The authors thank Mike Myles, Sam Saunders, and C.W. Elton at the ECU Multimedia &amp; Technology Services for providing assistance in video production. We acknowledge the grant support from North Carolina Biotechnology Center, Golfers against Cancer, Brody Brothers Endowment Fund, American Heart Association, and ECU/Vidant Cancer Research and Education Fund (L.V.Y. and M.J.R.).

1. 세포 배양 상처 봉합 분석 <ol><li> 트립신-EDTA 용액 0.25 %를 이용하여 조직 배양 플레이트로부터 세포를 분리. 원심 분리하여 15 ML 원뿔 관에서 펠렛 세포는, 뜨는을 대기음, 문화 매체에있는 세포를 다시 일시 중지합니다. 24 시간에 100 % 합류에 대한 6 - 웰 플레이트에 세포의 적절한 수의 접시. 주 : 시험 (예를 들어, 1 × 106 B16F10 흑색 종 세포의 우물에 시딩 의한 세포 분류와 잘 사용되는 크기로 100 % 합류점을 달성하기 위해 시간 및 셀의 개수를 결정하기 위해 필요할 수있다 6 잘 플레이트 전에 상처 발생 24 시간). 대안 적으로, 12 - 웰, 24 - 웰 플레이트가 사용될 수있다. 참고 : 가능한 경우, 세포는 상처 프리 캐스트를 만드는 처리 조직 배양 접시에 문화 삽입 (ibidi LLC부터)에 접종 할 수 있습니다. 문화 - 삽입 피펫 팁에 의해 손상으로부터 조직 배양 판의 표면을 보호 할 수 있습니다. 문화 삽입은 생략 단계를 사용하는 경우1.2. </li><li> 무균 환경에서 (일반적으로 바이오 안전성 후드) 조직 배양 플레이트의 상단에 단단히 눌러 200 μL 피펫 팁을 사용하여 신속하게 세포 단일 층을 통해 아래로 수직으로 상처를 확인합니다. 다른 크기의 피펫 팁이 요망되고 상처 크기를 만들기 위해 사용될 수있다. 그것은 표면에 손상을 줄 수 있으므로 피펫 팁으로 조직 배양 플레이트에 과도한 힘을 사용하지 마십시오. 상처 프리 캐스트의 경우,이 단계는 생략 될 수있다. </li><li> 조심스럽게 미디어와 세포 파편을 대기음. 천천히 웰의 바닥을 커버하고 추가적인 세포를 분리 피하기 위하여 잘 벽에 대해 충분히 배양 배지를 추가한다. 상처의 생성 및 검사에 따라 초기 사진이 촬영해야합니다. 적절한 온도와 CO 2 농도 설정 인큐베이터에서 조직 배양 접시를 놓습니다 (일반적으로 37 ° C와 5 % CO 2). </li><li> 여러 시점에서, 3 시간마다 예를 들면, incubat에서 플레이트를 분리또는 및 스냅 샷 사진을 촬영하고 상처 폐쇄를 확인하기 위해 거꾸로 현미경 아래에 배치합니다. 시간 경과 현미경을 사용할 수있는 경우 언제든지 온도 기간 및 CO 2 제어 챔버의 사진보기 (일반적으로 5 분마다 시작) 분마다 X 번호를 가지고. 세포의 종류에 따라, 상처 마감 시간이 다를 수 있습니다. </li><li> 스냅 사진의 결과를 분석하기 위해 눈금 막대를 사용하여 다른 상처의 일측의 거리를 측정한다. 산점도 또는 막대 그래프, 예를 들어 그림 1을 사용하여 분석하고 시간이 지남에 분명히 존재하는 상처 폐쇄. </li><li> 시간 경과 사진을 분석하기 위해 비디오를 만들기 위해 (http://rsb.info.nih.gov/ij/에서 자유롭게 사용 가능) ImageJ에 소프트웨어로 사진을 가져옵니다. 이 오픈 ImageJ에 작업을 수행하려면, 가져 오기를 클릭하고 이미지 시퀀스. 사진과 함께 파일을 찾기 파일의 첫 번째 사진을 클릭합니다. , 파일을 선택하여 동영상을 저장으로 저장되고, AVI. 단일 마이그레이션 세포 체인지에 관찰 할 수있다방향 움직임을 cterize. 또한, 이러한 lamellipodia는 형성과 후연 철회 등의 형태 학적 특성 (그림 2와 보조 비디오)뿐만 아니라 공부를 할 수있다. </li></ol> 2.없이 Transwell 세포의 이동과 침략 분석 <ol><li> 무균 환경 (일반적으로 생물 안전성 후드)에서 비 - 효소 적 세포 탈퇴 버퍼 또는 0.25 % 트립신-EDTA 용액, 펠렛 세포를 원심 분리에 의해를 사용하여 조직 배양 접시에서 세포를 분리하고, 기존의 미디어 펠렛 세포를두기 대기음. 0.1 % BSA (소 혈청 알부민)을 함유하는 무 혈청 세포 배양 배지에서 세포를 다시하는 것은 일시 중지. 참고 : 트립신-EDTA 인해 세포 표면 (17)에 다양한 수용체의 분열로 세포 이동 및 침윤에 영향을 미칠 수 0.25 %를 조사중인 세포주에 따라. 참고 : ML 당 세포의 수는 세포의 크기에 달려있다. 또한 테스트는 프로 시드의 밀도를 찾기 위해 필요할 수있다최상의 결과를 Vides의. 24 잘 삽입 트랜스 웰을 사용하는 경우 일반적으로 1 X 10 6 세포 / ML은 대부분의 세포 유형을위한 좋은 출발점이 될 것입니다. 트랜스 웰 인서트 크기들의 범위 및 추가 셀의 개수는 적절하게 조정되어야있다. </li><li> 플레이트 (100) 트랜스 웰 인서트의 필터 멤브레인 위에 셀 솔루션의 μL와 37 ° C에서 10 분 동안 배양하고 5 % CO 2 세포가 정착 할 수 있도록. 주 : 사용 된 트랜스 웰 막의 특정 기공 크기는 샘플에서 세포의 개별 크기에 의존한다. 세포가 너무 작은 경우, 예를 들어, 그들은 이동을 용이하게 할 필요없이 구멍을 통과하거나이 너무 큰 경우 그들은 세공을 맞지 않을 수도있다. 여러 트랜스 웰의 3 μm의 범위 기공 크기와 삽입, 5 μm의 및 세포 이동의 분석 8 μm의가 있습니다. 트랜스 웰 인서트는 코닝 같은 회사에서 상업적으로 이용 가능하다. 참고 : 트랜스 웰의 M을igration 분석은 쉽게 세포 침입 분석을 수행하기 위해 수정 될 수 있습니다. 이렇게 트랜스 웰 막 위에 세포 외 기질 (ECM) 물질을 추가 한 다음 ECM의 상단에 셀을 추가합니다. 예를 들어, 매트 리겔은 해동하고 얼음에 액화 한 후 마트 리젤 30-50 μL가 삽입 트랜스 웰 24 웰에 첨가하고, 얇은 겔층을 형성하기 위하여 15-30 분 동안 37 ° C의 배양기에서 고화. 세포 용액을 세포 외 기질을 통해 침입을 시뮬레이션하는 마트 리겔 코팅의 상부에 첨가된다. 참고 : 트랜스 웰의 세포 이동 및 트랜스 웰의 세포 침입 분석 사이에 뚜렷한 차이가 있습니다. 트랜스 웰의 세포 이동 분석은 화학 - 유인을 향한 세포의 화학 주성 능력을 측정합니다. 트랜스 웰 세포 침윤 분석은, 그러나, 일반적으로 세포 외 매트릭스와 암전 또는 배아 발달에서 발견되는 프로세스를 세포 주 화성 세포의 침윤을 모두 측정한다. </li><li> 피펫을 사용하여, 매우 carefully 24 웰 플레이트의 하부 챔버의 바닥으로 원하는 화학 - 유인의 600 μl를 추가합니다. 트랜스 웰 인서트를 이동하지 않고 화학 - 유인을 추가하고 거품을 생성하지 마십시오. 바닥 잘 화학 - 유인 액 화성 그라데이션을 형성하는 상부 잘 막과 접촉하게 확인하십시오. 배양 시간은 세포의 종류와 사용되는 화학 - 유인에 따라 달라집니다. 참고 : 또한 테스트 잠복기를 결정하기 위하여 필요할 수있다. 참고 : 부착 세포를 들어, 이주 세포 멤브레인 1,8의 타측에 부착된다. 이주 된 세포의 정량화는 단계 2.4 (2.4-2.8가 무균 환경에서 수행 할 필요가없는 단계) 2.8 다음을 행할 수있다. 비 부착 세포의 경우, 이주 된 세포는 하부 챔버의 미디어에 떨어질 것이다. 이주 된 세포의 수는 혈구 계를 이용하여 계산 또는 5 흐름 cytometer 수있다. </li><li> 플레이트에서 트랜스 웰 삽입물을 분리. 필요에 따라 신중하게 손상시키지 않고 멤브레인의 상단에서 마이그레이션되지 않은 미디어와 남아있는 세포를 제거하기 위해 여러 번 면봉을 사용합니다. </li><li> 24 웰 플레이트의 우물에 70 % 에탄올 600 ~ 1,000 μl를 추가합니다. 세포 고정을 할 수 있도록 10 분 동안 70 % 에탄올로 트랜스 웰 인서트를 놓습니다. 24 - 웰 플레이트에서 트랜스 웰 인서트를 제거하고 세포막의 상단에 남아있는 에탄올을 제거하기 위해 면봉을 사용합니다. 트랜스 웰의 막 (10-15 분) 건조하도록 허용합니다. </li><li> 24 - 웰 플레이트의 우물에 0.2 % 크리스탈 바이올렛의 600 ~ 1,000 μl를 추가하고 염색을 위해 그것으로 막을 놓습니다. 5 ~ 10 분 실온에서 알을 품다. </li><li> 부드럽게 피펫 팁이나 면봉으로 멤브레인의 상단에서 크리스탈 바이올렛을 제거합니다. 필요에 따라 매우 신중하게, 고정 된 세포를 세척 방지하기 위해 여분의 크리스탈 바이올을 제거하기 위해 여러 번 증류수로 막 찍어t. 트랜스 웰 막 건조 할 수 있습니다. </li><li> 보기 거꾸로 현미경 아래 및 화학 - 유인 향해 막을 통해 이주 및 멤브레인의 밑면 (도 3)에 부착 한 세포의 평균 합계를 얻기 위해 뷰의 다른 분야에서 세포의 수를 센다. </li></ol>

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The authors declare that they have no competing financial interests.

세포 이동은 암 연구에 연구하는 중요한 측면이며, 또한, 면역 발달 및 상처 치유의 연구에 적용될 수있다. 세포 배양은 폐쇄 분석 상처와 트랜스 웰의 세포 이동 및 침윤 분석 세포 이동성 행동의 자세한 정보를 공개하고 세포 이동 1,2,10,14의 분자 메커니즘을 조사하는 데 사용할 수 있습니다. 우리의 연구는 B16F10 흑색 종 세포주의 이동 속도 및 침윤 능력을 결정하기 위하여 이러한 세포 ?...

운동성 생균의 필수적인 특징이다. 세포 이동은 생활, 배아 발달, 면역 반응 및 암의 전이와 염증 1-9 많은 병적 인 프로세스의 개념에 참여하고있다. 따라서, 세포 이동성 행동을 연구하는 방법은 생명 과학, 생물학, 생명 공학 및 관련 분야의 분야의 광범위한 매우 유용한 연구 도구입니다. 암 환자에서 사망의 주원인은 전이 진행과 관련 될 때 암 연구에서 세포 이동의 연구는 특히 중요하다. 몸 전체에 확산 보급하는 암에 대한 위해, 암 세포가 이주해야하고 intravasate 혈액 순환에, 세포 외 기질 (ECM)을 통해 침입, 먼 사이트에 연결하고, 마지막으로 먼 초점 1,10-12을 형성하는 extravasate. 각종 생물학적 방법에서는 이러한 이벤트를 연구하는데 이용 될 수있다. 세포 배양 상처 폐쇄D 트랜스 웰 마이그레이션 및 침입 분석 널리 과학계 1,10에 사용됩니다. 이 테스트는 특정 세포 유형이 자발적으로 마이그레이션 또는 화학 - 유인에 반응하고 방향성을 향해 마이그레이션 할 수 있습니다 얼마나 잘 이해를 허용 할 수 있습니다 필요한 데이터를 제공 할 수 있습니다. 여러 철새 표현형은 설명 하였다. 세포는 중간 엽 또는 아메바 같은 운동이나 13 스트리밍 집단 이주 또는 셀을 표시 다세포 움직임으로 볼과 같은 단일 셀 형태로 마이그레이션 할 수 있습니다. 운동성 전지에 사용 운동의 방법은 쉽게 세포 배양 상처 봉합 분석을 이용하여 관찰 될 수있다. 세포의 이동을 연구하는 여러 가지 방법 중, 세포 상처 봉합 분석은 간단한 중 하나입니다. 이 방법은 전체 세포 덩어리의 이동 능력을 결정하는 데 유용합니다. 한 단계 더 촬영하면 이주 14시 개별 세포의 형태 학적 특징을 관찰 할 수 있습니다. 상처 봉합의 분석을 다음과 같은 여러 표현형은 공개 할 수있다. 컨트롤에 비교할 때 시간이 지남에 따라 폐쇄 된 거리를 측정하는 것은 특정 마이그레이션 변경 또는 이전에 알려지지 않은 장애인 철새 표현형을 보여줄 수 있습니다. 또한, 단일 세포 lamellipodium 형성, 꼬리 후퇴 및 방향 움직임은 관심 (14)의 세포에 손상 또는 향상 될 수 있습니다 무엇에 대한 단서를 제공 할 수 있습니다. 트랜스 웰 이주 및 침윤 분석법은 방향성 그들이 케모카인, 성장 인자, 지질, 또는 뉴클레오티드 4,5,8,15,16 여부 여러가지 항암 화학 유인 제에 응답하는 단일 세포의 능력을 분석하기 위해 사용될 수있다. 또한 인해 1,14 수용체의 과발현으로 차동 이동성 능력을 평가할 수있다. 이러한 분석은 또한 작은 GTPases 2 RHO 가족 같은 세포 이동의 주요 레귤레이터를 식별하고 특성화하기 위해 사용될 수있다. 액세서 쉽게이 짧고 다음sible 검사, 세포 이동의 모드와 3-D 행렬로 침입하는 세포의 능력이 또한 결정될 수있다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="601">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">Dulbecco&#8217;s modified Eagle medium (DMEM)</td>
			<td style="width:133px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">11995-073</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">Fetal bovine serum (FBS)</td>
			<td style="width:133px;">Gemini</td>
			<td style="width:107px;">100106</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">Bovine serum albumin (BSA)</td>
			<td style="width:133px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:107px;">A4503-50G</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:169px;">Trypsin EDTA 0.25%</td>
			<td style="width:133px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">25200-056</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">Dulbecco&#8217;s phosphate buffered saline (DPBS)</td>
			<td style="width:133px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">14190-250</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:169px;">Crystal violet</td>
			<td style="width:133px;">Sigma</td>
			<td style="width:107px;">C0775-100G</td>
			<td style="width:193px;">Dissolved in water at 0.2%</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">Cell disassociation buffer</td>
			<td style="width:133px;">Gibco</td>
			<td style="width:107px;">13151-014</td>
			<td style="width:193px;"></td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">Cell culture incubator</td>
			<td style="width:133px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:193px;">Model # 3145</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">SterilGARD biosafety hood</td>
			<td style="width:133px;">The Baker Company, Inc.&#160;</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:193px;">Model # VBM-600</td>
		</tr>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:169px;">EVOS Fl inverted microscope</td>
			<td style="width:133px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:107px;"></td>
			<td style="width:193px;">Model # AMF-4302-US</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:169px;">Tissue culture plate</td>
			<td style="width:133px;">Becton Dickinson</td>
			<td style="width:107px;">353046</td>
			<td style="width:193px;">Catalog number varies depending on the type of culture plate</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="63" rowspan="2" style="height:63px;width:169px;">Corning Transwell insert</td>
			<td rowspan="2" style="width:133px;">Fisher</td>
			<td rowspan="2" style="width:107px;">07-200-150</td>
			<td rowspan="2" style="width:193px;">Catalog number varies depending on the pore size of the membrane</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro cell migration and invasion assays

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and inflammation. Methods to examine cell migration are very useful and important for a wide range of biomedical research such as cancer biology, immunology, vascular biology, cell biology and developmental biology. Here we use tumor cell migration and invasion as an example and describe two related assays to illustrate the commonly used, easily accessible methods to measure these processes. The first method is the cell culture wound closure assay in which a scratch is generated on a confluent cell monolayer. The speed of wound closure and cell migration can be quantified by taking snapshot pictures with a regular inverted microscope at several time intervals. More detailed cell migratory behavior can be documented using the time-lapse microscopy system. The second method described in this paper is the transwell cell migration and invasion assay that measures the capacity of cell motility and invasiveness toward a chemo-attractant gradient. It is our goal to describe these methods in a highly accessible manner so that the procedures can be successfully performed in research laboratories even just with basic cell biology setup.

여기에 제시된 상처 봉합 분석 및 트랜스 웰의 세포 이동 분석법이 모델 시스템으로 마우스 B16F10 흑색 종 세포를 이용하여 수행 하였다. 상처 봉합 분석에서, B16F10 세포를 10 - 웰 조직 배양 접시에 접종하고, 24 시간에 100 % 합류로 성장시킨다. 약 700 μm의 폭의 상처는 시간 경과 현미경을 사용하여 촬영 한 피펫 팁과 상처 봉합 (세포의 이동)를 사용하여 생성되었습니다. 또한, 상처 폐쇄는 시간 경?...

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In vitro Cell Migration and Invasion Assays

일반적으로 사용되는 체외에서 세포의 이동 및 침윤을 조사하기위한 고도의 접근 방법이 설명되어 있습니다. 첫 번째 방법은 세포 운동성을 측정하는 세포 상처 폐쇄 분석이다. 두 번째 방법은 화성과 세포의 침략적인 능력을 평가하는 트랜스 웰 마이그레이션 및 침입 분석이다.

체외 세포 이동 및 내습 분석 실험에서

Migration is a key property of live cells and critical for normal development, immune response, and disease processes such as cancer metastasis and ...

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In vitro Cell Migration and Invasion Assays

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Cell Polarization and Migration

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136.8K 조회수.  East Carolina University.  일반적으로 사용되는 체외에서 세포의 이동 및 침윤을 조사하기위한 고도의 접근 방법이 설명되어 있습니다. 첫 번째 방법은 세포 운동성을 측정하는 세포 상처 폐쇄 분석이다. 두 번째 방법은 화성과 세포의 침략적인 능력을 평가하는 트랜스 웰 마이그레이션 및 침입 분석이다. 

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Assay for Adhesion and Agar Invasion in S. cerevisiae

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, biofilms can reduce industrial productivity, destroy structures, and threaten human life. 1-3 On the other hand, harnessing the power of biofilms can help clean the environment and generate sustainable energy. 4-8
The ability of S. cerevisiae to colonize surfaces and participate in complex biofilms was mostly ignored until the rediscovery of the differentiation programs triggered by various signaling pathways and environmental cues in this organism. 9, 10 The continuing interest in using S. cerevisiae as a model organism to understand the interaction and convergence of signaling pathways, such as the Ras-PKA, Kss1 MAPK, and Hog1 osmolarity pathways, quickly placed S. cerevisiae in the junction of biofilm biology and signal transduction research. 11-20 To this end, differentiation of yeast cells into long, adhesive, pseudohyphal filaments became a convenient readout for the activation of signal transduction pathways upon various environmental changes. However, filamentation is a complex collection of phenotypes, which makes assaying for it as if it were a simple phenotype misleading. In the past decade, several assays were successfully adopted from bacterial biofilm studies to yeast research, such as MAT formation assays to measure colony spread on soft agar and crystal violet staining to quantitatively measure cell-surface adherence. 12, 21 However, there has been some confusion in assays developed to qualitatively assess the adhesive and invasive phenotypes of yeast in agar.
Here, we present a simple and reliable method for assessing the adhesive and invasive quality of yeast strains with easy-to-understand steps to isolate the adhesion assessment from invasion assessment. Our method, adopted from previous studies, 10, 16 involves growing cells in liquid media and plating on differential nutrient conditions for growth of large spots, which we then wash with water to assess adhesion and rub cells completely off the agar surface to assess invasion into the agar. We eliminate the need for streaking cells onto agar, which affects the invasion of cells into the agar. In general, we observed that haploid strains that invade agar are always adhesive, yet not all adhesive strains can invade agar medium. Our approach can be used in conjunction with other assays to carefully dissect the differentiation steps and requirements of yeast signal transduction, differentiation, quorum sensing, and biofilm formation.

We describe a qualitative assay for yeast adhesion and agar invasion as a measure of invasive and pseudohyphal differentiation. This simple assay can be used to assess the invasive phenotype of various mutants as well as the effects environmental cues and signaling pathways on yeast differentiation.

S. cerevisiae의의 접착 및 아가르 침략을위한 분석

Yeasts are found in natural biofilms, where many microorganisms colonize surfaces. In artificial environments, such as surfaces of man-made objects, ...

연구

생물학

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical shock or electrical stimulation is available for study of various aspects of seizure activity and behavior. All flies, including wild-type, will undergo seizure-like activity if stimulated at a high enough voltage. Seizure like activity is an all-or-nothing response and each genotype has a specific seizure threshold. The seizure threshold of a specific genotype of fly can be altered either by treatment with a drug or by genetic suppression or enhancement. The threshold is easily measured by electrophysiology. Seizure-like activity can be induced via high frequency electrical stimulation delivered directly to the brain and recorded through the dorsal longitudinal muscles (DLMs) in the thorax. The DLMs are innervated by part of the giant fiber system. Starting with low voltage, high frequency stimulation, and subsequently raising the voltage in small increments, the seizure threshold for a single fly can be measured.

Neurocircuit Assays for Seizures in Epilepsy Mutants of Drosophila

Using high frequency electrical stimulation, seizure-like activity can be induced in Drosophila. This activity is easily recorded from the giant fiber system.

의 간질 발작의 돌연변이에 대한 Neurocircuit의 Assays Drosophila</em

Drosophila melanogaster is a useful tool for studying seizure like activity. A variety of mutants in which seizures can be induced through either physical ...

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to both secrete proteases that break down the basement membrane as well as migrate in order to be invasive. BD BioCoat Tumor Invasion System provides cells with conditions that allow assessment of their invasive property in vitro1,2. It consists of a BD Falcon FluoroBlok 24-Multiwell Insert Plate with an 8.0 micron pore size PET membrane that has been uniformly coated with BD Matrigel Matrix. This uniform layer of BD Matrigel Matrix serves as a reconstituted basement membrane in vitro providing a true barrier to non-invasive cells while presenting an appropriate protein structure to study invasion. The coating process occludes the pores of the membrane, blocking non-invasive cells from migrating through the membrane. In contrast, invasive cells are able to detach themselves from and migrate through the coated membrane. Quantitation of cell invasion can be achieved by either pre- or post-cell invasion labeling with a fluorescent dye such as DiIC12(3) or calcein AM, respectively, and measuring the fluorescence of invading cells. Since the BD FluoroBlok membrane effectively blocks the passage of light from 490-700 nm at &gt;99% efficiency, fluorescently-labeled cells that have not invaded are not detected by a bottom-reading fluorescence plate reader. However, cells that have invaded to the underside of the membrane are no longer shielded from the light source and are detected with the respective plate reader. This video demonstrates an endpoint cell invasion assay, using calcein AM to detect invaded cells.

An In vitro FluoroBlok Tumor Invasion Assay

This video demonstrates how to measure cell invasion through cell culture inserts using a fluorescence-based methodology.

체외에서 FluoroBlok 종양의 침략 분석

The hallmark of metastatic cells is their ability to invade through the basement membrane and migrate to other parts of the body. Cells must be able to ...

Rapid Homogeneous Detection of Biological Assays Using Magnetic Modulation Biosensing System

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or separation step. When the IL-8 target was present, a 'sandwich'-based assay attached magnetic beads with IL-8 capture antibody to streptavidin coupled fluorescent protein via the IL-8 target and a biotinylated IL-8 antibody. The magnetic beads are maneuvered into oscillatory motion by applying an alternating magnetic field gradient through two electromagnetic poles. The fluorescent proteins, which are attached to the magnetic beads are condensed into the detection area and their movement in and out of an orthogonal laser beam produces a periodic fluorescent signal that is demodulated using synchronous detection. The magnetic modulation biosensing system was previously used to detect the coding sequences of the non-structural Ibaraki virus protein 3 (NS3) complementary DNA (cDNA) [2]. The techniques that are demonstrated in this work for external manipulation and condensation of particles may be used for other applications, e.g. delivery of magnetically-coupled drugs in-vivo or enhancing the contrast for in-vivo imaging applications.

Magnetic modulation biosensing system is utilized to rapidly, sensitively and simply detect biological assays, such as DNA molecules and proteins.

자기 변조 Biosensing 시스템을 사용하여 생물 학적 Assays의 급속한 동차 검색

A magnetic modulation biosensing system (MMB) [1,2] rapidly and homogeneously detected biological targets at low concentrations without any washing or ...

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal regeneration and sprouting by secreting growth factors 1,2 and providing growth promoting adhesion molecules 3 and extracellular matrix molecules 4. In addition they myelinate the demyelinated axons at the site of injury 5.
However following transplantation, Schwann cells do not migrate from the site of implant and do not intermingle with the host astrocytes 6,7. This results in formation of a sharp boundary between the Schwann cells and astrocytes, creating an obstacle for growing axons trying to exit the graft back into the host tissue proximally and distally. Astrocytes in contact with Schwann cells also undergo hypertrophy and up-regulate the inhibitory molecules 8-13.
In vitro assays have been used to model Schwann cell-astrocyte interactions and have been important in understanding the mechanism underlying the cellular behaviour.
These in vitro assays include boundary assay, where a co-culture is made using two different cells with each cell type occupying different territories with only a small gap separating the two cell fronts. As the cells divide and migrate, the two cellular fronts get closer to each other and finally collide. This allows the behaviour of the two cellular populations to be analyzed at the boundary. Another variation of the same technique is to mix the two cellular populations in culture and over time the two cell types segregate with Schwann cells clumped together as islands in between astrocytes together creating multiple Schwann-astrocyte boundaries.
The second assay used in studying the interaction of two cell types is the migration assay where cellular movement can be tracked on the surface of the other cell type monolayer 14,15. This assay is commonly known as inverted coverslip assay. Schwann cells are cultured on small glass fragments and they are inverted face down onto the surface of astrocyte monolayers and migration is assessed from the edge of coverslip.
Both assays have been instrumental in studying the underlying mechanisms involved in the cellular exclusion and boundary formation. Some of the molecules identified using these techniques include N-Cadherins 15, Chondroitin Sulphate proteoglycans(CSPGs) 16,17, FGF/Heparin 18, Eph/Ephrins19.
This article intends to describe boundary assay and migration assay in stepwise fashion and elucidate the possible technical problems that might occur.

Analysis of Schwann-astrocyte Interactions Using In Vitro Assays

This article intends to describe in stepwise fashion the commonly used in vitro assays used in studying Schwann cell-asrtocyte interactions.

사용 Schwann - astrocyte 상호 작용 분석 체외에서 Assays

Schwann cells are one of the commonly used cells in repair strategies following spinal cord injuries. Schwann cells are capable of supporting axonal ...

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of hyperphosphorylated tau protein in the form of neurofibrillary tangles (NFTs). The density of NFT correlates well with cognitive impairment and other neurodegenerative symptoms, thus prompting the endeavor of developing tau aggregation-based therapeutics. Thus far, however, tau aggregation assays use recombinant or synthetic tau that is devoid of the pathology-related phosphorylation marks. Here we describe two assays using recombinant, hyperphosphorylated tau as the subject. These assays can be scaled up for high-throughput screens for compounds that can modulate the kinetics or stability of hyperphosphorylated tau aggregates. Novel therapeutics for Alzheimer's disease and other tauopathies can potentially be discovered using hyperphosphorylated tau isoforms.

In Vitro Aggregation Assays Using Hyperphosphorylated Tau Protein

Unmodified and hyperphosphorylated tau proteins were used in two in vitro aggregation assays to reveal the hyperphosphorylation-dependent fast aggregation kinetics. These assays pave the way for future screens for compounds that can modulate the propensity of hyperphosphorylated tau to form fibrils that underlie the progression of Alzheimer&#8217;s disease.

생체 외 분석에서 집계 Hyperphosphorylated 타우 단백질을 사용하여

Alzheimer's disease is one of a large group of neurodegenerative disorders known as tauopathies that are manifested by the neuronal deposits of ...

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound responses and repair in this model have illuminated our understanding of the cytoskeletal and genomic responses to tissue damage. The two most commonly used methods to wound the C. elegans adult skin are pricks with microinjection needles, and local laser irradiation. Needle wounding locally disrupts the cuticle, epidermis, and associated extracellular matrix, and may also damage internal tissues. Laser irradiation results in more localized damage. Wounding triggers a succession of readily assayed responses including elevated epidermal Ca2+ (seconds-minutes), formation and closure of an actin-containing ring at the wound site (1-2 hr), elevated transcription of antimicrobial peptide genes (2-24 hr), and scar formation. Essentially all wild type adult animals survive wounding, whereas mutants defective in wound repair or other responses show decreased survival. Detailed protocols for needle and laser wounding, and assays for quantitation and visualization of wound responses and repair processes (Ca dynamics, actin dynamics, antimicrobial peptide induction, and survival) are presented.

Methods for Skin Wounding and Assays for Wound Responses in C. elegans

The adult C. elegans skin is a tractable model for studies of epithelial wound responses, including wound closure, scar formation, and innate immunity.

에 상처 응답에 대한 피부 상처에 대한 방법 및 분석 실험<em&gt; C. 엘레</em

The C. elegans epidermis and cuticle form a simple yet sophisticated skin layer that can repair localized damage resulting from wounding. Studies of wound ...

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This occurs when endothelial cells, which line blood vessels, become adhesive to circulating immune cells such as monocytes. In vitro measurement of this adhesiveness has until now been done by quantifying the total number of monocytes that adhere to an endothelial layer either as a direct count or by indirect measurement of the fluorescence of adherent monocytes. While such measurements do indicate the average adhesiveness of the endothelial cell population, they are confounded by a number of factors, such as cell number, and do not reveal the proportion of endothelial cells that are actually adhesive. Here we describe and demonstrate a method which allows the enumeration of adhesive cells within a tested population of endothelial monolayer. Endothelial cells are grown on glass coverslips and following desired treatment are challenged with monocytes (that may be fluorescently labeled). After incubation, a rinsing procedure, involving multiple rounds of immersion and draining, the cells are fixed. Adhesive endothelial cells, which are surrounded by monocytes are readily identified and enumerated, giving an adhesion index that reveals the actual proportion of endothelial cells within the population that are adhesive.

Quantitation of Endothelial Cell Adhesiveness In Vitro

We report an in vitro method that allows the quantitation of the actual number of adhesive cells within an endothelial cell monolayer.

내피 세포 접착 정량<em&gt; 체외</em

One of the cardinal processes of inflammation is the infiltration of immune cells from the lumen of the blood vessel to the surrounding tissue. This ...

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity greatly impacts cell behavior to regulate normal and pathologic processes including cell proliferation, differentiation, adhesion signaling and directional migration. In this regard, the innate ability of certain cell types to migrate towards a stiffer, or less compliant matrix substrate is referred to as durotaxis. This phenomenon plays an important role during embryonic development, wound repair and cancer cell invasion. Here, we describe a straightforward assay to study durotaxis, in vitro, using polydimethylsiloxane (PDMS) substrates. Preparation of the described durotaxis chambers creates a rigidity interface between the relatively soft PDMS gel and a rigid glass coverslip. In the example provided, we have used these durotaxis chambers to demonstrate a role for the cdc42/Rac1 GTPase activating protein, cdGAP, in mechanosensing and durotaxis regulation in human U2OS osteosarcoma cells. This assay is readily adaptable to other cell types and/or knockdown of other proteins of interests to explore their respective roles in mechanosignaling and durotaxis.

A Simplified System for Evaluating Cell Mechanosensing and Durotaxis In Vitro

Many mammalian cells preferentially migrate towards a more rigid matrix or substrate through durotaxis. The goal of this protocol is to provide a simple in vitro system that can be used to study and manipulate cell durotaxis behaviors by incorporating polydimethylsiloxane (PDMS) substrates of defined rigidity, interfacing with glass coverslips.

평가 셀 Mechanosensing 및 Durotaxis에 대한 단순화 된 시스템<em&gt; 체외</em

The composition and mechanical properties of the extracellular matrix are highly variable between tissue types. This connective tissue stroma diversity ...

A Customizable Chamber for Measuring Cell Migration

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between cells, the extracellular matrix, and soluble and non-soluble chemical factors (e.g., chemoattractants). Standard methods for measuring the migration of cells, such as the Boyden chamber assay, work by counting cells on either side of a divider. These techniques are easy to use; however, they offer little geometric modification for different applications. In contrast, microfluidic devices can be used to observe cell migration with customizable concentration gradients of soluble factors1,2. However, methods for making microfluidics based assays can be difficult to learn.
Here, we describe an easy method for creating cell culture chambers to measure cell migration in response to chemical concentration gradients. Our cell migration chamber method can create different linear concentration gradients in order to study cell migration for a variety of applications. This method is relatively easy to use and is typically performed by undergraduate students.
The microchannel chamber was created by placing an acrylic insert in the shape of the final microchannel chamber well into a Petri dish. After this, poly(dimethylsiloxane) (PDMS) was poured on top of the insert. The PDMS was allowed to harden and then the insert was removed. This allowed for the creation of wells in any desired shape or size. Cells may be subsequently added to the microchannel chamber, and soluble agents can be added to one of the wells by soaking an agarose block in the desired agent. The agarose block is added to one of the wells, and time-lapse images can be taken of the microchannel chamber in order to quantify cell migration. Variations to this method can be made for a given application, making this method highly customizable.

This protocol details a customizable method to measure cell migration in response to chemoattractants that may also be used to determine the diffusion rate of a drug out of a polymer matrix.

측정 셀 마이그레이션에 대한 사용자 정의 상공 회의소

Cell migration is a vital part of immune responses, growth, and wound healing. Cell migration is a complex process that involves interactions between ...