 37 ° C, 5% CO2 플라스 크를 품 어.</li>
	<li>CMF PBS를 발음 하 고 그것을 폐기. 플라스 크에 트립 신/EDTA의 2 개 mL를 추가 합니다.</li>
	<li>부드럽게 바위 플라스 크, 셀, 코트 고 셀은 가시 현미경으로 분리 될 때까지 10 분 동안 37 ° C, 5% CO2 플라스 크를 품 어 완전히 솔루션을 허용. 참고: 보육 시간의 끝에, 셀 둥근 및 플라스틱 표면에 얽매이지 않는 표시 됩니다. 셀 잘 분리 된 경우, 수동 동요 필요할 수 있습니다.</li>
	<li>MEMg 플러스 10%의 10 mL을 추가 FBS 트립 신을 비활성화 하 고 플라스 크의 하단을 세척 하 여 세포를 수집. 원뿔 50 mL 튜브에 볼륨을 전송.</li>
	<li>80 x g에 5 분 동안 튜브 원심</li>
	<li>상쾌한 발음 하 고 다시 6 ml MEMg 플러스 10%의 세포를 중단 FBS. 반복적으로 어떤 덩어리 헤어 플라스틱.</li>
	<li>10 µ L는 micropipette와 셀 서 스 펜 션의 밖으로가 고 이전 Burker 또는 Neubauer 챔버에 넣어 커버 유리 아래 볼륨을 주입.</li>
	<li>휴대폰 번호를 계산 합니다.</li>
</ol>2. 세포는 문화에서 시드 삽입
<ol><li>에 12-잘 접시의 각 잘 멸 균 핀셋 (그림 1)으로 문화 삽입 전송. 핀셋을 사용 하 여 격판덮개의 표면에 그들을 해결 하기 위해 삽입 가장자리를 따라 누릅니다. 참고: 삽입 스티커 밑면 접착 수 있다.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56825/56825fig1.jpg"> 그림 1 : 12-잘 접시의 우물에 넣어 제대로 실리콘 문화 삽입의 도식 대표. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56825/56825fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<ol start="2"><li>제대로 MEMg 플러스 10%에 세포 현 탁 액을 희석 FBS. (약 실/3.5x104 셀) 셀 서 스 펜 션의 70 µ L로 삽입의 각 구획을 채우십시오. 참고: 각 구획에 적용 하는 셀의 밀도 세포의 종류에 따라 다릅니다. 합류 24 시간 이내 완료 리드 셀 밀도 사용 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>현미경, 셀 삽입 구획에서 유출 되지 하 고 37 ° C, 5% CO2에서 24 h에 대 한 12-잘 접시를 품 어 확인 합니다.</li>
</ol>3. 가짜 상처 치유 분석 결과
<ol><li>부 화, 후 confluent 셀 monolayers 형성 되었습니다 확인 하는 거꾸로 한 현미경 아래 셀을 시각화.</li>
	<li>다시 MEMg의 1 mL에 테스트 화합물 (예를 들어, 앰프)를 일시 중단 합니다. 참고:-20 ° c.에 저장 된 재고 솔루션에서 시작 하는 신선한 앰프 희석 준비</li>
	<li>부드럽게 멸 균 핀셋으로 삽입을 제거 합니다. 수 셀 monolayers 휴식 하지 않도록 주의 하십시오. 흡수 성 종이에 삽입 전송. 참고: 다시 사용 하려면 동일한 삽입, 소독 그들 적어도 3 h 70% 에탄올에. 이후에 멀리 그들을 던져 하는 것이 좋습니다.</li>
	<li>비 부착 한 세포를 제거 하는 micropipette를 사용 하 여 잘 당 MEMg의 1 mL를 추가 합니다. 접시를 닫고 부드럽게 바위. 참고: 팬 들은 그들의 혼란을 피하기 위해 셀 monolayers 위에 직접 매체의 정보를 추가 하지 마십시오.</li>
	<li>매체를 발음 하 고 잘 당 MEMg의 1 mL와 함께 그것을 대체. 접시를 닫고 비디오 카메라를 갖춘 4 배 확대에 거꾸로 현미경 (삽입 하 여 만든) 셀 무료 간격을 시각화 합니다. 이미지에서 시간 0 (T0)을.jpg 형식으로 그들을 저장 합니다.</li>
	<li>우물에서 매체를 제거 하 고 1 mL의 PBS와 함께 그들을 씻어 버리십시오.</li>
	<li>우물에 테스트 화합물 (포인트 3.2에서 준비)를 추가 합니다. 치료 컨트롤 샘플에 대 한 MEMg의 1 mL를 추가 합니다. 37 ° C, 5% CO2접시를 품 어.</li>
	<li>15, 20, 24 h 치료 후 셀 마이그레이션에 4 배 확대 현미경을 관찰 하 고 이미지. 참고:이 단계 동안 T0에 관해서는 동일한 지역에서 이미지를 캡처 하려고 합니다. 셀 이동 속도에 따라 이미지 캡처됩니다 시간 간격 선택 합니다.</li>
	<li>공부 하 고 몇 가지 선택적 저 해제의 효과, 즉 AG1478, 셀 마이그레이션에 삽입을 제거 하기 전에 각 삽입 구획에서 중간 발음.<ol>
<li>신선한 MEMg과 각 구획을 세척 하 고 MEMg AG1478와 보충의 70 µ L로 그것을 채우십시오.</li>
		<li>37 ° C, 5% CO2에서 외피의 30 분 후 포인트 3.3에서에서 설명 된 대로 진행 합니다. 참고: 세척 단계 및 특정 억제제와 셀 monolayers의 전처리 하는 동안 수 삽입을 제거 하지 않도록 주의 하십시오.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 이미지 분석
<ol><li>완료 되 면 실험, 다양 한 실험적인 그룹의 가장 대표적인 샘플의 이미지를 선택 하 고 T0, T15, T20, 및 T24 h에 단일 이미지를 포함 하는 zip 파일을 만듭니다. 참고: 단일 이미지 모든 샘플에 대 한 선택한 시간 간격에서가지고 간다. 세 번 이상 반복 되는 각 실험에 대 한 triplicates를 실행 합니다. 끝에서 모든 실험 그룹, 최소 3 이미지 ("a", "b", "c", 등등, 각각 독립적인 실험에서 파생)에 대 한 각 시간 지점에서 분석 된다.</li>
	<li>자동으로 선택한 시간 지점에서 (백분율로) 셀 적용 및 스크래치 영역의 실험 데이터를 포함 하는 스프레드시트 요약 파일 이메일로 제공 하는 이미지 분석 소프트웨어에 zip 파일을 업로드 합니다. 참고: 앞 가장자리와 격차 인식 크게 기반 edge 검출 방식 (포인트는 이미지 밝기 급격히 변경 식별 목적).</li>
	<li>데이터를 저장 하 고 그들을 수집 합니다. 시간 0에 평균 값에 따라 모든 데이터를 정상화. 상대 표준 오차 (SEM) 각 시간 지점에서 모든 복제의 정규화 된 데이터의 평균 값을 계산 합니다. 양방향 분산 분석 (ANOVA)을 사용 하 여 적절 한 통계 소프트웨어와 통계 분석을 수행 합니다. 펩 티 드 처리 그룹 및 다른 시간 간격 제어 그룹 사이 다름 간주 됩니다 통계적으로 p에 대 한 signiﬁcant < 0.05.</li>
	<li>선택한 시간 간격 모든 샘플 그룹 대 의 셀 적용 영역의 비율을 표시 한 히스토그램으로 얻은 데이터 그래프에 플롯 합니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Enyedi, B., Niethammer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+epithelial+wound+detection.">Mechanisms of epithelial wound detection.</a> Trends Cell Biol. 25, 398-407 (2015).</li><li>Kujath, P., Kujath, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Complicated+skin,+skin+structure+and+soft+tissue+infections+-+are+we+threatened+by+multi-resistant+pathogens?.">Complicated skin, skin structure and soft tissue infections - are we threatened by multi-resistant pathogens?.</a> Eur J Med Res. 15, 544-553 (2010).</li><li>Moreau-Marquis, S., Stanton, B. A., O'Toole, G. 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Implications for combination therapy with monoclonal antibody 806.</a> J Biol Chem. 282, 2840-2850 (2007).</li><li>Tokumaru, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+keratinocyte+migration+via+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor+by+the+antimicrobial+peptide+LL-37.">Induction of keratinocyte migration via transactivation of the epidermal growth factor receptor by the antimicrobial peptide LL-37.</a> J Immunol. 175, 4662-4668 (2005).</li><li>Tjabringa, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+antimicrobial+peptide+LL-37+activates+innate+immunity+at+the+airway+epithelial+surface+by+transactivation+of+the+epidermal+growth+factor+receptor.">The antimicrobial peptide LL-37 activates innate immunity at the airway epithelial surface by transactivation of the epidermal growth factor receptor.</a> J Immunol. 171, 6690-6696 (2003).</li><li>Di Grazia, A., Luca, V., Segev-Zarko, L. A., Shai, Y., Mangoni, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Temporins+A+and+B+stimulate+migration+of+HaCaT+keratinocytes+and+kill+intracellular+Staphylococcus+aureus.">Temporins A and B stimulate migration of HaCaT keratinocytes and kill intracellular Staphylococcus aureus.</a> Antimicrob Agents Chemother. 58, 2520-2527 (2014).</li></ol>

저자 공개할 게 없다

셀 마이그레이션 상처 치유, 배아 개발 및 암 전이 포함 하 여 많은 생리 적 및 병 적인 행사에 필수 과정입니다. 셀 마이그레이션에서 생체 외에서 기본적인 절차는 포함 한다: (i) 세포 단층, (ii) 셀, confluent 계층에는 의사의 생산의 창조 (iii) 캡처 이미지 상처까지 여러 시간 간격의 폐쇄에 도달 그리고 (iv) 선택한 셀의 마이그레이션 속도 측정 하기 위해 이미지 시퀀스의 분석.
<p class="jove...

동물에서 상처 치유 하는 것이 부상1무결성 및 조직 층의 정상 기능을 다시 설정 하는 기본 프로세스는 크게 알려져 있습니다. 물리적, 화학적 모욕에서 보호 장벽을 형성 상피 표면 외부 환경 (예를 들어, 호흡기, 피부 및 위장 책자)에 노출에 불구 하 고, 상처의 형성 수 있습니다 쉽게 발생 하는, 특히 후 수술 또는 미생물 감염2. 예를 들어, 기회 주의 세균성 병원 체 녹 농 균, 특히 낭 성 섬유 증 (CF) 환자에에서 의해 폐 조직의 식민 이끌어 낸다 필연적인 호흡3, 기도 상피 세포의 손상 4. 상처 치유 부상된 조직5의 정상적인 구조를 복원 하는 복잡 한 호스트 복구 메커니즘입니다. 그것은 초기 염증, 포괄 epithelialization, 신생, 콜라겐 생산 및 세포 분화6,7,8 개장 하는 조직 재생 기간 다음에 의해 특징 . 상피의 무결성을 보장 하 고 미생물 증식 제어 모든 살아있는 유기 체 방어 분자, 항균 성 펩 티 드 (암페어)9,10를 포함 하 여 생산. 상처 치유 과정은 체 외에서 세포 파편 및 다른 세포 유형 사이 복잡 한 상호 작용의 부족으로 인해 시뮬레이션 하기 매우 어렵습니다. 그러나, 생체 외에서 의 능력 펩 티 드를 자극 하 여 의사는 상처의 폐쇄를 가속 상피 세포의 손상 된 상피 세포를 치유 하는 능력의 지표입니다. 실제로, 셀 마이그레이션 상처 치유, 속도 제한 이벤트 이며 향상 된 상처 치유에 대 한 대상 치료에 도움이 될 것입니다 공부 셀 마이그레이션에 영향을 미칠 수 있는 요인.
여기, 높은 재현성 실험 분석 결과 셀 마이그레이션 시험관을 평가 하기 위해 특수 실리콘 문화 삽입에 따라 제공 됩니다. 그것은 500 μ m 간격 (의사 상처)에 confluent 셀 단층의 생성을 기반으로 합니다. 인공 "상처" 필드의 가장자리에 셀 셀 없는 지역으로 이주, 새로운 셀 연락처 형성 시작 됩니다. 문화 삽입 빠른 상처 치유 실험을 위한 새로운 도구를 나타냅니다. 500 μ m 벽으로 구분 된 두 개의 저수지 제공 됩니다, 그리고 그들이 배치 될 수 있습니다 제대로 3 cm 접시 접시 또는 12-잘 접시의 우물에서. 세포 현 탁 액으로 삽입의 각 구획을 작성 하면서 삽입의 제거 (분리 벽으로 동일한 폭) 약 500 μ m의 깨끗 한 셀 프리 갭 생기게 됩니다 합류까지 각 지정 된 지역에서 성장 하는 셀 수 있습니다. 보충 시험 화합물과 적절 한 세포 배양 접시에 다음 추가할 수 접시/잘. 나중에, 간격 폐쇄는 거꾸로 한 현미경, 이미지 수집에 대 한 비디오 카메라를 갖춘 선호 하나에서 다른 시간 간격 구상 될 수 있다. 마지막으로, 웹 기반 자동화 이미지 분석 프로그램에 의해 셀 적용 지역에 있는 변화의 측정 상처 폐쇄 및 세포 이동의 속도의 정량화를 허용할 것 이다. 전반적으로,이 방법은 고아 한 분석 결과, 스크래치를 무 균 바늘 confluent 셀 monolayers incising에 의해 수동으로 이루어집니다 또는 한 피 펫 팁11에 관하여 앞으로 단계입니다. 실제로, 마지막 절차 접시의 플라스틱 바닥을 파괴할 수 있는 플레이트/잘 하 고 주름을 만드는 표면 코팅. 또한, "상처" 지역은 없습니다, 간격의 전체 길이 따라 잘 정의 된 폭이 매우 바늘/팁에 연구원에 의해 적용 된 압력에 따라 달라 집니다. 또한, 빠질된 셀 스크래치;의 가장자리에서 생존 및 죽은 세포의 덩어리를 형성할 수 있다 또한, "상처" 영역으로 살아있는 세포의 확산 방해할 수 있습니다 세포 이동, 재현할 수 없는 결과12생성의 속도.
또한, 스크래치 이미지 분석 플랫폼 덕분에 사용자 빠르게 받을 수 (분) 이내 추가 소프트웨어를 습득의 필요성 없이 선택한 셀의 철새 행동에 양적 데이터. 이 플랫폼은 낮은 (~ 5 배)의 위상 대비 현미경 이미지, 중간 (~ 10 배), 및 높은 (~ 20 X) 확대 분석 가능 하다. Zip 파일 (*.jpg, *.jpeg, *.jp2, *.png, *.gif, *.tiff 형식)에서 이미지의 업로드 후 분석 자동으로 실시 셀 적용 지역 및 스크래치 영역 비율 뿐만 아니라 셀의 속도 보여 주는 요약 파일을 생성 하려면 마이그레이션, 고유 시간 간격입니다.
개구리 피부 앰프-파생, 즉 Esc(1-21) 및 그것의 diastereomer Esc(1-21)-1 c13및 표현 기능 CF 막 횡단 전도성 레 귤 레이 터 (CFTR)14,15, 기관지 세포 라인을 사용 하 여이 작품에 치료 (제어) 샘플에 비해 펩타이드-유도 된 세포 이동의 예로 제공 됩니다. 기도 상피 세포 및 CFTR 폐 기능을 유지 하는 중요 한 역할을 재생 및 수리16상처. 또한, 표 피 성장 인자 수용 체 (EGFR), 상기 펩 티 드에 의해 유도 된 기관지 세포의 마이그레이션 EGFR12의 활성화를 포함 하는 증거의 선택적 억제제 (예, AG1478)17 에 의하여 18 보고 됩니다.
요약 하자면,이 절차의 목표는 어떻게 이러한 실리콘 문화 삽입 사용 정확 하 게 부착 세포 (예를 들어, 기관지 상피 세포)와 분자의 결정을 신속 하 고 쉽게 접근할 수 있는 분석 결과 나타냅니다 표시 이러한 이벤트를 제어 하는 메커니즘.

<table><tbody><tr><td>Minimum essential medium (MEM)&amp;nbsp;</td><td>Euroclone</td><td>ECB2071L</td><td>Warm in 37 &amp;deg;C water bath before use</td></tr><tr><td>Glutamine</td><td>Euroclone</td><td>ECB3000D</td><td></td></tr><tr><td>Heat inactivated Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Euroclone</td><td>ECS0180DH&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Penicillin and Streptomycin</td><td>Euroclone</td><td>ECB3001D</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8833</td><td></td></tr><tr><td>Trypsin/EDTA 1X in PBS</td><td>Euroclone</td><td>ECB3052D</td><td>Warm at room temperature before use</td></tr><tr><td>DPBS without calcium and magnesium (CMF-PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>DPBS with calcium and magnesium (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Ibidi Culture-Insert 2 well</td><td>Ibidi&amp;nbsp;</td><td>80209</td><td></td></tr><tr><td>Wimasis Image Analysis</td><td>Ibidi&amp;nbsp;</td><td>30002</td><td></td></tr><tr><td>PRISM software&amp;nbsp;</td><td>GraphPad</td><td>version 6.0</td><td></td></tr></tbody></table>

a novel in vitro wound healing assay to evaluate cell migration

이 작품의 목표는 일부 immunomodulatory 분자, 항균 성 펩 티 드 (암페어) 셀 마이그레이션 자극 등의 능력을 평가 하는 새로운 방법을 보여줍니다. 중요 한 것은, 셀 마이그레이션은 속도 제한 이벤트를 조직 계층의 일반 기능과 무결성 손상 후 상처 치유 과정. 셀 단층에서 수동으로 만든된 스크래치에 기반은, 고전적인 분석 결과,이 방법의 장점은 특별 한 실리콘 문화의 사용 삽입 필드를 만드는 한 셀-무료 의사 상처 잘 정의 된 폭 (500 μ m 2 개의 구획을 제공 하는 ). 또한, 자동된 이미지 분석 플랫폼으로 그것은 빠르게 상처 폐쇄 및 세포 이동의 속도에 양적 데이터를 얻을 수 있습니다. 더 정확 하 게, 기관지 상피 세포의 마이그레이션에 두 개구리 피부 앰프의 효과가 표시 됩니다. 또한, 특정 억제제와 이러한 셀의 전처리 등 기본 분자 메커니즘에 정보를 제공 합니다.

이 프로토콜은 상처 치유 기능 CFTR 표현 하는 기관지 상피 세포에서 유도 된 세포 마이그레이션 활동 측면에서 Esc(1-21)와 Esc(1-21)-1 c의 효과 결정 하기 위해 사용 되었다. 이 분석 결과에서 문화 삽입 12-잘 접시의 우물에 배치 하 고 각 구획은 MEMg 10% 보충에 35000 셀 시드 FBS. 셀 24 h. 이내 완벽 한 합류를 나중에 도달, 500 μ m 간격 생성 된 고 각 잘 다른 농도에서 펩 티 드를 포?...

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A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

여기, 선물이 기관지 상피 세포의 마이그레이션에 펩 티 드의 효과 평가 하는 프로토콜. 이 메서드는 셀 마이그레이션 및 상처 폐쇄의 속도에 양적 데이터의 신속 하 고 재현성 높은 획득에 대 한 수 있습니다.

상처 치유 분석 결과 셀 마이그레이션 평가 하는 새로운 체 외에

The aim of this work is to show a novel method to evaluate the ability of some immunomodulatory molecules, such as antimicrobial peptides (AMPs), to ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

21.7K 조회수.  Sapienza University of Rome. 여기, 선물이 기관지 상피 세포의 마이그레이션에 펩 티 드의 효과 평가 하는 프로토콜. 이 메서드는 셀 마이그레이션 및 상처 폐쇄의 속도에 양적 데이터의 신속 하 고 재현성 높은 획득에 대 한 수 있습니다.

비디오: A Novel In Vitro Wound Healing Assay to Evaluate Cell Migration

Assessment of Endothelial Cell Migration After Exposure to Toxic Chemicals

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms including wound healing disorder. The physiological process of wound healing is highly complex. The formation of granulation tissue is a key step in this process resulting in a preliminary wound closure and providing a network of new capillary blood vessels &#8211; either through vasculogenesis (novel formation) or angiogenesis (sprouting of existing vessels). Both vasculo- and angiogenesis require functional, directed migration of endothelial cells. Thus, investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of chemical induced wound healing disorders and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention.
We assessed impaired wound healing after alkylating agent exposure and tested potential candidate compounds for treatment. We used a set of techniques outlined in this protocol. A modified Boyden chamber to quantitatively investigate chemokinesis of EEC is described. Moreover, the use of the wound healing assay in combination with track analysis to qualitatively assess migration is illustrated. Finally, we demonstrate the use of the fluorescent dye TMRM for the investigation of mitochondrial membrane potential to identify underlying mechanisms of disturbed cell migration. The following protocol describes basic techniques that have been adapted for the investigation of EEC.

Investigation of early endothelial cell (EEC) migration is important to understand the pathophysiology of certain illnesses and to potentially identify novel strategies for therapeutic intervention. The following protocol describes techniques to assess cell migration that have been adapted for the investigation of EEC.

유해 화학 물질에 노출 된 후 내피 세포 이동의 평가

Exposure to chemical substances (including alkylating chemical warfare agents like sulfur and nitrogen mustards) cause a plethora of clinical symptoms ...

연구

발생학

Evaluation of the Cell Invasion and Migration Process: A Comparison of the Video Microscope-based Scratch Wound Assay and the Boyden Chamber Assay

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration and invasion abilities to understand how cancer cells disseminate, with the aim of developing new treatment strategies. Analysis of the cellular and molecular basis of these abilities has led to the characterization of cell mobility and the physicochemical properties of the cytoskeleton and cellular microenvironment. For many years, the Boyden chamber assay and the scratch wound assay have been the standard techniques to study cell invasion and migration. However, these two techniques have limitations. The Boyden chamber assay is difficult and time consuming, and the scratch wound assay has low reproducibility. Development of modern technologies, especially in microscopy, has increased the reproducibility of the scratch wound assay. Using powerful analysis systems, an &#34;in-incubator&#34; video microscope can be used to provide automatic and real-time analysis of cell migration and invasion. The aim of this paper is to report and compare the two assays used to study cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and an optimized in vitro video microscope-based scratch wound assay.

This study reports two different methods for the analysis of cell invasion and migration: the Boyden chamber assay and the in vitro video microscope-based wound-healing assay. The protocols for these two experiments are described, and their benefits and disadvantages are compared.

셀 침공 및 마이그레이션 프로세스의 평가: 비디오 현미경-기반 스크래치의 비교 분석 결과 및 Boyden 챔버 분석 결과 상처

The invasion and migration abilities of tumor cells are main contributors to cancer progression and recurrence. Many studies have explored the migration ...

암 연구학

A Device for Performing Cell Migration/Wound Healing in a 96-Well Plate

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor metastasis. In this assay, cells are grown to form a confluent monolayer and a mechanical wound is created by scratching with a device. Then the migration rate of the cells towards the denuded area can be monitored by imaging. Our 8-channel mechanical wounder is designed to tackle most of the problems associated with the cell migration assay. Firstly, our wounder can be easily sterilized by autoclaving or with common disinfectants. Secondly, the individual adjustable pins allow even contact with the cell culture plate so that sharp and reproducible wounds can be created. Thirdly, the guiding bars on both sides of the wounder ensure consistent wounding position in each well. The use of disposable plastic pipette tips for wounding can further provide better handling of the wounder as well as to minimize cross-contamination. In conclusion, our cell wounder can provide researchers with a user friendly and reproducible device for performing the cell migration assay using the standard 96-well culture plate.

Here, we present a protocol to perform a semi-high throughput cell migration assay on a 96-well cell culture plate. This protocol is a fast, simple and economical method to create consistent scratch wounds on a cell monolayer.

96 웰 플레이트에 세포 마이그레이션 / 상처 치유를 수행하기위한 장치

The cell migration/wounding assay is a commonly used method to study cell migration and other biological processes, such as angiogenesis and tumor ...

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into changes in clinical standards used for treating wounds and decreasing morbidity and mortality for patients. Wound healing is a complex process that requires strategic cell and tissue interaction and function. One of the many critically important functions of wound healing is individual and collective cellular migration. Upon injury, various cells from the blood, surrounding connective, and epithelial tissues rapidly migrate to the wound site by way of chemical and/or physical stimuli. This migration response can largely dictate the outcomes and success of a healing wound. Understanding this specific cellular function is important for translational medicine that can lead to improved wound healing outcomes. Here, we describe a protocol used to better understand cellular migration as it pertains to wound healing, and how changes to the cellular environment can significantly alter this process. In this example study, dermal fibroblasts were grown in media supplemented with fetal bovine serum (FBS) as monolayer cultures in tissue culture flasks. Cells were aseptically transferred into tissue culture treated 12-well plates and grown to 100% confluence. Upon reaching confluence, the cells in the monolayer were vertically scratched using a p200 pipet tip. Arsenic diluted in culture media supplemented with FBS was added to individual wells at environmentally relevant doses ranging 0.1-10 &#956;M. Images were captured every 4 hours (h) over a 24 h period using an inverted light microscope to observe cellular migration (wound closure). Images were individually analyzed using image analysis software, and percent wound closure was calculated. Results demonstrate that arsenic slows down wound healing. This technique provides a rapid and inexpensive first screen for evaluation of the effects of contaminants on wound healing.

In Vitro Scratch Assay to Demonstrate Effects of Arsenic on Skin Cell Migration

This study focuses on an in vitro model of wound healing (scratch assay) as a mechanism for determining how environmental contaminants such as arsenic influence cellular migration. The results demonstrate that this in vitro assay provides rapid and early indications of changes to cellular migration prior to in vivo experimentation.

생체 외에서 피부 세포 마이그레이션에 비소의 효과 설명 하기 위해 분석 결과 스크래치

Understanding the physiologic mechanisms of wound healing has been the focus of ongoing research for many years. This research directly translates into ...

환경과학

Analysis of Cell Migration within a Three-dimensional Collagen Matrix

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic development, wound healing, and immune responses. However, cell migration is also a key mechanism in cancer enabling these cancer cells to detach from the primary tumor to start metastatic spreading. Within the past years various cell migration assays have been developed to analyze the migratory behavior of different cell types. Because the locomotory behavior of cells markedly differs between a two-dimensional (2D) and three-dimensional (3D) environment it can be assumed that the analysis of the migration of cells that are embedded within a 3D environment would yield in more significant cell migration data. The advantage of the described 3D collagen matrix migration assay is that cells are embedded within a physiological 3D network of collagen fibers representing the major component of the extracellular matrix. Due to time-lapse video microscopy real cell migration is measured allowing the determination of several migration parameters as well as their alterations in response to pro-migratory factors or inhibitors. Various cell types could be analyzed using this technique, including lymphocytes/leukocytes, stem cells, and tumor cells. Likewise, also cell clusters or spheroids could be embedded within the collagen matrix concomitant with analysis of the emigration of single cells from the cell cluster/ spheroid into the collagen lattice. We conclude that the 3D collagen matrix migration assay is a versatile method to analyze the migration of cells within a physiological-like 3D environment.

Cell migration is a biological phenomenon that is involved in a plethora of physiological, such as wound healing and immune responses, and pathophysiological processes, like cancer. The 3D-collagen matrix migration assay is a versatile tool to analyze the migratory properties of different cell types within in a 3D physiological-like environment.

세 가지 차원 콜라겐 매트릭스 내에서 세포의 이동 분석

The ability to migrate is a hallmark of various cell types and plays a crucial role in several physiological processes, including&#160;embryonic ...

생체공학

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on two-dimensional surfaces. However, the physiological environment in which in vivo wound healing takes place is three-dimensional rather than two-dimensional. It is becoming increasingly clear that cell behavior differs greatly in two-dimensional vs. three-dimensional environments; therefore, there is a need for more physiologically relevant in vitro models for studying cell migration behaviors in wound closure. The method described herein allows for the study of cell migration in a three-dimensional model that better reflects physiological conditions than previously established two-dimensional scratch assays. The purpose of this model is to evaluate cell outgrowth via the examination of cell migration away from a spheroid body embedded within a fibrin matrix in the presence of pro- or anti-migratory factors. Using this method, cell outgrowth from the spheroid body in a three-dimensional matrix can be observed and is easily quantifiable over time via brightfield microscopy and analysis of spheroid body area. The effect of pro-migratory and/or inhibitory factors on cell migration can also be evaluated in this system. This method provides researchers with a simple method of analyzing cell migration in three-dimensional wound associated matrices in vitro, thus increasing the relevance of in vitro cell studies prior to the use of in vivo animal models.

Characterizing Cell Migration Within Three-dimensional In Vitro Wound Environments

The goal of this protocol is to evaluate the effect of pro- and anti-migratory factors on cell migration within a three-dimensional fibrin matrix.

환경 상처 3 차원 생체 외에서 내 셀 마이그레이션 특성화

Currently, most in vitro models of wound healing, such as well-established scratch assays, involve studying cell migration and wound closure on ...

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During In Vitro Wound Healing

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated experimental procedures, while potentially lacking in precision. In vitro culture of epithelial cell lines provides a suitable platform for researching the cell migratory behavior in wound healing and the impact of treatments on these cells. The physiology of epithelial cells is often studied in non-confluent conditions; however, this approach may not resemble natural wound healing conditions. Disrupting the epithelium integrity by mechanical means generates a realistic model, but may impede the application of molecular techniques. Consequently, microscopy based techniques are optimal for studying epithelial cell migration in vitro. Here we detail two specific methods, the artificial wound scratch assay and the artificial migration front assay, that can obtain quantitative and qualitative data, respectively, on the migratory performance of epithelial cells.

Microscopy Based Methods for the Assessment of Epithelial Cell Migration During  In Vitro Wound Healing

This manuscript describes how incision-like lesions made on cultured epithelial cell monolayers conveniently model wound healing in vitro, allowing for imaging by confocal or laser scanning microscopy, and which can provide high-quality quantitative and qualitative data for studying both cell behavior and the mechanisms involved in migration.

현미경 기반 방법을 생체 외에서 상처 치유 중 상피 세포 이동의 평가 대 한

Cell migration is a mandatory aspect for wound healing. Creating artificial wounds on research animal models often results in costly and complicated ...

의학

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

In vitro Cell Migration and Invasion Assays

Commonly used, highly accessible methods for examining cell migration and invasion in vitro are described. The first method is the cell wound closure assay that measures cell motility. The second method is the transwell migration and invasion assay that assesses the chemotactic and invasive capacity of cells.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

생물학

Scratch Migration Assay and Dorsal Skinfold Chamber for In Vitro and In Vivo Analysis of Wound Healing

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective treatment. Appropriate in vitro and in vivo approaches are essential for the identification of new target molecules for drug treatments to improve the skin wound healing process. We identified the &#946;3 subunit of voltage-gated calcium channels (Cav&#946;3) as a potential target molecule to influence the wound healing in two independent assays, i.e., the in vitro scratch migration assay and the in vivo dorsal skinfold chamber model. Primary mouse embryonic fibroblasts (MEFs) acutely isolated from wild-type (WT) and Cav&#946;3-deficient mice (Cav&#946;3 KO) or fibroblasts acutely isolated from WT mice treated with siRNA to down-regulate the expression of the Cacnb3 gene, encoding Cav&#946;3, were used. A scratch was applied on a confluent cell monolayer and the gap closure was followed by taking microscopic images at defined time points until complete repopulation of the gap by the migrating cells. These images were analyzed, and the cell migration rate was determined for each condition. In an in vivo assay, we implanted a dorsal skinfold chamber on WT and Cav&#946;3 KO mice, applied a defined circular wound of 2 mm diameter, covered the wound with a glass coverslip to protect it from infections and desiccation, and monitored the macroscopic wound closure over time. Wound closure was significantly faster in Cacnb3-gene-deficient mice. Because the results of the in vivo and the in vitro assays correlate well, the in vitro assay may be useful for the high-throughput screening before validating the in vitro hits by the in vivo wound healing model. What we have shown here for wild-type and Cav&#946;3-deficient mice or cells might also be applicable for specific molecules other than Cav&#946;3.

Here, we present a protocol for an in vitro scratch assay using primary fibroblasts and for an in vivo skin wound healing assay in mice. Both assays are straightforward methods to assess in vitro and in vivo wound healing.

스크래치 마이그레이션 분석 및 등갈 피부 접기 챔버 에서 생체 외 및 상처 치유의 생체 내 분석

Impaired cutaneous wound healing is a major concern for patients suffering from diabetes and for elderly people, and there is a need for an effective ...

Optimized Scratch Assay for In Vitro Testing of Cell Migration with an Automated Optical Camera

Cell migration is an important process that influences many aspects of health, such as wound healing and cancer, and it is, therefore, crucial for developing methods to study the migration. The scratch assay has long been the most common in vitro method to test compounds with anti- and pro-migration properties because of its low cost and simple procedure. However, an often-reported problem of the assay is the accumulation of cells across the edge of the scratch. Furthermore, to obtain data from the assay, images of different exposures must be taken over a period of time at the exact same spot to compare the movements of the migration. Different analysis programs can be used to describe the scratch closure, but they are labor intensive, inaccurate, and forces cycles of temperature changes. In this study, we demonstrate an optimized method for testing the migration effect, e.g. with the naturally occurring proteins Human- and Bovine-Lactoferrin and their N-terminal peptide Lactoferricin on the epithelial cell line HaCaT. A crucial optimization is to wash and scratch in PBS, which eliminates the aforementioned accumulation of cells along the edge. This could be explained by the removal of cations, which have been shown to have an effect on keratinocyte cell-cell connection. To ensure true detection of migration, pre-treating with mitomycin C, a DNA synthesis inhibitor, was added to the protocol. Finally, we demonstrate the automated optical camera, which eliminates excessive temperature cycles, manual labor with scratch closure analysis, while improving on reproducibility and ensuring analysis of identical sections of the scratch over time.