성인 마우스 입천장에서 1 차 구강 각막 세포의 격리 및 문화

최근에는 구두 각질 세포가 독특한 특성으로 주목받고 있습니다. 우리는 다운스트림 응용 프로그램에 적합한 줄기 세포와 같은 상태에서 마우스 구강 각질 세포를 배양하기위한 프로토콜을 제공합니다. 마우스 구강 각질 세포의 문화와 피부 각질 세포와 다른 특성.

이 프로토콜에서, 우리는 성공적으로 1 차 마우스 구강 각질 세포질을 격리하고 장기 배양 기술을 개발했습니다. 이 배양 시스템은 구강 바실라 줄기 세포 및 관련 질병의 특징을 더 이해하기 위해 분자 및 생화학 적 분석을 사용할 수 있습니다. 성인 C57BLK6J 마우스를 희생한 후 면도기로 입 주위의 머리카락을 제거하고 가위를 사용하여 뺨에서 턱을 양쪽턱쪽으로 자른다.

다음으로, 포셉을 사용하여 입을 넓게 열고 면봉을 사용하여 혈액을 흡수한 다음, 10%의 포비도요오드요오드가 들어있는 면봉으로 입 안을 닦아 팔레트를 소독합니다. 마우스 팔레트를 수확하려면 먼저 외과 메스 블레이드를 사용하여 상악 치아의 팔레트 측면을 따라 전체 두께 한계 절개를 합니다. 그런 다음 raspatorium을 사용하여 팔레트 전체를 조심스럽게 해부하십시오.

팔레트 조직을 항생제와 항mycotics로 보충하는 완전한 매체의 4 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 튜브로 신속하게 전송합니다. 잠복이 준비될 때까지 조직을 얼음 위에 두십시오. 라미나르 플로우 후드에서 항생제와 항진균제를 함유한 완전한 배지 4밀리리터를 함유한 60mm 접시에 조직을 옮겨주세요.

그런 다음 짧은 무딘 집게와 메스 블레이드를 사용하여 조직에서 혈액을 부드럽게 제거하고 완전한 매체로 조직을 10 번 씻습니다. 마지막 세척 후, 항생제와 항균제로 보충 된 0.025 %의 4 밀리리터를 포함하는 35 밀리미터 접시에 조직을 전송합니다. 상피 표면을 아래로 향한 조직을 놓고 문화 후드의 실온에서 16 시간 동안 배양하십시오.

하룻밤 트립신 소화 후, 한 쌍의 무딘 집게를 사용하여 트립신 용액에서 조직을 제거하고 상피 표면이 향하는 트립신 억제제 용액을 포함하는 60밀리미터 접시로 옮습니다. 다음으로, 집게로 팔레트 가장자리를 잡고 메스 블레이드를 사용하여 기본 라미나 프로프리아에서 상피 층을 부드럽게 긁어냅니다. 조직에서 상피 세포의 최대 양을 수집하려면, 이전에 입증 된 바와 같이 완전한 매체의 4 밀리리터와 다른 60 밀리미터 접시로 조직을 전송합니다.

다음으로, 멸균 100 미크로른 세포 여과기를 50 밀리리터 원내 튜브 위에 놓습니다. 그리고 멸균 파이펫을 사용하여 트립신 용액 2 밀리리터를 스트레이너에 옮겨 표면을 적시십시오. 그런 다음 파이펫을 사용하여 60mm 접시에 셀 서스펜션을 몇 번 혼합하고 100 미크론 세포 스트레이너를 통해 세포를 필터링합니다.

세포의 수를 계산하려면, trypan 블루 용액의 50 마이크로 리터에 셀 서스펜션의 15 마이크로 리터를 추가 한 다음 세포 트라이팬 블루 믹스의 10 마이크로 리터를 혈종계에 전송하고 세포의 수를 계산합니다. 다음으로, 세포 현탁액원심을 원심분리하고, 상체를 제거하고, 첼렉스 FBS를 포함하는 완전한 배지의 2밀리리터를 튜브에 추가한다. 5 밀리 리터 파이펫을 사용하여 여러 번 적정하여 셀 펠릿을 다시 중단합니다.

그런 다음 1마우스에서 5번째 세포에 2~5회 10회 플레이트를 콜라겐 타입 1로 미리 코팅한 24웰 플레이트의 1개 우물로 플레이트하고 배지를 변경하지 않고 2일 동안 37°C에서 세포를 배양한다. 1 차 경구 각질 세포는 단층으로 성장하고 조약돌 형태를 표시했습니다. 작은 각질 세포 식민지는 3 일과 5 일 후에 보였다.

인큐베이션 1주일 후, 이 식민지들은 더 커지고 단단한 식민지를 형성했다. 첫 번째 구절은 초기 도금에서 2 주 동안 수행되었고 나중에 구절에서 각질 세포는 문화의 짧은 기간으로 안정적인 성장을 나타냈다. 각질 세포는 격리 과정에서 상당한 섬유아세포 오염이 발생하면 성장을 멈췄습니다.

배양 후, 각질 세포는 각질 14 및 알파6-인테그린을 표현했다. 초기 및 후기 통로 세포는 그들의 줄기를 확인하는 P63의 균일한 표정을 보여주었습니다. 그러나, 높은 칼슘으로 처리된 각질 세포는 높은 칼슘 처리가 줄기 세포 관련 유전자를 억제한다는 것을 나타내는 감소된 P63 발현을 나타낸다.

분화 마커 케라틴(13)은 초및 후반 구절에서 희귀하거나 발현이 없는 것으로 나타났지만, 높은 칼슘 치료에서 유의한 발현을 보였다. 섬유아세포 마커 PDGFR 알파는 이 프로토콜이 기저 각질 세포를 성공적으로 분리하고 미분화 상태에서 이러한 세포를 유지할 수 있음을 나타내는 각질 세포 배양에서 발현되지 않았다. 트래핑은 경막외 측에서 시작하여 조직 샘플당 10분이어야 합니다.

또한 일반적으로, 세포의 파이펫팅은 더 나은 세포 생존을 위해 중요합니다. 2~3회 통과 후, 경구 각질세포는 추가 기능실험을 위해 안정된다. 중요 한 것은, 이 프로토콜은 체외에서 세포 및 분자 분석에 대 한 형질 전환 마우스 수명과 결합 될 수 있습니다.

최근 연구는 구강 바실라 줄기 세포의 역학과 이질성을보고했다. 이 방법은 구강 줄기 세포 생물학의 연구를 용이하게하고 구강 질환의 더 나은 이해로 이어질 것입니다.