저자는 프로세스 개발 및 장치 제작에 그들의 귀중 한 지원을 위해 하는 ChiLab, 재료 및 마이크로 실험실-Politecnico 디 토리노-교수 C F Pirri, 닥터 M Cocuzza와 박사 S L Marasso의에서 DISAT 인정 하... 우리는 토론 및 이미지 처리에서 지원에 대 한 Quantacell에서 빅터 라신 감사합니다. 우리는 GFP LifeAct 마우스를 제공에 대 한 마우스에 대 한 그들의 지원에 대 한 인 퀴리와 파블로 바 가스와 아나 마리아 레논 (인 퀴리)의 동물 시설에서 이자벨 Grandjean를 마 농 샤 감사. 우리는 형광 배제 방법의 이해에 그들의 도움 인 Langevin 및 Clotilde Cadart, 라 리사 Venkova, Matthieu Piel 인 퀴리-UMR 144에서에서 올리비에 Thouvenin에 감사. 마지막으로, 우리 소에 그들의 지원 위한 인 피에르-질 드 Gennes (CNRS UMS 3750)의 기술 플랫폼을 감사합니다. 이 작품은 유럽 연구 위원회 고급 부여 번호 321107 "첼로,"에 의해 부분적으로 지원 되었다 PSL 대학교 (SwithNeuroTrails 프로젝트), ANR Investissement d'Avenir, IPGG Labex 및 Equipex.

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저자는 충돌의 관심을 선언합니다.

뉴런의 볼륨 이미지 구성 때문에이 세포의 길고 얇은 확장 FXm 기술에 대 한 도전. 이 프로토콜 신경 영상 전용 미세 장치의 동일한 종류의 변종을 설명 합니다.
미세 디자인의 측면, 옆에 목표의 형광 제외 이미징에 대 한 기본 이며 절충 한 측면 해상도 이미지 선명도 의미 합니다. 그것은에 게재 되었습니다 13 챔버 높이 보다 작은 초점의 깊이를 선도 높은 NA 없음을 볼륨 측정의 정밀도 대 한 해로운 영상 초점에서 수행한 및 충분 한 마진의 개체의 윤곽선 사이 남아 있는 경우 nterest 그리고 통합의 경계입니다. 그러나, 초점의 깊이 보다 훨씬 더 높은 상공의 사용 때문에 광자 확산는 부드럽게 이미지 선명도 관심사의 목표의 가장자리를 손상 한다. 3 µ m 높은 챔버의 제조 측면 흐리게이 감소 하 고 매우 잘 정의 된 형광 제외 이미지도 높은 NA를 사용 하 여 제공 (0.8) 40 X 목표 측면 고해상도 신경 분 지를 시각화.
3 µ m 높은 챔버의 경우 칩 조립은 중요 한 단계, 특히 하지만 주의 조작 4.1.2에 설명 된 대로 방지 지붕 붕괴. 이러한 얇은 실에 관련 된 볼륨 비율 높은 표면 또한 시간이 지남에 Dextran 농도의 안정성의 문제를 제기. 우리 보육의 1 박 후는 Dextran의 표면 흡수 했다 무시할 수 확인: PBS에서 Dextran을 교체 후 기둥와 배경 사이의 강도 차이 사이 초기 강도 대비 1000 당 약 1 Dextran의 면 전에 서이 두 영역입니다. 참고 아래쪽 coverslip에 및 PDMS 지붕에 신경 준수 수 있습니다. 이 효과 코팅으로 꽃무늬 coverslips (즉, 우리가 하지 PDMS 챔버 내 접착 분자를 품 어 할 때)를 사용 하 여 따라서 엄격 하 게 지역화 챔버의 바닥에 때 사라집니다.
그렇다 하 고 그들의 도전적인 형태 뉴런 FXm 오히려 적합 한 방법, 즉 dextran endocytosis의 주요 한계 중 하나는 매우 제한 된는 사실 때문에이 셀. 우리 선택 10 kDa 정립에에서 억제 범위 (시간) 어떤 보이는 endocytosis 현상.
결론적으로에 FXm의 개념적 단순 일련의 실험적인 문제는 현재 프로토콜, nanometric PDMS 거칠기 및 미세 챔버 높이, 또는 배경 교정의 흘 수에 대 한 수정에 의해 해결 되었습니다에 의해 균형 PDMS 기둥 사이의 천장입니다. 그러나, 형광 매체 제한에 가까운 미세 챔버를 사용 하 여 효과적인 표면 세포 접착, 또는 중앙에서 소마를 제외 하는 필요성을 절감 하 지원 기둥의 필요성 같은 몇 가지 특정 제약 조건 생성 높은 해상도 관측에 액세스할 수 있는 셀의 영역을 제한 하는 높은 선명도와 신경 확장 관찰 하 약 실. 이 방법의 한 가지 가능한 진화 한 광학 교체 물리적 감 금이를 제거 하는 것입니다. 빛 시트 현미경의 새로운 개발 있습니다 결합 될 advantageously FXm 미래에.

세포질 볼륨의 정확한 지식은 셀 크기 항상성 단 세포 미생물 1 그리고 더 일반적으로 mitotic 세포 2의 문제에 의해 구동 지난 몇 년 동안에서 증가 주목을 받고 있다. 그러나, 셀 볼륨의 질문은 또한 포스트 mitotic 세포는 뉴런 전형적인 예제 구성에 대 한 관련.
볼륨은 참으로 다양 한 스케일과 시간 지점에서 생리 및 병리학 사건의 중요 한 서명 전기 활동 (밀리초 단위) 3 에 돌이킬 수 없는 관련 된 과도 axonal 변형에서 신경 삶에 신경 붓기가 발생 하는 신경 퇴행 성 질병 (인간에서 년간) 4의 무 증상 단계. 그러나, 가장 큰 볼륨의 변화 신경 성장 동안 (고려 유기 체)에 따라 주 또는 일의 중간 시간 규모에서 발생합니다. 뉴런의 확장 하 고 복잡 한 형태는 배수 문제를 제기 셀 크기의 규칙. Axonal 길이 직경 실제로 단단히 규제 vivo에서, 각 신경 유형 5,6값 특정 있습니다.
이러한 문제 vivo에서, 해결 하기 위해 복잡 한 또한 단순화 된 방법으로 해결할 수 있습니다 생체 외에서. 그 목표에 빨리 볼륨 측정 전용 메서드 충분히 성장 역학 (즉 분의 시간 규모에서) 및 호환 관찰 시간 또는 일이 필요 합니다. 여러 가지 방법은 세포 볼륨 시험관에 직접 또는 간접적으로 액세스할 수 년 동안 개발 되었습니다. Confocal 영상에서 셀 재건, 그들 중 하나 이지만이 방법은 약 500 nm 7의 제한 된 축 해상도 표시 하는 동안 빛에 라벨 부착 및 반복 노출 의미. Note 격자 빛 시트 현미경 8라는 더 정교 하 고 최근 방법으로 부분적으로이 두 마지막 단점을 극복할 수 있다는. 원자 힘 현미경 검사 법 사용된 9 되었지만이 검색 방법은 느리고 지루한 본질에 의해. 또한, 육체적 인 접촉을 셀 필요 고려 신경 10의 극단적인 부드러움 측정 방해할 수 있습니다. 다른 세포 유형 11, 하지만 대 한 부적 절 한 확장 뉴런 처럼 접착제 셀 임피던스 또는 공명을 사용 하 여 간접 방법 고용 있다.
가장 유망한 방법 중 하나는 형광 염료로 가득 가까운 챔버에 세포의 제외 된 볼륨의 측정을 기반으로 합니다. 형광 제외 방법 (FXm) 라벨, 필요로 그것의 원리에서 간단 하 고 빠르고, 긴 기간 세포 인구 잠재적으로 하위 광학 축 해상도 광학 이미징 적합 하다. 더 정확 하 게, z에서 해상도 있지만이 궁극적인 해결책을 제한 하는 잡음의 여러 소스 (즉, 세포가 없는 지역에서), 카메라의 동적 범위를 나눈 문화 챔버에 최대 형광 강도에 따라 다릅니다. 이 방법은 매우 강력한 마이그레이션 부착 셀 12 의 볼륨에 따라 또는 철저 하 게 13에 설명 된 대로 포유류 세포의 유사 분열 동안 볼륨 변화 연구 되었습니다. 그러나, 뉴런 FXm 하위 미세 프로세스에 광범위 한 그들의 분파를 고려에 대 한 방법론 문제를 구성 합니다.
선물이 여기 신경 가지와 동적 구조 성장 콘 같은 신경 성장에 관여의 높이와 고정밀 볼륨 액세스를 부드러운 FXm 챔버의 제조를 선도 하는 방법.
실 축 해상도 최적화 하기 위해 측정 하는 개체 보다 비슷한 높이 있어야 합니다. 따라서, 우리는 세 가지 서로 다른 높이의 중앙 측정 챔버 특징 다른 FXm 장치 설계. Neurite 측정에 전념 하는 가장 얇은 (3 µ m 높이):이 낮은 높이 제외 소마는 근처 15 µ m 높은 중간 챔버에 남아. 두꺼운 중앙 챔버 (10과 12 µ m) 전체 세포 성장에 따라 충분히 높다. 장치는 또한 중앙 챔버의 양쪽에 위치한 두 개의 저수지를 포함 한다. 4 개의 주입 구멍 (IH)은 이렇게 구현 하 고 다음과 같이 지정 된다: 입구와 출구 역할 칩, 휴대폰 정지를 반면 다른 두 저수지를 피드.
우리는 알려진된 기하학의 포토 레지스트 구조를 사용 하 여 높이 측정에 대 한 첫 번째 조립된 교정 coverslips가 있다. 우리는 다음 몇 군데 무료 성장 신경, 하지만 또한 형태학 상으로 제한 된 뉴런 접착의 micropatterns에.

<table><tbody><tr><td>&lt;strong&gt;Equipments&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plasmalab System 100</td><td>Oxford Instruments</td><td></td><td>To perform DRIE</td></tr><tr><td>MJB4 mask aligner</td><td>SUSS MicroTec</td><td></td><td>SU-8 photolithography</td></tr><tr><td>NXQ 4006 Mask aligner</td><td>Neutronix Quintel</td><td></td><td>Photolithography associated to DRIE</td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Diener Electronic</td><td>Pico PCCE</td><td></td></tr><tr><td>Cell culture hood</td><td>ADS Laminaire</td><td>Optimale 12</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Heraeus Multifuge X1R</td><td></td></tr><tr><td>Incubator 37 &amp;deg;C 5% CO2</td><td>Panasonic</td><td>MCO-170AICUVH-PE IncuSafe CO2 Incubator</td><td></td></tr><tr><td>Epifluorescence microscope</td><td>Leica</td><td>DMi8</td><td></td></tr><tr><td>PDMS Oven between 65 and 80 &amp;deg;C</td><td>Memmert</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mechanical profilometer</td><td>Veeco</td><td>Dektak 6M Stylus Profiler</td><td></td></tr><tr><td>Optical profilometer</td><td>Veeco</td><td>Wyko NT9100</td><td></td></tr><tr><td>Vacuum desiccator</td><td>Verrerie Villeurbanaise (Kartel Labware)</td><td>230KAR</td><td>Diameter 200 mm</td></tr><tr><td>Ultrasonic bath sonicator</td><td>Labo Moderne</td><td>SHE1000</td><td>Volume of the bath: 0.8 liter</td></tr><tr><td>Hotplate</td><td>Stuart SD162</td><td>SD162</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Masks&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DRIE</td><td></td><td></td><td>Supplementary data</td></tr><tr><td>Su8 Mask 1</td><td></td><td></td><td>Supplementary data</td></tr><tr><td>Su8 Mask 2</td><td></td><td></td><td>Supplementary data</td></tr><tr><td>Su8 Mask 3</td><td></td><td></td><td>Supplementary data</td></tr><tr><td>S1805 calibration stripes</td><td></td><td></td><td>Supplementary data</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Small laboratory equipment&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 mm hole puncher</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>29002519 (US reference)</td><td></td></tr><tr><td>Scalpel or razor blade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>9&quot; Stainless Steel Flat Spatula with Spoon</td><td>VWR International</td><td>82027-532</td><td>To demold PDMS</td></tr><tr><td>Top Lip Wafer Handling</td><td>VWR International</td><td>63042-096</td><td></td></tr><tr><td>Curved tweezer</td><td>FST</td><td>Dumont #7 Forceps - Standard / Dumoxel</td><td>To manipulate glass coverslips</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Substrates&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Silicon wafer</td><td>Prolog Semicor Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>24x24 mm glass coverslips</td><td>VWR</td><td>631-0127</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Photoresists and developpers&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ 1518 positive photoresist</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>Before DRIE process, thicknes 1.8 &amp;micro;m</td></tr><tr><td>AZ 351B developer</td><td>Microchemicals GmbH</td><td></td><td>To develop positive AZ 1518 photoresist</td></tr><tr><td>SU-8 2007</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2025</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SU-8 2050</td><td>MicroChem</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PGMA developer</td><td>Technic</td><td></td><td>To develop SU-8 negative photoresist</td></tr><tr><td>Microposit S1805 resist</td><td>Chimie Tech Services</td><td></td><td>Positive photoresist used to obtain 0.5&amp;micro;m high structures</td></tr><tr><td>MF 26A developer</td><td>Chimie Tech Services</td><td></td><td>To develop positive S1805 photoresist</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Laboratory consumables&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Disposable plastic pipette 3 mL</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td></td><td></td></tr><tr><td>P100 Petri dishes</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>20 mL syringe</td><td>Terumo</td><td>SS+20ES1</td><td></td></tr><tr><td>Transparent scotch tape</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Square wipes</td><td>VWR</td><td>115-2148</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>DUTSCHER</td><td>90260</td><td>Plastic paraffin film</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Chemicals&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>(3-Methacryloxypropyl)trichlorosilane</td><td>abcr</td><td>AB 109004</td><td></td></tr><tr><td>PDMS and curing agent Sylgard 184</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>761036</td><td></td></tr><tr><td>isopropanol</td><td></td><td>W292907</td><td></td></tr><tr><td>poly-ornithine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4957 - 50 mL</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol absolute</td><td>Sigma-aldrich</td><td>02865</td><td>99.8%</td></tr><tr><td>3-methacryloxypropyl-trimethoxysilane</td><td>Sigma-aldrich</td><td>M6514-25ML</td><td>(C4H5O2)-(CH2)3- Si(OCH3)3</td></tr><tr><td>acetic acid</td><td>Sigma-aldrich</td><td>71251-5ML-F</td><td></td></tr><tr><td>Dextran 10kW conjugated with Alexa488</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22910</td><td>Absoprtion at 488 nm</td></tr><tr><td>Dextran 10kW conjugated with Alexa647</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>D22914</td><td>Absoprtion at 647 nm</td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Culture medium&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>MEM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21090-022</td><td></td></tr><tr><td>Horse Serum</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>26050088</td><td></td></tr><tr><td>B27</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12587-010</td><td></td></tr><tr><td>Glutamax 200 mM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>35050-061</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Pyruvate GIBCO 100 mM</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td></td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15710-049</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537-500ML</td><td></td></tr><tr><td>HBSS 10x</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>14180-046</td><td></td></tr><tr><td>Hepes 1M</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>15630-056</td><td></td></tr><tr><td>trypsin-EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>59418C-100ML</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>21103-049</td><td></td></tr><tr><td>Neurobasal without phenol red</td><td>LifeTechnologies - ThermoFisher</td><td>12348-017</td><td></td></tr><tr><td>&lt;strong&gt;Softwares&lt;/strong&gt;</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Routine in Matlab for background normalization</td><td>Quantacell</td><td>Contact Victor Racine: victor.racine@quantacell.com</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ</td><td></td><td></td><td>To select specific ROI for image analysis</td></tr><tr><td>Routine</td><td>ImageJ</td><td></td><td>Supplementary data</td></tr><tr><td>Routine</td><td>Matlab</td><td></td><td>Supplementary data</td></tr></tbody></table>

high-resolution volume imaging of neurons by the use of fluorescence exclusion method and dedicated microfluidic devices

볼륨은 다른 시간의 척도에 신경 세포의 생리 및 병리학 특성에 관한 중요 한 매개 변수입니다. 신경은 그들의 확장된 없는 형태학에 관한 매우 독특한 셀 고 따라서 볼륨 측정에 대 한 여러 방법론 도전을 모집. 신경 성장 체 외에서 의 특별 한 경우 선택한 방법론 하위 미세 축 해상도 전체 필드 관찰 시간 또는 일 분에서 시간의 척도에 함께 포함 되어야 합니다. 셀 모양 재건 confocal 영상, 전기 기반 측정 또는 원자 힘 현미경을 사용 하 여 같은 다른 방법과 달리 최근에 개발 된 형광 제외 방법 (FXm) 이러한 과제를 수행 하기 위해 잠재력이 있다. 그러나, 그것의 원리에서 간단한 되 고, 있지만 신경에 대 한 고해상도 FXm 구현의 여러 조정 및 전용된 방법론 필요 합니다. 선물이 여기 형광 제외, 낮은 거칠기 다중 구획 미세 장치, 그리고 마지막으로 로컬 신경 볼륨의 생체 외에서 측정을 달성 하기 위해 micropatterning의 조합에 따라 하는 방법. 장치에서 제공 하는 높은 해상도 사용 하 여 신경 프로세스 (neurites)의 로컬 볼륨 및 볼륨 성장 콘 (Gc) 같은 신경 성장에 관련 된 몇 가지 특정 구조의 측정 수 있었습니다.

섹션 1과 2에에서 설명 된 제조 과정의 결과 그림 1A의 이미지에 의해 설명 된다-1B 및 그림 1C의 곡선. 그림 1D 의 PDMS 칩, 즉 중앙에서과 20 µ m 높은 다음 중간 챔버의 2 개의 다른 대표 지역의 거칠기 값을 표시합니다. 약 7 배 거칠기 감소 수-8 포토 레지스트 대신 에칭된 Si 웨이퍼를 사용 하 여 얻은 되었습니다. 다음, FXm 10 µ m 높은 챔버 내에서 알려진된 형상 (그림 2A)의 감광 스트라이프에 적용 처음 했다. 이미지 처리 및 강도 높이 변환 후 ( 그림 2B의 그래프 참조),이 스트라이프 (그림 2C) 따라 횡단면에 FXm 프로필 원하는 높이 프로필 (그림 2D) 제공. 그림 2D 기계 profilometry 및 FXm 메서드를 사용 하 여 얻은 프로필 간의 비교를 보여 줍니다. 가장자리와 고원 값을 포함 하 여 이러한 프로필은 매우 유사 하 고, 메서드를 유효성 검사. FXm 데이터의 분산 더 그림 3 및 그림 4, 평가 방법의 궁극적인 해상도의 대표는 하지만 결과 낮은 강도에서 매우 약한의 가능한 효과 피하기 위해 고용 자동-감광 GFP 채널에서의 형광.
그런 다음, 3 µ m에 10 µ m 높은 챔버 (그림 3) neurites를 관찰합니다. 배경 잡음의 표준 편차는 약 18 nm 강도 높이 변환 및 배경 개정 후. 이 값은 실제 실리콘 표면에 casted PDMS 표면 거칠기 보다 약간 더 높은 (12 nm, 그림 1D의 표 참조) 수 8 금형에서 얻은 PDMS에 측정 하는 거칠기 보다 훨씬 낮은 하지만. 이러한 결과 기둥을 쓰-8 포토 레지스트로 구멍을 열고 보다는 실리콘 웨이퍼에 우물을 시추의 부가 가치를 강조 표시 합니다. 이러한 낮은 값 그림 3A에 표시 된 것 같은 볼륨에서 높은 신호를 잡음 비율과 매우 명확한 이미지를 수 있습니다. 그러한 이미지에서 검색할 수 있는 데이터의 예를 들어, 우리는 1.6 µ m (즉, 10 픽셀) 넓은 neurite 볼륨 계산 슬라이스 ( 그림 3B의 그래프 참조). 약 400의 평균 neurite 높이 가치를 제공를 사용 하 여 첫 번째 근사에서 이러한 데이터의 선형 적합 nm, 비교 예 10 일 신체 callosum 5내의 오래 된 새끼 있는 500 nm axonal 직경. 우리 또한 함께 FXm 접착 직렬 abutted 2 µ m와 6 µ m 길이에서 30 µ m의 넓은 줄무늬의 구성의 micropatterns. 우리의 목표는 3D 모양에 neurite 폭의 영향을 연구 했다. 그림 3C 3D 표현 10 µ m 높은 상공에서 얻은 이미지를 전체 신경의 잘못 된 색상 표시 합니다. Soma는 큰 줄무늬의 말단에 위치 하 고 있습니다 반면 Neurites 2 µ m와 6 µ m 넓은 줄무늬에 퍼지고 있다. 높이 프로 파일은 세 가지 다른 횡단면에 당겨 졌다. 그림 3A에 표시 하는 그래프와 일관성, 표면 (그림 3D) neurite 폭 횡단면 증가 이상의 통합.
우리는 또한 성장 콘 (GC) 3D 구조에 집중 했다. 그림 4 A B 두 가지 GC 프로필 3 µ m 높은 상공에는 그들의 분기 하위 구조를 강조 표시 합니다. 또한, 우리는 12 µ m 높은 상공에서 Gc의 볼륨의 역학에 따라 시간 경과 실험을 수행. 그림 4C 축소의 주기 및 몇 분의 시간 규모에서 주어진된 GC의 재 활성화를 표시합니다. GFP lifeact 마우스를 사용 하 여, 덕분에 성장 콘 GFP 방출 파장에 현지 했다 (510 nm) 그들의 높은 걸 집중에서. 파장에서 식별 하는 표면 647에서 dextran 방출 파장에 통합 하는 데 사용 되었다 GC 볼륨을 계산 하는 nm. 그림 4D 마침내 약 6 µ m3의 값을 중심으로 3 개의 다른 뉴런에 다른 시간 지점 및 위치에서 GC 볼륨의 분포가 표시 됩니다.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2.jpg"> 그림 1: FXm PDMS 챔버. (A)는 4 개의 다른 단계 최종 금형에 지도 제작의의 음모. 입구, 출구 및 저수지의 위치 표시 됩니다. 스케일 바: 1 mm. (B) 광 profilometer를 사용 하 여 얻은 PDMS FXm 챔버의 이미지. 이 이미지는 10 µ m 높은 기둥의 3 행과 20, 50, 90 µ m 높이 중간 챔버를 포함 하는 중앙 챔버를 보여줍니다. 눈금 막대: 500 µ m. (C) (B)에 그려진 두 개의 점선 따라 칩의 횡단면 뷰. 옐로우/골드: 기둥, 블루 따라 횡단면: 기둥 사이의 횡단면. (D) PDMS 거칠기의 값 측정 50 × 50 µ m2 지역에 실리콘 성형 20 µ m 높은 수-8 중간 챔버에 의미 (이 분야의 위치에 대 한 화살표 참조). 평균 값은 세 가지 영역 측정에서 얻은 했다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig1v2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig2.jpg"> 그림 2: 감광 제 스트라이프를 사용 하 여 관심의 대상으로 FXm 방법의 교정. (A)는 10 µ m 높은 상공에서 찍은 GFP 형광 이미지 가득한 10000 MW dextran 488에서 흡수 1 mg/mL에서 nm. (B: 배경, p: 기둥)입니다. 건조 40 X 나 0.8 목표 관찰. 눈금 막대: 50 µ m. (B) 선형 보정 법칙은 두 색된 사각형 (A)에 표시 된 파란색 파선의 수준에서 얻은 대답 (C) 형광 강도 프로필에 표시는 포토 레지스트 교차의 평균 강도에서 얻은 스트라이프 (0.45 μ m 높은 긍정적인 감광 제)입니다. (D) (B) (파란색 점)의 데이터의 높이 변환 강도 후 기계 profilometer (검은 점) 및 FXm에서 얻어진 프로 파일의 비교. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig2large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig3.jpg"> 그림 3: Neurite 볼륨 이미징. (A) Neurite 다음 15 µ m 중간 챔버에 위치한 소마에서 중앙 3 µ m 높은 챔버로 확장. 488에서 10000 MW dextran 흡수를 사용 하 여 수행 하는 이미징 및 40 X, 나 0.8 건조 목표. 인세트 두 neurites와 오른쪽에 그래프를 선택한 배경 감소 일상적인 하이라이트의 사용 후 얻은. 스케일 바: 30 µ m. (B) Neurite 슬라이스 볼륨 neurite 폭의 기능으로 (A)에 표시 된 22 프로필 (평균 10 픽셀, 즉 1.6 µ m "neurite 조각"에)에서 얻은. 실선은 슬로프 0.4 µ m 원점 통과의 선형 적합을 나타냅니다. (C) 접착 부분에 꽃무늬 신경의 거짓 컬러 이미지 연속 2 µ m와 6 µ m 넓은 젊고 아름 다운 여자 (흰색에서 표현) 했다. 647에서 흡수 10000 MW dextran 가득 10 µ m 높은 상공에서 측정 되었다 및 40 x 나를 사용 하 여 0.8 건조 목표. ((D)) 높이 프로 파일에 해당 하는 색된 점선된 라인 (C)에 표시 된 동일한 색상 코드를 유지. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56923/56923fig4.jpg"> 그림 4: 정적 및 동적 성장 콘 영상. (A-B) 성장 원뿔 높이 프로 파일 관련된 이미지에 표시 된 노란색 라인을 따라 높이 변환 강도 후 3 µ m 높은 상공에서 얻은. 10000 MW dextran 488에서 흡수와 채우기를 사용 하 여 수행 하는 관측 및 40 X, 나 0.8 건조 목표. (C) 전체 신경 영상 12 µ m 높은 상공에 가득 10000 MW dextran 647에서 흡수 nm. 관찰 두 가지 형광 채널 변경: 성장 콘 지역화 (노란 점선), 및 형광 제외에서 GC 볼륨 계산 CY5 GFP. 파선 노란색으로 포함 하는 표면 GC 볼륨을 계산 하기 위해 사용 되었다. 그래프는 두 대표 다른 시간 지점에서 GFP와 CY5 채널에 시간, 및 관련 된 형태학 GC 볼륨의 변화를 보여줍니다. 모든 데이터는 40 x 나를 사용 하 여 인수 했다 0.8 건조 목적은 모든 3 분 스케일 바: 10 µ m. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/56923fig4large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>1:8 µ m 레이어 마스크</td>
			<td>마스크 2시 30분 µ m 층</td>
			<td>마스크 3시 40분 µ m 층</td>
		</tr>
<tr>
<td>수-8 종류</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s @ 2000 rpm</td>
			<td>30 s 3050 rpm @</td>
			<td>30 s 3250 rpm @</td>
		</tr>
<tr>
<td>부드러운 빵</td>
			<td>95 ° C @ 3 분</td>
			<td>65 ° C + 6 분 95 ° C @ @ 2 분</td>
			<td>65 ° C + 7 분 95 ° C @ @ 3 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>노출 에너지</td>
			<td>110 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>사후 노출 빵</td>
			<td>95 ° C @ 4 분</td>
			<td>1 분 65 ° C + 6 분 95 ° C @ @</td>
			<td>65 ° C + 7 분 95 ° C @ @ 2 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>개발</td>
			<td>2 분 30 초</td>
			<td>5 분</td>
			<td>6 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>하드 빵 (옵션)</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
		</tr>
</tbody></table>표 1: 사진 평판 단계 12 μ m 높이 중앙 챔버를 포함 하는 장치를 만들려고 수행. 중간 챔버의 높이: 20, 50, 90 µ m.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>마스크 1시 10분 µ m 층</td>
			<td>마스크 2시 30분 µ m 층</td>
			<td>마스크 3시 40분 µ m 층</td>
		</tr>
<tr>
<td>수-8 종류</td>
			<td>2007</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s 1500 rpm @</td>
			<td>30 s 3050 rpm @</td>
			<td>30 s 3250 rpm @</td>
		</tr>
<tr>
<td>부드러운 빵</td>
			<td>95 ° C @ 3 분</td>
			<td>65 ° C + 6 분 95 ° C @ @ 2 분</td>
			<td>65 ° C + 7 분 95 ° C @ @ 3 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>노출 에너지</td>
			<td>125 mJ/cm2
</td>
			<td>155 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>사후 노출 빵</td>
			<td>95 ° C @ 4 분</td>
			<td>1 분 65 ° C + 6 분 95 ° C @ @</td>
			<td>65 ° C + 7 분 95 ° C @ @ 2 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>개발</td>
			<td>2 분 30 초</td>
			<td>5 분</td>
			<td>6 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>하드 빵 (옵션)</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
		</tr>
</tbody></table>표 2: 사진 평판 단계 높이에서 10 μ m의 중앙 챔버를 포함 하는 장치를 만들려고 수행. 중간 챔버의 높이: 20, 50, 90 µ m.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>단계</td>
			<td>마스크 1시 12분 µ m 층</td>
			<td>마스크 2시 32분 µ m 층</td>
			<td>마스크 3시 40분 µ m 층</td>
		</tr>
<tr>
<td>수-8 종류</td>
			<td>2015</td>
			<td>2025</td>
			<td>2050</td>
		</tr>
<tr>
<td>Spincoating</td>
			<td>30 s 3250 rpm @</td>
			<td>30 s 2500 rpm @</td>
			<td>30 s 3250 rpm @</td>
		</tr>
<tr>
<td>부드러운 빵</td>
			<td>95 ° C @ 3 분</td>
			<td>65 ° C + 5 분 95 ° C @ @ 2 분</td>
			<td>65 ° C + 7 분 95 ° C @ @ 3 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>노출 시간</td>
			<td>140 mJ/cm2
</td>
			<td>157 mJ/cm2
</td>
			<td>170 mJ/cm2
</td>
		</tr>
<tr>
<td>사후 노출 빵</td>
			<td>95 ° C @ 4 분</td>
			<td>1 분 65 ° C + 5 분 95 ° C @ @</td>
			<td>65 ° C + 7 분 95 ° C @ @ 2 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>개발</td>
			<td>3 분</td>
			<td>5 분</td>
			<td>6 분</td>
		</tr>
<tr>
<td>하드 빵 (옵션)</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
			<td>200 ° C @ 3-5 분</td>
		</tr>
</tbody></table>표 3: 사진 평판 단계 높이에서 3 μ m의 중앙 챔버를 포함 하는 장치를 만들려고 수행. 중간 챔버의 높이: 18, 50, 90 µ m.
추가 데이터 1: masks_neuron_volume_chips.tiff. PDMS 장치 (DRIE 마스크와 마스크 1-3)를 조작 하는 데 사용 하는 마스크의 개요 보기. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.tiff">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 데이터 2: 파일 "masks_neuron_volume_chips.dxf". 전자 파일 조작 DRIE 마스크와 마스크 1-3 하 수 있도록 합니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/masks_neuron_volume_chips.dxf">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 데이터 3: "Mask_Photoresist stripes.dxf". 전자 파일 레지스트 줄무늬의 포토 리소 그래피에 사용 되는 마스크를 조작 수 있도록 합니다. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/Mask_Photoresist-stripes.dxf">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 데이터 4: 파일: conversion_mattotiff.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/conversion_mattotiff.m">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
보조 데이터 5: 파일: importfilevol.m <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56923/importfilevol.m">이 파일을 다운로드 하려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

볼륨은 세포의 생리 및 병리학 적 특성에 관한 중요 한 매개 변수입니다. Neurites 및 신경 성장에 동적 구조 분석에 필요한 하위 미세 축 분해능으로 생체 외에서 신경 볼륨의 전체 필드 측정을 허용 하는 형광 제외 방법을 설명 합니다.

고해상도 볼륨 이미징의 뉴런 형광의 사용 제외 방법에 의해 및 미세 장치 전용

Volume is an important parameter regarding physiological and pathological characteristics of neurons at different time scales. Neurons are quite unique ...

high-resolution-volume-imaging-neurons-use-fluorescence-exclusion

Research

JoVE Journal

Neuroscience

7.0K 조회수.  Université PSL, CNRS. 볼륨은 세포의 생리 및 병리학 적 특성에 관한 중요 한 매개 변수입니다. Neurites 및 신경 성장에 동적 구조 분석에 필요한 하위 미세 축 분해능으로 생체 외에서 신경 볼륨의 전체 필드 측정을 허용 하는 형광 제외 방법을 설명 합니다.

비디오: High-resolution Volume Imaging of Neurons by the Use of Fluorescence eXclusion Method and Dedicated Microfluidic Devices

Measuring Exocytosis in Neurons Using FM Labeling

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time imaging of vesicles labeled with FM dye to monitor the rate of presynaptic vesicle release.  FM4-64 is a red fluorescent amphiphilic styryl dye that embeds into the membranes of synaptic vesicles as endocytosis is stimulated.  Lipophilic interactions cause the dye to greatly increase in fluorescence, thus emitting a bright signal when associated with vesicles and a nominal one when in the extracellular fluid. After a wash step is used to help remove external dye within the plasma membrane, the remaining FM is concentrated within the vesicles and is then expelled when exocytosis is induced by another round of electrical stimulation. The rate of vesicles release is measured from the resulting decrease in fluorescence.  Since FM dye can be applied external and transiently, it is a useful tool for determining rates of exocytosis in neuronal cultures, especially when comparing the rates between transfected synapses and neighboring control boutons.



The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission. Here we used real-time imaging of vesicles labeled with the red fluorescent dye FM 4-64 to measure the rate of presynaptic vesicle release in hippocampal neuronal cultures.

FM 레이블을 사용하여 뉴런의 Exocytosis 측정

The ability to measure the kinetics of vesicle release can help provide insight into some of the basics of neurotransmission.  Here we used real-time ...

연구

생물학

A Rapid Approach to High-Resolution Fluorescence Imaging in Semi-Thick Brain Slices

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are characteristic to neurons in both normal and diseased brain. Towards this, a great deal of effort has been placed on building high-resolution neuroanatomical maps1-3. With the expansion of molecular genetics and advances in light microscopy has come the ability to query not only neuronal morphologies, but also the molecular and cellular makeup of individual neurons and their associated networks4. Major advances in the ability to mark and manipulate neurons through transgenic and gene targeting technologies in the rodent now allow investigators to 'program' neuronal subsets at will5-6. Arguably, one of the most influential contributions to contemporary neuroscience has been the discovery and cloning of genes encoding fluorescent proteins (FPs) in marine invertebrates7-8, alongside their subsequent engineering to yield an ever-expanding toolbox of vital reporters9. Exploiting cell type-specific promoter activity to drive targeted FP expression in discrete neuronal populations now affords neuroanatomical investigation with genetic precision.
Engineering FP expression in neurons has vastly improved our understanding of brain structure and function. However, imaging individual neurons and their associated networks in deep brain tissues, or in three dimensions, has remained a challenge. Due to high lipid content, nervous tissue is rather opaque and exhibits auto fluorescence. These inherent biophysical properties make it difficult to visualize and image fluorescently labelled neurons at high resolution using standard epifluorescent or confocal microscopy beyond depths of tens of microns. To circumvent this challenge investigators often employ serial thin-section imaging and reconstruction methods10, or 2-photon laser scanning microscopy11. Current drawbacks to these approaches are the associated labor-intensive tissue preparation, or cost-prohibitive instrumentation respectively.
Here, we present a relatively rapid and simple method to visualize fluorescently labelled cells in fixed semi-thick mouse brain slices by optical clearing and imaging. In the attached protocol we describe the methods of: 1) fixing brain tissue in situ via intracardial perfusion, 2) dissection and removal of whole brain, 3) stationary brain embedding in agarose, 4) precision semi-thick slice preparation using new vibratome instrumentation, 5) clearing brain tissue through a glycerol gradient, and 6) mounting on glass slides for light microscopy and z-stack reconstruction (Figure 1).
For preparing brain slices we implemented a relatively new piece of instrumentation called the 'Compresstome' VF-200 (http://www.precisionary.com/products_vf200.html). This instrument is a semi-automated microtome equipped with a motorized advance and blade vibration system with features similar in function to other vibratomes. Unlike other vibratomes, the tissue to be sliced is mounted in an agarose plug within a stainless steel cylinder. The tissue is extruded at desired thicknesses from the cylinder, and cut by the forward advancing vibrating blade. The agarose plug/cylinder system allows for reproducible tissue mounting, alignment, and precision cutting. In our hands, the 'Compresstome' yields high quality tissue slices for electrophysiology, immunohistochemistry, and direct fixed-tissue mounting and imaging. Combined with optical clearing, here we demonstrate the preparation of semi-thick fixed brain slices for high-resolution fluorescent imaging.

Here we describe a rapid and simple method to image fluorescently labeled cells in semi-thick brain slices. By fixing, slicing, and optically clearing brain tissue we describe how standard epifluorescent or confocal imaging can be used to visualize individual cells and neuronal networks within intact nervous tissue.

세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

A fundamental goal to both basic and clinical neuroscience is to better understand the identities, molecular makeup, and patterns of connectivity that are ...

신경과학

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from individual neurons are critical for understanding how neural circuits function under natural conditions. Traditionally, these recordings have been performed 'blind', meaning the identity of the recorded cell is unknown at the start of the recording. Cellular identity can be subsequently determined via intracellular1, juxtacellular2 or loose-patch3 iontophoresis of dye, but these recordings cannot be pre-targeted to specific neurons in regions with functionally heterogeneous cell types. Fluorescent proteins can be expressed in a cell-type specific manner permitting visually-guided single-cell electrophysiology4-6. However, there are many model systems for which these genetic tools are not available. Even in genetically accessible model systems, the desired promoter may be unknown or genetically homogenous neurons may have varying projection patterns. Similarly, viral vectors have been used to label specific subgroups of projection neurons7, but use of this method is limited by toxicity and lack of trans-synaptic specificity. Thus, additional techniques that offer specific pre-visualization to record from identified single neurons in vivo are needed. Pre-visualization of the target neuron is particularly useful for challenging recording conditions, for which classical single-cell recordings are often prohibitively difficult8-11. The novel technique described in this paper uses retrograde transport of a fluorescent dye applied using tungsten needles to rapidly and selectively label a specific subset of cells within a particular brain region based on their unique axonal projections, thereby providing a visual cue to obtain targeted electrophysiological recordings from identified neurons in an intact circuit within a vertebrate CNS.
The most significant novel advancement of our method is the use of fluorescent labeling to target specific cell types in a non-genetically accessible model system. Weakly electric fish are an excellent model system for studying neural circuits in awake, behaving animals12. We utilized this technique to study sensory processing by "small cells" in the anterior exterolateral nucleus (ELa) of weakly electric mormyrid fish. "Small cells" are hypothesized to be time comparator neurons important for detecting submillisecond differences in the arrival times of presynaptic spikes13. However, anatomical features such as dense myelin, engulfing synapses, and small cell bodies have made it extremely difficult to record from these cells using traditional methods11, 14. Here we demonstrate that our novel method selectively labels these cells in 28% of preparations, allowing for reliable, robust recordings and characterization of responses to electrosensory stimulation.

Retrograde Fluorescent Labeling Allows for Targeted Extracellular Single-unit Recording from Identified Neurons In vivo

Retrograde transport of fluorescent dye labels a sub-population of neurons based on anatomical projection. Labeled axons can be visually targeted in vivo, permitting extracellular recording from identified axons. This technique facilitates recording when neurons cannot be labeled through genetic manipulation or are difficult to isolate using 'blind' in vivo approaches.

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용<em&gt; 생체 내</em

The overall goal of this method is to record single-unit responses from an identified population of neurons. In vivo electrophysiological recordings from ...

Voltage-sensitive Dye Recording from Axons, Dendrites and Dendritic Spines of Individual Neurons in Brain Slices

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding how the brain works. The primary function of any nerve cell is to process electrical signals, usually from multiple sources. Electrical properties of neuronal processes are extraordinarily complex, dynamic, and, in the general case, impossible to predict in the absence of detailed measurements. To obtain such a measurement one would, ideally, like to be able to monitor, at multiple sites, subthreshold events as they travel from the sites of origin on neuronal processes and summate at particular locations to influence action potential initiation. This goal has not been achieved in any neuron due to technical limitations of measurements that employ electrodes. To overcome this drawback, it is highly desirable to complement the patch-electrode approach with imaging techniques that permit extensive parallel recordings from all parts of a neuron. Here, we describe such a technique - optical recording of membrane potential transients with organic voltage-sensitive dyes (Vm-imaging) - characterized by sub-millisecond and sub-micrometer resolution. Our method is based on pioneering work on voltage-sensitive molecular probes 2. Many aspects of the initial technology have been continuously improved over several decades 3, 5, 11. Additionally, previous work documented two essential characteristics of Vm-imaging. Firstly, fluorescence signals are linearly proportional to membrane potential over the entire physiological range (-100 mV to +100 mV; 10, 14, 16). Secondly, loading neurons with the voltage-sensitive dye used here (JPW 3028) does not have detectable pharmacological effects. The recorded broadening of the spike during dye loading is completely reversible 4, 7. Additionally, experimental evidence shows that it is possible to obtain a significant number (up to hundreds) of recordings prior to any detectable phototoxic effects 4, 6, 12, 13. At present, we take advantage of the superb brightness and stability of a laser light source at near-optimal wavelength to maximize the sensitivity of the Vm-imaging technique. The current sensitivity permits multiple site optical recordings of Vm transients from all parts of a neuron, including axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines. The acquired information on signal interactions can be analyzed quantitatively as well as directly visualized in the form of a movie.

An imaging technique for monitoring of membrane potential changes with sub-micrometer spatial and sub-millisecond temporal resolution is described. The technique, based on laser excitation of voltage-sensitive dyes, allows measurements of signals in axons and axon collaterals, terminal dendritic branches, and individual dendritic spines.

Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

Understanding the biophysical properties and functional organization of single neurons and how they process information is fundamental for understanding ...

Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and medical applications. Strengths of fluorescence include its sensitivity, specificity, and compatibility with live imaging. Unfortunately, conventional forms of fluorescence microscopy suffer from one major weakness, diffraction-limited resolution in the imaging plane, which hampers studies of structures with dimensions smaller than ~250 nm. Recently, this limitation has been overcome with the introduction of super-resolution fluorescence microscopy techniques, such as photoactivated localization microscopy (PALM). Unlike its conventional counterparts, PALM can produce images with a lateral resolution of tens of nanometers. It is thus now possible to use fluorescence, with its myriad strengths, to elucidate a spectrum of previously inaccessible attributes of cellular structure and organization.
Unfortunately, PALM is not trivial to implement, and successful strategies often must be tailored to the type of system under study. In this article, we show how to implement single-color PALM studies of vesicular structures in fixed, cultured neurons. PALM is ideally suited to the study of vesicles, which have dimensions that typically range from ~50-250 nm. Key steps in our approach include labeling neurons with photoconvertible (green to red) chimeras of vesicle cargo, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a high-resolution PALM image. We also demonstrate the efficacy of our approach by presenting exceptionally well-resolved images of dense-core vesicles (DCVs) in cultured hippocampal neurons, which refute the hypothesis that extrasynaptic trafficking of DCVs is mediated largely by DCV clusters.

We describe how to implement photoactivated localization microscopy (PALM)-based studies of vesicles in fixed, cultured neurons. Key components of our protocol include labeling vesicles with photoconvertible chimeras, collecting sparsely sampled raw images with a super-resolution microscopy system, and processing the raw images to produce a super-resolution image.

신경 밀도 코어 소체의 수퍼 - 해상도 이미징

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

Visualization of Endosome Dynamics in Living Nerve Terminals with Four-dimensional Fluorescence Imaging

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis muscle of the garter snake. Raw data comprises time-lapse sequences of 3D z-stacks. Each stack contains 4-20 images acquired with epifluorescence optics at focal planes separated by 400-1,500 nm. Steps in the acquisition of image stacks, such as adjustment of focus, switching of excitation wavelengths, and operation of the digital camera, are automated as much as possible to maximize image rate and minimize tissue damage from light exposure. After acquisition, a set of image stacks is deconvolved to improve spatial resolution, converted to the desired 3D format, and used to create a 4D "movie" that is suitable for variety of computer-based analyses, depending upon the experimental data sought. One application is study of the dynamic behavior of two classes of endosomes found in nerve terminals-macroendosomes (MEs) and acidic endosomes (AEs)-whose sizes (200-800 nm for both types) are at or near the diffraction limit. Access to 3D information at each time point provides several advantages over conventional time-lapse imaging. In particular, size and velocity of movement of structures can be quantified over time without loss of sharp focus. Examples of data from 4D imaging reveal that MEs approach the plasma membrane and disappear, suggesting that they are exocytosed rather than simply moving vertically away from a single plane of focus. Also revealed is putative fusion of MEs and AEs, by visualization of overlap between the two dye-containing structures as viewed in each three orthogonal projections.

Four-dimensional (4D) imaging is utilized to study the behavior and interactions among two types of endosomes in living vertebrate nerve terminals. Movement of these small structures is characterized in three dimensions, permitting confirmation of events such as endosome fusion and exocytosis.

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

Four-dimensional (4D) light imaging has been used to study behavior of small structures within motor nerve terminals of the thin transversus abdominis ...

Use of Pre-Assembled Plastic Microfluidic Chips for Compartmentalizing Primary Murine Neurons

Microfabricated methods to compartmentalize neurons have become essential tools for many neuroscientists. This protocol describes the use of a commercially available pre-assembled plastic chip for compartmentalizing cultured primary rat hippocampal neurons. These plastic chips, contained within the footprint of a standard microscope slide, are compatible with high-resolution, live, and fluorescence imaging. This protocol demonstrates how to retrograde label neurons via isolated axons using a modified rabies virus encoding a fluorescent protein, create isolated microenvironments within one compartment, and perform axotomy and immunocytochemistry on-chip. Neurons are cultured for &gt;3 weeks within the plastic chips, illustrating the compatibility of these chips for long-term neuronal cultures.

This protocol describes the use of plastic chips to culture and compartmentalize primary murine neurons. These chips are preassembled, user-friendly, and compatible with high-resolution, live, and fluorescence imaging. This protocol describes how to plate rat hippocampal neurons within these chips and perform fluidic isolation, axotomy and immunostaining.

Compartmentalizing 기본 Murine 뉴런에 대 한 조립된 플라스틱 미세 칩의 사용

Microfabricated methods to compartmentalize neurons have become essential tools for many neuroscientists. This protocol describes the use of a ...

머리에 고정되고 자유롭게 움직이는 동물에서 Microprism을 사용한 다층 이미징

Long-Term Imaging of Identified Neural Populations using Microprisms in Freely Moving and Head-Fixed Animals

With the advancement of multi-photon microscopy and molecular technologies, fluorescence imaging is rapidly growing to become a powerful approach for studying the structure, function, and plasticity of living brain tissues. In comparison to conventional electrophysiology, fluorescence microscopy can capture the neural activity as well as the morphology of the cells, enabling long-term recordings of the identified neuron populations at single-cell or subcellular resolution. However, high-resolution imaging typically requires a stable, head-fixed setup that restricts the movement of the animal, and the preparation of a flat surface of transparent glass allows visualization of neurons at one or more horizontal planes but is limited in studying the vertical processes running across different depths. Here, we describe a procedure to combine a head plate fixation and a microprism that gives multilayer and multimodal imaging. This surgical preparation not only gives access to the entire column of the mouse visual cortex but allows two-photon imaging in a head-fixed position and one-photon imaging in a freely moving paradigm. Using this approach, one can sample identified cell populations across different cortical layers, register their responses under head-fixed and freely moving states, and track the long-term changes over months. Thus, this method provides a comprehensive assay of the microcircuits, enabling direct comparison of neural activities evoked by well-controlled stimuli and under a natural behavioral paradigm.

저자 스포트라이트: Comparative Imaging of Neural Activity in Awake and Freedom Moving States(깨어 있고 자유롭게 움직이는 상태에서의 신경 활동 비교 이미징)

When integrated with a head-plate and an optical design compatible with both single- and two-photon microscopes, the microprism lens presents a significant advantage in measuring neural responses in a vertical column under diverse conditions, including well-controlled experiments in head-fixed states or natural behavioral tasks in freely moving animals.

자유롭게 움직이고 머리가 고정된 동물에서 마이크로프리즘을 사용하여 식별된 신경 집단의 장기 이미징

With the advancement of multi-photon microscopy and molecular technologies, fluorescence imaging is rapidly growing to become a powerful approach for ...

고해상도 볼륨 이미징의 뉴런 형광의 사용 제외 방법에 의해 및 미세 장치 전용

요약

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이 비디오의 챕터

FM 레이블을 사용하여 뉴런의 Exocytosis 측정

세미 두께 뇌 조각의 고해상도 형광 이미징에 대한 빠른 접근

역행 형광 라벨이 확인 된 신경 세포의 표적 세포 외 단일 단위 기록을 허용

Axons, 수석 및 뇌 슬라이스의 개별 뉴런의 수지상 쪽의 전압에 민감한 염료 기록

신경 밀도 코어 소체의 수퍼 - 해상도 이미징

네 차원 형광 이미징과 신경 말단 생활에 엔도 좀 역학의 시각화

Compartmentalizing 기본 Murine 뉴런에 대 한 조립된 플라스틱 미세 칩의 사용

자유롭게 움직이고 머리가 고정된 동물에서 마이크로프리즘을 사용하여 식별된 신경 집단의 장기 이미징

자유롭게 움직이고 머리가 고정된 동물에서 마이크로프리즘을 사용하여 식별된 신경 집단의 장기 이미징

자유롭게 움직이고 머리가 고정된 동물에서 마이크로프리즘을 사용하여 식별된 신경 집단의 장기 이미징