이탈리아 연구소 핵 물리학 (INFN)에 대 한 부분적으로 INFN 자오선 프로젝트를 통해이 작품을 자금. 저자는 INFN 자오선 프로젝트 조정;에 대 한 교수 Edoardo Milotti (물리학과, 대학교의 트리 에스테, 이탈리아)를 인정 닥터 Roberto Chignola (생명 공학 부, 대학교의 베로나, 이탈리아) Caco-2 셀, ohmmeter, 제공 하 고 그의 귀중 한 도움과 훈련에 대 한. 우리는 또한 기술 지원에 대 한 Agnese Solari 인정합니다.

다음 프로토콜 건강 한 지원자에서 인간의 피 철수를 포함 한다. 기증자 등록 사전 서 면된 동의 제공합니다. 이 절차는 헬싱키 선언에 따라 그리고 혈액 인출 전문 의료 조 수에 의해 수행 되었다.
1. 세포 문화 및 공동 문화 설정
<ol><li>1 주일 전에 방사선, 2.5 × 105 셀/mL와 10% 태아 둔감 한 혈 청 (FBS), 2 mM L-글루타민, 100 U/mL 페니실린, 100 μ g/mL 스 보충 하는 신선한 RPMI1640 매체에 포함 된 Caco-2 셀 서 스 펜 션 준비.</li>
	<li>종자의 살 균 1 µ m 기 공 직경 세포 배양에서 세포 현 탁 액 2 mL 6 잘 플레이트에 대 한 삽입 하 고 삽입 6 잘 플레이트에 넣어. 참고: 셀 문화 삽입 셀 뿌리기 전에 메 마른 완전 한 매체를 가진 외피에 의해 활성화 해야 합니다. 이 경우에, 문화 미디어 삭제 하 고 셀 서 스 펜 션 미디어로 대체 되어야 한다.</li>
	<li>10 %FBS, 2 mM L-글루타민, 100 IU/mL 페니실린, 및 각 바닥 구획, 100 µ g/mL 스 보충 하는 신선한 RPMI1640 매체의 3 mL를 추가 하 고 습도 분위기 5% CO2를 포함 하는 인큐베이터에서 37 ° C에서 세포 문화.</li>
	<li>Caco-2 셀 방사선의 같은 날, 상용 리튬-헤 파 린 코팅 6 mL 튜브에 인간의 전체 혈액 수집 (튜브 크기: 13 x 100 m m).</li>
	<li>그 후, Ficoll 기울기를 사용 하 여 주변 혈액 단 세포 (PBMC)를 격리 합니다. PBMC를 분리, 50 mL 원뿔 원심 분리기 튜브 및 레이어 전체 혈액의 동일 볼륨 Ficoll 25 mL를 넣어 Ficoll 표면에 RPMI1640와 함께 1:1 희석. 참고: 정상적인 건강 한 기증자는 일반적으로 약 4-10 × 106 PBMC/mL 있다.</li>
	<li>실 온에서 30 분 400 x g에서 50 mL 튜브 원심</li>
	<li>부드럽게 파스퇴르 피 펫과 포부에 의해 Ficoll와 플라즈마 사이의 인터페이스에서 PBMC를 수집 하 고 15 mL 원뿔 튜브에 넣어.</li>
	<li>두 번 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)의 10 mL를 추가 하 여 10 분 동안 250 x g에서 PBMC centrifuging에서 PBMC를 씻어.</li>
	<li>문화 PBMC T25 h 조 3-5의 최대 c m2 플라스 크에서 완료 하기 전에, 5% CO2를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 설명한 대로 RPMI1640 미디어. 참고: 실험 당일 PBMC를 수집 하 고 2 × 106 셀/글쎄, 공동 문화의 아래쪽 구획에서 완전 한 RPMI1640 매체의 3 mL에 씨앗. Caco-2 셀 삽입 PBMC 포함 된 웰 스 30 분 그들의 방사선 조사 후 전송 됩니다. PBMC 전체 혈액에서 수집 수 없습니다 수 이상 약 72 h에 대 한 문화에서 유지 아니라면 예를 들어와 자극. phytohaemagglutinin (PHA), 세포의 생존 후 손실 됩니다. 주의: 모든 혈액과 혈액 제품의 안전과 품질 전체 과정을 통해 보장 되어야 한다.</li>
</ol>2. 방사선 설정
참고: Caco-2 세포의 방사선은 정기적으로 다양 한 유형의 암 치료에 사용 되는 선형 가속기 Istituto 디 Ricovero e Cura Carattere Scientifico (IRCCS) 미 됩니다 (파 비아, 이탈리아)의 방사선 치료 부서에서 수행 되었다.
<ol><li>6 MV 피크를 광자 엑스레이 에너지를 설정 합니다. 선형 가속기 pulsing 정권에서 작동 한다 (대략 4 ms의 2 연속 펄스 사이의 시간; 5 µs 복용량에 대 한 단일 펄스의 지속 시간 최대 1 × 10-3 Gy/p 비율).</li>
	<li>Caco-2 장에 1.4 cm 두께 유리 야 (사용 된 방사선의 보다 약간 더 큰 거리에 해당) 방사선의 소스에서 100 cm에서 엑스레이의 궤도에 삽입을 포함 하는 6-잘 접시를 놓습니다.</li>
	<li>방사선 backscattered 방사선 구성 요소 및 입자 평형 발생 하기 전에 각 샘플에 0.5 cm 두께 bolus를 놓습니다.</li>
	<li>셀을 비추는 (2-10 Gy 사이의 복용량) 아파트와 대칭 (± 2%) 20 x 20 cm2 방사선 분야 그리고 분당 3 Gy의 복용량 비율. 참고: "가짜" 제어-비친된 셀 받았다 방사선 룸을 입력 하지 않고 비친된 그들의 동일한 절차 조건 (받은 복용량: 0 Gy). 주의: 이온화 방사선 생산 장치 전문된 인력에 의해서만 사용 되어야 한다.</li>
</ol>3. 세포 생존 능력 분석 실험 (MTT 분석 결과)
참고: Caco-2 세포 대사 활동143-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium 브 로마 이드 (MTT) 분석 결과 통해 평가 했다.
<ol><li>시드 2 × 105 Caco-2 24-잘 접시 24 h에에서 완전 한 매체의 1.25 mL에 조사 하기 전에.</li>
	<li>2.1-2.4 단계에서 설명한 대로 셀을 비추는 다음 5% CO2를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
	<li>방사선 조사, 후 21 h 5 mg/mL MTT 솔루션의 100 µ L을 추가 하 고 포함 된 5% CO2 3 h 습도 분위기에서 37 ° C에서 셀을 계속.</li>
	<li>삭제는 상쾌한 고 1 mL의 PBS로 세포를 씻어.</li>
	<li>각 잘에서 디 메 틸 sulfoxide (DMSO)의 500 µ L을 추가 하 여 formazan 결정을 녹이 고 λ에서 다 잘 플레이트 리더 흡 광도 평가 = 570 nm.</li>
	<li>방사선 조사 후 단계 3.3-3.4-3.5-3.6에서 45 h를 반복 합니다. 참고: 결과 100%로 표준화 해당 가짜 상태에서 섭 동으로 표시 됩니다. 주의: DMSO는 피부, 눈 및 호흡 체계 (GHS07, GHS08)에 대 한 가연성 및 자극 에이전트입니다. 눈 접촉, 풍부한 물으로 즉시 세척 하 고 의료 조언을 추구 합니다. MTT는 피부, 눈 및 호흡 체계 (GHS07, GHS08)에 대 한 자극 에이전트. 눈 접촉, 물로 하 고 의료 조언을 추구 합니다.</li>
</ol>4. 가능한 셀 결정 (Trypan Blue 염료 배제 분석 결과)의 비율
참고: 실행 가능한 세포의 백분율 Trypan Blue 염료 배제 분석 결과 의해 평가 되었다.
<ol><li>시드 2 × 105 Caco-2 24-잘 접시 24 h에에서 완전 한 매체의 1.25 mL에 조사 하기 전에.</li>
	<li>셀 범위 0에에서 복용량을 비추는-10 Gy (2.1-2.4 단계 참조) 다음 24-48 h에 대 한 5% CO2 를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 세포를 품 어.</li>
	<li>2 선택한 시간 포인트, PBS로 세포 세척, 후, 삭제 다음 트립 신-ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 솔루션의 100 µ L를 추가 합니다. 2 분 동안 5% CO2 를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 세포를 넣어 다음 완전 한 매체 효소 반응 체포를 추가 합니다.</li>
	<li>1.5 mL 튜브에 세포를 수집 하 고 원심 5 분 삭제에 대 한 500 x g에 튜브는 상쾌한 다시 PBS의 50 µ L에서 세포를 일시 중지.</li>
	<li>Trypan Blue 염료 솔루션의 50 µ L로 세포 현 탁 액을 혼합 하 고 실 온에서 3 분을 위한 혼합물을 품 어.</li>
	<li>스테인드 계산 (비 가능한) 및 (가능한) 셀 Bürker 챔버와 흠 없는.</li>
</ol>5. 트랜스 상피 전기 저항 (TEER)
<ol><li>씨앗 5 × 105 Caco-2 셀 6 잘 플레이트에 조사 이전 1 주일 공동 삽입 (폴 리 에틸렌 테 레프 탈 산 (애완 동물), 2 x 106 모/cm2) 문화.</li>
	<li>1 시간 전에 방사선, 전압계/ohmmeter와 TEER를 측정 합니다.</li>
	<li>2.1-2.4 단계에서 설명한 대로 셀을 비추는.</li>
	<li>Caco-2 셀 5% CO2를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 PBMC 공동 문화의 존재/부재에 품 어.</li>
	<li>처음 몇 시간 후 방사선에 대 한 측정 TEER 매 시간, 그리고 이후에 모든 3 h 48 h까지.</li>
</ol>6. 서쪽 오 점 분석 Claudin-1, Occludin, Afadin, 조 1, ZO-2, NF-kB, 및 XIAP
<ol><li>씨앗 5 × 105 셀 6 잘 플레이트 공동 문화에 엑스레이 노출 하기 전에 1 주 (애완 동물, 2 x 106 모/cm2)를 삽입 하 고 2.1-2.4 단계에서 설명한 대로 셀을 비추는.</li>
	<li>Caco-2 셀 5% CO2를 포함 하는 습도 분위기에서 37 ° C에서 PBMC 공동 문화의 존재/부재에 품 어.</li>
	<li>Caco-2를 준비 하는 방사선 조사, 후 48 h 및 PBMC 세포 lysates 셀 세포와 세포를 치료 하 여 버퍼-20 ° c.에 샘플 저장 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
	<li>Bicinchoninic 산 (BCA) 메서드에서 총 단백질 양을 계량. 참고: 프로토콜 수 수 일시 중지 여기.</li>
	<li>Laemli 샘플 버퍼 β-mercaptoethanol 추가 총 단백질의 동등한 양으로 혼합 (β-mercaptoethanol의 최종 농도 5%), 5 분 동안 95 ° C에서 샘플을 열 고 10000 x g에서 그들을 회전.</li>
	<li>부하 샘플 4-20%에서 젤 캐스트 및 polyvinildiene 불 소 (PVDF) 막에 1 h. 전송 단백질에 대 한 120 V에서 전기 영동을 수행.</li>
	<li>잠복기 5% 비 지방 건조 우유 (NFDM) 0.2% 추가 PBS에 실 온에서 PVDF 막 여 비 특정 바인딩 사이트 차단 트윈-20 (PBT). 막 세 번 0.2%의 10 mL로 씻어 PBT 5 분.</li>
	<li>다음 주 항 체와 4 ° C에서 하룻밤 배치 되 고 전에 실 온에서 1 h에 대 한 부드러운 동요와 막 품 어: 안티-claudin-1, 안티-ZO-1, 안티-ZO-2, 안티-afadin, 안티 occludin, 안티-NF-kB, 안티-XIAP와 안티 말라. 막 세 번 0.2%의 10 mL로 씻어 PBT 5 분.</li>
	<li>부드러운 동요와 함께 실 온에서 1 h에 대 한 2 차 항 체 양 고추냉이 과산화 효소 HRP 활용으로 막 품 어. 막 세 번 0.2%의 10 mL로 씻어 PBT 5 분.</li>
	<li>실내 온도에, 향상 된 화학 발광 키트와 함께 막을 배양 하 여 사진 필름을 개발 합니다.</li>
	<li>사진 필름 스캐닝 시스템으로 취득 하 고 적당 한 이미지 분석 소프트웨어와 함께 얻은 밴드 계량. 참고: Claudin 1, Occludin, Afadin, ZO-1, 그리고 조 2의 평가 Caco-2 셀에서 수행 됩니다. NF-kB와 XIAP의 평가 PBMC에서 수행 됩니다. 주의: β-mercaptoethanol은 독성 (GHS05, GHS06, GHS08, GHS09). 하지 증기를 호흡, 환경에 릴리스를 방지 하 고 개인 보호 장치 및 호흡기 보호를 착용. 삼 키는 경우 즉시 의료 조언을 부탁 드립니다.</li>
</ol>7. 통계 분석
<ol><li>방사선 노출 및 공동 문화는 통계적으로 중요 한 섭 동 유발 여부를 확인 하려면 테스트를 수행 양방향 분산 분석 (ANOVA) 여러 비교 반복 측정 (비교 Bonferroni 게시물 임시 테스트와 함께 복제) 의미합니다.</li>
	<li>명시 하지 않으면, 양측 스튜던트 t-검정에 의해 통계적 유의 성 (p)를 계산 합니다. 각 값은 ≥3 독립적인 실험 ± 표준 오차의 의미 (SEM)의 평균입니다.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Cunningham, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colorectal+cancer.">Colorectal cancer.</a> Lancet. 375 (9719), 1030-1047 (2010).</li><li>Mancuso, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+bystander+radiation+effects+in+Patched+heterozygous+mouse+cerebellum.">Oncogenic bystander radiation effects in Patched heterozygous mouse cerebellum.</a> PNAS. 105 (34), 12445-12450 (2008).</li><li>Demaria, S., Formenti, S. 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E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+produced+by+external+radiation+in+parameters+influencing+intestinal+permeability+and+microparticle+uptake+in+vitro.">Changes produced by external radiation in parameters influencing intestinal permeability and microparticle uptake in vitro.</a> Int J Radiat Biol. 84 (6), 467-486 (2008).</li></ol>

저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

선진국에서 그것의 높은 발생으로 대 장 암 사망률 및 인구에서 사망률의 가장 빈번한 원인 중 하나입니다. 그것은 일반적으로 수술, 화학요법, 그리고 방사선 치료1에 의해 관리 됩니다. 방사선 치료의 프레임 워크에서 특정 주의 건강 한 조직을 노출4;의 효과를 부여 해야 합니다. 또한, 방사선 노출 및 면역 체계의 관계에 대 한 체계적인 연구는 라디오 immunotherapy3의 접근을 개발 하기 위한 기본.
우리는이 작품에서 채택 하는 방법론 Caco-2 셀 및 PBMC 크로스 토크의 조사를 맞게 되었습니다. 우리는 종양 세포의 엑스레이 노출의 효과에 집중 하지만 동일한 프로토콜 약리 작용 연구에 적용할 수 있습니다. 표준 세포 배양 관련 생리 적 조건에 가까이 되 고, 강한이 방법의 장점은 다른 세포 유형 및 자료의 분석의 가능성을 주어진 복잡 한 시스템의 완전 한 해 부의 가능성 공동 문화 자체의 두 구획으로 신호 분자. 이 방법에서는, 정기적으로 적용 된 생물 학적 방법 상호 관련된 메커니즘 휴대의 이해를 도울 수 있다.
Caco-2 셀에 X 레이 유도 효과의 초기 특성 두 보완 측정에 근거 했다, 즉 MTT 색도계 분석 결과 고 Trypan blue 염료 제외 테스트. 이러한 두 가지 분석 실험의 다른 초점에 의해 분명히 일관성 없는 결과 설명할 수 있었다. MTT은 Trypan 파랑 염료 생활 셀 제외 염료 메커니즘에 기반 하면서 oxidoreductase 효소 활동을 평가 합니다.
Caco-2-PBMC 상호 작용의 조사 공동 문화의 2 개의 구획 사이 완전 한 별거에 지도할 수 있는 상피 단층의 생성을 필요 합니다. Caco-2 셀 공동 문화 삽입에 뿌리기의 가능성이 셀 인구 조사 수 있습니다. 공동 문화 조사 후 시작, 이후 PBMC의 어떤 실수로 노출으로 인해 아무 편견이 있다. 이 설정 해야 손상 (또는 오염)을 피하기 위해 신중 하 게 처리 되어야 세포 단층 삽입의 움직임 동안 다른 한 6 잘 플레이트에서 합니다. 신중 하 게 수행 하는 경우 TEER 측정 조사 단층 침투성을 간단 하 고 비-침략 적 방법입니다. 이 분석 결과 엄격 하 게 공동 문화 설정에 관련 된 그리고 단층 침투성의 조사에 대 한 유일한 선택이 아니다. 그것은 잘 신선한 완전 한 매체와 보정은 일단 좋은 재현성을 측정의 수 있습니다. 일반적인 분석 아래 "basolateral" 하나에 위 "꼭대기" 구획에서 화학 염료의 확산에 초점 (예: fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran 분석 결과)16. 그러나, PBMC이이 연구에서 basolateral 구획에 있기 때문에, 우리는 실험에서 화학 시 약의 소개를 방지 하기로.
이 작품에서 채택 하는 다른 기법 중 TEER 측정은 유일 하 게 공동 문화 설정17,18필요 합니다. 그러나, 다른 일반적인 실험실 기술은 설치 생리에 가까운 조건의 조사 수 데이터 강한 생물 학적 중요성으로 셀 공동 문화에 적용 될 때 더 유익한 결과 제공 합니다. 다른 한편으로, 그것은 다공성 지원에 성장 하는 세포를 사용 하 여 서 부 럽 통해 분석할 세포 추출의 준비를 위한 세포 세포의 용 해 등 샘플을 준비 하는 데 필요한 작업에 몇 가지 문제가 발생할 수 언급 해야 합니다.
이 연구에서 채택 하는 시스템 개선, 예를 들면 기질 환경 재현 수 물질의 응용 프로그램으로 추가 될 가능성이 있다. 그러나,이 또한 시스템의 증가 복잡성 귀 착될 것 이다 고 설정의 완전 한 해 부 달성 될 더 어려울 것 이다.
셀 공동 문화에 대 한 설정을 확실히 복잡 한 시스템의 이해에 대 한 생체 외에서 연구의 발전을 위한 강력한 도구를 나타냅니다. 이 기술은 분자 신호에 그리고 가능한 응용 프로그램의 프레임 워크에서 면역 체계의 활동의 변조에 기초 연구 연구에 새로운 입력을 제공 하는 기본 메커니즘에 대 한 지식을 증가 하는 종양학 임상 환자 관리입니다.

이 작품에서 채택 하는 방법론은 대 장 암 세포와 면역 체계를 이용 하는 일반 2 차원 세포 배양에 비해 생리 적 조건에 가깝게 설정 간의 상호 작용을 조사 하도록 설계 되었습니다.
대 장 암 (CRC) 세 번째 가장 빈번한 유형의 (글로벌 암 전망대, 암, 세계 보건 기구, http://gco.iarc.fr에 대 한 연구를 위한 국제 기관)의 경우 전세계 1 백만 이상으로 암으로 간주 됩니다. CRC의 관리는 수술, 화학요법 또는 방사선 치료1통해 정기적으로 수행 됩니다. 수술 또는 화학요법 같은 침략 적 기법에 비해, 방사선 치료는 크게 일반적인 해로운 조직의 반응 방사선 복용량의 지역화 된 배달 덕분에 이러한 임상 접근에서 파생 방지 합니다. 그러나, 부작용은 건강 한 세포에 직접적인 피해와 피해 대상 비 효과2,,34중재 염증 트리거링 주변의 건강 한 조직에 발생할 수 있습니다. 대 장 암 치료 중 방사선 조사로 인해 불리 한 효과에 초점을 맞추고, 두 가지 측면 조사 될 필요가 있다. 첫째, 장 불 침투성의 책임 메커니즘 방사선 전달 일으키는, 차례 차례로, 세균성 인구 변경된 포함 및 paracellular 통로 분자와 용액의 부작용의 가능성에 의해 변경 될 수 있습니다. 둘째, 창 자 연관 된 림프 조직 (GALT)의 존재 세균성 성장을 통제 하 고 일반적인 면역 반응5,,67중재의 기능을 가진 면역 시스템의 전초 역할을 합니다. 이러한 기능을 수행 하기 위해 장 불 침투성 세포의 세포 막 사이 접합 단지의 기능 때문에 유지 됩니다. 이러한 이유로, 엑스레이의 다른 복용량 인해 유발된 해로운 결과 혼자 및 공동 문화 PBMC Caco-2 셀에 조사 되었다.
생물 의학 연구에 조사의 첫번째 setline는 세포 배양에 대 한 연구를 실시, 운전 하는 다른 세포 유형 사이 세포 생물학과 상호 상호 작용 하는 메커니즘의 상세한 지식이 부족 될 수 있습니다 중요 한 때 기관, 시스템, 그리고 실험실에서 쉽게 다시 만들 수 없는 기구의 생리학의 학문에 접근. 따라서, 우리 두 셀 인구 함께의 연구와 세포와 extracellular 메커니즘에 관련 된 측면의 해 부를 수 있도록 공동 문화 체제를 채택 하기로.
공동 문화 상피 기능과 다른 세포 유형 사이 상호 작용을 공부 하는 때 악용 하는 기법 이다. 특히, 이러한 기술의 사용 epithelia 셀 특징 극성으로 구성 되어 있기 때문에 우리의 경우, 필수 됩니다. 장 배리어의 경우 enterocytes 표시 꼭대기와 잘 정의 된 분극 하 고 basolateral 극 일반적으로 꽉 교차점을 만드는 접착 분자의 존재로 인해 분리 합니다. 이 구획은 paracellular 인신 매매와 결정된 분자만 통과 허용 피하 조직 생리학에 대 한 필요 합니다. 이 기능은 물론 설정 배양 정상 세포와 함께 재현 가능한 되지 않습니다. 또한, 공동 문화 체제의 채택 꼭대기 표면 (창 자 루멘에 해당)은 다른 세포와 직접 접촉 하는 동안만 basolateral 표면에에서 면역 세포의 존재를 재현 합니다.
최근, Caco-2 셀 라인 장 방 벽의 생체 외에서 모델로 더 많은 중요성을 얻었다. 인간 결 장 선 암에서 파생, Caco-2 세포 분화 능력을 유지 하 고 기능 편광된 단층8, 공동 문화 삽입에서 성장 될 때 세포 막 속성의 조사 수 있는 만듭니다.
Caco-2 다공성 막에 경작 장 단층의 잘 설립 된 생체 외에서 모델 이후 개선 Caco-2와 다른 세포 사이 공동 문화 되었습니다. 이 설치는 빈번 하 게 채택 되었다 측정 다른 사이 누화 종류9 셀 Caco-2를 해명 하는 데 사용 수 불안정 Caco-2 혼자 경작에 관하여 공동 문화에서 외 인 자극에 응답.
많은 연구 Caco-2 해결 동작 때 모두 비 병원 성 박테리아와 공동 경작 하 고 주변 혈액 단 세포, 특히 면역 시스템10와 혼선을 명료 하 게. 포-루비 오 외. 11 공부 Caco-2/PBMC 공동 문화에 여러 가지 cytokines의 표정을 Caco-2 세포를 자극 하는 bifidobacteria. 그들의 작품에 cytokine 식 프로필 PBMC의 존재/부재에서 세균성 자극에 따라 상당한 수정 강조 표시 됩니다. 그들의 결과 PBMC 존재 bifidobacteria에 Caco-2 sensitizes 결론으로 이어질.
비 병원 성 및 병원 성 박테리아 Caco-2 셀의 다른 응답 다른 연구 팀에 의해 평가 되어 있다. Parlesak 외. 12 대장균에 Caco-2 셀의 면역 억제 효과 입증-PBMC를 자극. 또한, 할 러 외. 13 enteropathogenic 대장균 종 또는 비 enteropathogenic 박테리아 i.e.E. 대장균 종, Caco-2 셀 두 lipopolysaccharide (LPS)와 자극된의 응답 공부 균 종, 강화는 Caco-2 세포의 응답 공동 문화 설정에 백혈구의 존재에 엄격 하 게 따라 하는 추측.
다른 상호 보완적인 실험실 분석을 수행 하 여 (예: 서쪽 오 점, 트랜스 상피 전기 저항, MTT, 등), 공동 문화에서 성장 하는 다른 세포 유형의 분석 뿐만 아니라 전체 방법론 약속 더 많은 대표에 비보를 정말 어떻게 간주 될 수 있는 결과. 또한,이 설정 관련된 셀 형식의 연구 뿐만 아니라 위 대 더 낮은 구획에 또는 존재 에서에서 발표 하는 세포 신호 분자를 수 있도록 다른 공동 문화 구획의 분리 수 있습니다. 대 공동 문화의 부재.

<table><tbody><tr><td>ThinCert&lt;br/&gt; 6 Well Cell Culture Inserts for Multiwell Plates</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657610</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Cell Culture Multiwell Plate, 6 Well&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>657160</td><td>Plastic</td></tr><tr><td>Cell Culture Multiwell Plate, 24 Well&amp;nbsp;</td><td>Greiner Bio-one</td><td>662160</td><td>Plastic</td></tr><tr><td>RPMI 1640 without L-Glutamine</td><td>Lonza</td><td>12-167F</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Foetal Bovine Serum</td><td>Lonza</td><td>DE14-801</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>L-Glutamine 200 mM</td><td>Lonza</td><td>17-605C</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Penicillin/Streptomycin&amp;nbsp; 10K/10K</td><td>Lonza</td><td>17-602E</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; Incubator</td><td>Heal Force</td><td>HF240</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Ficoll Histopaque-1077</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10771</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Tube, 50 mL, PP, Conical Bottom</td><td>Greiner Bio-one</td><td>227261</td><td>Plastic</td></tr><tr><td>Tube, 15 mL, PP, Conical Bottom</td><td>Greiner Bio-one</td><td>188261</td><td>Plastic</td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>ThermoScientific</td><td>CL31R</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3813</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Cell Culture Flask, 25 cm&lt;sup&gt;2&lt;/sup&gt;, PS</td><td>Greiner Bio-one</td><td>690175</td><td>Plastic</td></tr><tr><td>Clinac 2100 Linear Accelerator</td><td>Varian</td><td>CLINAC 2100C/D</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide (MTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5655</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Dimethyl sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8418</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Multiwell Plate Reader</td><td>GDV</td><td>DV990BV6</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution 0,4 %&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>K940</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Trypsin-EDTA Solution</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T4049</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>1.5 mL tubes</td><td>Eppendorf</td><td>0030125150</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Millicell-ERS voltmeter/ohmeter</td><td>Millipore</td><td>MERS 00001</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Cell Lysis Buffer (10x)</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>#9803</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>B&amp;uuml;rker Hemocytometer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>BR719520</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>BCA Protein Quantification Kit</td><td>Abcam</td><td>ab102536</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>2x Laemmli Sample Buffer&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>#1610737</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>#1610710</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Accublock Digital Dry Bath</td><td>Labnet International Inc.</td><td>D1100</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>4&amp;ndash;20% Mini-PROTEAN TGX Stain-Free Protein Gels, 10 well, 30 &amp;micro;L</td><td>BioRad</td><td>#4568093&amp;nbsp;</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN&amp;nbsp;Tetra Vertical Electrophoresis Cell for Mini Precast Gels, 4-gel</td><td>BioRad</td><td>#1658004</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>PowerPac HC High-Current Power Supply</td><td>BioRad</td><td>#1645052&amp;nbsp;</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein WesternC Blotting Standards</td><td>BioRad</td><td>#1610385&amp;nbsp;</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>10x Tris/Glycine/SDS Running Buffer</td><td>BioRad</td><td>#1610732&amp;nbsp;</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Trans-Blot&amp;nbsp;Turbo Mini PVDF Transfer Packs</td><td>BioRad</td><td>#1704156</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Trans-Blot&amp;nbsp;Turbo Transfer System</td><td>BioRad</td><td>#1704150</td><td>Equipment</td></tr><tr><td>Blotting-Grade Blocker&amp;nbsp;</td><td>BioRad</td><td>#1706404</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93773</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Claudin-1 (D5H1D) XP&amp;nbsp;Rabbit mAb&amp;nbsp;</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>#13255</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Bovine Serum Albumine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>ZO-1 (D7D12) Rabbit mAb&amp;nbsp;</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>#8193</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>ZO-2 Antibody&amp;nbsp;</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>#2847</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Afadin (D1Y3Z) Rabbit mAb</td><td>Cell Signalling Technology</td><td>&amp;nbsp;#13531</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Anti-Occludin Antibody</td><td>Millipore</td><td>ABT146</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Anti-NF-kB p65 antibody [E379]</td><td>Abcam</td><td>ab32536</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Anti-XIAP antibody&amp;nbsp;</td><td>Abcam</td><td>ab21278</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Amersham ECL Mouse IgG, HRP-linked whole Ab (from sheep)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA931V</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Amersham ECL Rabbit IgG, HRP-linked whole Ab (from donkey)</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>NA934V</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Clarity Western ECL Substrate, 200 mL</td><td>BioRad</td><td>#1705060&amp;nbsp;</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Carestream&amp;nbsp;Kodak&amp;nbsp;autoradiography GBX developer/replenisher</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7042</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Carestream&amp;nbsp;Kodak&amp;nbsp;autoradiography GBX fixer/replenisher</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P7167</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Carestream&amp;nbsp;Kodak&amp;nbsp;BioMax&amp;nbsp;light film</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z370401</td><td>Reagents</td></tr><tr><td>Gel Doc EZ System</td><td>BioRad</td><td>#1708270&amp;nbsp;</td><td>Equipment</td></tr></tbody></table>

a co-culture method to investigate the crosstalk between x-ray irradiated caco-2 cells and pbmc

프로토콜 채택에이 작품을 어떻게 엑스레이 교란 장 장벽의 기능 대 장 종양 세포와 면역계 사이의 상호 작용에 초점을 맞추고 탈피 목표로. 대 장 암 암, 수술, 화학요법, 그리고 방사선 치료에 의해 일반적으로 처리의 가장 일반적인 유형 중 하나입니다. 타겟팅 종양에 방사선 치료의 장점은 잘 알려져 있습니다. 그러나, 건강 한 조직의 제한 노출 장의 장벽 및 면역 체계에 미치는 영향에 대해 특히 큰 관심사입니다. 일반 세포 배양에 비해 더 생리 적인 것과 유사한 조건에서 두 셀 인구 사이 상호 작용을 공부 하 채택된 설치 수 있습니다. 이 위해 우리가 다른 기술에 리조트와 우리는 생체 외에서 공동 문화 모델 사용, 단층과 같은 문화 매체를 공유 PBMC 분화 Caco-2 셀에 따라. 이 프로토콜에 염증 통로의 활성화 그리고, 서쪽 오 점, 분자 변경, 즉 거시적인 효과, 즉 세포 생존 능력 및 트랜스 상피 전기 저항 (TEER)에 초점을 개발 되었습니다. 면역 세포와 Caco-2 셀에 꽉 접합 단백질 표정. Caco-2 세포 생존 능력에 방사선 효과의 초기 평가 동안 TEER는 ohmmeter를 통해 고정된 시간 간격 측정 되었다 Trypan 블루 분석 실험, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium 브 로마 이드 (MTT)를 통해 평가 되었다 특히 공동 문화 시스템을 위해 설계 되었습니다. 이 방법에서는, 방사선, 존재의 주변 혈액 단 세포 (PBMC), 그리고 결국 그들의 시너지 효과 인해 효과 설명할 수 있습니다. 이러한 상호 보완적인 기술을 통해 PBMCs 추가 된 때 높은 라디오-저항 Caco-2의 2-10 Gy의 x-레이 및 증가 Caco-2 단층 침투성의 범위 내에서 관찰 합니다. 특히, PBMC 존재 관련 꽉 접합 비 계 단백질 식에서 변형 된 것으로 밝혀졌다.

실험 전에 1 주 셀 삽입의 다공성 막에 뿌 렸 고 있으며 다음과 같은 일 동안 성장할 수 있습니다. 합류의 레벨도는 거꾸로 한 현미경을 사용 하 여 확인할 수 있습니다 또는 TEER 값의 측정을 통해. 실제로, 성장 단계 TEER 모든 다공성 막 세포에 의해 덮여 있다 그리고 그들은 차별화 된 셀 단층을 형성 될 때까지 늘리면 유지 합니다. 세포 증식 빠른/느린, 실험 후 시드 되 고 이전/나중 지점에서 시작할 수 있습니다. 때에 합류, 세포는 다음 가져 방사선 조사 시설, imparted 환경 스트레스 (온도, pH)와 함께/없이 아래 칸 (그림 1A)에 시드 PBMC 공동 문화를 시작 하기 전에 최소화 또는 Caco-2 세포의 확산을 평가. 초기 시드 밀도 주어진 하루에 0 셀 한다 도달 100% 합류 하 고 고원 TEER 그림 1B에 의해 관찰 될 수 있는 상피 세포의 차별화 된 단층을 만듭니다. 셀 같은 상태에 도달, TEER 값으로 오래 된 문화 매체는 대체 신선한 매체와 적어도 일주일에 한 번 (그림 1B) 상대적으로 다음 주 일정 유지 됩니다. 그림 1C같이 24 시간에도 접수 (최대 10 Gy) 복용량 별도로 48 h에 MTT 분석 결과 어떤 통계적 Caco-2 세포의 증식 상태 변경을 표시 되지 않습니다.
다른 결과 Caco-2 셀의 단기 사망률에 관한 관찰 되었다. 두 시간 지점에서 셀 사망률에는 복용량-의존 증가 표시 Trypan 푸른 얼룩. 이 결과 죽은 세포의 백분율 높은 배달된 복용량 (10 Gy) 생산 세포 죽음 (그림 1D)의 20% 대략만 고려 하는 경우에 특히 매우 낮은 것으로 나타날 있지만 방사선 노출의 명확한 효과 보여 줍니다.
샘플 또는 더 낮은 구획에서 PBMC 없이 공동 경작 했다. PBMC에 어떤 외부 자극에는 영향을 받지 못한 사실을 감안할 때, 48 h 실험 PBMC 죽을 시작으로 도입 하는 바이어스를 피하기 위해 이상적인 여겨졌다. 따라서,에서 방사선, 직전 TEER 정기적으로 측정 했다 48 h에 대 한 조사 프로토콜에 의해 발생 가능한 일시적인 효과를 추적. 그림 1 E F같이 TEER 값 제시는 더 나은 (1200-1500 Ω·cm2순서의 있던) 미리 치료 조건에 관하여 상대 변형을 강조 x 선 방사선에 의해 유도 된 섭 동 및 존재/부재 PBMC의 공동 문화에 의해 또는. 두 경우 모두에서 초기 과도 피크 볼 수 있습니다 명확 하 게 첫 번째 시간이 시점에서 방사선 노출, 방사선 프로시저에 표시 될 수 있습니다.
하지에서 PBMC (그림 1E)와 함께 공동 문화, TEER 값은 48 h 동안,까지 거의 일정 한 엑스레이의 10 Gy 후, 셀 표시 TEER 장기간된 감소 3 h 방사선 조사 후에 시작. PBMCs의 존재는 완전히 TEER 임시 역학 (그림 1F)를 수정합니다. 모든 복용에 대 한 감소는 TEER 때 명확 하 게 약 30 h 방사선 조사 후, 최대 3 h에서 관찰 TEER 정착 상수 값 (그림 1F)에 나타납니다.
단단한 접속점 단지 식 수준 서쪽 오 점 분석 결과 통해 Caco-2 세포 lysates에서 조사 되었다. Caco-2 셀 (0, 2, 및 10 Gy의 복용량)과 이온화 방사선에 노출 되었고 이후에 성장 혼자 또는 공동 문화 48 h에 대 한 맨 아래 칸에 PBMCs ( 그림 2A-F에서 같이). Claudin-1와 Occludin (그림 22B) x 선 및/또는 공동 문화 PBMC 크게 변경 하지 것을 발견 했다. 큰 변동이 대신 ZO-1 조 2, Afadin (그림 2C, 2D, 2E) 비 계 단백질에서 관찰 되었다. 특히, ZO-2 식 수준에 있는 감소는 Caco-2 혼자 성장 하는 때 동안 10 Gy에서 PBMC와 공동 문화에 때 2 Gy 후 이미 관찰 됩니다. Afadin 식 수준 대신 영향을 받습니다 10 Gy 엑스레이의 직후 Caco-2는 PBMCs와 공동 경작 하는 때 추가 감소.
PBMCs 공동 Caco-2 교양 염증 상태에 관한 분석 했다, 특히 핵 전사 인자 kB (NF-kB)와 apoptosis 단백질 (XIAP) 레벨의 X 연결 된 억제 물 조사 되었습니다 (그림 2 G-난). NF-kB 총 금액은 영향을 받지는 공동 문화 Caco-2 다른 방사선 복용량 (그림 2G)에 노출. 그와 반대로, XIAP 레벨 4-fold 최대 2 Gy에 10 Gy 공동 문화, 규제 하지만 했다 큰 변화가 요구 같은 변동을 얻을 더 나은 통계적 인 힘 분석 샘플의 더 높은 번호.
같이 그림 2F 와 2I, 일부 일반적인 악대는 관심사의 단백질의 예상된 분자량 옆 나타날 수 있습니다. 사실과 일반적인 밴드 쉽게 구별할 수 있습니다, 하지 않는 한 다른 항 체 또는 BSA 또는 NFDM 농도 고려 되어야 한다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56908/56908fig1.jpg"> 그림 1 . 전반적으로 실험적인 체제 및 방사선 노출 PBMC 공동 문화의 거시적인 효과. 공동 문화 모델의 A) 회로도 묘사. B) TEER 값은 단층의 적절 한 성장과 분화 상태를 평가 하기 위해 Caco-2 셀의 초기 씨앗에서 매일 측정. C) 세포 생존 능력 및 D) Caco-2 엑스레이 (0, 2, 5, 및 10 Gy)에 노출에 사망. Gy의 엑스레이 없이 교양 또는 F E) TEER 측정 Caco-2 셀에 0, 2, 및 10 반구) PBMCs와 함께. 각 값은 ≥3 독립적인 실험 ± SEM.의 평균 * p 발 < 0.05; * * p-버지니아 l < 0.01; p-발 < 0.001입니다. 그래프 Morini 알 외에서에서 적응입니다. 15. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56908/56908fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56908/56908fig2.jpg"> 그림 2. 서쪽 오 점 결과 Caco-2와 PBMC lysates의. 꽉 접합 단백질 (Claudin-1 (A), Occludin (B), ZO-1 (C), ZO-2 (D), 및 Afadin (E)) 0, 2, 및 10 Gy의 엑스레이 후 Caco-2 및 공동 문화에서 PBMC의 존재/부재의 식 수준입니다. 값은 말라 수준에서 정규화 됩니다. 각 단단한 연결 단백질 및 조건에 대 한 설명을 영화 패널 (F)에 표시 됩니다. NF-κB (G) 및 XIAP (H) PBMCs 공동 Caco-2 세포와 배양의 식 수준입니다. NF-kB, XIAP, 그리고 걸에 대 한 대표적인 영화 패널에 표시 됩니다. 각 값은 ≥3 독립적인 실험 ± SEM. 그래프 Morini 알 외에서에서 적응의 의미입니다. 15. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56908/56908fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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A Co-culture Method to Investigate the Crosstalk Between X-ray Irradiated Caco-2 Cells and PBMC

우리는 X 레이 방사선 Caco-2와 주변 혈액 단 세포 (PBMC) 사이 누화를 조사 하는 프로토콜을 제시. 프로토콜은 Caco-2 조사와 PBMC; 공동 문화권의 시작 그 후, 트랜스 상피 전기 저항 48 h 및 서양 오 점 Caco-2에 PBMC 수행을 통해 정기적으로 측정 됩니다.

X-선 사이 누화를 조사 하는 공동 문화 방법을 반구 Caco-2 셀 및 PBMC

The protocol adopted in this work aims at unraveling how X-rays perturb the functioning of the intestinal barrier, focusing on the interplay between ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

12.9K 조회수.  Università degli Studi di Pavia. 우리는 X 레이 방사선 Caco-2와 주변 혈액 단 세포 (PBMC) 사이 누화를 조사 하는 프로토콜을 제시. 프로토콜은 Caco-2 조사와 PBMC; 공동 문화권의 시작 그 후, 트랜스 상피 전기 저항 48 h 및 서양 오 점 Caco-2에 PBMC 수행을 통해 정기적으로 측정 됩니다.

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A Mimic of the Tumor Microenvironment: A Simple Method for Generating Enriched Cell Populations and Investigating Intercellular Communication

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events leading to stromal activation and establishment of the tumor microenvironment (TME). Several in vitro and in vivo models of the TME have been developed; however, in general these models do not readily permit isolation of individual cell populations, under non-perturbing conditions, for further study. To circumvent this difficulty, we have employed an in vitro TME model using a cell growth substrate consisting of a permeable microporous membrane insert that permits simple generation of highly enriched cell populations grown intimately, yet separately, on either side of the insert&#39;s membrane for extended co-culture times. Through use of this model, we are capable of generating greatly enriched cancer-associated fibroblast (CAF) populations from normal diploid human fibroblasts following co-culture (120 hr) with highly metastatic human breast carcinoma cells, without the use of fluorescent tagging and/or cell sorting. Additionally, by modulating the pore-size of the insert, we can control for the mode of intercellular communication (e.g., gap-junction communication, secreted factors) between the two heterotypic cell populations, which permits investigation of the mechanisms underlying the development of the TME, including the role of gap-junction permeability. This model serves as a valuable tool in enhancing our understanding of the initial events leading to cancer-stroma initiation, the early evolution of the TME, and the modulating effect of the stroma on the responses of cancer cells to therapeutic agents.

We adapted a permeable microporous membrane insert to mimic the tumor microenvironment (TME). The model consists of a mixed cell culture, allows simplified generation of highly enriched individual cell populations without using fluorescent tagging or cell sorting, and permits studying intercellular communication within the TME under normal or stress conditions.

종양 미세 환경의 모방 : 세포 간 통신을 농축 세포 인구를 생성 및 조사를위한 간단한 방법

Understanding the early heterotypic interactions between cancer cells and the surrounding non-cancerous stroma is important in elucidating the events ...

연구

암 연구학

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract (ECME)-based Three-dimensional System

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, thus greatly influencing normal tissue homeostasis and disease outcome. In breast cancer, tumor-associated macrophages (TAMs) play a critical role in disease progression, metastasis, and recurrence; therefore, understanding the mechanisms of monocyte chemoattraction to the tumor microenvironment and their interactions with tumor cells is important to control the disease. Here, we provide a detailed description of a three-dimensional (3D) co-culture system of human breast cancer (BrC) cells and human monocytes. BrC cells produced high basal levels of regulated on-activation, normal T-cell expressed and secreted (RANTES), monocyte chemoattractant protein-1 (MCP-1), and granulocyte-macrophage colony-stimulating factor (G-CSF), while in co-culture with monocytes, pro-inflammatory cytokines Interleukin (IL)-1 beta (IL-1&#946;) and IL-8 were enriched together with matrix metalloproteinases (MMP)-1, MMP-2, and MMP-10. This tumor stroma microenvironment promoted resistance to anoikis in MCF-10A 3D acini-like structures, chemoattraction of monocytes, and invasion of aggressive BrC cells. The protocols presented here provide an affordable alternative to study intra-tumor communication and are an example of the great potential that in vitro 3D cell systems provide to interrogate specific features of tumor biology related to tumor aggression.

Analyzing the Communication Between Monocytes and Primary Breast Cancer Cells in an Extracellular Matrix Extract ECME-based Three-dimensional System

Here, we describe a three-dimensional culture method to analyze the morphology of primary breast cancer cells, as well as to study their direct/indirect interactions with monocytes and the outcomes such as collagen degradation, immune cell recruitment, cell invasion, and promotion of cancer-related inflammation.

(ECME) 추출 Monocytes 그리고 기본 유 방 암 세포는 세포 외 기질 간의 통신을 분석-기반 3 차원 시스템

Embedded in the extracellular matrix (ECM), normal and neoplastic epithelial cells intimately communicate with hematopoietic and non-hematopoietic cells, ...

Dual Effects of Melanoma Cell-derived Factors on Bone Marrow Adipocytes Differentiation

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are available for studying the significant crosstalk; however, a two-dimensional transwell system for coculture remains a classic, reliable, and easy way for this crosstalk study. Here, we present a detailed protocol that shows the coculture of bone marrow adipocytes and melanoma cells. Nevertheless, such a coculture system could not only contribute to the study of cell signal transductions of cancer cells induced by bone marrow adipocytes, but also to the future mechanistic study of bone metastasis which may reveal new therapeutic targets for bone metastasis.

Here, we present a reliable and straightforward two-dimensional (2D) coculture system for studying the interaction between tumor cells and bone marrow adipocytes, which reveals a dual effect of melanoma cell-derived factors on the bone marrow adipocytes differentiation and also poses a classic method for the mechanistic study of bone metastasis.

골 Adipocytes 차별화에 흑색 종 세포 유래 요인의 이중 효과

The crosstalk between bone marrow adipocytes and tumor cells may play a critical role in the process of bone metastasis. A variety of methods are ...

Studying the Effects of Tumor-Secreted Paracrine Ligands on Macrophage Activation using Co-Culture with Permeable Membrane Supports

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer growth and metastasis. Paracrine signals can involve cell-cell contact between different cell types, such as PD-L1 expressed on the surface of tumors interacting directly with PD-1 on the surface of T cells, or the secretion of ligands by a tumor cell to affect an immune cell. Here we describe a co-culture method to interrogate the effects of tumor-secreted ligands on immune cell (macrophage) activation. This straightforward procedure utilizes commercially available 0.4 &#181;m polycarbonate membrane permeable supports and standard tissue culture plates. In the process described, macrophages are cultured in the upper chamber and tumor cells in the lower chamber. The presence of the 0.4 &#181;m barrier allows for the study of intercellular signaling without the confounding variable of physical contact, because the two cell types share the same medium and exposure to paracrine ligands. This approach can be combined with others, such as genetic alterations of the macrophage (e.g., isolation from genetic knock-out mice) or tumor (e.g., CRISPR-mediated alterations) to study the role of specific secreted factors and receptors. The approach also lends itself to standard molecular biological analyses such as quantitative reverse transcription polymerase chain reaction (qRT-PCR) or Western blot analysis, without the need for flow sorting to separate the two cell populations. Enzyme-linked immunosorbent assays (ELISAs) can similarly be utilized to measure secreted ligands to better understand the dynamic interaction of cell signaling in the multiple cell type context. Duration of co-culture can also be varied for the study of temporally regulated events. This co-culture method is a robust tool that facilitates the study of tumor-secreted signals in the immune context.

Here, we present a method using permeable membrane supports to facilitate the study of non-contact paracrine signaling used by tumor cells to suppress the immune response. The system is amenable to studying the role of tumor-secreted factors in dampening macrophage activation.

투과성 멤브레인 지지대를 이용한 공동 배양을 이용한 대식세포 활성화에 대한 종양 분비 파라크린 리간드의 효과 연구

Tumor-derived paracrine signaling is an overlooked component of local immunosuppression and can lead to a permissive environment for continued cancer ...

Monitoring Cancer Cell Invasion and T-Cell Cytotoxicity in 3D Culture

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited number of assays allow for direct monitoring and mechanistic insights into the interactions between tumor and immune cells, amongst which, T-cells play a significant role in executing the cytotoxic response of the adaptive immune system to cancer cells. Most assays are based on two-dimensional (2D) co-culture of cells due to the relative ease of use but with limited representation of the invasive growth phenotype, one of the hallmarks of cancer cells. Current three-dimensional (3D) co-culture systems either require special equipment or separate monitoring for invasion of co-cultured cancer cells and interacting T-cells.
Here we describe an approach to simultaneously monitor the invasive behavior in 3D of cancer cell spheroids and T-cell cytotoxicity in co-culture. Spheroid formation is driven by enhanced cell-cell interactions in scaffold-free agarose microwell casts with U-shaped bottoms. Both T-cell co-culture and cancer cell invasion into type I collagen matrix are performed within the microwells of the agarose casts without the need to transfer the cells, thus maintaining an intact 3D co-culture system throughout the assay. The collagen matrix can be separated from the agarose cast, allowing for immunofluorescence (IF) staining and for confocal imaging of cells. Also, cells can be isolated for further growth or subjected to analyses such as for gene expression or fluorescence activated cell sorting (FACS). Finally, the 3D co-culture can be analyzed by immunohistochemistry (IHC) after embedding and sectioning. Possible modifications of the assay include altered compositions of the extracellular matrix (ECM) as well as the inclusion of different stromal or immune cells with the cancer cells.

The presented approach simultaneously evaluates cancer cell invasion in 3D spheroid assays and T-cell cytotoxicity. Spheroids are generated in a scaffold-free agarose multi-microwell cast. Co-culture and embedding in type I collagen matrix are performed within the same device which allows to monitor cancer cell invasion and T-cell mediated cytotoxicity.

3D 배양에서 암 세포 침략 및 T 세포 세포 독성 을 감시

Significant progress has been made in treating cancer with immunotherapy, although a large number of cancers remain resistant to treatment. A limited ...

Real-Time Detection and Capture of Invasive Cell Subpopulations from Co-Cultures

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of cancer cell populations typically generate a single endpoint measurement that does not distinguish between cancer cell subpopulations with different invasive potential. Also, the tumor microenvironment consists of different resident stromal and immune cells that alter and participate in the invasive behavior of cancer cells. Invasion into tissues also plays a role in immune cell subpopulations fending off microorganisms or eliminating diseased cells from the parenchyma and endothelial cells during tissue remodeling and angiogenesis. Real-Time Cellular Analysis (RTCA) that utilizes impedance biosensors to monitor cell invasion was a major step forward beyond endpoint measurement of invasion: this provides continuous measurements over time and thus can reveal differences in invasion rates that are lost in the endpoint assay. Using current RTCA technology, we expanded dual-chamber arrays by adding a further chamber that can contain stromal and/or immune cells and allows measuring the rate of invasion under the influence of secreted factors from co-cultured stromal or immune cells over time. Beyond this, the unique design allows for detaching chambers at any time and isolating of the most invasive cancer cell, or other cell subpopulations that are present in heterogeneous mixes of tumor isolates tested. These most invasive cancer cells and other cell subpopulations drive malignant progression to metastatic disease, and their molecular characteristics are important for in-depth mechanistic studies, the development of diagnostic probes for their detection, and the assessment of vulnerabilities. Thus, the inclusion of small- or large-molecule drugs can be used to test the potential of therapies that target cancer and/or stromal cell subpopulations with the goal of inhibiting (e.g., cancer cells) or enhancing (e.g., immune cells) invasive behavior.

We describe an approach to detect and capture invasive cell subpopulations in real-time. The experimental design uses Real-Time Cellular Analysis by monitoring changes in the electric impedance of cells. Invasive cancer, immune, endothelial or stromal cells in complex tissues can be captured, and the impact of co-cultures can be assessed.

공동 배양물로부터의 침습적 세포 하위집단의 실시간 검출 및 포획

Invasion and metastatic spread of cancer cells are the major cause of death from cancer. Assays developed early on to measure the invasive potential of ...

유세포분석 기반 암 면역 주기 모니터링 

Co-Culture In Vitro Systems to Reproduce the Cancer-Immunity Cycle

Fundamental cancer research and the development of effective counterattack therapies both rely on experimental studies detailing the interactions between cancer and immune cells, the so-called cancer-immunity cycle. In vitro co-culture systems combined with multiparametric flow cytometry (mFC) and tumor-on-a-chip microfluidic devices (ToCs) enable simple, fast, and reliable monitoring and characterization of each step of the cancer-immunity cycle and lead to the identification of the mechanisms responsible for tipping the balance between cancer immunosurveillance and immunoevasion. A thorough understanding of the dynamic interplays between cancer and immune cells provides critical insights to outsmart tumors and will accelerate the pace of therapeutic personalization and optimization in patients. Specifically, here we detail a straightforward mFC- and ToC-assisted protocol for unraveling the dynamic complexities of each step of the cancer-immunity cycle in murine cancer cell lines and mouse-derived immune cells and focus on immunosurveillance. Considering the time- and cost-related features of this protocol, it is certainly feasible on a large scale. Moreover, with minor variations, this protocol can be both adapted to human cancer cell lines and human peripheral-blood-derived immune cells and combined with genetic and/or pharmacologic inhibition of specific pathways in order to identify biomarkers of immune response.

암-면역 주기 모니터링 및 종양 미세환경 역학 탐구

Here, we detail a simple, fast, and reliable multiparametric flow cytometry- and tumor-on-a-chip-assisted protocol to monitor and characterize the steps constituting the cancer-immunity cycle. Indeed, a thorough understanding of the interplays between cancer and immune cells provides critical insights to outsmart tumors and guide clinical care.

암-면역 주기를 재현하기 위한 Co-Culture In Vitro 시스템

Fundamental cancer research and the development of effective counterattack therapies both rely on experimental studies detailing the interactions between ...

Microfluidic Co-Culture Models for Dissecting the Immune Response in in vitro Tumor Microenvironments

Complex disease models demand cutting-edge tools able to deliver physiologically and pathologically relevant, actionable insights, and unveil otherwise invisible processes. Advanced cell assays closely mimicking in vivo scenery are establishing themselves as novel ways to visualize and measure the bidirectional tumor-host interplay influencing the progression of cancer. Here we describe two versatile protocols to recreate highly controllable 2D and 3D co-cultures in microdevices, mimicking the complexity of the tumor microenvironment (TME), under natural and therapy-induced immunosurveillance. In section 1, an experimental setting is provided to monitor crosstalk between adherent tumor cells and floating immune populations, by bright field time-lapse microscopy. As an applicative scenario, we analyze the effects of anti-cancer treatments, such as the so-called immunogenic cancer cell death inducers on the recruitment and activation of immune cells. In section 2, 3D tumor-immune microenvironments are assembled in a competitive layout. Differential immune infiltration is monitored by fluorescence snapshots up to 72 h, to evaluate combination therapeutic strategies. In both settings, image processing steps are illustrated to extract a plethora of immune cell parameters (e.g., immune cell migration and interaction, response to therapeutic agents). These simple and powerful methods can be further tailored to simulate the complexity of the TME encompassing the heterogeneity and plasticity of cancer, stromal and immune cells subtypes, as well as their reciprocal interactions as drivers of cancer evolution. The compliance of these rapidly evolving technologies with live-cell high-content imaging can lead to the generation of large informative datasets, bringing forth new challenges. Indeed, the triangle &#39;&#39;co-cultures/microscopy/advanced data analysis&#34; sets the path towards a precise problem parametrization that may assist tailor-made therapeutic protocols. We expect that future integration of cancer-immune on-a-chip with artificial intelligence for high-throughput processing will synergize a large step forward in leveraging the capabilities as predictive and preclinical tools for precision and personalized oncology.

In the age of immunotherapy and single-cell genomic profiling, cancer biology requires novel in vitro and computational tools for investigating the tumor-immune interface in a proper spatiotemporal context. We describe protocols to exploit tumor-immune microfluidic co-cultures in 2D and 3D settings, compatible with dynamic, multiparametric monitoring of cellular functions.

in vitro 종양 미세환경에서 면역 반응을 해부하기 위한 미세유체 공동 배양 모델

Complex disease models demand cutting-edge tools able to deliver physiologically and pathologically relevant, actionable insights, and unveil otherwise ...

X-선 사이 누화를 조사 하는 공동 문화 방법을 반구 Caco-2 셀 및 PBMC

요약

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이 비디오의 챕터

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암-면역 주기를 재현하기 위한 Co-Culture In Vitro 시스템

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