열 충격 반응은 세포질 프로테오스타증을 유지하고 바다 예레건의 분자, 세포 및 유기체 수준에서 특징지어질 수 있는 필수적인 세포 스트레스 반응 경로입니다. 우리는 열 충격 반응 분야의 재현성을 향상시키기 위해 바다 예인선에서 열 충격 반응의 강력한 유도를 생성하는 일련의 표준화 된 프로토콜과 모범 사례를 제시합니다. 우리는 열 내성, 일반적으로 사용되는 유기체 분석이 열 충격 반응에 의존하지 않는다는 것을 보여줍니다.
대신 열충격 반응에 의존하는 유기체 분석인 열 회수를 사용하는 것이 좋습니다. 열 충격 반응은 계란 누워의 개시와 감쇠됩니다. 따라서 개발 타이밍은 열 충격 반응 실험에서 고려해야 할 중요한 변수입니다.
동기화된 웜 채우기를 만드는 것으로 시작합니다. 플래티넘 와이어 픽을 사용하여 약 10개의 그레이드 성인용 웜을 신선한 접시에 옮기세요. 성인과 함께 옮겨졌을 수 있는 계란이나 애벌레를 제거하십시오.
벌레가 한 시간 동안 알을 낳은 다음 접시에서 성인을 제거하십시오. 개발 타이밍은 각 변형과 벌레가 발생하는 온도에 따라 달라진다는 점을 고려하여 원하는 발달 단계까지 동기화된 웜을 섭씨 20도에서 유지합니다. 벌레가 열 충격을 준비하면 플레이트를 파라핀 필름으로 감싸고 리드 무게가있는 테스트 튜브 랙을 사용하여 1 시간 동안 섭씨 33도의 순환 수조에 담급니다.
수조에서 접시를 회수하고 종이 타월로 건조. 파라핀 필름을 제거하고 벌레가 6~24시간 동안 섭씨 20도에서 회복되도록 하여 GFP 합성에 충분한 시간이 될 수 있습니다. 이미징슬라이드를 준비하려면 실험실 테이프스트립이 있는 두 개의 다른 슬라이드 사이에 현미경 슬라이드를 배치합니다.
3% 아가로즈 용액을 물에 넣고 아가로즈가 녹을 때까지 전자레인지에 가열합니다. 그런 다음 1 밀리리터 파이펫을 사용하여 슬라이드 중앙에 아가로즈의 약 150 마이크로 리터를 배치합니다. 슬라이드를 빈 슬라이드로 즉시 덮어 실험실 테이프에 놓이게 되도록 수직으로 배치한 다음 조심스럽게 제거합니다.
웜을 고정하려면, 아가로즈 패드의 중앙에 M9 버퍼인 밀리머 레바미솔 1방울을 넣고 백금 와이어 픽을 사용하여 10개의 웜을 드롭으로 옮킵니다. 선택적으로, 아가로즈 패드의 바깥쪽으로 레바미솔을 펼치고 벌레가 마비될 때 벌레를 선택과 정렬합니다. 커버 슬립으로 벌레를 덮고 형광 현미경을 사용하여 가능한 한 빨리 이미지를 처리하십시오.
열회수 분석기를 수행하려면 웜을 동기화하고 원하는 발달 단계까지 섭씨 20도에서 유지합니다. 그런 다음 6 시간 동안 열 충격을. 수조에서 접시를 제거하고 48 시간 동안 섭씨 20도에서 회복 할 수 있습니다.
복구 후, 육포 운동이나 마비없이 기계적 자극 후 즉시 멀리 크롤링 할 수있는 벌레의 수를 계산합니다. 세포 수준에서 열 충격 반응 유도를 시각화하기 위해, 두 형광 기자 바다 예르간 균주를 분석했다. 열 충격이 없는 네거티브 대조군 샘플에서 hsp-16.2 기자는 정상적인 자동 형광을 보였지만 hsp-70 기자는 항문 우울기 근육에 결투형 형광을 가했다.
1시간 동안의 열 충격 후, RNAi가 기자 유도를 측정하기 전에 hsf-1을 쓰러뜨리는 데 사용되었을 때 두 기자에서 강력한 형광이 관찰되었습니다. 두 균주의 형광은 심각하게 감소되었다, 이러한 기자는 hsf-1 의존임을 나타내는. 분자 수준에서 열 충격 반응의 유도량을 양화하기 위해, 2개의 토착 열 충격 단백질은 rt key PCR로 측정되었다.
1시간 33도의 열충격으로 2, 000배 이상의 상온충격유전자의 상대적 발현이 증가하는 것으로 나타났다. 열회복 분석결과 6시간 열충격에 노출되어 48시간 회복 후 정상적인 움직임을 보인 벌레가 20% 감소하는 것으로 나타났다. hsf-1의 녹다운은 정상 운동에 있는 극적인 감소를 일으키는 원인이 되었습니다, 이상 95% 벌레의 약동 운동 또는 마비를 보여주는 prodded 되 고 후.
대조적으로, hsf-1의 낙마는 열내성 분석의 결과에 큰 영향을 미치지 않았으며, 이는 벌레가 연속 섭씨 35도 온도에 노출되고 살아있는 벌레의 백분율은 다양한 시간 지점에서 측정된다. 이 기술을 처음으로 수행 할 때, 물이 접시에 들어가 실험을 망치는 것을 방지하기 위해 두 번 파라핀 필름으로 플레이트를 포장해야합니다. 분자 분석은 RNA-seq를 사용하여 게놈 분석으로 확장될 수 있습니다.
열 충격 반응에 의해 영향을 받는 다른 유기체 검사는 수명 등 포함될 수 있다. 바다 예레건의 분자, 세포 및 유기체 열 충격 반응 반응 과 상관 관계를 맺는 독특한 능력은 개발 및 질병에서이 경로의 역할에 대한 이해를 위해 귀중한 것으로 입증되었습니다.
