이 작품은, (BAS에) 2 R15 GM061539-02을 부여 (JEL에) 2 R15 NS40425-03, MH 66179 (오레곤 보건 과학 대학 / OHSU 박사 게리 은행에)는 건강의 국립 연구소에 의해 지원하고, P30했다 NS061800 (OHSU의 박사 슈 아이 허에). 우리는 해마 신경 세포의 문화에 광범위한 지원을위한 바바라 Smoody 감사합니다, 박사 부부. 이 원고의 중요한 읽기 브라이언 긴 제임스 아브 네이.

1. 샘플 준비 <ol><li> 표준 분자 생물학 기술을 이용하여, DCVs을 대상으로 photoconvertible 또는 광활성 키메라를 코딩하는 DNA를 준비합니다. 참고 : 하나의 가능성은 DNA의 인코딩 조직 플라스 미노 겐 활성제-Dendra2 키메라 (TPA-Dendra2). Dendra2은 녹색에서 자외선 (12)에 노출시 적색 발광으로 전환 photoconvertible 단백질이다. </li><li> 고성능 # 1.5 커버의 문화 해마의 신경 세포는 표준 프로토콜 13 다음 ~ 5-10 일 동안 미끄러. </li><li> 양이온 성 지질 시약을 사용하여 해마의 신경 세포를 개발하는 형질. 참고 : 바이러스 성 매개 감염이 성숙한 신경 세포에 대한 더 효과적입니다. 이러한 대안은 다른 곳에서 14 상세히 설명되었다. <ol><li> ~ DNA 1 μg 최소 필수 배지 (MEM)와 양이온 성 지질 시약 4 μL, 250 μl를 함유하는 제 1.5 ㎖의 튜브 250 μl를 함유하는 1.5 ㎖의 튜브를 준비MEM의. </li><li> 5 분 솔루션을 품어. </li><li> 두 용액을 결합하고 추가로 30 분 동안 생성 된 혼합물을 배양한다. </li><li> 배양시 배양 배지의 여러 ML을 포함하는 요리는 37 ℃로 가온 준비 </li><li> 부드럽게 따뜻한 매체를 포함하는 요리에 신경을 포함하는 커버 전표를 전송하고 형질 전환 혼합물을 추가합니다. </li><li> 부드럽게 요리를 기울 후 90 분 동안 37 ° C에서 인큐베이터에 배치합니다. </li><li> 그들의 &quot;가정 요리&quot;에 신경을 반환하고 ~ ~ 18 시간을 기다립니다. </li></ol></li><li> 인산염 완충 생리 식염수에 4 % 파라 포름 알데히드 / 4 % 자당의 45 분 동안 세포를 수정 (PBS, pH를 7.4) 37 ℃로 가온 참고 : PALM 실험에서, 미세 구조의 양호한 보존을 달성하기 위해 중요하고, 면역 형광 염색법에 사용되는 표준 포름 알데히드 고정 프로토콜은 일반적으로 15 충분하지 않다. 가난한 구조 보존을위한 하나의 중요한 이유는 충분 F입니다포름 알데히드는 고정 부가 형성 및 단백질 가교 결합을 포함하고, 후자의 공정은 16 꽤 느리다 ixation 시간 때문이다. 45 분 고정 형광 감지 할 수없는 overfixation에 의한 손실이 문제를 완화하는 데 도움이됩니다. </li><li> 워시 커버 필터링 PBS와 함께 ~ 10 배를 미끄러 져. 참고 :이 형광 오염 물질을 줄일 수 있습니다. 이미지 샘플 상대적으로 신속하게 고정 후. 빛 단단한 용기에 여과 PBS에서 4 ° C에서 임시 저장 세포. </li><li> 필터링 PBS에서 챔버의 뉴런을 포함하는 마운트 커버 전표. 주의 : 샘플이 유리보다 낮은 굴절률을 가진 PBS와 같은 수성 매질, 장착되어야 전반사 형광 (TIRF) 기반의 조명을 구현할. 전용 커버 슬립 - 근위 형광 흥분 때문에 TIRF 기반의 조명은 매우 유용하고, 배경 형광 17에 큰 관련 드롭이있다. </li></ol> 2. 이미지 수집 &lt;/ P&gt; <ol><li> 슈퍼 해상도 이미징 시스템을 켭니다. <ol><li> 아크 램프를 켭니다. </li><li> 에 (전원 원격 스위치) &quot;시스템 / PC&quot;와 &quot;구성 요소&quot;스위치 뒤집기 &quot;에 있습니다.&quot; </li><li> 컴퓨터 (현미경 제어 태블릿 / 도킹 스테이션 이후에 제공)을 켭니다. 주 : 도킹 스테이션은 광학 및 광로의 많은 특성, 목적 및 포커스의 특히 선택을 제어하고 감시하는데 사용될 수있다. </li><li> 두 소프트웨어 아이콘을 클릭하고 로그인 대화 상자에서 &quot;시작 시스템&quot;옵션을 선택합니다. </li></ol></li><li> 샘플을 검사합니다. <ol><li> 레이저 안전 캐비닛의 전면 및 상단 액세스 패널을 엽니 다. </li><li> 무대와 목표에 액세스 할 수 투과광 팔을 기울이십시오. </li><li> 알파 계획 - 고차 색지움 100X 개구에 기름을 넣어 / NA는 1.46 (TIRF) 목적 =. 참고 : 63X 높은 NA 목적은 100X 대신에 사용될 수있다. </li><li> 무대에 샘플을 장착하고, 일을 높이고샘플을 향해 전자의 목표. </li><li> 도킹 스테이션의 XYZ 함수를 사용하여 렌즈 위치를 모니터한다. 렌즈의 초점이 야구장 (예를 들어, Z ~ 2.50 mm)에있을 때 중지합니다. </li><li> 완전히 액세스 패널을 닫습니다. 참고 : 레이저 안전을 참여. </li><li> 미세 조정 위치 탭의 접안 및 버튼을 사용하여 초점을 맞 춥니 다. 참고 : 위치 탭 아크 램프 기반의 조명을 생산하고 접안하여 샘플의 직접 관찰을 용이하게 버튼에 대한 액세스를 제공합니다. 마찬가지로, 인수 탭 레이저 기반의 조명을 생산하고 카메라가 이미지 캡처를 용이하게 도구에 대한 액세스를 제공합니다. <ol><li> 선택 위치 탭으로 이동하여 &quot;트랜스에 있습니다.&quot; </li><li> 안구 확장 기호를 클릭합니다. 참고 :이 빛의 경로를 개략적으로 나타납니다. 빛의 경로 속성은 왼쪽 회로도에 해당 아이콘을 클릭하거나 도킹 스테이션에 터치 스크린을 사용하여 변경할 수 있습니다. 예를 들어, 필터Dendra2에서 방출을보기위한 적절한 반사기 리볼버 아이콘을 사용하여 선택할 수 있습니다. </li><li> 접안 렌즈로보고, 가이드로 도킹 스테이션을 사용하여 초점으로 세포를 가져옵니다. 참고 : 해마 신경 세포가 형질하기 어려운, 그리고 따라서 반사 조명을 사용하여 초점을 좀 까다로운 일이 될 수 있기 때문에 샘플이 매우 띄엄 띄엄 형광 세포로 채워집니다. 이 경우, 가이드로서 송신 조명 및 도킹 스테이션의 Z 판독을 사용한다. </li><li> 집중 후 &quot;Off&quot;로 빛을 전환합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 상당히 밝은 반점이 형광을 전시하고, 건강을 나타내는 고전적인 형태를 가지고있는 세포를 식별합니다. <ol><li> 반사 된 빛과 Dendra2에서 녹색 방출을보기위한 필터의 적절한 선택. </li><li> 낮은 강도의 여기 광을 사용하여 Dendra2의 키메라를 발현하는 세포의 커버 슬립을 검색합니다. </li></ol></li><li> ACQ로 전환uisition 탭을 클릭합니다. <ol><li> 적절하게 설계되거나 쉽게 수정 PALM 수집 구성을로드하기 위해 &quot;실험 관리자&quot;를 사용합니다. 참고 : 레이저 파워 슬라이더 : 그런 실험이 존재하지 않는 경우, 지침으로 다음 설정을 사용하여 시작하는 실험 설계 구성 (405) 뉴 멕시코 (~ 50 mW의 레이저 0.01 %); 488 nm의 (~ 100 mW의 레이저 3 %); 561 nm의 (~ 100 mW의 레이저 40 %) 노출 시간 : ~ 50 밀리 초; 카메라 게인 ~ 200; 다차원 취득 : 시계열 (사이클 = 30,000, 구간 = 0); 트랙 : 에피 조명 488 nm의 및 TIRF 기반 조명 (단계 2.5.1 참조) 561 nm의; 목적 : 100X (NA가 1.46 =); TIRF 각도 슬라이더 : 입사각 ~ 67-72 °; 픽셀의 크기 : 100 nm의; 시야 : TIRF (대안 선택이 더 높은 레이저 강도를 산출하고 표백하기가 더 어렵습니다 형광체에 사용됩니다). </li><li> 팝업 메뉴가 레이저에 전환에 대한 쿼리와 함께 표시 할 때 &quot;예&quot;를 클릭합니다. </li></ol></li><li> 이미지를 가져와카메라 평면에 초점 세포의. <ol><li> 488 nm의 에피 조명 레이저 트랙을 선택합니다. 참고 : 트랙 이미징 동안 사용되는 빔 구성되어 있습니다. 여기서, 트랙 이름은 카메라로 전달되는 발광을 생성 여기 파장에 의해 결정된다. 예를 들어, 561 nm의 트랙은 405과 561 나노 레이저 라인을 모두 사용하지만 필터 큐브는 카메라 (561) nm의 광에 의해 여기 photoconverted Dendra2으로부터 만 발광을 통과한다. </li><li> &quot;연속적인&quot;수집 버튼을 사용하여 카메라에 셀의 초점을 맞춘다. </li></ol></li><li> 기존 위드 이미지를 수집합니다. <ol><li> &quot;스냅&quot;버튼을 사용합니다. </li><li> &#39;파일&#39;메뉴로 이동을 선택하여 이미지를 저장합니다 &quot;다른 이름으로 저장 / 저장합니다.&quot; </li></ol></li><li> TIRF 기반의 조명을 설정합니다. <ol><li> 488 트랙을 선택하고 EPI / TIRF 버튼을 사용하여 &quot;TIRF&quot;로 전환합니다. </li><li> &quot;연속&quot;인수를 선택합니다. </li><li> T를 조정그는 TIRF 기반 조명 슬라이더. 참고 :이 배경 갑자기 어두워이며 표본은 한 평면 (18)에 집중 될 때 TIRF는 달성된다. 새로운 기능이 샘플들로 포커싱을 통해 명백해질 경우 TIRF에서 초점이 하나의 평면이 있기 때문에, 입사 각도가 너무 낮다. </li><li> 이중 405 nm의 레이저로 561 트랙을 사용하여 TIRF 각도를 체크 &quot;해제.&quot; </li><li> PALM 실험을 시작하기 전에 &quot;의&quot;다시 405 nm의 레이저를 켭니다. </li></ol></li><li> PALM 데이터를 수집합니다. <ol><li> &quot;실험을 시작합니다.&quot;HIT 참고 : 원하는 경우, &quot;온라인 처리 옵션&quot;탭을 열고 원시 데이터를 수집하는 동안 복원 PALM 이미지를 모니터링하는 (실험을 시작하기 전에) &quot;온라인 처리 PALM&quot;과 &quot;적당한 Gauss2D&quot;를 확인합니다. 이것은 데이터의 품질과 상대적으로 시간 소모적 인 데이터 수집 프로세스를 계속하는 따라서 값의 평가를 용이하게 할 것이다. </li><li> 시각광 변환을 모니터링 할 수 있습니다. </li><li> 405 nm의 (photoconverting) 레이저의 강도를 증가하면 Dendra2의 광 변환이 줄어든다 (일반적으로 ~ 10,000 RAW 이미지의 취득 후). </li><li> 광 변환이 증가하면 실험을 계속합니다. 그렇지 않으면, &quot;중지&quot;현재 단계 버튼을 눌렀을 때 (데이터의 손실없이) 실험을 중지합니다. </li><li> 데이터 수집 (~ 15 분 후) 완료되면 이미지를 저장합니다. </li></ol></li></ol> 3. 이미지 프로세싱, 디스플레이 및 분석 <ol><li> 디스크에 저장된 온라인 처리, 처리로 이미지의 부재. <ol><li> , 처리 탭을 클릭하는 방법 탭을 열고 선택 &quot;PALM을.&quot; </li><li> 네 개의 하위 옵션에서 다시 &quot;PALM&quot;를 선택합니다. </li><li> 열려있는 파일 메뉴로 이동하여 그 파일을보고, 히트 &quot;를 선택합니다.&quot; </li><li> 히트 &quot;에 적용됩니다.&quot; 참고 :이 기본 OPTI와 피크 / 형광 찾는 피크 지역화를 시작합니다기능. 필요한 경우, 피크는 &quot;PAL-그룹&quot;탭을 사용하여 그룹화 할 수 있습니다. 그룹화는 최대 좌표가 충분히 유사한 경​​우 하나의 분자에 여러 개의 연속 프레임에 나타나는 피크를 할당합니다. 또, 데이터는 소프트웨어의 모델 - 기반 드리프트 정렬 옵션을 사용하여 샘​​플 드리프트 보정 될 수있다. </li></ol></li><li> 피크 지역화 된 데이터에 제대로 지역화 저조한 샘플 구성 요소를 필터링합니다. <ol><li> 현지화 정밀도와 형광 물질을 폐기, σ&gt; &quot;PAL-필터&quot;도구를 사용하여 35 nm의. </li><li> 봉우리, D 사이의 평균 거리, 직경, D.의 소포를 해결하기에 너무 큰 영역에서 형광을 폐기 <ol><li> 현지화 정밀 히스토그램에서, σ, 평균 현지화 정도의 ​​압축을 풉니 다. </li><li> σ에 기초하여 D를위한 최대 허용 값 및 섀넌 - 나이 퀴 스트 criteron 19을 계산 해상도 근사값 20 R에서 구체화 = D =[(2.35σ) 2 + (2D) 2] 1 / 2. </li><li> 반경 D / 2의 원 안에 / (4D 2) πD 2 미만으로 둘러싸인 봉우리를 삭제하려면 &quot;PALM의 이상 값을 제거&quot;도구 이웃 임계 값을 설정합니다. </li></ol></li><li> &quot;PAL-렌더링&quot;도구를 사용하여 PALM 이미지로 처리 PALM 데이터를 변환; 그림 1을 참조하십시오. </li><li> &quot;프로필&quot;기능을 선택하여 크기와 간격을 정량화. <ol><li> 관련 라인과 테이블 옵션을 확인하고 이미지에서 원하는 방향을 따라 선을 그립니다. </li><li> 반 최대 강도로 전체 폭을 결정하여 직경을 정량화. </li><li> 강도 프로파일의 피크 - 투 - 피크 간격을 측정하여 간격을 정량화. </li></ol></li></ol></li></ol>

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	<li>Goldstein, A. Y., Wang, X., Schwarz, T. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Axonal+transport+and+the+delivery+of+pre-synaptic+components.">Axonal transport and the delivery of pre-synaptic components.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 495-503 (2008).</li><li>Combs, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+microscopy:+a+concise+guide+to+current+imaging+methods.">Fluorescence microscopy: a concise guide to current imaging methods.</a> Curr Protoc Neurosci. , (2010).</li><li>Sengupta, P., Van Engelenburg, S., Lippincott-Schwartz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+cell+structure+and+function+with+point-localization+superresolution+imaging.">Visualizing cell structure and function with point-localization superresolution imaging.</a> Dev Cell. 23, 1092-1102 (2012).</li><li>Alberts, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Molecular Biology of the Cell. , (2007).</li><li>Bury, L. A., Sabo, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Coordinated+trafficking+of+synaptic+vesicle+and+active+zone+proteins+prior+to+synapse+formation.">Coordinated trafficking of synaptic vesicle and active zone proteins prior to synapse formation.</a> Neural Dev. 6, 24 (2011).</li><li>Matsuda, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+activity-dependent+secretion+of+brain-derived+neurotrophic+factor+from+axon+and+dendrite.">Differential activity-dependent secretion of brain-derived neurotrophic factor from axon and dendrite.</a> J Neurosci. 29, 14185-14198 (2009).</li><li>Tao-Cheng, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrastructural+localization+of+active+zone+and+synaptic+vesicle+proteins+in+a+preassembled+multi-vesicle+transport+aggregate.">Ultrastructural localization of active zone and synaptic vesicle proteins in a preassembled multi-vesicle transport aggregate.</a> Neuroscience. 150, 575-584 (2007).</li><li>Zhai, R. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembling+the+presynaptic+active+zone:+a+characterization+of+an+active+zone+precursor+vesicle.">Assembling the presynaptic active zone: a characterization of an active zone precursor vesicle.</a> Neuron. 29, 131-143 (2001).</li><li>Ahmari, S. E., Buchanan, J., Smith, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assembly+of+presynaptic+active+zones+from+cytoplasmic+transport+packets.">Assembly of presynaptic active zones from cytoplasmic transport packets.</a> Nat Neurosci. 3, 445-451 (2000).</li><li>Garner, C. C., Zhai, R. G., Gundelfinger, E. D., Ziv, N. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+mechanisms+of+CNS+synaptogenesis.">Molecular mechanisms of CNS synaptogenesis.</a> Trends Neurosci. 25, 243-251 (2002).</li><li>Chuang, J. Z., Milner, T. A., Zhu, M., Sung, C. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+29+kDa+intracellular+chloride+channel+p64H1+is+associated+with+large+dense-core+vesicles+in+rat+hippocampal+neurons.">A 29 kDa intracellular chloride channel p64H1 is associated with large dense-core vesicles in rat hippocampal neurons.</a> J Neurosci. 19, 2919-2928 (1999).</li><li>Chudakov, D. M., Lukyanov, S., Lukyanov, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Using+photoactivatable+fluorescent+protein+Dendra2+to+track+protein+movement.">Using photoactivatable fluorescent protein Dendra2 to track protein movement.</a> Biotechniques. 42, (2007).</li><li>Kaech, S., Banker, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Culturing+hippocampal+neurons.">Culturing hippocampal neurons.</a> Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).</li><li>Scalettar, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hindered+submicron+mobility+and+long-term+storage+of+presynaptic+dense-core+granules+revealed+by+single-particle+tracking.">Hindered submicron mobility and long-term storage of presynaptic dense-core granules revealed by single-particle tracking.</a> Dev Neurobiol. 72, 1181-1195 (2012).</li><li>Lippincott-Schwartz, J., Manley, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Putting+super-resolution+fluorescence+microscopy+to+work.">Putting super-resolution fluorescence microscopy to work.</a> Nat Methods. 6, 21-23 (2009).</li><li>Helander, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Formaldehyde+binding+in+brain+and+kidney:+A+kinetic+study+of+fixation.">Formaldehyde binding in brain and kidney: A kinetic study of fixation.</a> Journal of Histotechnology. 22, 317-318 (1999).</li><li>Axelrod, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+in+cell+biology.">Total internal reflection fluorescence microscopy in cell biology.</a> Traffic. 2, 764-774 (2001).</li><li>Toomre, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alignment+and+calibration+of+total+internal+reflection+fluorescence+microscopy+systems.">Alignment and calibration of total internal reflection fluorescence microscopy systems.</a> Cold Spring Harb Protoc. 4, 504-509 (2012).</li><li>Shannon, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Communication+in+the+presence+of+noise.">Communication in the presence of noise.</a> Proc IRE. 37, 10-21 (1949).</li><li>Hess, S. T., Gould, T. J., Gunewardene, M., Bewersdorf, J., Mason, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultrahigh+resolution+imaging+of+biomolecules+by+fluorescence+photoactivation+localization+microscopy.">Ultrahigh resolution imaging of biomolecules by fluorescence photoactivation localization microscopy.</a> Methods Mol Biol. 544, 483-522 (2009).</li><li>Sengupta, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Probing+protein+heterogeneity+in+the+plasma+membrane+using+PALM+and+pair+correlation+analysis.">Probing protein heterogeneity in the plasma membrane using PALM and pair correlation analysis.</a> Nat Methods. 8, 969-975 (2011).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+intracellular+fluorescent+proteins+at+nanometer+resolution.">Imaging intracellular fluorescent proteins at nanometer resolution.</a> Science. 313, 1642-1645 (2006).</li><li>Schermelleh, L., Heintzmann, R., Leonhardt, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+super-resolution+fluorescence+microscopy.">A guide to super-resolution fluorescence microscopy.</a> J Cell Biol. 190, 165-175 (2010).</li><li>Zhong, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoactivated+localization+microscopy+(PALM):+an+optical+technique+for+achieving+~10-nm+resolution.">Photoactivated localization microscopy (PALM): an optical technique for achieving ~10-nm resolution.</a> Cold Spring Harb Protoc. 2010, (2010).</li><li>Lochner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+copackaging+and+cotransport+yields+postsynaptic+colocalization+of+neuromodulators+associated+with+synaptic+plasticity.">Efficient copackaging and cotransport yields postsynaptic colocalization of neuromodulators associated with synaptic plasticity.</a> Dev Neurobiol. 68, 1243-1256 (2008).</li><li>Geisler, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drift+estimation+for+single+marker+switching+based+imaging+schemes.">Drift estimation for single marker switching based imaging schemes.</a> Optics Express. 20, 7274-7289 (2012).</li></ol>

저자가 공개하는 게 없다.

PALM 및 관련 최고 해상도의 형광 현미경 기술은 최근 광학 현미경과 전자 현미경 (EM) 22 ~ 24의 잘 확립 된 형태의 귀중한 보완 등장했습니다. PALM의 긍정적 인 특성은 비교적 간단한 샘플 준비 최소한의 샘플 섭동 (perturbation)이 (가) 있습니다. 원칙적으로, PALM는 살아있는 세포를 연구 할 수있다. 아마 PALM의 주요 음의 속성은 크게 살아있는 세포에 빠르게 동적 프로세스의 연구를 방해 시간이...

세포 프로세스의 숫자는 특정 세포 내 목적지로 생체 분자의 정확하고 효율적인 소포 - 중재 인신 매매에 따라 달라집니다. 한 가지 눈에 띄는 예는 잠재적으로 말초 사전 및 시냅스 사이트 1에 신경 소마의 생합성의 사이트에서 시냅스 성분의 긴 원거리, 소포 - 중재 배달로 시작되는 시냅스 어셈블리입니다. 형광 현미경 소포 인신 매매를 공부 강력하고 인기있는 방법입니다. 기술의 강점은 민감도, 특이도, 라이브 영상 2와 호환이 (가) 있습니다. 불행하게도, 비교적 최근까지,이 기술은 ~ 250 나노 미터보다 작은 크기와 구조의 연구를 방해 한 가지 큰 약점, 회절 제한 해결 방법 2, 고통했다. 최근, 형광 현미경의 측 방향 해상도 초해 형광 미시간의 도입으로 회절 장벽을 능가같은 PALM 3과 croscopy 기술. PALM의 측면 해상도는, 수십 나노 미터는 적으로 일반적으로 50 ~ 250 nm의 4 ~ 범위 치수가 소포의 연구에 적합합니다. 그것은 특정 세포 내 사이트에 자신의 인신 매매의 몇 가지 측면을 포함하여 소포의 이전에 액세스 할 수없는 특성의 스펙트럼을 설명하기 위하여, 그것의 수많은 장점과 함께, 형광을 사용하는 지금 이렇게 할 수 있습니다. PALM 구현하기가 간단하지 않습니다, 그리고 성공 전략은 종종 연구중인 시스템의 유형에 맞게 조정해야합니다. 여기에서 우리는 기공을 갖는 구조의 PALM 연구를 구현하는 방법을 설명하고, 우리는 해마 신경 세포에있는 DCVs의 경우에 대한 우리의 접근 방식의 효과를 보여줍니다. 특히, 우리는 해마 신경 세포의 시냅스에 가설에게 DCVs의 인신 매매를 해결하기 위해 PALM를 사용은 DCV 클러스터 5-8에 의해 매개된다. N 개발에 시냅스 소포의 클러스터 매개 매매그것은 빠른 시냅스 안정화 및 조립 9,10을 용이하게 할 수 있기 때문에 eurons는 흥미로운 가능성이다. DCVs의 클러스터 인신 매매의 지지자들은 클러스터링 6을 지원하는 증거로 외인 DCV화물을 품고 extrasynaptic 형광 puncta에의 큰 외관상의 크기를 인용. 그러나 이러한 puncta에 클러스터링에서 발생하는 것과 회절에서 발생하는 구별 크기 효과에 적합하지 않습니다 회절 제한 형광 현미경 기술을 사용하여 생성 된 이미지에 나타납니다. 이 문제를 해결하기 위해, 우리는 기존의 위드 형광 및 DCVs을 대상으로 키메라를 표현하는 해마 신경 세포의 PALM 이미지를 수집. 이러한 이미지의 분석은 기존의 이미지에서 추정 extrasynaptic DCV 클러스터의&gt; 92 %, 80 nm의 PALM 이미지에서 (개인 DCV 크기) 11 puncta에로 해결되는 것으로 나타났다. hippoca 개발 DCVs에 적용 따라서, 이들 데이터는 큰폭 클러스터링 가설 무효화mpal 신경.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1105">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Zeiss PALM</td>
			<td style="width:169px;">Carl Zeiss, Inc.</td>
			<td style="width:119px;">Elyra PS.1</td>
			<td style="width:572px;">With Zeiss Efficient Navigation (ZEN) software and fluorescence filter Set 77 HE GFP/mRFP/Alexa633&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="28">
			<td height="28" style="height:28px;width:245px;">Lipofectamine 2000 Transfection Reagent</td>
			<td style="width:169px;">Life Technoligies</td>
			<td style="width:119px;">11668-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Minimum Essential Medium</td>
			<td style="width:169px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">11095-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Phosphate-Buffered Saline</td>
			<td style="width:169px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">10010049</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:245px;">Paraformaldehyde</td>
			<td style="width:169px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:119px;">19208</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">Sucrose</td>
			<td style="width:169px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">S-8501</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:245px;">growth glass coverslips 18mm 1.5D</td>
			<td style="width:169px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">NC0059095</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

super-resolution imaging of neuronal dense-core vesicles

<html> 형광 검출 현대 생물학 및 의료 애플리케이션에서 사용 많은 널리 활용하고 신속하게 진행 현미경 기술에 대한 기반을 제공합니다. 형광의 강점은 민감도, 특이도, 라이브 영상과의 호환성이 (가) 있습니다. 불행하게도, 형광 현미경의 전통적인 형태 ~ 250 나노 미터보다 작은 크기와 구조의 연구를 방해 영상 평면에서 하나의 주요 약점, 회절 제한 해상도에서 고통. 최근, 이러한 제한은 photoactivated 현지화 현미경 (PALM)와 같은 초 고해상도 형광 현미경 기술의 도입으로 극복하고있다. 는 기존의 대응과는 달리, PALM은 수십 나노 미터의 측면 해상도로 이미지를 생성 할 수 있습니다. 그것은 세포의 구조 및 조직의 이전에 액세스 할 수없는 속성의 스펙트럼을 설명하기 위하여, 그것의 수많은 장점과 함께, 형광을 사용하는 지금 이렇게 할 수 있습니다. _content &quot;&gt; 불행히도, PALM 구현하기 간단하지 않습니다, 그리고 성공 전략은 종종 연구중인 시스템의 유형에 맞게 조정해야합니다.이 문서에서는, 우리는 고정 된 배양 된 신경 세포의 기공을 갖는 구조의 단일 색상 PALM 연구를 구현하는 방법을 보여줍니다. PALM은 이상적으로 50 ~ 250 nm의 ~에서. 우리의 접근의 주요 단계를 포함 일반적으로 범위 치수가 소포의 연구에 적합와 간헐적 샘플링 RAW 이미지를 수집, photoconvertible (빨강 녹색) 소포화물의 키메라와 신경 세포를 라벨 수퍼 - 해상도 현미경 시스템, 고해상도 PALM 화상을 생성하는 것의 이미지를 처리​​. 또한 반박되는 배양 된 해마 뉴런 고밀도 코어 소포 매우 잘 해결 이미지 (DCVs)을 제시하여 우리의 접근 방법의 효능을 입증 DCVs의 extrasynaptic 매매는 DCV 클러스터에 의해 주로 매개되는 가설.

도 1은 이미징 처리 한 최종 제품을 나타낸다. 본 PALM 콘텐츠에서 지역화 형광체의 가로 좌표를 중심 디스플레이 모드를 사용하여 도시하고, 연관된 DCV의 수퍼 - 해상도 화상을 가우시안 디스플레이 모드를 사용하여 도시된다. 그림 2A는 유사한 위드와 TPA-Dendra2을 표현 체외 해마 신경 세포에있는 여덟 일 소마와 인접 프로세스의 PALM의 ?...

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Super-resolution Imaging of Neuronal Dense-core Vesicles

우리는 photoactivated 현지화 현미경 (PALM) 기반의 고정, 배양 신경 세포에있는 소포의 연구를 구현하는 방법에 대해 설명합니다. 우리 프로토콜의 주요 구성 요소는 초 해상 현미경 시스템 띄엄 샘플링 된 원시 영상을 수집하고, 수퍼 - 해상도 이미지를 생성하는 것의 이미지를 처리​​ photoconvertible 키메라와 라벨링 소포를 포함한다.

신경 밀도 코어 소체의 수퍼 - 해상도 이미징

Detection of fluorescence provides the foundation for many widely utilized and rapidly advancing microscopy techniques employed in modern biological and ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

9.6K 조회수.  Lewis & Clark College.  우리는 photoactivated 현지화 현미경 (PALM) 기반의 고정, 배양 신경 세포에있는 소포의 연구를 구현하는 방법에 대해 설명합니다. 우리 프로토콜의 주요 구성 요소는 초 해상 현미경 시스템 띄엄 샘플링 된 원시 영상을 수집하고, 수퍼 - 해상도 이미지를 생성하는 것의 이미지를 처리​​ photoconvertible 키메라와 라벨링 소포를 포함한다. 

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In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, well-characterized nervous system allows identification and fluorescence imaging of any neuron within the intact animal. Simple immobilization techniques with minimal impact on the animal's physiology allow extended time-lapse imaging. The development of genetically-encoded calcium sensitive fluorophores such as cameleon 1 and GCaMP 2 allow in vivo imaging of neuronal calcium relating both cell physiology and neuronal activity. Numerous transgenic strains expressing these fluorophores in specific neurons are readily available or can be constructed using well-established techniques. Here, we describe detailed procedures for measuring calcium dynamics within a single neuron in vivo using both GCaMP and cameleon. We discuss advantages and disadvantages of both as well as various methods of sample preparation (animal immobilization) and image analysis. Finally, we present results from two experiments: 1) Using GCaMP to measure the sensory response of a specific neuron to an external electrical field and 2) Using cameleon to measure the physiological calcium response of a neuron to traumatic laser damage. Calcium imaging techniques such as these are used extensively in C. elegans and have been extended to measurements in freely moving animals, multiple neurons simultaneously and comparison across genetic backgrounds. C. elegans presents a robust and flexible system for in vivo neuronal imaging with advantages over other model systems in technical simplicity and cost.

In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans

With its small transparent body, well-documented neuroanatomy and a host of amenable genetic techniques and reagents, C. elegans makes an ideal model organism for in vivo neuronal imaging using relatively simple, low-cost techniques. Here we describe single neuron imaging within intact adult animals using genetically encoded fluorescent calcium indicators.

C.의 생체 Neuronal 칼슘 이미징에서 elegans

The nematode worm C. elegans is an ideal model organism  for relatively simple, low cost neuronal imaging in vivo. Its small transparent body and simple, ...

연구

신경과학

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of stress-induced plasticity is the dauer stage of C. elegans. Dauers are an alternative developmental larval stage formed under conditions of low concentrations of bacterial food and high concentrations of a dauer pheromone. Dauers display extensive developmental and behavioral plasticity. For example, a set of four inner-labial quadrant (IL2Q) neurons undergo extensive reversible remodeling during dauer formation. Utilizing the well-known environmental pathways regulating dauer entry, a previously established method for the production of crude dauer pheromone from large-scale liquid nematode cultures is demonstrated. With this method, a concentration of 50,000 - 75,000 nematodes/ml of liquid culture is sufficient to produce a highly potent crude dauer pheromone. The crude pheromone potency is determined by a dose-response bioassay. Finally, the methods used for in vivo time-lapse imaging of the IL2Qs during dauer formation are described.

In Vivo Imaging of Dauer-specific Neuronal Remodeling in C. elegans

Following exposure to specific environmental stressors, the nematode Caenorhabditis elegans undergoes extensive phenotypic plasticity to enter into a stress-resistant &#8216;dauer&#8217; juvenile stage. We present methods for the controlled induction and imaging of neuroplasticity during dauer.

C.에서 영속 특정 신경 세포 리모델링의 생체 내 이미징에서 엘레

The mechanisms controlling stress-induced phenotypic plasticity in animals are frequently complex and difficult to study in vivo. A classic example of ...

Prolonged Incubation of Acute Neuronal Tissue for Electrophysiology and Calcium-imaging

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the experimental time, and increases the number of animals that are utilized per study. This limitation specifically impacts protocols such as calcium imaging that require prolonged pre-incubation with bath-applied dyes. Exponential bacterial growth within 3 - 4 h after slicing is tightly correlated with a decrease in tissue health. This study describes a method for&#160;limiting the proliferation of bacteria in acute preparations to maintain viable neuronal tissue for prolonged periods of time (&#62;24 h) without the need for antibiotics, sterile procedures, or tissue culture media containing growth factors. By cycling the extracellular fluid through UV irradiation and keeping the tissue in a custom holding chamber at 15 - 16 &#176;C, the tissue shows no difference in electrophysiological properties, or calcium signaling through intracellular calcium dyes at &#62;24 h postdissection. These methods will not only extend experimental time for those using acute neuronal tissue, but will reduce the number of animals required to complete experimental goals, and will set a gold standard for acute neuronal tissue incubation.

Once removed from the body, neuronal tissue is greatly affected by environmental conditions, leading to eventual degradation of the tissue after 6 - 8 h. Using a unique incubation method, which closely monitors and regulates the extracellular environment of the tissue, tissue viability can be significantly extended for &#62;24 h.

전기 생리학 및 칼슘 이미징에 대한 급성 신경 조직의 장기간 배양

Acute neuronal tissue preparations, brain slices and retinal wholemount, can usually only be maintained for 6 - 8 h following dissection. This limits the ...

Analyzing Dendritic Morphology in Columns and Layers

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and columns to facilitate brain wiring during development and information processing in developed animals. Postsynaptic neurons elaborate dendrites in type-specific patterns in specific layers to synapse with appropriate presynaptic terminals. The fly medulla neuropil is composed of 10 layers and about 750 columns; each column is innervated by dendrites of over 38 types of medulla neurons, which match with the axonal terminals of some 7 types of afferents in a type-specific fashion. This report details the procedures to image and analyze dendrites of medulla neurons. The workflow includes three sections: (i) the dual-view imaging section combines two confocal image stacks collected at orthogonal orientations into a high-resolution 3D image of dendrites; (ii) the dendrite tracing and registration section traces dendritic arbors in 3D and registers dendritic traces to the reference column array; (iii) the dendritic analysis section analyzes dendritic patterns with respect to columns and layers, including layer-specific termination and planar projection direction of dendritic arbors, and derives estimates of dendritic branching and termination frequencies. The protocols utilize custom plugins built on the open-source MIPAV (Medical Imaging Processing, Analysis, and Visualization) platform and custom toolboxes in the matrix laboratory language. Together, these protocols provide a complete workflow to analyze the dendritic routing of Drosophila medulla neurons in layers and columns, to identify cell types, and to determine defects in mutants.

Here, we show how to analyze dendritic routing of Drosophila medulla neurons in columns and layers. The workflow includes a dual-view imaging technique to improve the image quality and computational tools for tracing, registering dendritic arbors to the reference column array and for analyzing the dendritic structures in 3D space.

열 및 레이어에 수지상 형태학 분석

In many regions of the central nervous systems, such as the fly optic lobes and the vertebrate cortex, synaptic circuits are organized in layers and ...

Two-photon Calcium Imaging in Neuronal Dendrites in Brain Slices

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ fluctuations can occur through a variety of membrane and intracellular mechanisms and play a crucial role in the induction of synaptic plasticity and regulation of dendritic excitability. Hence, the ability to record different types of Ca2+ signals in dendritic branches is valuable for groups studying how dendrites integrate information. The advent of two-photon microscopy has made such studies significantly easier by solving the problems inherent to imaging in live tissue, such as light scattering and photodamage. Moreover, through combination of conventional electrophysiological techniques with two-photon Ca2+ imaging, it is possible to investigate local Ca2+ fluctuations in neuronal dendrites in parallel with recordings of synaptic activity in soma. Here, we describe how to use this method to study the dynamics of local Ca2+ transients (CaTs) in dendrites of GABAergic inhibitory interneurons. The method can be also applied to studying dendritic Ca2+ signaling in different neuronal types in acute brain slices.

We present a method combining whole-cell patch-clamp recordings and two-photon imaging to record Ca2+ transients in neuronal dendrites in acute brain slices.

두뇌 조각에서 신경 모 수석에서 2 광자 칼슘 이미지

Calcium (Ca2+) imaging is a powerful tool to investigate the spatiotemporal dynamics of intracellular Ca2+ signals in neuronal dendrites. Ca2+ ...

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and neurodegenerative disease across species. Although these neurotoxic challenges have long been considered to be cell-intrinsic, considerable evidence now supports that misfolded human disease proteins originating in one neuron can appear in neighboring cells, a phenomenon proposed to promote pathology spread in human neurodegenerative disease.
C. elegans adult neurons that express aggregating proteins can extrude large (~4 &#181;m) membrane-surrounded vesicles that can include the aggregated protein, mitochondria, and lysosomes. These large vesicles are called &#8220;exophers&#8221; and are distinct from exosomes (which are about 100x smaller and have different biogenesis). Throwing out cellular debris in exophers may occur by a conserved mechanism that constitutes a fundamental, but formerly unrecognized, branch of neuronal proteostasis and mitochondrial quality control, relevant to processes by which aggregates spread in human neurodegenerative diseases.
While exophers have been mostly studied in animals that express high copy transgenic mCherry within touch neurons, these protocols are equally useful in the study of exophergenesis using fluorescently tagged organelles or other proteins of interest in various classes of neurons.
Described here are the physical features of C. elegans exophers, strategies for their detection, identification criteria, optimal timing for quantitation, and animal growth protocols that control for stresses that can modulate exopher production levels. Together, details of protocols outlined here should serve to establish a standard for quantitative analysis of exophers across laboratories. This document seeks to serve as a resource in the field for laboratories seeking to elaborate molecular mechanisms by which exophers are produced and by which exophers are reacted to by neighboring and distant cells.

Quantitative Approaches for Scoring in vivo Neuronal Aggregate and Organelle Extrusion in Large Exopher Vesicles in C. elegans

This protocol describes approaches for detection and quantitation of large aggregate and/or organelle extrusions (~4 &#181;m) produced by C. elegans cells in the form of membrane-bound exophers. We describe strains, growth conditions, scoring criteria, timing, and microscopy considerations needed to facilitate dissection of this debris expulsion mechanism.

C. 예르간에서 큰 Exopher 소포에서 생체 신경 골집 및 세포구 압출에서 득점에 대한 정량적 접근

Toxicity of misfolded proteins and mitochondrial dysfunction are pivotal factors that promote age-associated functional neuronal decline and ...

Super-Resolution Imaging to Study Co-Localization of Proteins and Synaptic Markers in Primary Neurons

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. Imaging studies are widely used to investigate their function and plasticity in physiological and pathological conditions. Because of their size and structure, localization studies of proteins require high-resolution imaging techniques. In this protocol, we describe a procedure to study in primary neurons the co-localization of target proteins with synaptic markers at a super-resolution level using structured illumination microscopy (SIM). SIM is a patterned-light illumination technique that doubles the spatial resolution of wide-field microscopy, reaching a detail of around 100 nm. The protocol indicates the required controls and settings for robust co-localization studies and an overview of the statistical methods to analyze the imaging data properly.

This protocol shows how to employ super-resolution microscopy to study protein co-localization in primary neuronal cultures.

1차 뉴런에서 단백질과 시냅스 마커의 공동 국소화를 연구하는 초해상도 이미징

Synapses are the functional elements of neurons and their defects or losses are at the basis of several neurodegenerative and neurological disorders. ...

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are optimized to minimize their impact on behavior. This is first achieved by using a holder that minimizes movement hindrances. The back of the fly&#8217;s head is glued to this holder at an angle that allows optical access to the whole brain while retaining the fly&#8217;s ability to walk, groom, smell, taste and see. The back of the head is dissected to remove tissues in the optical path and muscles responsible for head movement artefacts. The fly brain can subsequently be imaged to record brain activity, for instance using calcium or voltage indicators, during specific behaviors such as walking or grooming, and in response to different stimuli. Once the challenging dissection, which requires considerable practice, has been mastered, this technique allows to record rich data sets relating whole brain activity to behavior and stimulus responses.

Preparing Adult Drosophila melanogaster for Whole Brain Imaging during Behavior and Stimuli Responses

We present a method specifically tailored to image the whole brain of adult Drosophila during behavior and in response to stimuli. The head is positioned to allow optical access to the whole brain, while the fly can move its legs and the antennae, the tip of the proboscis, and the eyes can receive sensory stimuli.

행동과 자극 반응 도중 전체 두뇌 화상 진찰을 위한 성인 Drosophila melanogaster를 준비합니다

We present a method developed specifically to image the whole Drosophila brain during ongoing behavior such as walking. Head fixation and dissection are ...

ROS Live Cell Imaging During Neuronal Development

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the different ROS, hydrogen peroxide (H2O2) is best characterized with respect to roles in cellular signaling. H2O2 has been implicated during the development in several species. For example, a transient increase in H2O2 has been detected in zebrafish embryos during the first days following fertilization. Furthermore, depleting an important cellular H2O2 source, NADPH oxidase (NOX), impairs nervous system development such as the differentiation, axonal growth, and guidance of retinal ganglion cells (RGCs) both in&#160;vivo and in vitro. Here, we describe a method for imaging intracellular H2O2 levels in cultured zebrafish neurons and whole larvae during development using the genetically encoded H2O2-specific biosensor, roGFP2-Orp1. This probe can be transiently or stably expressed in zebrafish larvae. Furthermore, the ratiometric readout diminishes the probability of detecting artifacts due to differential gene expression or volume effects. First, we demonstrate how to isolate and culture RGCs derived from zebrafish embryos that transiently express roGFP2-Orp1. Then, we use whole larvae to monitor H2O2 levels at the tissue level. The sensor has been validated by the addition of H2O2. Additionally, this methodology could be used to measure H2O2 levels in specific cell types and tissues by generating transgenic animals with tissue-specific biosensor expression. As zebrafish facilitate genetic and developmental manipulations, the approach demonstrated here could serve as a pipeline to test the role of H2O2 during neuronal and general embryonic development in vertebrates.

This protocol describes the use of a genetically encoded hydrogen peroxide (H2O2)-biosensor in cultured zebrafish neurons and larvae for assessing the physiological signaling roles of H2O2 during nervous system development. It can be applied to different cell types and modified with experimental treatments to study reactive oxygen species (ROS) in general development.

신경 발달 도중 ROS 살아있는 세포 화상 진찰

Reactive oxygen species (ROS) are well-established signaling molecules, which are important in normal development, homeostasis, and physiology. Among the ...

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

Inferior olive (IO), a nucleus in the ventral medulla, is the only source of climbing fibers that form one of the two input pathways entering the cerebellum. IO has long been proposed to be crucial for motor control and its activity is currently considered to be at the center of many hypotheses of both motor and cognitive functions of the cerebellum. While its physiology and function have been relatively well studied on single-cell level in vitro, presently there are no reports on the organization of the IO network activity in living animals. This is largely due to the extremely challenging anatomical location of the IO, making it difficult to subject to conventional fluorescent imaging methods, where an optic path must be created through the entire brain located dorsally to the region of interest.
Here we describe an alternative method for obtaining state-of-the-art -level calcium imaging data from the IO network. The method takes advantage of the extreme ventral location of the IO and involves a surgical procedure for inserting a gradient-refractive index (GRIN) lens through the neck viscera to come into contact with the ventral surface of the calcium sensor GCaMP6s-expressing IO in anesthetized mice. A representative calcium imaging recording is shown to demonstrate the feasibility to record IO neuron activity after the surgery. While this is a non-survival surgery and the recordings must be conducted under anesthesia, it avoids damage to life-critical brainstem nuclei and allows conducting large variety of experiments investigating spatiotemporal activity patterns and input integration in the IO. This procedure with modifications could be used for recordings in other, adjacent regions of the ventral brainstem.

In vivo Calcium Imaging in Mouse Inferior Olive

We present a protocol to expose the brainstem of adult mouse from the ventral side. By using a gradient-refractive index lens with a miniature microscope, calcium imaging can be used to examine the activity of inferior olive neural somata in vivo.