우리는 누구의 슬라이드 두 번째 인간의 측면-의해-측면 비교로 서 사용 된 안토니 보 웬 사 브리 나 놀란 그 슬라이드 3 인간의 측면-의해-측면 및 두 번째 현미경 비교로 사용 했다 인정 하 고 싶습니다.

1입니다. 인도 잉크 슬라이드의 준비
<ol><li>슬라이드에 cryptococcal 샘플의 10 µ L 플라스틱 모든 원형 효 모 스트레인 작동 하지만이 실험에 대 한 H99 사용 유일한 스트레인. 참고: 샘플 문화 미디어에서 직접 경우 PBS 또는 물과 1:2 희석 방지할 수 있습니다 인도 잉크 clumping에서.</li>
	<li>샘플에 인도 잉크 얼룩의 2 µ L 플라스틱 하 고 물리적으로 샘플을 피 펫 팁을 밀고 하 인도 잉크 균등 하 게 분산 때까지 원운동에서 이동 하 여 혼합.</li>
	<li>배치 하는 coverslip 샘플 다음 부드럽게 그리고 균일 하 게 낮추는 coverslip의 반대편 샘플 슬라이드의 표면에 대해 coverslip의 왼쪽된 가장자리를 눌러.</li>
	<li>5 분 동안 건조 공기를 허용 합니다.</li>
	<li>부드럽게 하는 물개를 형성 하 고 인도 잉크 얼룩 보존 coverslip 국경 매니큐어의 가벼운 레이어를 적용.</li>
</ol>2. 이미지 슬라이드
<ol><li>카메라 부착 및 알려진된 픽셀 미크론 변환 밝은 분야 현미경에 슬라이드를 배치 합니다. 셀 캡슐은 명확 하 고 셀 몸은 초점, 어두운 밴드 필터, 목표, 및 대비를 조정 합니다. 참고: 다양 한 필터, 목표, 및 대비 설정을 작동 하지만 목표, Ph1 필터, 2 x 2 비 닝 x 20는 것이 좋습니다.</li>
	<li>보기의 필드는 하지만 하지 cryptococcal 세포로, 세포 캡슐과 배경, 사이 명확한 대조와 overpopulated 조밀 하 고 어두운 밴드 시각 셀 시체와 함께 제대로 초점을 확인 합니다. 참고: 최적의 이미지에 대 한 셀의 정확한 수는 샘플 및 사용 목적에 따라 달라 집니다. 셀 클러스터 또는 중복 되지 않습니다 보장 하기 위해 중요 한 측면은, 셀 초점 비행기 크게 다양 하지 않습니다 그리고 그 중요 한 인도 잉크 얼룩 배경 (필드의 적어도 25%)에서 명확 하 게 볼 수 있습니다.</li>
	<li>으로 측정 알고리즘 단일 디렉토리에 이미지에서 실행 되 고 출력 데이터는 이미지 파일의 이름에 따라 구성 됩니다 분명 제목, 단일 디렉터리에 이미지를 저장 합니다.</li>
</ol>3. 알고리즘 설정
<ol><li>Python 버전 2.7을 설치</li>
	<li>"핍 설치 베개" 명령을 실행 하 여 추가 파이썬 라이브러리를 설치 하 고 "핍 설치 openpyxl".</li>
	<li>MATLAB에서 지침에 따라 설치</li>
	<li>빌드 https://www.mathworks.com/help/matlab/matlab_external/install-the-matlab-engine-for-python.html에서 제공 하는 지침에 따라 MATLAB 파이썬 라이브러리.</li>
	<li>이 원고 보충 자료 ("QCA.py", "Analysis2.m", 및 "TestRun.m")에 포함 된 세 가지 필요한 파일을 다운로드 합니다. 참고:이 파일은 어떤 위치에 추출 될 수 있다 하지만 모든 3 동일한 디렉터리에 있어야 합니다.</li>
</ol>4입니다. 알고리즘의 사용
<ol><li>QCA.py를 두 번 클릭 하 여 응용 프로그램을 실행 합니다. 참고: 응용 프로그램 시작 하려면 몇 분 정도 걸릴 수 있습니다. "QCA.py" 파일 ".m" 파일 실제 알고리즘 실행을 호출 하는 프로그램 구조를 포함 되어 있습니다.</li>
	<li>프로그램에 설명 된 단계를 따릅니다.<ol>
<li>이미지 파일의 확장 형식 앞에 마침표와 세미콜론으로 구분 된 입력 (예. ". TIF;입니다. jpeg") 다음 클릭 버튼을 입력 합니다.</li>
		<li>디렉터리 선택 단추를 클릭 하 고 이미지를 포함 하는 폴더를 선택 하 여 이미지 파일이 있는 디렉터리를 선택 하십시오.</li>
		<li>이미지 목록 생성 버튼을 클릭 하 여 디렉터리에서 이미지 파일의 목록을 생성 합니다. 이미지는 오른쪽에 텍스트 상자에 나열 됩니다. 검토 하 고 목록을 정확 하 고 완전 한 확인 하십시오.</li>
		<li>무작위 이미지 선택 버튼을 클릭 하 여 미리 보기를 사용 하 고 목록에서 임의의 이미지를 선택 합니다. 참고: 이미지를 "잘못 된 이미지 모드 오류" 열 수 없는 경우 알고리즘은 여전히 제대로 작동 하지 이미지를 표시 하는도 불구 하. 4.2.7 단계 후 테스트 이미지는 여전히 표시 됩니다.</li>
		<li>현미경 목적과 binning 설정을 입력 합니다. 기본 설정이 일치 하지 않는 경우 사용 하는 현미경 "사용자 정의 픽셀 변환"을 선택 하 고 이미지 파일에 대 한 픽셀을 음 변환 입력. 일단 선택, 계산 변환 버튼을 클릭 하 고 오른쪽에 텍스트 상자에 올바른 변환을 확인 하십시오. 참고: 그림 1 에 표시 된 대표 이미지 확대와 2 x 2 비 닝 선택 x 40로 계산 했다.</li>
		<li>서클 검색 알고리즘 매개 변수를 입력 합니다.<ol>
<li>Min과 Max 캡슐 반경 항목으로 외부 캡슐 탐지에 대 한 감지 최소 및 최대 반지름을 입력 합니다. 작은 범위에는 더 정확한 결과 얻을 수 있게 됩니다.</li>
			<li>최소 및 최대 셀 바디 반경 항목으로 세포 체 감지 감지 최소 및 최대 반지름을 입력 합니다. 참고: 이러한 항목의 모든 4 소스 이미지에 따라 그들의 각각 값을 픽셀 단위로 표현 하는 숫자 이어야 합니다.</li>
			<li>알고리즘의 감도 임계값 조정 캡슐 및 셀 바디 감도 슬라이더를 이동 합니다. 낮은 감도 엄격한 될 것입니다 고 거짓 긍정적인 원 탐지 줄어들지만 적은 진짜 서클을 검색할 수 있습니다. 반대로, 높은 감도 검색 속도 증가 하지만 거짓 긍정적인 원형에서 또한 발생할 수 있습니다. 참고: 대표적인 결과 최소 캡슐 반경 7, 45의 최대 캡슐 반지름, 최소 몸 반경 4, 30의 최대 몸 반지름, 87, 캡슐 감도 및 87의 바디 감도 얻은 했다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>테스트 실행 버튼을 클릭 하 여 무작위로 선택 된 이미지에 매개 변수를 테스트 합니다. 결과 원본 이미지를 대체 하는 프로그램의 위 중심에 표시 됩니다. 결과 정확한 경우에, 또한 선택 된 파라미터 모든 선택 된 이미지에 맞는 보장 하려고 추가 임의 이미지를 선택 하는 것이 좋습니다.<ol>
<li>기관 및 감지 하는 캡슐의 수를 최대화 하 고 시각적으로 동그라미 제대로 맞게 표시 여부 검사. 감지 하는 캡슐 내에서 시체의 수 오른쪽에 텍스트 상자에 표시 됩니다. 그렇지 않으면, 결과 정확한 될 때까지 알고리즘 매개 변수를 조작 합니다. 참고: 두꺼운 색된 동그라미는 시각화 도움에. 측정에 대 한 생성 하는 실제 원 HCT 알고리즘에 의해 계산 하는 수학 곡선입니다.</li>
		</ol>
</li>
		<li>분석 시작 단추를 클릭 하 여 이미지 파일의 전체 디렉터리에 감지 알고리즘을 실행 합니다. 각 이미지 분석 될 것 이다 고 프로그램 표시 됩니다 "완료" 오른쪽 텍스트 상자에 모든 이미지를 분석 하는 경우.</li>
		<li>일치 및 정리 단추를 클릭 합니다. 일치 하는 검색 된 캡슐에, 감지 셀 시체와 진정한 캡슐 반경 캡슐에서 몸을 빼서 계산 됩니다. 참고: 경우 형광을 검출 하는 알고리즘 사용 되 고 또는 다른 상황이 하나의 원형은 감지이 단계 필요 하지 않습니다. 대신 당겨 시체 또는 당겨 캡슐 버튼 각각만 파란색 이나 녹색 원만에 대 한 데이터를 수집 하려면 클릭 합니다. 그것은 그 캡슐 데이터를 검색 하는 경우에 반지름 됩니다 참조 셀의 총 반경 세포 체의 반경 수 없습니다 뺄 때 주의 하는 것이 중요.</li>
		<li>이미지 디렉토리에 "CleanedOuput.csv" 파일에 완성 된 데이터를 찾습니다. 데이터의 원피스를 선택 하는 경우에 "CleanedBodies.csv" 또는 "CleanedCapsules.csv" 파일이 표시 됩니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Park, B. J., Wannemuehler, K. A., Marston, B. J., Govender, N., Pappas, P. G., Chiller, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+the+current+global+burden+of+cryptococcal+meningitis+among+persons+living+with+HIV%2FAIDS%5BTitle%5D)+AND+%22AIDS%22%5BJournal%5D)">Estimation of the current global burden of cryptococcal meningitis among persons living with HIV/AIDS.</a> AIDS. 23 (4), 525-530 (2009).</li>
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</ol>

저자는 공개 관심의 없습니다 충돌 있다.

이 기술의 중요 한 단계는 인도 잉크 슬라이드를 준비 하 고 현미경 이미지를 획득. 알고리즘의 다양 한 슬라이드와 이미지 기술 성공적으로 테스트 되었습니다 동안 권장된 프로토콜이이 원고에 설명 되어 있습니다. 다 당 류 캡슐이이 입자는 너무 커서 다 당 류 fibril 네트워크 침투 캡슐의 도메인에서 인도 잉크 입자의 배제에 기반으로 감지 됩니다. 인도 잉크 제외 어두운 배경 위에 밝은 원 발?...

Cryptococcus neoformans immunosuppressed 인구에서 주로 인간의 질병와 관련 된 전세계 편 발견 병원 성 효 모 이다. C. neoformans 전염병1인 사하라 총 연간 사망자의 중요 한 원인이 가장 주목할만 하 게 차지 한다. Cryptococcal 감염의 주요 임상 징후는 감염 된 대 식 세포 (트로이 목마 방법)에 전송 하 여 중앙 신경 시스템의 침공을 다음과 같이 meningoencephalitis 또는 혈액-뇌 장벽에의 직접 교차점. C. neoformans 는 인체 온도, urease 활동, melanization, 및 다 당 류 캡슐2의 형성에서 복제 하는 기능을 포함 한 몇 가지 독성 요소를 표현 한다. 다 당 류 캡슐 glucuronoxylomannan와 glucoronoxylomannangalactan 고분자와 기능 호스트 면역 반응2등 환경 스트레스 요인에 대 한 보호벽으로 반복 구성 됩니다.
Cryptococcal 다 당 류 캡슐 크기의 크기 일관 되 게 연관 되지 않은 독성과, 비록 증거가 병 인2,3,,45에 있는 요인 다는 것 6,7. 캡슐 크기 염 병 리6와 연결, 제어 Cryptococcus 감염5, 하 대 식 세포 기능에 영향을 줄 수 있습니다 이며 독성의 손실8결 석 하는 경우 발생할 수 있습니다. 따라서, 캡슐 크기 측정은 일반적인 cryptococcal 연구, 하지만 아무 fieldwide 캡슐 측정 하는 방법에 대 한 표준.
현재, C. neoformans 다 당 류 캡슐 측정 현미경 이미지, 수동 측정에 기반 하 고 실험실9,10, 마다 이미지 및 측정 취득의 정확한 방법 11. 이 방법에는 즉시 관심사는 일부 연구 요구 정확도 신뢰성 유지를 어렵게 만드는 개별 측정의 수천의 수집 이다. 또한, 결과 게시 하는 경우에 종종 있다 측정 방법의 부적당 한 설명. 많은 출판물 어떻게 그들의 측정 가져온, 설명 하지 어떤 초점 비행기 사용 되었다, 그들은 한 측정을 사용 하거나 몇 가지, 또는 다른 평균 반지름 또는 지름, 사용 여부를 어떻게 그들은 캡슐 식별에 대 한 임계값을 결정 세부 사항입니다. 일부 출판물만 상태는 프로그램으로 그들의 방법 사용 되었다, 예를 들어, "어도비 포토샵 c s 3의 사용 된 셀 측정 하"11. 재현성 어려울 수 있습니다 표준화 및 정보 보고의이 부족이 불가능 한 경우. 인간의 시력, 컴퓨터 밝기, 현미경 설정 차이 슬라이드 조명, 및 다른 요인 뿐만 아니라 개인 간의 하지만 샘플, 사이 계산 픽셀 강도 값의 비율에 따라 일정 하 게 유지 됩니다 반면 변화할 수 있다 고 샘플 사이의 적용 가능 합니다. 이 기술은 없는 없음 전에 필드에 대 한 캡슐 크기를 측정 하는 표준화, 신속, 정확 하 고 간단한 기술 제공의 맥락에서 생성 되었습니다.
앞에서 설명한 대로 CHT 알고리즘은 오래 된, 그리고 스크립트를 자동으로 검색 하는 원 전에 작성 되었습니다. 이 메서드는 어디 다른 스크립트 짧은을 것 이라고 하는 두 가지 영역에서 향상 됩니다. 첫째, 단순히 서클 감지 충분 하지 않습니다, cryptococcal 세포와 두 가지 동그라미 서로 관하여 감지 해야 하기 때문에. 이 방법은 특히 감지 캡슐 내에서 셀 시체, 둘 사이 차별 하 고 관련 몸 캡슐 쌍에 대해서만 계산을 수행. 둘째, 심지어 때 동일한 프로토콜, 다른 수 사관 다음으로 끝날 것 이다 다른 이미지 획득. 탐정 제어할 모든 알고리즘 매개 변수를 함으로써,이 도구는 수집 방법의 광범위 한 범위에 맞게 조정할 수 있습니다. 표준화 범위, 목표, 필터, 그리고에 대 한 필요가 있다.
이 기술은 이미지 내 원 그들의 배경과 그 명암을 감지 하는 탐정 필요 어떤 상황 든 지에 쉽게 적용할 수 있습니다. 두 원 가볍고 어두운 그들의 백그라운드 검출 될 수 있다, 보다,이 기술을 사용 하 여 측정.

<table><tbody><tr><td>India Ink</td><td>Becton, Dickinson and Co.</td><td>261194</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Superfrost Microscope Slides</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-550-143</td><td>25x75x1</td></tr><tr><td>Fisherfinest Premium Cover Glass</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-548-B</td><td>22x22-1</td></tr><tr><td>Sally Hansen HardasNails Xtreme Wear Nail Polish</td><td>Sally Hansen</td><td>N/A</td><td>109 invisible</td></tr><tr><td>SAB Media</td><td>Sigma</td><td>S3306</td><td></td></tr><tr><td>Cryptotoccus neoformans</td><td>ATCC</td><td>208821</td><td>H99 strain</td></tr><tr><td>Olympus AX70 Microscope</td><td>Olympus</td><td>AX70TRF</td><td>Discontinued ; Bright Field Microscope</td></tr><tr><td>Qimaging Retiga 1300</td><td>Qimaging</td><td>N/A</td><td>Discontinued ; Camera Microscope Attachment</td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td>N/A</td><td>Most recent version recommended</td></tr><tr><td>Python Programming Language</td><td>Python</td><td>N/A</td><td>Version 2 necessary ; 2.7 recommended</td></tr><tr><td>Microsoft Excel</td><td>Microsoft</td><td>N/A</td><td>Most recent version recommended</td></tr><tr><td>Phosphate Buffered Saline (PBS)</td><td>Sigma</td><td>P3813</td><td></td></tr></tbody></table>

automated measurement of cryptococcal species polysaccharide capsule and cell body

이 기술의 목적은 많은 수의 다 당 류 캡슐 측정에 대 한 일관 된, 정확한, 및 관리 프로세스를 제공 하입니다.
첫째, 임계값 이미지 강도 값 고유 각 이미지에 대 한 계산에 따라 생성 됩니다. 그런 다음 원형 개체와 확고 원 Hough 변환 (CHT) 알고리즘을 사용 하 여 백그라운드에 따라 검색 됩니다. 마지막으로, 검색 된 셀 캡슐과 시체 중심 좌표와 반지름 크기, 일치 하 고 데이터 관리 스프레드시트에서 사용자에 게 보내집니다.
이 기법의 장점은 간단 하지만 중요 한입니다. 첫 번째, 이러한 계산 인간 보다는 알고리즘에 의해 수행 되기 때문에 정확성과 신뢰성 증가 된다. 정확성이 나 신뢰성 얼마나 많은 샘플 분석에 아무 하락이 있다. 둘째,이 이렇게 캡슐 측정 연구소에 의해 다릅니다 현재 상황 대신 Cryptococcus 필드에 대 한 잠재적인 표준 운영 절차를 설정 합니다. 셋째, 주어진 있다는 수동 캡슐 측정 느리고 단조, 자동화에 차례로 점점 강력한 통계 및 높은 처리량 데이터 분석을 용이 하 게 하는 효 모 세포의 큰 숫자에 빠른 측정 수 있습니다.
이 기술의 주요 제한 방법에서 온 알고리즘 기능. 첫째, 알고리즘 서클 생성할 것 이다. 동안 Cryptococcus 세포와 그들의 캡슐에 원형 형태, 비 원형 물체 감지에이 기술을 적용할 것은 어려울 것 이다. 둘째, 서클 감지는 어떻게 인해 CHT 알고리즘 여러 클러스터 된 서클의 바깥쪽 가장자리에 따라 거 대 한 의사 원을 검색할 수 있습니다. 그러나, 의사 원 안에 잡힌 안하고 셀 시체 수 있습니다 쉽게 감지 되며 결과 데이터 집합에서 제거.
이 기술은 인도 잉크 밝은 분야 현미경 검사 법;에 따라 Cryptococcus 종의 원형 다 당 류 캡슐을 측정 하기 위한 의미 그것은에 적용 될 수 있지만 다른 대비 원형 개체 측정을 기반으로 합니다.

카메라(그림 1)과 함께 밝은 분야 현미경을 사용 하 여 인도 잉크 슬라이드의 현미경 사용 이미지를 먼저 얻을 수 있습니다. 세포 분리 및 세포와 배경 사이 대조를 만들 충분 한 얼룩을 사용 또한 보기의 필드를 압도 하지 충분히 낮은 밀도를 중요 하다. 프로토콜에서 설명 했 듯이, 최적의 이미지에 대 한 셀의 정확한 수 샘플, 현미경, 사...

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Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

Cryptococcal 종 다 당 류 캡슐과 세포 체의 자동화 된 측정

이 기술은 다 당 류 캡슐 몸과 반지름을 측정 하도록 설계 되어 자동된 배치 이미지 프로세서를 설명 합니다. 처음 Cryptococcus neoformans 캡슐 측정을 위해 설계 자동된 이미지 프로세서는 원형 개체의 다른 기반으로 하는 대비 검출에도 적용할 수 있습니다.

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
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automated-measurement-cryptococcal-species-polysaccharide-capsule

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

7.3K 조회수.  Johns Hopkins Bloomberg School of Public Health. 이 기술은 다 당 류 캡슐 몸과 반지름을 측정 하도록 설계 되어 자동된 배치 이미지 프로세서를 설명 합니다. 처음 Cryptococcus neoformans 캡슐 측정을 위해 설계 자동된 이미지 프로세서는 원형 개체의 다른 기반으로 하는 대비 검출에도 적용할 수 있습니다.

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Separating Bacteria by Capsule Amount Using a Discontinuous Density Gradient

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are available to quantify and compare capsule production between different strains or mutants, there is no widely used method for sorting bacteria based on how much capsule they produce. We have developed a method to separate bacteria by capsule amount, using a discontinuous density gradient. This method is used to compare capsule amounts semi-quantitatively between cultures, to isolate mutants with altered capsule production, and to purify capsulated bacteria from complex samples. This method can also be coupled with transposon-insertion sequencing to identify genes involved in capsule regulation. Here, the method is demonstrated in detail, including how to optimize the gradient conditions for a new bacterial species or strain, and how to construct and run the density gradient.

We demonstrate the use of discontinuous density gradients to separate bacterial populations based on capsule production. This method is used to compare capsule amount between cultures, isolate mutants with a specific capsule phenotype, or to identify capsule regulators. Described here is the optimization and running of the assay.

불연속 밀도 그라디언트를 사용 하 여 캡슐 양만큼 박테리아를 분리

Capsule is a key virulence factor in many bacterial species, mediating immune evasion and resistance to various physical stresses. While many methods are ...

연구

유전학

Use of Image Cytometry for Quantification of Pathogenic Fungi in Association with Host Cells

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans commonly employ infection of mammalian hosts or host cells (i.e. macrophages) followed by yeast quantification using colony forming unit analysis or flow cytometry. While colony forming unit enumeration has been the most commonly used method in the field, this technique has disadvantages and limitations, including slow growth of some fungal species on solid media and low and/or variable plating efficiencies, which is of particular concern when comparing growth of wild-type and mutant strains. Flow cytometry can provide rapid quantitative information regarding yeast viability, however, adoption of flow cytometric detection for pathogenic yeasts has been limited for a number of practical reasons including its high cost and biosafety considerations. Here, we demonstrate an image-based cytometric methodology using the Cellometer Vision (Nexcelom Bioscience, LLC) for the quantification of viable pathogenic yeasts in co-culture with macrophages. Our studies focus on detection of two human fungal pathogens: Histoplasma capsulatum and Candida albicans. H. capsulatum colonizes alveolar macrophages by replicating within the macrophage phagosome, and here, we quantitatively assess the growth of H. capsulatum yeasts in RAW 264.7 macrophages using acridine orange/propidium iodide staining in combination with image cytometry. Our method faithfully recapitulates growth trends as measured by traditional colony forming unit enumeration, but with significantly increased sensitivity. Additionally, we directly assess infection of live macrophages with a GFP-expressing strain of C. albicans. Our methodology offers a rapid, accurate, and economical means for detection and quantification of important human fungal pathogens in association with host cells.

Here, we demonstrate how image cytometry can be used for quantification of pathogenic fungi in association with host cells in culture. This technique can be used as an alternative to CFU enumeration.

숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 이미지 계측법의 사용

Studies of the cellular pathogenesis mechanisms of pathogenic yeasts such as Candida albicans, Histoplasma capsulatum, and Cryptococcus neoformans ...

면역학 및 감염병학

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within a cell, tissue, organ, biological fluid, or organism. Metabolomics traditionally focuses on water-soluble metabolites. The water-soluble metabolome is the final product of a complex cellular network that integrates various genomic, epigenomic, transcriptomic, proteomic, and environmental factors. Hence, the metabolomic analysis directly assesses the outcome of the action for all these factors in a plethora of biological processes within various organisms. One of these organisms is the budding yeast Saccharomyces cerevisiae, a unicellular eukaryote with the fully sequenced genome. Because S. cerevisiae is amenable to comprehensive molecular analyses, it is used as a model for dissecting mechanisms underlying many biological processes within the eukaryotic cell. A versatile analytical method for the robust, sensitive, and accurate quantitative assessment of the water-soluble metabolome would provide the essential methodology for dissecting these mechanisms. Here we present a protocol for the optimized conditions of metabolic activity quenching in and water-soluble metabolite extraction from S. cerevisiae cells. The protocol also describes the use of liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) for the quantitative analysis of the extracted water-soluble metabolites. The LC-MS/MS method of non-targeted metabolomics described here is versatile and robust. It enables the identification and quantification of more than 370 water-soluble metabolites with diverse structural, physical, and chemical properties, including different structural isomers and stereoisomeric forms of these metabolites. These metabolites include various energy carrier molecules, nucleotides, amino acids, monosaccharides, intermediates of glycolysis, and tricarboxylic cycle intermediates. The LC-MS/MS method of non-targeted metabolomics is sensitive and allows the identification and quantitation of some water-soluble metabolites at concentrations as low as 0.05 pmol/&#181;L. The method has been successfully used for assessing water-soluble metabolomes of wild-type and mutant yeast cells cultured under different conditions.

Quantitative Metabolomics of Saccharomyces Cerevisiae Using Liquid Chromatography Coupled with Tandem Mass Spectrometry

We present a protocol for the identification and quantitation of major classes of water-soluble metabolites in the yeast Saccharomyces cerevisiae. The described method is versatile, robust, and sensitive. It allows the separation of structural isomers and stereoisomeric forms of water-soluble metabolites from each other.

탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 Cerevisiae의 정량적 Metabolomics

Metabolomics is a methodology used for the identification and quantification of many low-molecular-weight intermediates and products of metabolism within ...

생화학

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic yeast. Capsule size can vary widely between strains, has the ability to grow rapidly when introduced to stressful or low nutrient conditions, and has been positively correlated with strain virulence. For these reasons, the size of the capsule is of great interest to C. neoformans researchers. The growth of the C. neoformans capsule is induced during phenotypic testing to help understand the effects of different treatments on the yeast or size differences between strains. Here we describe one of the standard methods of capsule induction and compare two accepted methods of staining and measuring capsule diameter: (i) India ink, a negative stain, used in conjunction with conventional light microscopy and (ii) co-staining with fluorescent dyes of both the cell wall and capsule followed by confocal microscopy. Finally, we show how measurement of capsule diameter from India ink-stained samples can be automated using computational image analysis.

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

The polysaccharide capsule is the primary virulence factor in Cryptococcus neoformans, and its size correlates with strain virulence. Capsule diameter measurements are used in phenotypic testing and to gauge therapeutic efficacy. Here a standard method of capsule induction is presented, and two methods of staining and measuring diameter are compared.

Cryptococcus neoformans 에서 캡슐 직경의 크기 문제: 측정

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record forces curves on 1000 cells in 4 hours automatically. To maintain a 4 hour analysis time, the number of force curves per cell is reduced to 9 or 16. The method combines a Jython based program and a strategy for assembling cells on defined patterns. The program, implemented on a commercial Bio-AFM, can center the tip on the first cell of the array and then move, automatically, from cell to cell while recording force curves on each cell. Using this methodology, it is possible to access the biophysical parameters of the cells such as their rigidity, their adhesive properties, etc. With the automation and the large number of cells analyzed, one can access the behavior of the cell population. This is a breakthrough in the Bio-AFM field where data have, so far, been recorded on only a few tens of cells.

Automation of Bio-Atomic Force Microscope Measurements on Hundreds of C. albicans Cells

This protocol aims to automate AFM measurements on hundreds of microbial cells. First, microbes are immobilized into PDMS stamp microstructures and then force spectroscopy measurements are performed automatically on hundreds of immobilized cells.

수백 개의 알비칸스 세포에 대한 생체 원자력 현미경 측정 자동화

The method presented in this paper aims to automate Bio-AFM experiments and the recording of force curves. Using this method, it is possible to record ...

생체공학

Adhesion of Candida parapsilosis to Bovine Serum Albumin under Fluid Shear

C. parapsilosis (Cp) is an emerging cause of bloodstream infections in certain populations. The&#160;Candida clade, including Cp, is increasingly developing resistance to the first and the second line of antifungals. Cp is frequently isolated from hands and skin surfaces, as well as the GI tract. Colonization by Candida predisposes individuals to invasive bloodstream infections. To successfully colonize or invade the host, yeast must be able to rapidly adhere to the body surfaces to prevent elimination by host defense mechanisms. Here we describe a method to measure adhesion of Cp to immobilized proteins under physiologic fluid shear, using an end-point adhesion assay in a commercially available multichannel microfluidic device. This method is optimized to improve reproducibility, minimize subjectivity, and allow for the fluorescent quantification of individual isolates. We also demonstrate that some clinical isolates of Cp show increased adhesion when grown in conditions mimicking a mammalian host, whereas a frequently used lab strain, CDC317, is non-adhesive under fluid shear.

<meta charset="utf8"></head><body>Fluid Shear에서 Bovine Serum Albumin에 대한 Candida parapsilosis의 접착

Adhesion is an important first step in colonization and pathogenesis for Candida. Here, an in vitro assay is described to measure adhesion of C. parapsilosis isolates to immobilized proteins under fluid shear. A multichannel microfluidics device is used to compare multiple samples in parallel, followed by quantification using fluorescence imaging.

Fluid Shear에서 Bovine Serum Albumin에 대한 Candida parapsilosis의 접착

C. parapsilosis (Cp) is an emerging cause of bloodstream infections in certain populations. The&#160;Candida clade, including Cp, is increasingly ...

<meta charset="utf8"></head><body>진균 파트너와 함께 자당을 분비하는 시아노박테리아를 공동 배양하기 위한 프로토콜

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being explored as a method for solar-driven bioproduction. One approach involves the use of CO2-fixing cyanobacteria that secrete organic carbon to support the metabolism of a co-cultivated heterotroph, which in turn transforms the carbon into higher-value goods or services. In this protocol, a technical description to assist the experimentalist in the establishment of a co-culture combining a sucrose-secreting cyanobacterial strain with a fungal partner(s), as represented by model yeast species, is provided. The protocol describes the key prerequisites for co-culture establishment: Defining the media composition, monitoring the growth characteristics of individual partners, and the analysis of mixed cultures with multiple species combined in the same growth vessel. Basic laboratory techniques for co-culture monitoring, including microscopy, cell counter, and single-cell flow cytometry, are summarized, and examples of nonproprietary software to use for data analysis of raw flow cytometry standard (FCS) files in line with FAIR (Findable, Accessible, Interoperable, Reusable) principles are provided. Finally, commentary on the bottlenecks and pitfalls frequently encountered when attempting to establish a co-culture with sugar-secreting cyanobacteria and a novel heterotrophic partner is included. This protocol provides a resource for researchers attempting to establish a new pair of co-cultured microbes that includes a cyanobacterium and a heterotrophic microbe.

<meta charset="utf8"></head><body>Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria(종속영양 효모와 광영양성 설탕 분비 시아노박테리아를 결합한 공동 배양의 조립

This protocol provides a comprehensive guideline for the setup and quantitative monitoring of co-cultures, including photoautotrophic sugar-secreting cyanobacteria and heterotrophic yeasts.

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria(종속영양 효모와 광영양성 설탕 분비 시아노박테리아를 결합한 공동 배양의 조립 및 정량화)

With the increasing demand for sustainable biotechnologies, mixed consortia containing a phototrophic microbe and heterotrophic partner species are being ...

Cryptococcal 종 다 당 류 캡슐과 세포 체의 자동화 된 측정

요약

더 많은 비디오 탐색

불연속 밀도 그라디언트를 사용 하 여 캡슐 양만큼 박테리아를 분리

숙주 세포와 관련하여 병원성 곰팡이의 정량화를 위해 이미지 계측법의 사용

고처리량/고함량 스크리닝에 적용된 세포내 진균의 정량화를 위한 현미경 표티픽 분석

탠덤 질량 분광과 결합 된 액체 크로마토그래피를 사용하여 사카로미세스 Cerevisiae의 정량적 Metabolomics

Cryptococcus neoformans 에서 캡슐 직경의 크기 문제: 측정

수백 개의 알비칸스 세포에 대한 생체 원자력 현미경 측정 자동화

Fluid Shear에서 Bovine Serum Albumin에 대한 Candida parapsilosis의 접착

Fluid Shear에서 Bovine Serum Albumin에 대한 Candida parapsilosis의 접착

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria(종속영양 효모와 광영양성 설탕 분비 시아노박테리아를 결합한 공동 배양의 조립 및 정량화)

Assembly and Quantification of Co-Cultures Combining Heterotrophic Yeast with Phototrophic Sugar-Secreting Cyanobacteria(종속영양 효모와 광영양성 설탕 분비 시아노박테리아를 결합한 공동 배양의 조립 및 정량화)