Name: isolation and culture of primary mouse keratinocytes from neonatal and adult mouse skin
Uploaded: 2017-07-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 51 s
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이 연구는 내과학 연구소 (R01AR069653 to Zhang LJ)와 국립 보건원 (National Institute of Health Support) (5T32AR062496-03 to CA)에 의해 지원되었습니다.

모든 동물 실험은 UCSD 기관 동물 관리 및 사용위원회의 승인을 받았습니다. 1. 신생아 피부로부터의 일차 마우스 KC 분리 및 배양 <ol><li> C57B / 6 wildtype 마우스의 출생 후의 0-2 신생아를 가위로 목을 베고 희생시킵니다. 손목과 발목 관절 바로 위의 팔다리를 잘라 낸 다음 작은 구멍을 남기고 꼬리를 완전히 잘라냅니다. </li><li> 전체 피부를 벗기기 위해서는 먼저 날카로운 가위를 꼬리 부분의 구멍을 통해 삽입하고 몸의 등쪽 중간 선을 따라 피부를 목에있는 구멍으로 자릅니다. 다음으로, 한 포셉을 사용하여 노출 된 몸체와 다른 포셉을 잡고 피부를 잡아 당기고 몸 전체의 피부를 부드럽게 껍질을 벗기고 다리 운동을하면서 하나의 연속 동작으로 껍질을 벗깁니다. <ol><li> 손상되지 않은 부분으로 피부를 떼어 내고 피부를 부러지지 않도록주의하십시오. 그러면 디스펜스 단계에서 세포가 손실 될 수 있습니다. </li></ol></li> &lt;li&gt; 10cm 페트리 접시에 멸균 PBS 15 ML로 벗겨 피부를 씻어 다음 KC 성장 매체에 4 MG / ML dispase를 포함 얼음 차가운 dispase 소화 버퍼로 가득 2 ML 튜브에 각 강아지의 피부를 놓으십시오 (KC 기초 배지는 0.06 mM의 CaCl2를, DGS, 및 항생제 / 항진균제를 갖는다). 참고 : 다중 피부 분리 물을 혼합하여 12 mL 디스펜스 용액이 들어있는 1 개의 15 mL 튜브 (튜브 당 최대 5 개의 스킨)에서 배양 할 수 있습니다. 회 전자에 4 ° C 냉장고에서 하룻밤 피부 튜브를 품어. <ol><li> 피부가 접히지 않도록주의하십시오. 접힌 부위가 dispase 용액에 충분히 노출되지 않습니다. </li></ol></li><li> 다음날 (12-18 시간 후) 디스 페아 제 용액과 함께 피부를 페트리 접시에 옮기십시오. 여분의 dispase 멀리 씻어 15 ML 멸균 PBS와 새로운 페트리 접시에 각 조직 조각을 전송하십시오. </li><li> 포셉의 두 쌍을 사용하여, PBS에서 피부를 파악,피부를 들어 올리고 표피면을 아래로하고 진피면을 위로하여 새로운 페트리 접시로 옮깁니다. 조심 스레 피부 주름을 스트레치하여 페트리 접시에서 완전히 확장되도록하십시오. </li><li> 새로운 페트리 접시에 각 피부에 대한 트립신 기반 소화 솔루션 500 μL를 놓으십시오. 겸자를 사용하여 천천히 표피를 아래로 들어 올리면서 표피를 들어 올리십시오. 진피를 생물학적 위험 물질로 폐기하십시오. 분리 된 표피를 옮기고 기본 층이 아래쪽에있는 트립신 용액의 각 방울에 부유시킨다. <ol><li> 표피가 트립신 솔루션에 접혀 있다면, 상피에서 기본 KCs의 효율적인 소화를 보장하기 위해 집게를 사용하여 모든 주름을 제거합니다. </li></ol></li><li> 20 분 동안 온화한 교반과 수평 쉐이크에 실온 (뚜껑을 덮은 상태로) 트립신 솔루션의 페트리 접시에 피부를 품어. </li><li> 표피 당 보충 된 KC 성장 배지 2 mL를 첨가한다.표피)를 배양 접시에 첨가 하였다. 겸자를 사용하여 표피를 잡고 앞뒤로 활발히 표피를 문질러 표피 시트에서 단일 세포를 릴리스하십시오. <ol><li> 세포가 표피에서 분리되면 서서히 흐려지는 것을보십시오. 페트리 접시를 기울여 접시에 남아있는 표피 시트를 떠나는 새로운 튜브에 세포 현탁액을 수집하고 전송하십시오. </li></ol></li><li> 2 ML KC 성장 매체를 추가 한 후 표피 시트의 마찰을 두 번 더 반복하고 같은 튜브에 세포 suspensions를 결합. </li><li> 적절한 혈청 피펫을 사용하여 세포 덩어리를 깰 수 있도록 세포 솔루션을 부드럽게 몇 번 피펫 쳐서 새로운 50 mL 원심 튜브에 100 μm 필터를 통과시킵니다. </li><li> 180 X g에서 5 분 동안 여과 된 세포를 원심 분리하십시오. </li><li> 뜨는에서 대기음과 부드럽게 1 ML 차가운 KC 성장 매체 / 표피에있는 세포 펠렛을 resuspend. </li><li> hemocytometer로 세포를 센다. <br/&gt; 참고 : KC는 자연히 현탁액에서 분화 할 수 있으므로 세포가 최적의 성능을 발휘할 수 있도록 격리 후 가능한 한 빨리 세포를 플레이 팅해야합니다. 우리는 KC 자발 분화 속도를 줄이기 위해 셀을 얼음 위에 놓는 것이 좋습니다. </li><li> 세포 부착을 촉진 세포 외 매트릭스 (ECM) 제품으로 미리 코팅 문화 요리에 KC 성장 매체 5 X 10 4 / cm 2 의 밀도로 세포를 씨앗. 주 : 우리는 ()를 참조 물질의 표를 참조 젤라틴 계 도료는 상용 가능한 (예를 들어 부착 요소를 사용하여 세포를 37 ℃에서 5 % CO 2의 가습 배양기에서 배양하고, 새로운 배지이었다. 격일로 보충했다. <ol><li> 코팅을 위해, 세포 시딩 이전에 10 분 내지 2 시간 동안 실온으로 가온 된 세포 부착 코팅 물질로 배양 접시를 코팅한다. 직전에 부착 요소를 제거하십시오.세포 현탁액을 추가. </li></ol></li><li> 초기 도금 후 매체를 변경하여 연결되지 않은 세포를 제거하고 세포가 실험 전에 원하는 confluency에 도달 할 때까지 매일 매체를 교체하십시오. </li></ol> 2. 성인 꼬리 가죽으로부터의 일차 마우스 KC 격리 <ol><li> 동물 시설 규정에 따라 성인 C57BL / 6 마우스 (바람직하게는 6 ~ 15 주 사이, 남성 또는 여성)를 희생하십시오. 꼬리 받침에서 몸통의 꼬리를 잘라내어 꼬리 끝 부분에 가시 구멍이 생길 수 있도록 꼬리 끝의 ~ 2mm를 자릅니다. </li><li> 꼬리 가죽을 벗겨 내려면 먼저 날카로운 날을 사용하여 꼬리 선단을 꼬리 끝 부분까지 자릅니다. 다음, 하나의 포셉을 사용하여 노출 된 꼬리뼈와 다른 포셉을 잡아서 피부를 잡아 당기고 꼬리뼈를 부드럽게 하나의 연속 동작으로 껍질에서 벗겨냅니다. 껍질을 벗긴 피부를 밋밋 라인에서 잘라내어 각 조각의 길이가 2-3cm 미만이되도록하십시오. </li><li> 껍질을 벗긴 피부를 헹구십시오.10cm 페트리 접시에 멸균 PBS 15 ML의 다음 얼음 차가운 dispase 소화 버퍼 (KC 성장 매체에 4 MG / ML dispase) 가득한 2 ML 튜브에 각 꼬리에서 피부를 놓으십시오. 참고 : 여러 개의 피부 조각을 결합하여 12 mL의 디스 페스 용액이 들어있는 1 개의 15 mL 튜브 (튜브 당 최대 5 개의 꼬리)에 배양 할 수 있습니다. <ol><li> 회 전자에 4 ° C 냉장고에서 하룻밤 피부 튜브를 품어. </li></ol></li><li> 꼬리 표피에서 단일 세포 현탁액을 분리하기 위해 1.4에서 1.13 단계를 수행하십시오. </li><li> 콜라겐으로 사전 코팅 문화 요리에 KC 성장 매체에서 10 x 10 4 / cm 2 (hematocytometer로 계산)의 밀도로 성인 세포를 씨앗. 참고 : 우리는 시판되는 콜라겐 기반 코팅 키트를 사용합니다 (자세한 내용은 표 참조). 세포를 5 % CO 2 , 37 ℃의 가습 된 배양기에서 배양하고, 매일 새로운 배지를 보충 하였다. 일반적으로 c궁극적 인 요리는 세포 파종 전에 30 분 ~ 1 시간 동안 콜라겐으로 코팅해야합니다. 우리는 젤라틴 기반의 코팅 물질 인 부착 인자와 비교하여 콜라겐으로 코팅 된 경우 요리에 성인 KC 부착이 유의하게 증가한다는 것을 관찰했다. </li><li> 초기 도금 후 매체를 변경하여 연결되지 않은 세포를 제거하고 세포가 실험 전에 원하는 confluency에 도달 할 때까지 매일 매체를 교체하십시오. </li></ol> 3. 고 칼슘에 의한 KCs의 체외 분화 <ol><li> 말단 분화를 유도하기 위해, 배지에 0.2 mM의 CaCl2를 추가. </li><li> 또는 높은 칼슘을 첨가하기 전에 저칼슘 KC 기저 배지에서 성장 보조제없이 일일 배양 된 KC를 굶기십시오. 참고 : 성장 인자 기아는 초기 분화 및 K10 5 와 같은 조기 분화 마커의 유도에 대한 세포 투입을 향상시킬 것입니다 </sup&gt;. </li></ol> 4. UVB 조사에 의한 KC로부터의 세포 사멸 및 TNFα 방출 <ol><li> 세포가 confluency에 도달 할 때까지 매일 매체 변화와 KC 성장 매체 (37 % C 5 % CO 2 humidified 인큐베이터에서)에서 마우스 KCs를 문화. UVB 조사 직전, 성장 매체를 제거하고 PBS 500 μL로 교체하십시오. 그런 다음 세포를 25 mJ / cm 2 UVB 또는 모의 컨트롤 (UVB 없음)으로 처 리하십시오. 주 : UVB 조사는 이전 10 바와 같이 8 개의 W 전구 (312 ㎚)와 휴대용 UVB 램프를 사용하여 수행된다. UVB 조사 후 PBS를 흡인하고 새로운 배지를 첨가한다. </li><li> 측정 및 6, 8의 CCK-8 세포 생존 분석으로 세포 생존율을 정량화하고, 제조자의 지시 11 다음 24 시간 후 UVB 치료. </li><li> 원하는 시점에서 UVB로 치료 KCs에서 조건 미디어를 수집하고 TNFα 릴리스를 측정제조사의 지시에 따라 마우스 TNF (Mono / Mono) ELISA kit에 의한 조건 매질에서 7 , 12 . </li></ol>

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피부 표피는 몸을 외부 환경으로부터 분리 및 보호하고 수분 손실, 병원체, 열 및 자외선 조사로 인한 손상을 방지하는 중요한 장벽으로 작용합니다. KC는 표피의 주된 세포 계통이며 표피 KC의 일차 배양은 장벽 형성의 생물학적 과정과 in vitro에서의 환경 모욕 에 대한 KCs의 반응을 연구하고 이해하는 데 유용한 도구입니다. 여기에서는 신생아 및 성인 마우스 피...

피부는 신체에서 가장 큰 기관이며 표피는 바깥쪽에 가장 많이 있습니다. 표피는 신체와 환경을 분리하기 위해 손상되지 않은 표피 장벽을 형성하는데 결정적인 역할을하므로 물 손실을 방지하고 알레르기 항원, 병원체 및 UVB 노출과 같은 환경 모욕으로부터 보호합니다. 표피는 미분화 된 기저 각질 세포 (KCs)의 단일 층에서부터 기저층, 가시 돌기 층, 과립층 및 각질층으로 구성된 다층 층상 상피로 발전한다. 표피 줄기 세포와 중계 증폭 세포로 구성된 기초 KC는 증식 성이 있고 미분화되어있다. 기초 KC가 세포주기를 빠져 나감에 따라, 세포는 분화를 결정하고 세포 - 세포 접합의 성숙과 표피 투과성 장벽 (epidermal permeability barrier, EPB)의 형성과 함께 표피 표면을 향해 서서히 이동한다. 가시 광선 층의 KC는 초기 별 차이를 표현합니다.케라틴 10 (K10)과 같은 이온 마커; KCs가 세분화 된 층으로 이동함에 따라 세포는 Filaggrin (FLG), Loricrin (LOR) 및 Involucrin (INV)과 같은 후기 분화 마커를 발현합니다. 각질층에서 KC는 말단 분화 된 각질 세포가되어 새로운 세포가 그들을 대체 할 때 결국 박리를 통해 흘러 나온다. 칼슘은 표피에서 가장 생리적 인 작용제로 간주 되며 in vitro 및 in vivo 에서 유사한 방식으로 분화 를 유발합니다. 정상 피부 표피에서는 칼슘 이온이 피부 표면을 향한 농도가 증가하는 특징적인 &quot;농도 구배&quot;를 형성합니다 1 , 2 , 3 . 칼슘 농도는 가장 낮은 층 (기저부 및 가시 돌기)의 낮은 수준에서 상부의 과립층의 첨단으로 상승한 다음 가장 표면적인 층 (각질층)에서는 무시할 수있는 수준으로 떨어집니다.<html> 칼슘 구배는 성분 투과성 장벽의 출현과 동시에 발생하며 칼슘 신호 전달이 KC 분화의 중요한 역할을한다는 것을지지합니다. 시험 관내 에서 낮은 칼슘 (0.02-0.1 mM)은 단일 층으로서 기저부 KCs의 증식을 유지하지만, 높은 칼슘 (&gt; 0.1 mM)은 단단 - 접합 형성 및 유도에 의해 입증 된 바와 같이 말단 분화에 대한 세포의 신속하고 돌이킬 수없는 공약을 유도한다 기초 칼슘 4 , 5 에 대한 높은 칼슘 처리시 LOR 및 INV 장벽 형성 외에도 표피 KC는 피부의 타고난 면역계의 중요한 구성 요소입니다. UVB 조사 또는 손상시 방출되는 병원균 또는 손상 관련 분자 패턴 (DAMP)에 대한 반응으로 KC는 TNFα, IL6 및 IFNβ와 같은 염증성 사이토 카인을 대량 생산하여 면역계 활성화를 유도합니다&gt; 6 , 7 , 8 , 9 . 병원균 제거를 위해서는 KC로부터의 적절한 염증 신호가 필요하지만 통제되지 않은 염증 반응은 건선이나 주사와 같은자가 염증성 피부 질환의 발병을 유발할 수 있습니다 6 , 8 . 전반적으로, KC는 손상되지 않은 피부 장벽을 유지하고 병원균 침입 또는 환경 모욕시 면역 반응을 시작하는 데 중요한 역할을합니다. 그러므로 상피 세포의 일차 배양은 상피 생물학, KC 분화 및 KC 자극에 의한 타고난 면역 반응을 연구하는데 유용한 기술이다. 주요 마우스 표피 KC의 분리 및 배양은 KC의 다양한 자각 감수성 및 감수성으로 인해 어려운 과정이 될 수 있습니다. 여기에서 우리는 신생아 마우스 피부에서 KCs를 분리하고 배양하는 방법을 설명합니다성인 마우스 꼬리 피부. 성인 KC 격리의 경우, 우리는 다음과 같은 이유로이 조직에서 생존 가능한 KC를 충분히 분리하기가 어려울 수 있으므로 마우스 등쪽 피부를 사용하지 않습니다. 첫째, 모발주기 (휴지기)의 휴지기에있는 성인의 지느러미 피부는 얇은 표피는 단지 1-2 층의 세포로 이루어지기 때문에 낮은 세포 수율과 표피와 진피의 비효율적 인 분리가 이루어 지는데, 이것은 성공적인 KC 격리를위한 중요한 단계입니다. 둘째로, 성인의 지느러미 피부에 존재하는 높은 모낭 밀도는 진피에서 표피를 분리하는 어려움에 더 기여합니다. 대신, 우리는 일상적으로 꼬리 피부를 성인 마우스 KCs의 공급원으로 사용합니다.이 상피는 표피 KC 3-5 층으로 두껍습니다. 또한 모낭의 밀도가 낮아 표피 분리를 방해하지 않으므로 마우스의 나이와 머리카락 순환 단계에 관계없이 성인 마우스 꼬리 피부와 KC 격리가 가능합니다. 고립 된 신비탈크 KC는 젤라틴 코팅 배양 접시에 뿌리는 반면, 콜라겐 코팅 배양 접시는 성숙한 세포가 신생아 대응 물과 비교할 때 손상된 능력 때문에 분리 된 성인 KC를 배양하는데 사용됩니다. 마우스 KC를 배양하기 위해 저칼슘 기저 배지에는 표피 성장 인자 (EGF), 소 트랜스페린, 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF1), 프로스타글란딘 E2 (PGE2), 소 혈청 알부민 (BSA) 및 하이드로 코르티손이 포함 된 dGS가 보충된다. 초기 도금 후 2-4 일 사이에 대부분의 분화 된 KC는 매일 중간 배양 중에 씻겨 나갈 수 있고 나머지 접착 세포는 전형적인 조약돌 형태 4를 나타내며 증식하고 초기 분화 마커 K10을 발현하지 않습니다.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 neonates or adult wildtype mice</td><td>Jackson Laboratory</td><td>000664</td><td>Wildtype mice (originally purchased from Jackson Laboratory) are breeded and maintained in animal vivarium at UCSD.</td></tr><tr><td>KC basal medium (EpiLife)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>MEPICF500</td><td>basal medium for keratinocyte culture with 0.06 mM CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td></tr><tr><td>Defined Growth Supplement (dGS)</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>S0125</td><td>defined growth supplements for culture medium</td></tr><tr><td>Dispase powder</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>17105041</td><td>enzyme to dissociate the epidermis from dermis</td></tr><tr><td>Attachment Factor</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>S006100</td><td>gelatin-based coating material</td></tr><tr><td>Coating Matrix</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>R011K</td><td>Collagen-based coating material</td></tr><tr><td>TrypLE</td><td>Invitrogen, Carlsbad, CA</td><td>12604-013</td><td>A gentle trypsin-like enzyme to dissociate keratinocytes from epidermal sheet</td></tr><tr><td>100 &amp;mu;m Cell Strainer Nylon mesh</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>CCK-8 cell viability Kit</td><td>Dojindo Molecular Technologies, Rockville, MD</td><td>CK04-11</td><td></td></tr><tr><td>Mouse TNF (Mono/Mono) ELISA Set II</td><td>BD Biosciences, San Jose, CA</td><td>555268</td><td></td></tr><tr><td>Corded Hand-Held UV Lamps</td><td>Spectronics, Westbury, NY</td><td>EB-280C</td><td></td></tr><tr><td>8-watt UV tubes</td><td>Spectronics, Westbury, NY</td><td>BLE-8T312</td><td></td></tr><tr><td>Light Inverted Microscope for cell culture</td><td>ZEISS, Jena, Germany</td><td>Axio Observer</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescent Microscope</td><td>Olympus</td><td>BX41</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and culture of primary mouse keratinocytes from neonatal and adult mouse skin

keratinocyte (KC)는 피부의 가장 바깥 쪽 레이어 인 표피의 주된 세포 타입입니다. 표피 KCs는 UVB 조사 또는 병원체와 같은 환경 모욕에 대하여 온전한 피부 장벽을 형성하고 또한 그 모욕에 염증 반응을 개시해서 피부 방위를 제공에있는 긴요 한 역할을한다. 여기에서는 신생아 마우스 피부 및 성인 마우스 꼬리 피부에서 KC를 분리하는 방법을 설명합니다. 우리는 또한 cheleed 태아 소 혈청 (cFBS)에 비해 정의 성장 보조제 (dGS)를 사용하여 culturing 조건을 설명합니다. 기능적으로, 우리는 신생아 및 성인 KC 모두가 높은 칼슘 - 유도 된 말단 분화, 단단한 접합 형성 및 층화에 매우 반응한다는 것을 보여준다. 또한, 배양 된 성인 KC는 UVB에 의해 유발 된 세포 사멸에 민감하며 UVB 조사시 다량의 TNF를 방출 할 수 있습니다. 함께 여기에 설명 된 방법 은 체외 모델의 설정에 대한 연구자에게 유용 할 것입니다신생아 마우스 및 / 또는 성인 마우스에서 표피 생물학을 연구합니다.

신생아 및 성인의 KCs의 높은 칼슘 유도 된 말단 분화. 관세청 도금 및 0.06 mM의 CaCl2를 유지 일차 마우스 상피 세포는 단층으로 성장하고, 각 셀은 조약돌 모양을 나타내는, 구별 간 공간 다각형했을 때 합류 (도 1a 및도 2a). CaCl2를 행 0.2mM의 승강은 세포의 급격한 형태 변화를 유도. 높은 칼슘 스위치 ?...

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Isolation and Culture of Primary Mouse Keratinocytes from Neonatal and Adult Mouse Skin

표피 각질 형성 세포 (epidermal keratinocytes)는 기능적인 피부 장벽을 형성하고 외부 환경 모욕에 대한 숙주 방어의 최전선에 위치하고 있습니다. 여기에서는 신생아 및 성인 마우스 피부에서 표피 각질 형성 세포를 분리하고 1 차 배양하고 각질 세포에서 최종 분화 및 UVB 유발 염증 반응을 유도하는 방법을 설명합니다.

신생아 및 성인 마우스 피부의 1 차 마우스 각질 세포의 분리 및 배양

The keratinocyte (KC) is the predominant cell type in the epidermis, the outermost layer of the skin. Epidermal KCs play a critical role in providing skin ...

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Research

JoVE Journal

Biology

30.7K 조회수.  UC San Diego.  표피 각질 형성 세포 (epidermal keratinocytes)는 기능적인 피부 장벽을 형성하고 외부 환경 모욕에 대한 숙주 방어의 최전선에 위치하고 있습니다. 여기에서는 신생아 및 성인 마우스 피부에서 표피 각질 형성 세포를 분리하고 1 차 배양하고 각질 세포에서 최종 분화 및 UVB 유발 염증 반응을 유도하는 방법을 설명합니다. 

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Isolating Hair Follicle Stem Cells and Epidermal Keratinocytes from Dorsal Mouse Skin

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by distinct pools of SCs, which are located in the permanent portion of the HF, a region known as the bulge. These multipotent bulge SCs were initially identified as slow cycling label retaining cells; however, their isolation has been made feasible after identification of specific cell markers, such as CD34 and keratin 15 (K15). Here, we describe a robust method for isolating bulge SCs and epidermal keratinocytes from mouse HFs utilizing fluorescence activated cell-sorting (FACS) technology. Isolated hair follicle SCs (HFSCs) can be utilized in various in vivo grafting models and are a valuable in vitro model for studying the mechanisms that govern multipotency, quiescence and activation.

An ideal model for studying adult stem cell biology is the mouse hair follicle. Here we present a protocol for isolating different populations of hair follicles stem cells and epidermal keratinocytes, employing enzymatic digestion of mouse dorsal skin followed by FACS analysis.

등쪽 마우스 피부에서 헤어 난포 줄기 세포와 표피 각질 형성 세포를 분리

The hair follicle (HF) is an ideal system for studying the biology and regulation of adult stem cells (SCs). This dynamic mini organ is replenished by ...

연구

발생학

Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. In addition, keratinocytes play an essential role in the initiation, maintenance, and regulation of epidermal immune responses by being part of the innate immune system responding to antigenic stimuli in a fast, nonspecific manner. Here, we describe a protocol for isolation of primary human keratinocytes from adult skin, and demonstrate that these cells respond to calcium-induced terminal differentiation, as measured by an increased expression of the differentiation marker involucrin. In addition, we show that the isolated keratinocytes are responsive to IL-1&#946;-induced activation of intracellular signaling pathways as measured by the activation of the p38 MAPK pathway. Taken together, we describe a method for isolation and culturing of primary human keratinocytes from adult skin. Because the keratinocytes are the predominant cell type in the epidermis, this method is useful to study molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

The human skin acts as a first line of defense against the external environment. We present a method for isolating primary human keratinocytes from adult skin. These isolated keratinocytes are useful in numerous experimental setups, and are a highly suitable model for studying molecular mechanisms in cutaneous biology in vitro.

생성 및 기본 인간 Keratinocytes 성인 피부에서의 경작

The main function of keratinocytes is to provide the structural integrity of the epidermis, thereby maintaining a mechanical barrier to the outside world. ...

A Simplified and Efficient Method to Isolate Primary Human Keratinocytes from Adult Skin Tissue

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical applications. The conventional isolation method of human keratinocytes involves a two-step sequential enzymatic digestion procedure, which has been proven to be inefficient in generating primary cells from adult tissues due to the low cell recovery rate and reduced cell viability. We recently reported an advanced method to isolate human primary epidermal progenitor cells from skin tissues that utilizes the Rho kinase inhibitor Y-27632 in the medium. Compared with the traditional protocol, this new method is simpler, easier, and less time-consuming, and increases epithelial stem cell yield and enhances their stem cell characteristics. Moreover, the new methodology does not require the separation of the epidermis from the dermis, and, therefore, is suitable for isolating cells from different types of adult tissues. This new isolation method overcomes the major shortcomings of conventional methods and is more suitable for producing large numbers of epidermal cells with high potency both for laboratory and for clinical applications. Here, we describe the new method in detail.

Here we present a protocol to efficiently isolate primary human keratinocytes from adult skin tissues. This method simplifies the conventional procedure by using the ROCK Inhibitor Y-27632 in the inoculation medium to spontaneously separate epidermal cells from dermal cells.

성인 피부 조직에서 기본 인간의 Keratinocytes를 분리 하는 단순 하 고 효율적인 방법

Primary human keratinocytes isolated from fresh skin tissues and their expansion in vitro have been widely used for laboratory research and for clinical ...

Isolation and Staining of Mouse Skin Keratinocytes for Cell Cycle Specific Analysis of Cellular Protein Expression by Mass Cytometry

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the epidermis of mouse skin. There are seven important steps: separation of the epidermis from the dermis, digestion of the epidermis, staining of the epidermal cell populations with cisplatin, sample barcoding, staining with metal tagged antibodies for cell cycle markers and proteins of interest, detection of metal-tagged antibodies by mass cytometry, and the analysis of expression in the various cell cycle phases. The advantage of this approach over histological methods is the potential to assay the expression pattern of &#62;40 different markers in a single cell at different phases of the cell cycle. This approach also allows for the multivariate correlation analysis of protein expression that is more quantifiable than histological/imaging methods. The disadvantage of this protocol is that a suspension of single cells is needed, which results in the loss of location information provided by the staining of tissue sections. This approach may also require the inclusion of additional markers to identify different cell types in crude cell suspensions. The application of this protocol is evident in the analysis of hyperplastic skin disease models. Moreover, this protocol can be adapted for the analysis of specific sub-type of cells (e.g., stem cells) by the addition of lineage-specific antibodies. This protocol can also be adapted for the analysis of skin cells in other experimental species.

This protocol describes how to isolate skin keratinocytes from mouse models, to stain with metal-tagged antibodies, and to analyze stained cells by mass cytometry in order to profile the expression pattern of proteins of interest in the different cell cycle phases.

질량 세포 측정에 의한 세포 단백질 발현의 세포 주기 특이적 분석을 위한 마우스 피부 각질 세포의 분리 및 염색

The goal of this protocol is to detect and quantify protein expression changes in a cell cycle-dependent manner using single cells isolated from the ...

Establishing a High Throughput Epidermal Spheroid Culture System to Model Keratinocyte Stem Cell Plasticity

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human cancers. As a lining tissue, the skin epithelium is often subject to injury and has evolutionarily adapted by acquiring the cellular plasticity necessary to repair damaged tissue. Over the years, several efforts have been made to study epithelial plasticity using in&#160;vitro and ex vivo cell-based models. However, these efforts have been limited in their capacity to recapitulate the various phases of epithelial cell plasticity. We describe here a protocol for generating 3D epidermal spheroids and epidermal spheroid-derived cells from primary neonatal human keratinocytes. This protocol outlines the capacity of epidermal spheroid cultures to functionally model distinct stages of keratinocyte generative plasticity and demonstrates that epidermal spheroid re-plating can enrich heterogenous normal human keratinocytes (NHKc) cultures for integrin&#945;6hi/EGFRlo keratinocyte subpopulations with enhanced stem-like characteristics. Our report describes the development and maintenance of a high throughput system for the study of skin keratinocyte plasticity and epidermal regeneration.

Here we describe a protocol for the systematic cultivation of epidermal spheroids in 3D suspension culture. This protocol has wide-ranging applications for use in a variety of epithelial tissue types and for the modeling of several human diseases and conditions.

각질 줄기 세포 가소성을 모델링하기 위해 높은 처리량 표피 스페로이드 배양 시스템 구축

Epithelial dysregulation is a node for a variety of human conditions and ailments, including chronic wounding, inflammation, and over 80% of all human ...

Isolation and Culture of Adult Epithelial Stem Cells from Human Skin

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate daughter cells that retain the stem cell phenotype and transit-amplifying cells (TA cells) that migrate from the stem cell niche, undergo rapid proliferation and terminally differentiate to repopulate the tissue.
Epithelial stem cells have been identified in the epidermis, hair follicle, and intestine as cells with a high in vitro proliferative potential and as slow-cycling label-retaining cells in vivo 1-3. Adult, tissue-specific stem cells are responsible for the regeneration of the tissues in which they reside during normal physiologic turnover as well as during times of stress 4-5. Moreover, stem cells are generally considered to be multi-potent, possessing the capacity to give rise to multiple cell types within the tissue 6. For example, rodent hair follicle stem cells can generate epidermis, sebaceous glands, and hair follicles 7-9. We have shown that stem cells from the human hair follicle bulge region exhibit multi-potentiality 10.
Stem cells have become a valuable tool in biomedical research, due to their utility as an in vitro system for studying developmental biology, differentiation, tumorigenesis and for their possible therapeutic utility. It is likely that adult epithelial stem cells will be useful in the treatment of diseases such as ectodermal dysplasias, monilethrix, Netherton syndrome, Menkes disease, hereditary epidermolysis bullosa and alopecias 11-13. Additionally, other skin problems such as burn wounds, chronic wounds and ulcers will benefit from stem cell related therapies 14,15. Given the potential for reprogramming of adult cells into a pluripotent state (iPS cells)16,17, the readily accessible and expandable adult stem cells in human skin may provide a valuable source of cells for induction and downstream therapy for a wide range of disease including diabetes and Parkinson's disease.

A rapid, robust way of isolating viable adult epithelial stem cells from human skin is described. The method utilizes enzymatic digestion of skin collagen matrix , followed by plucking of hair follicles and isolation of single cell suspensions or tissue fragments for cell culture.

사람의 피부에서 성인 상피 줄기 세포의 분리 및 문화

The homeostasis of all self-renewing tissues is dependent on adult stem cells. As undifferentiated stem cells undergo asymmetric divisions, they generate ...

생물학

Generating Primary Cultures for Keratinocyte Live Cell Imaging

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in vitro.&#160;Live-cell imaging has allowed for significant advances in the ability to identify differences between keratinocyte stem cells and committed progenitor behavior. Live-cell imaging is an evolving and somewhat challenging method to study keratinocyte behavior in vitro. This protocol has been developed to culture keratinocytes at low seeding density, enabling relatively long-term time-lapse photography and monitoring of individual cell behavior. Passage 0 keratinocytes are grown at clonal density, and time-lapse photography allows documentation of individual cell divisions and the time of their occurrence. For maximum biological relevance, freshly isolated human keratinocytes are placed in vitro. This approach focuses on proliferation. However, this protocol can be adapted for use in other live cell imaging applications measuring individual cell behavior, such as measuring cell migration, wound healing, and motility.

This protocol outlines the culture of freshly obtained (passage 0) keratinocytes for use in live cell imaging.

Keratinocyte Live Cell Imaging을 위한 1차 배양 생성

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in ...

생체공학

Isolation of Mouse Epidermal Keratinocytes and Their In Vitro Clonogenic Culture

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately 30 x 106 viable cells per mouse. Primary adult mouse keratinocytes are harvested from the dorsal skin of female mice. Male mice (~6 weeks old) can be used for keratinocyte harvesting depending on the requirements of the experiment. Euthanized mice are shaved and sterilized with serial washes in povidone iodine and ethanol solutions (70% alcohol). After disinfecting the mice, the dorsal skin is removed and the subcutaneous fat and muscle are removed with a scalpel and discarded. The skins are cut into small pieces and treated with a mild, low temperature trypsinization to detach the lower dermis from the epidermis. The scraped epidermises are stirred at low speed, filtered to remove the hairs, counted, and re-suspended in culture medium. This method provides an excellent single cell suspension of highly culturable cells for many downstream applications.

The goal of this protocol is to isolate epidermal keratinocytes from the dorsal skin of adult mice for a variety of downstream applications such as molecular biology, biochemistry, fluorescence activated cell sorting, and primary in vitro uses (e.g., clonogenic keratinocytes).

마우스 표피 각질 세포와 체외 클로노겐 문화의 격리

The protocol described here is a reliable method of harvesting primary keratinocytes from adult female mice (54 &#177; 2 days old) yielding approximately ...

Isolation and Culture of Primary Oral Keratinocytes from the Adult Mouse Palate

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have attracted attention because of their unique function and characteristics. They maintain the homeostasis of the oral epithelium and serve as resources for applications in regenerative therapies. However, in vitro studies that use oral primary keratinocytes from adult mice have been limited due to the lack of an efficient and well-established culture protocol. Here, oral primary keratinocytes were isolated from the palate tissues of adult mice and cultured in a commercial low-calcium medium supplemented with a chelexed-serum. Under these conditions, keratinocytes were maintained in a proliferative or stem cell-like state, and their differentiation was inhibited even after increased passages. Marker expression analysis showed that the cultured oral keratinocytes expressed the basal cell markers p63, K14, and &#945;6-integrin and were negative for the differentiation marker K13 and the fibroblast marker PDGFR&#945;. This method produced viable and culturable cells suitable for downstream applications in the study of oral epithelial stem cell functions in vitro.

The present protocol describes the isolation and culture of oral keratinocytes derived from the adult mouse palate. An evaluation method using immunostaining is also reported.

성인 마우스 입천장에서 1 차 구강 각막 세포의 격리 및 문화

For years, most studies involving keratinocytes have been conducted using human and mouse skin epidermal keratinocytes. Recently, oral keratinocytes have ...

Human Skin Keratinocyte Isolation: A Method to Culture Primary Keratinocytes from Skin Samples

Johansen, C. et al. <a href="https://www.jove.com/v/56863"> Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin</a>. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of keratinocytes&#8212;the most prominent cells of human skin&#39;s epidermal layer, by employing a combination of enzymatic digestion and mechanical disruption methods. This method helps in the preferential growth of keratinocytes over other skin cell types using a selective growth medium.

인간 피부 각질 세포 분리: 피부 샘플에서 1차 각질 세포를 배양하는 방법

Johansen, C. et al.  Generation and Culturing of Primary Human Keratinocytes from Adult Skin. J. Vis. Exp. (2017)
This video describes the isolation of ...