우리 감사 생물학과 분자 생물 과학 (MOBI) 박사 중간 테네시 주립 대학 (MTSU)에이 연구에 대 한 자금 제공. 프로젝트 또한 MTSU 재단에 의해 D.E.N.에 게 수 여 특별 한 프로젝트 교부 금에 의해 부분적으로 투자 되었다.

참고: C. neoformans Biosafety 수준 2 (BSL-2) 병원 체 이며 연구자 작업 적절 한 예방 조치를 취해야 합니다. 상세한 절차 어떻게에 안전 하 게 BSL-2 병원 체와 함께 작업에서 찾을 수 있습니다 중앙 질병 관리국 (CDC)에 웹사이트, 하지만 그것은 C. neoformans 의 접촉으로 오는 모든 사람 제대로 처리에서 훈련 되어야 한다 병원 성 대리인 및 적절 한 개인 보호 장비 (PPE), 일반적으로 라텍스 또는 니트 릴 장갑을 항상 착용 해야 합니다. 또한, 샘플 및 어떤 유출2810% 표 백제 솔루션 사용 하 여 즉시 정리의 aerosolization를 방지 하기 위해 원심 분리기에로 터를 봉인 한다.
1. 캡슐 유도
참고: 모든 단계 다른 설명이 없는 한 상 온에서 수행 되어야 합니다.
<ol><li>C. neoformans 효 모 펩 포도 당 (YPD) 국물 (pH 6.5 ± 0.2)에서 문화 그리고 로그 단계 (약 18-36 h) 때까지 떨고와 37 ° C에서 품 어.</li>
	<li>870 x g 21 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 고 버퍼링 하는 인산 염 (PBS)로 세 번 세척.</li>
	<li>사용 하 여 셀을 계산 하 여 Dulbecco의 최소한의 필수 미디어 (DMEM)에서 2 × 105 셀/2 mL에 resuspend는 hemocytometer (또는 자동화 된 셀 카운터).</li>
	<li>캡슐을 유도를 37 ° C, 5% CO2 18 h에서 품 어. 참고: 미디어에 영양소의 부재와 CO2 의 존재의 조합 C. neoformans 캡슐 성장을 자극.</li>
	<li>후 보육 (위에서) centrifuging 표면에 뜨는 모든 하지만 5-10 µ L을 제거 하 여 세포를 수확. 동시에 각 스트레인 측정에 대 한 해당 취소 유발된 셀 샘플을 수확. 이러한 부정적인 컨트롤을 사용 합니다. 참고: 셀 펠 릿 아주 작은 되며 볼 하기 어려울 수 있습니다. 상쾌한 발음 할 때 주의 해야 합니다.</li>
	<li>인도 잉크 (섹션 2.1) 또는 형광 염료 (섹션 2.2) 얼룩.</li>
</ol>2. 얼룩
<ol><li>
만 인도 잉크 얼룩
	<ol>
<li>인도 잉크와 누 룩 얼룩, 나머지 상쾌한에 펠 릿을 resuspend와 4μL를 추가 (약 절반) 세포 현 탁 액 및 유리 현미경 슬라이드에 인도 잉크의 4μL의. 부드럽게 혼합 하 고 거품을 방지.</li>
		<li>13 m m 유리 coverslip (#1.5 두께)를 적용 하 고 비-독성 실 란 트 (투명 매니큐어) 밖으로 건조에서 샘플을 방지 하기 위해 가장자리를 밀봉 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
형광 염료와 염색
	<ol>
<li>형광 염료와 누 룩 얼룩, 1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 50 µ L PBS에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>Calcofluor 화이트 (CFW)의 동등한 양으로 문화를 품 어 (1 µ g/mL) 및 캡슐 mAb 18B7 AlexaFluor488을 활용 ( 재료의 표참조) (AF488) (10 µ g/mL) 37 ° c.에 30 분</li>
		<li>870 x g 후 보육 21 ° C에서 5 분 동안에 세포를 원심 하 고 상쾌한 발음.</li>
		<li>1% 소 혈 청 알 부 민 (BSA)와 10 µ L PBS에 셀 펠 릿을 resuspend.</li>
		<li>유리 현미경 슬라이드에 세포 현 탁 액의 8 µ L 플라스틱</li>
		<li>13 m m 유리 coverslip (#1.5 두께)를 적용 하 고 비-독성 실 란 트 (투명 매니큐어) 밖으로 건조에서 샘플을 방지 하기 위해 가장자리를 밀봉 합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인도 잉크와 형광 페인트 얼룩
	<ol>
<li>인도 잉크 형광 페인트의 얼룩의 효능을 직접 비교를 공동 얼룩의 두 종류와 같은 세포 인구 얼룩. 이렇게 하려면 먼저 셀 형광 캡슐와 단계 2.2.1-2.2.3에 의하여 세포 벽 얼룩을 품 어.</li>
		<li>다음, 붙일 스테인드 세포 현 탁 액 및 인도 잉크를 유리 슬라이드에 동일 볼륨 (4 µ L) 플라스틱. 부드럽게 섞는다.</li>
		<li>13 m m 유리 coverslip (#1.5 두께)를 적용 하 고 밖으로 건조에서 샘플을 방지 하기 위해 비-독성 실 란 (투명 매니큐어)와 가장자리를 밀봉.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. 이미지 수집/현미경
<ol><li>
인도 잉크 얼룩이 세포 이미징.
	<ol>
<li>표준 가벼운 현미경 (100 X 배율)를 사용 하 여 이미지를 취득 합니다.</li>
		<li>이미지 상태 당 50 셀의 최소입니다. 참고: 필드 셀 수가 달라 집니다, 그리고이 허용 됩니다. 그러나 그것은 중요 한,, 그 겹치는 세포 이들은 (수동 및 자동화 된 소프트웨어와 함께)를 측정 하기 어려운 만큼, 최소한 지켜질. 이 실험에 대 한 이미지는 노출 시간 셀의 작은 움직임으로 인 한 흐림 효과 최소화 하면서 이미지 대비를 극대화 하기 위해 최적화 된 16 비트 깊이에 인수 했다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
형광 염료와 스테인드 세포 이미징
	<ol>
<li>형광 현미경 검사 법에 의해 셀을 이미지를 현미경 이미징 소프트웨어 열고 fluorophores 사용에 대 한 적절 한 여기 및 방출 파장 선택 (CFW와 AF488는 흥분는 405nm 전등과 488 nm, 각각 사용 하 여). 형광 현미경을 사용 하 여 이미지를 취득 합니다.</li>
		<li>이미지 상태 당 50 셀의 최소입니다. 참고: 필드 셀 수가 달라 집니다, 그리고이 허용 됩니다. 그러나 그것은 중요 한,, 그 겹치는 세포 이들은 (수동 및 자동화 된 소프트웨어와 함께)를 측정 하기 어려운 만큼 최소한 지켜질.</li>
		<li>특정된 필드 내에서 각 셀에 대 한 최대 캡슐 직경 얻을 수 있도록 셀의 z-스택 이미지 시리즈를 취득 합니다.<ol>
<li>현미경 제어 소프트웨어에서 "z-스택" 바 "z-스택" 컨트롤 패널을 열고 패널의 왼쪽된 위 모퉁이에서 "첫 번째/마지막" 옵션을 선택을 클릭 합니다.</li>
			<li>초점을 현미경에 정밀한 초점 제어를 사용 하 여 단일 효 모 세포와 모든 현재 시야 내에서 캡슐의 넓은 포인트 이며 클릭 "설정 첫 번째" 수준.</li>
			<li>현재 시야 내에서 셀의 모든 캡슐과 같은 셀의 셀 시체의 포인트로 위에 초점을 정밀한 초점 컨트롤을 사용 하 고 "마지막 설정"을 클릭 합니다.</li>
			<li>그런 다음 현재 위치에 대 한 z-스택 얻으려고 "수집" 탭에서 "실험 시작"을 클릭 합니다. 여러 위치에 프로세스를 반복 하 여 최소 50 셀의 z-스택 이미지 획득. 참고: 이러한 실험 confocal pinhole 설정 되었습니다 1.0 AU와 0.7 µ M를 커버 하는 10-20 조각의 겹치는 z 시리즈는 선택한 위치에 인수 했다. AU = 공기 단위.</li>
		</ol>
</li>
		<li>다음, 각 z 스택 시리즈 변환 최대 강도 예측 (MIP) 적절 한 이미지 분석 소프트웨어를 사용 하 여. 참고: MIPs 프로젝트 스택된 이미지29의 모든 면에서 가장 큰 강도. MIPs를 만드는 생산 최대 셀 및 스택 내에 캡처된 3 차원 캡슐 직경에 해당 하는 이미지의 2 차원 표현을 하나 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
인도 잉크 및 형광 염료와 스테인드 세포 이미징
	<ol>
<li>Widefield (40 배 확대) 나 공초점 현미경을 사용 하 여 이미지 (63 X 또는 100 배 확대). 인도 잉크 및 형광 염료와 스테인드 셀에 대 한 컴퓨터 제어 단계와 기름 침수 목표 widefield 현미경을 사용 하 여 이미지를 캡처하십시오. 참고: 사용 중인 현미경 해야 제어할 수 CFW 이미징 소프트웨어를 사용 하 여. 340-380 nm 여기 필터를 통해 흥분 하 고 빛을 방출 하는 형광은 400 nm dichroic 거울에서 반영 435-485 nm 배리어 필터를 통해 감지 한다. AF488 형광 465-495 nm 여기 필터를 통해 흥분 수 그리고 방출된 빛 515-555 nm 배리어 필터 505 nm dichroic 거울에서 반사를 통해 검출 될 수 있다.</li>
		<li>각 착 방법에 대 한 조건 당 50 셀의 최소 이미지.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. 수동 측정 캡슐의
<ol><li>인도 잉크 또는 형광 성 얼룩으로 얼룩이 셀, 수동으로 측정 캡슐 및 셀 직경 셀 측정 소프트웨어를 사용 ( 재료의 표참조). 이렇게 하려면, "파일"로 이동 > "이미지 열기" > "측정"을 커서를 사용 하 여 전체 셀 (전체 직경)의 가장 넓은 지점을 통해 직선을 그립니다.</li>
	<li>다음, 다시 "측정"을 클릭 하 고 세포 체 (세포 체 직경)를 통해 직선을 그립니다. 참고: 측정 셀에 자동으로 저장 됩니다.</li>
	<li>모든 셀 (최소 50/그룹)에 대 한이 프로세스를 반복 합니다.</li>
	<li>그들은 측정 됩니다 일단 이미지를 저장 하려면 클릭 "파일" > "다른 이름으로 저장" 하 고 이미지를 적절 하 게 이름을.</li>
	<li>새로 측정된 파일을 선택 하 고 데이터를 스프레드시트 소프트웨어를 내보낼.</li>
	<li>방정식을 사용 하 여 캡슐 평균 직경을 계산: ([총 직경]-[셀 본체 지름]).</li>
</ol>5. 자동화 측정 캡슐의
참고: 성공적인 자동화 된 측정을 위해 16 비트 이미지를 사용 대비 높은 수준 하 고는 제대로 적절 한 이미지 분석 소프트웨어 함께 초점을 맞추고 있다 ( 재료의 표참조). C. neoformans 캡슐 측정에 대 한 이미지 때 그것은 세포 벽과 캡슐 사이 경계에 어두운 반지에 집중 하는 것이 중요. 소프트웨어를를 제대로 셀 및 캡슐을 나타내는 수 있습니다.
<ol><li>반전 및 모든 인도 잉크 묻은 적절 한 이미지 편집 소프트웨어를 사용 하 여 셀 이미지의 복사본을 만듭니다 ( 재료의 표참조). 이렇게 하려면 "파일" > "열기" 인도 잉크 얼룩이 이미지를 연 다음 "제어" + "나"는 이미지를 반전. 클릭 "파일" > "다른 이름으로 저장"을 거꾸로 이미지를 저장.</li>
	<li>원래와 거꾸로 가져올 소프트웨어에 이미지 클릭 "파일" > "가져오기 순서" > "로드 이미지" > "정의 시퀀스 (수동으로)" > "치수 (채널)" > "가져오기" > "적용". 참고: C. neoformans 세포 시체 및 캡슐 확인 될 수 있다 고 '조리법'-는 소프트웨어에 포함 된로-특정 알고리즘을 사용 하 여 마스크.</li>
	<li>거꾸로 이미지에 ' 식민지 분석기 (형광)' 제조 법을 사용 하 여 검색 하 고 셀 바디 마스크 다음 "적용"을 클릭 합니다. 거꾸로 이미지에서 C. neoformans 세포의 경계를 정의 하는 어두운 반지 주변 캡슐 보다 밝게 된다.</li>
	<li>거꾸로 이미지에 ' 식민지 분석기 (형광)' 제조 법을 사용 하 여 그들의 캡슐에서 C. neoformans 세포 시체를 세그먼트 다음 "적용" 클릭 합니다. 이 수의 마스크를 만듭니다. "수 면" 탭을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여이 카운트 마스크를 "셀 몸"를 이름을 바꿉니다. 참고: 여러 이미지 처리 단계 제조 법 구성: 배경 제거, 물체 감지, 개체 분리 및 하위 집합 필터링.</li>
	<li>다음, 원본 이미지에 ' 세포 증식 ' 제조 법을 사용 하 여 캡슐, 마스크를 감지 하 고 "적용"을 클릭 합니다. 이 수의 마스크를 만듭니다. "수 면" 탭을 마우스 오른쪽 단추로 클릭 하 여이 카운트 마스크를 "캡슐"을 이름을 바꿉니다.</li>
	<li>서로 인접 한 캡슐을 분할 하는 원본 이미지에 새로운 마스크를 만들기 제조 법, ' 캡슐 파티션 '을 사용 하 여. 이렇게 하려면 제조 법 드롭 다운 메뉴에서 "파티션 캡슐"을 클릭 합니다. 캡슐 파티션 상자에서 캡슐 영역에 대 한 지금은 이름이 바뀐된 수 마스크 "캡슐" (5.5)을 선택 합니다. Crypto 셀 (5.4)에 대 한 지금은 이름이 바뀐된 수 마스크 "바디 셀"을 선택 합니다. 입력된 채널, 및 "분할 캡슐에 대 한 마스크 만들기"원본 "를 선택입니다. 클릭 "적용 참고: 제조 법 셀 및 캡슐 직경, 길고 짧은 축 검출 마스크에서 셀과 캡슐, 및 지역 측정의 센터를 교차의 평균으로 정의 생성 합니다. 이 소프트웨어의 스프레드시트 탭 아래에 있는 출력을 찾아. 모든 이미지 (최소 50 셀/그룹)에 대해이 프로세스를 반복 합니다. 제조 법의 매개 변수 개별 이미지의 최적화를 조정 하거나 여러 개의 이미지의 일괄 검색에 대 한 최적화 된 수 있습니다. 추가 측정 셀 및 캡슐의 형태학의 포괄적인 특성화에 대 한 제조 법으로 계산할 수 있습니다.</li>
	<li>추가 분석을 위해 선택의 스프레드시트 소프트웨어를 데이터를 내보냅니다.</li>
</ol>

<ol>
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H., Kim, Y. H., Shin, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximum+intensity+projection+using+bidirectional+compositing+with+block+skipping.">Maximum intensity projection using bidirectional compositing with block skipping.</a> J Xray Sci Technol. 23 (1), 33-44 (2015).</li><li>Janbon, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+the+genome+and+transcriptome+of+Cryptococcus+neoformans+var.+grubii+reveals+complex+RNA+expression+and+microevolution+leading+to+virulence+attenuation.">Analysis of the genome and transcriptome of Cryptococcus neoformans var. grubii reveals complex RNA expression and microevolution leading to virulence attenuation.</a> PLoS Genet. 10 (4), e1004261 (2014).</li><li>Bisson, G. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+use+of+HAART+is+associated+with+decreased+risk+of+death+during+initial+treatment+of+cryptococcal+meningitis+in+adults+in+Botswana.">The use of HAART is associated with decreased risk of death during initial treatment of cryptococcal meningitis in adults in Botswana.</a> J Acquir Immune Defic Syndr. 49 (2), 227-229 (2008).</li><li>van Teeffelen, S., Shaevitz, J. W., Gitai, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+analysis+in+fluorescence+microscopy:+bacterial+dynamics+as+a+case+study.">Image analysis in fluorescence microscopy: bacterial dynamics as a case study.</a> Bioessays. 34 (5), 427-436 (2012).</li><li>Granger, D. L., Perfect, J. R., Durack, D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virulence+of+Cryptococcus+neoformans.+Regulation+of+capsule+synthesis+by+carbon+dioxide.">Virulence of Cryptococcus neoformans. Regulation of capsule synthesis by carbon dioxide.</a> J Clin Invest. 76 (2), 508-516 (1985).</li></ol>

저자, Hoyin 라는 DRVision Aivia 자동된 이미지 분석 소프트웨어를 게시 하는 제품 관리자입니다.

수십 년 동안, 캡슐 mycologists와 임상 C. neoformans cryptococcosis 병원 체에 대 한 주요 독성 요인으로 그것의 역할 때문에 관심된에 대 한 연구의 주요 초점 되었습니다. 에 현미경 검사 법을 사용 하 여 긴장 캡슐 크기 차이 측정 하 고 다른 성장 아래 조건 병원 체 및 다양 한 자극 (즉, 서로 다른 환경 조건에 그것의 응답에 대 한 중요 한 정보를 제공할 수 있습니다. 잠재적인 약물 치료, ...

매년 마다 분기 백만 사람들에 영향을 미치는 매년 180000 이상의 죽음의 결과로, Cryptococcus neoformans 이며, 세포내 병원 성 효 모 cryptococcosis1,2, 의 원인이 되는 대리인 3. 어려운 히트 하지 않은 항 레트로 바이러스 치료에 대 한 준비가 액세스 그들을 심하게 병4,,56에 감염 되기 쉬운 만드는 가난한 나라에서 HIV 양성 환자는. CDC에서 데이터는 사하라 사막 이남의 아프리카에서C. neoformans 죽이고 결핵 보다 더 많은 사람들이 매년 매달 기록1어떤 Ebola 발발 보다 더 나타냅니다. 노출의 가장 일반적인 경로 환경7평범 desiccated 포자를 흡입에서 발생 합니다. 입력 되 면 폐, 감염 된 개인에서 C. neoformans 의 성공에 기여 하는 여러 가지 독성 요인 있다. Acapsular 변종 악성8되지 않는 다 당 류 캡슐 미생물의 기본 독성 요인으로 간주 됩니다.
Cryptococcal 캡슐의 3 개의 원리 구성 요소를 만든: glucuronoxylomannan (GXM), galactoxylomannan (GalXM), mannoproteins (MPs)9. MPs는 캡슐의 비교적 작은 세포 벽 관련 구성 요소, 면역성 이며 주로 프로 염증 반응을9,10를 홍보할 수 있습니다. GXM 및 GalXM 캡슐의 대부분을 확인 하는 반면, (> 90% 무게에 의해) 면역 효과11있다. 그것의 immunomodulatory 효과 이외에는 캡슐 vivo에서 의 급속 한 확대는 호스트 phagocytic 세포 (즉, 중 성구 및 대 식 세포)12섭취에 기계적인 장벽을 만듭니다. C. neoformans 캡슐과 그것의 종합은 복잡 하지만 전반적으로, 증가 캡슐 직경 증가 독성6,,1314와 상관 된다. 이 감안할 때, 신속 하 고 정확 하 게 계량 캡슐 측정 수 C. neoformans 연구에 대 한 중요 하다.
C. neoformans 세포와 그것의 다 당 류 캡슐 동적 구조 이며 시간15변화 표시. 캡슐은 밀도, 크기, 및 호스트 환경16,,1718의 변화에 대 한 응답에서 어셈블리에서 변경할 수 있습니다. 낮은 철 또는 영양 수준, 혈 청, 인간의 생리 적 pH를 증가 CO2 노출 캡슐 성장16,18,,1920를 시작으로 알려져 있습니다. 또한, 연구원은 보여주었다는 감염 시 immunoreactivity에 큰 차이가 발생 하는 구조적인 변화 대출 호스트 C. neoformans 를 이점을21,22. 이것은 C. neoformans 캡슐의 아키텍처는 다양 한 방법으로 분석 하기 때문에 알려져 있다. 전자 현미경 검사 법, 예를 들어 캡슐 외부, 더 투과 층23아래 내부 전자 밀도 레이어와 이기종 매트릭스는 계시 했다. 산란 및 광학 족집게를 사용 하 여 연구자의 고분자 속성24더 명료를 허용 했습니다. 둘 다 정적 및 동적 산란 측정에서 결과 분석, 우리는 알고 다 당 류 캡슐 복잡 한 분기 구조23있다. 광학 핀셋 구조 강성을 테스트 하 고 평가 하는 그것의 항 체 반응24사용 되었습니다. 그러나, 지금까지 가장 자주 고용된 분석 C. neoformans 캡슐의 그것의 크기의 측정 이다.
캡슐 크기 척도, 연구원은 간단한 측정 해야 사용: 캡슐의 선형 직경. 디지털 현미경 인도 잉크 또는 형광 염료와 스테인드 여러 C. neoformans 셀 (일반적으로 수백)의 이미지를 캡처하는 데 사용 됩니다. 각 셀 몸과 주변 캡슐의 크기 측정 됩니다. 데이터는 컴파일하고 캡슐의 평균 직경 (셀 바디 + 캡슐) 전체 셀 직경에서 세포 체 직경을 빼서 계산 됩니다. 이 시점까지이 측정 수행 되었습니다 수동으로. 그러나 일반적으로 정확 하 고, 연구자에 대 한이 메서드는 단점이 있습니다. 큰 데이터 집합 며칠이 걸릴 수 있습니다 또는 직접 분석 하는 주. 그리고 이러한 측정 수동으로 할 수 있습니다, 때문에 주관과 인간의 오류 영향을 미칠 수 결과.
자동화 된 컴퓨터 이미지 분석 생물 이미지 25,,2627의 더 빠르고 더 신뢰할 수 있는 분석을 사용 하는 분자 세포 생물학의 여러 분야에서 연구자 불가 결 한 도구가 되고있다. 정확한 이미지 분석 기법 무엇입니까 종종 복잡 하 고 거 대 한 데이터 집합에서 양적 정보 내 필요 하다. 그러나, 일부 측정, 특히 C. neoformans 캡슐의 측정을 자동화 하기 어려운 되었습니다. 정확 하 게 식별 하는 세포 벽과 캡슐, 일반적으로 어두운 링 단계 대조 현미경 검사 법에 의해 군데 나타나는 간의 인터페이스 간단한 임계값을 사용 하 여 해결 성가신 될 수 있습니다. 또한, C. neoformans 세포 문화에 함께 덩어리 하는 경향이 셀의 정확한 세분화 정확한 측정을 위해 필요 합니다.
이 프로젝트의 목표는 (i) C. neoformans, (ii) 비교 및 대비 인도 잉크 캡슐 유도 대 한 표준 프로토콜 중 하나를 설명 했다 고 형광 얼룩으로 직경 측정 캡슐 관련 된 (iii) 개발 간단 하 고, 계산 방법 인도 잉크 얼룩이 이미지 분석 소프트웨어, (iv)를 사용 하 여 셀의 이미지를 사용 하 여 캡슐 직경을 측정 하는 이점 및 제한 수동으로 캡슐 직경을 측정 하 고 소프트웨어 자동화를 사용 하 여의 평가 합니다. 우리 두 착 방법, 형광 세포 벽 및 캡슐의 라벨의 찾을, 더 시간이 걸리는 반면, 실험 사이 가장 일관 된 결과 제공. 그러나 두 방법 모두 성공적으로 구별을 사용 하는, 실험실 및 임상 C. neoformans 사이 긴장 다른 전시 캡슐 크기. 또한, 우리는 인도 잉크 얼룩이 이미지에서에서 캡슐 직경의 측정을 자동화 하 고 이것은 캡슐의 수동 측정에 대안을 발견 수 있었다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="983">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:451px;">Capsule Induction</td>
			<td style="width:204px;"></td>
			<td style="width:117px;"></td>
			<td style="width:211px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">C. neoformans cells</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>The clinical lab strain, H99S, was a kind gift from Dr. John Perfect (Duke University).&#160; The clinical strains, B18 and B52, were kind gifts from Dr. Greg Bisson (University of Pennsylania).&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Peptone Dextrose Broth (YPD)</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>DF0428-17-5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Phosphate Buffered Saline (PBS)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>This is made in the lab using standard recipe (137mM NaCl, 2.7 mM KCl, 10mM Na2HPO4O, 2 mM Kh2PO4O)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">DMEM/high-glucose with L-glutamine, without sodium pyruvate</td>
			<td>GE Life Sciences</td>
			<td>SH30022.01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">6-well plates</td>
			<td>Falcon</td>
			<td>CL5335-5EA</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Shaking incubator</td>
			<td>Thermo Scientific&#160;</td>
			<td></td>
			<td>MaxQ6000</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CO2 incubator</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Isotemp</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Centrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Legend XTR</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Staining</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Legend Micro 21R</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">India ink</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>14-910-56</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Calcofluor white</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>18909-100ML-F</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18B7 mouse anti-GXM antibody conjugated to Alexafluor 488</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>A kind gift from Dr. Arturo Casadevall (Johns Hopkins University)&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">PBS with 1% Bovine Serum Albumin (BSA)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>PBS is the same recipe listed above (line 4) with 1% BSA added and filter sterilized.</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>A9418</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superfrost microscope slides</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>12-550-143</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass coverslips</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2855-18</td>
			<td>#1.5 thickness</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Clear nail polish or other non-toxic sealant</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image Acquisition&#160;</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Immersion oil</td>
			<td>Cargille&#160;</td>
			<td>16484</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope with immersion oil objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Zeiss Axio A1 with a Plan - NEOFLUAR 100x oil immersion NA 1.30 objective</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Light microscope camera</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>Zeiss Axiocam ErCD camera</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope with oil immersion objective</td>
			<td>Zeiss</td>
			<td></td>
			<td>LSM 700 laser scanning confocal equipped with a Plan-Apochromat 63X NA 1.4 oil immersion DIC M27 objective.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope software</td>
			<td>Zen 2009</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Confocal microscope camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td>Nikon Ti-Eclipse with a Intensilight epifluorescence illuminator (Nikon), CoolSNAP MYO microscope camera (Photometrics), Plan Apo 60x NA 1.40 oil immersion objective (Nikon) and 1.5x magnification changer.&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Widefield imaging software</td>
			<td>Nikon Elements (Nikon)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Capsule Measurement</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image editing software</td>
			<td>Photoshop (Adobe)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscope software for manual measurement</td>
			<td>Axiovision (Carl Zeiss)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Image analysis software for automated meesurement</td>
			<td>Aivia (DRVision Technologies)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spreadsheet software</td>
			<td>Excel (Microsoft)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

size matters: measurement of capsule diameter in cryptococcus neoformans

다 당 류 캡슐 Cryptococcus neoformans 의 기본 독성 요소 이며 가장 일반적으로이 병원 성 효 모의 측면을 공부. 캡슐 크기 긴장 사이 넓게 변화할 수 있다, 스트레스 또는 낮은 영양 조건에 도입 하는 때 급속 하 게 성장 수 있으며 변형 독성과 긍정적으로 상관 되었다. 이러한 이유로, 캡슐의 크기는 C. neoformans 연구자에 게 큰 관심입니다. C. neoformans 캡슐의 성장 phenotypic 테스트 하는 동안 긴장의 효 모 또는 크기 차이에 다른 처리의 효과 이해할 수 있도록 유도 된다. 여기 우리 캡슐 유도 및 비교 두 허용 방법 얼룩이 지 고 캡슐 직경 측정의 표준 방법 중 하나를 설명: (i) 인도 잉크, 부정적인 얼룩, 함께 기존의 가벼운 현미경 검사 법 및 (ii) 공동으로 얼룩에 사용 세포 벽 및 캡슐 뒤에 confocal 현미경 검사 법의 형광 페인트 마지막으로, 우리는 어떻게 인도 잉크 얼룩이 진 샘플에서 캡슐 직경의 측정 수 보여 전산 이미지 분석을 사용 하 여 자동화.

캡슐 유도, 세포 얼룩, 이미징, 및 측정 기법을 설명 하기 위해 사용 하는의 3 개의 긴장 C. neoformans: 일반적인, 잘 특징이 실험실 스트레인, H99S30및 2 개의 임상으로 고립 된 긴장의 이전 알 수 없는 캡슐 직경, B18, b 5231.
캡슐 유도, 얼룩, 및 인도 잉크를 사용 하 여 이미지 수집 워크플로 ...

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Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

Cryptococcus neoformans 에서 캡슐 직경의 크기 문제: 측정

다 당 류 캡슐 Cryptococcus neoformans 에 기본 독성 요소 이며 크기 상관 스트레인 독성. 캡슐 직경 측정 phenotypic 테스트 및 치료 효능을 측정 하기 위해 사용 됩니다. 여기 캡슐 유도의 표준 방법을 제시 하 고 얼룩이 지 고 직경 측정의 두 가지 방법 비교.

The polysaccharide capsule of Cryptococcus neoformans is the primary virulence factor and one of the most commonly studied aspects of this pathogenic ...

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Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Size Matters: Measurement of Capsule Diameter in Cryptococcus neoformans

13.4K 조회수.  Middle Tennessee State University. 다 당 류 캡슐 Cryptococcus neoformans 에 기본 독성 요소 이며 크기 상관 스트레인 독성. 캡슐 직경 측정 phenotypic 테스트 및 치료 효능을 측정 하기 위해 사용 됩니다. 여기 캡슐 유도의 표준 방법을 제시 하 고 얼룩이 지 고 직경 측정의 두 가지 방법 비교.

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Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a surveillance system for potentially harmful antigens, optimizing mucosal immunity and adaptive immune responses1. Lymph is formed from interstitial fluid that enters blind-ended initial lymphatics, and then is transported against a pressure gradient in larger collecting lymphatics. Each collecting lymphatic is made up of a series of segments called lymphangions, separated by bicuspid valves that prevent backflow. Each lymphangion possesses a contractile cycle that propels lymph against a pressure gradient toward the central circulation2. This phasic contractile pattern is analogous to the cardiac cycle, with systolic and diastolic phases, and with a lower contraction frequency4. In addition, lymphatic smooth muscle generates tone and displays myogenic constriction and dilation in response to increases and decreases in luminal pressure, respectively5. A hybrid of molecular mechanisms that support both the phasic and tonic contractility of lymphatics are thus proposed.
Contraction of smooth muscle is generally regulated by the cytosolic Ca2+ concentration ([Ca2+]i) plus sensitivity to Ca2+, of the contractile elements in response to changes in the environment surrounding the cell6. [Ca2+]i is determined by the combination of the movement of Ca2+ through plasma membrane ligand or voltage gated Ca2+ channels and the release and uptake of Ca2+ from internal stores. Cytosolic Ca2+ binds to calmodulin and activates enzymes such as myosin light chain (MLC) kinase (MLCK), which in turn phosphorylates MLC leading to actin-myosin-mediated contraction8. However, the sensitivity of this pathway to Ca2+ can be regulated by the MLC phosphatase (MLCP)9. MLCP activity is regulated by Rho kinase (ROCK) and the myosin phosphatase inhibitor protein CPI-17.
Here, we present a method to evaluate changes in [Ca2+]i over time in isolated, perfused lymphatics in order to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction. Using isolated rat mesenteric collecting lymphatics we studied stretch-induced changes in [Ca2+]i and contractile activity. The isolated lymphatic model offers the advantage that pressure, flow, and the chemical composition of the bath solution can be tightly controlled. [Ca2+]i was determined by loading lymphatics with the ratiometric, Ca2+-binding dye Fura-2. These studies will provide a new approach to the broader problem of studying the different molecular mechanisms that regulate phasic contractions versus tonic constriction in lymphatic smooth muscle.

Measurement of Cytosolic Ca2+ in Isolated Contractile Lymphatics

We introduce an approach to evaluate the cytosolic Ca2+ concentration in isolated lymphatics to study Ca2+-dependent and Ca2+-sensitizing mechanisms of lymphatic smooth muscle contraction.

Cytosolic CA의 측정 2 + 절연 수축성 Lymphatics에

Lymphatic vessels comprise a multifunctional transport system that maintains fluid homeostasis, delivers lipids to the central circulation, and acts as a ...

연구

면역학 및 감염병학

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human &gamma;-HVs, such as EBV and KSHV, has severely hindered detailed pathogenic studies. Murine &gamma;-herpesvirus 68 (&gamma;HV68) shares extensive genetic and biological similarities with human &gamma;-HVs and is a natural pathogen of murid rodents2. As such, evaluation of &gamma;HV68 infection of mice inbred strains at different stages of viral infection provides an important model for understanding viral lifecycle and pathogenesis during &gamma;-HVs infection.
Upon intranasal inoculation, &gamma;HV68 infection results in acute viremia in the lung that is later resolved into a latent infection of splenocytes and other cells, which may be reactivated throughout the life of the host3,4. In this protocol, we will describe how to use the plaque assay to assess infectious virus titer in the lung homogenates on Vero cell monolayers at the early stage (5 - 7 days) of post-intranasal infection (dpi). While acute infection is largely cleared 2 - 3 weeks postinfection, a latent infection of &gamma;HV68 is established around 14 dpi and maintained later on in the spleen of the mice. Latent infection usually affects a very small population of cells in the infected tissues, whereby the virus stays dormant and shuts off most of its gene expression. Latently-infected splenocytes spontaneously reactivate virus upon explanting into tissue culture, which can be recapitulated by an infectious center (IC) assay to determine the viral latent load. To further estimate the amount of viral genome copies in the acutely and/or latently infected tissues, quantitative real-time PCR (qPCR) is used for its maximal sensitivity and accuracy. The combined analyses of the results of qPCR and plaque assay, and/or IC assay will reveal the spatiotemporal profiles of viral replication and infectivity in vivo.

&#947;-Herpesviruses (&#947;-HVs) establish life-long persistency in their host. Infection of mice with &#947;-HV68 provides a genetically tractable in vivo model for the characterization of the lifecycle/pathogenesis of &#947;HVs. This protocol describes the detection and quantitation of &#947;HV68 infection at acute and latent stages following infection by plaque-forming, infectious center, and qPCR assays.

마우스에 γHV68 감염의 측정

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in particular, is known to occur as a response to infection in mammals 1 and has also recently been described in Drosophila melanogaster2. It is generally accepted that sleep is beneficial to the host during an infection and that it is important for the maintenance of a robust immune system3,4. However, experimental evidence that supports this hypothesis is limited4, and the function of excess sleep during an immune response remains unclear. We have used a multidisciplinary approach to address this complex problem, and have conducted studies in the simple genetic model system, the fruitfly Drosophila melanogaster. We use a standard assay for measuring locomotor behavior and sleep in flies, and demonstrate how this assay is used to measure behavior in flies infected with a pathogenic strain of bacteria. This assay is also useful for monitoring the duration of survival in individual flies during an infection. Additional measures of immune function include the ability of flies to clear an infection and the activation of NF&kappa;B, a key transcription factor that is central to the innate immune response in Drosophila. Both survival outcome and bacterial clearance during infection together are indicators of resistance and tolerance to infection. Resistance refers to the ability of flies to clear an infection, while tolerance is defined as the ability of the host to limit damage from an infection and thereby survive despite high levels of pathogen within the system5. Real-time monitoring of NF&kappa;B activity during infection provides insight into a molecular mechanism of survival during infection. The use of Drosophila in these straightforward assays facilitates the genetic and molecular analyses of sleep and the immune response and how these two complex systems are reciprocally influenced.

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

To understand a link between the immune response and behavior, we describe a method to measure locomotor behavior in Drosophila during bacterial infection as well as the ability of flies to mount an immune response by monitoring survival, bacterial load, and real-time activity of a key regulator of innate immunity, NF&kappa;B.

면역 반응과 수면에서의 양적 측정<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Measurement of Tactile Allodynia in a Murine Model of Bacterial Prostatitis

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently shown that UPEC have an important role in the initiation of chronic pelvic pain2, a feature of Chronic prostatitis/Chronic pelvic pain syndrome (CP/CPPS)3,4. Infection of the prostate by clinically relevant UPEC can initiate and establish chronic pain through mechanisms that may involve tissue damage and the initiation of mechanisms of autoimmunity5.
A challenge to understanding the pathogenesis of UPEC in the prostate is the relative inaccessibility of the prostate gland to manipulation. We utilized a previously described intraurethral infection method6 to deliver a clinical strain of UPEC into male mice thereby establishing an ascending infection of the prostate. Here, we describe our protocols for standardizing the bacterial inoculum7 as well as the procedure for catheterizing anesthetized male mice for instillation of bacteria.
CP/CPPS is primarily characterized by the presence of tactile allodynia4. Behavior testing was based on the concept of cutaneous hyperalgesia resulting from referred visceral pain8-10. An irritable focus in visceral tissues reduces cutaneous pain thresholds allowing for an exaggerated response to normally non-painful stimuli (allodynia). Application of normal force to the skin result in abnormal responses that tend to increase with the intensity of the underlying visceral pain. We describe methodology in NOD/ShiLtJ mice that utilize von Frey fibers to quantify tactile allodynia over time in response to a single infection with UPEC bacteria.

Infection of the prostate may be a contributing factor in mediating pelvic pain in chronic prostatitis. We describe the procedure for preparation of standardized bacterial inoculum, instillation of bacteria into the urethra of male mice and methodology for measuring tactile allodynia in mice over time.

세균 Prostatitis의 손쥐 모델에 촉각 Allodynia 측정

Uropathogenic Escherichia coli (UPEC) are pathogens that play an important role in urinary tract infections and bacterial prostatitis1. We have recently ...

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular interaction that is not clearly understood is non-lytic exocytosis. In this process, yeast cells are released into the extracellular space by a poorly understood mechanism that leaves both the macrophage and Cn viable. Here, we describe how to follow a large number of individually infected macrophages for a 24 hr infection period by time-lapsed microscopy. Infected macrophages are housed in a heating chamber with a CO2 atmosphere attached to a microscope that provides the same conditions as a cell-culture incubator. Live digital microscopy can provide information about the dynamic interactions between a host and pathogen that is not available from static images. Being able to visualize each infected cell can provide clues as to how macrophages handle fungal infections, and vice versa. This technique is a powerful tool in studying the dynamics that are behind a complex phenomenon.

Visualizing Non-lytic Exocytosis of Cryptococcus neoformans from Macrophages Using Digital Light Microscopy

We describe how to visualize macrophage-C. neoformans (Cn) interactions in real time, with specific emphasis on the process of non-lytic exocytosis using digital light microscopy. Using this technique individually infected macrophages can be studied to ascertain various aspects of this phenomenon.

의 비 용해성 세포 외 유출을 시각화<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em&gt; 디지털 광학 현미경을 사용하여 대 식세포에서

Many aspects of the infection of macrophages by Cryptococcus neoformans have been extensively studied and well defined. However, one particular ...

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are able to replicate in the deep lung. Phagocytosis of Cryptococcus by macrophages is one of the ways that the disease is able to spread into the central nervous system to cause lethal meningoencephalitis. Therefore, study of the association between Cryptococcus and macrophages is important to understanding the progression of the infection. The present study describes a step-by-step protocol to study macrophage infectivity by C. neoformansin vitro. Using this protocol, the role of host sterols on host-pathogen interactions is studied. Different concentrations of methyl--cyclodextrin (MCD) were used to deplete cholesterol from murine reticulum sarcoma macrophage-like cell line J774A.1. Cholesterol depletion was confirmed and quantified using both a commercially available cholesterol quantification kit and thin layer chromatography. Cholesterol depleted cells were activated using Lipopolysacharide (LPS) and Interferon gamma (IFN&#947;) and infected with antibody-opsonized Cryptococcus neoformans wild-type H99 cells at an effector-to-target ratio of 1:1. Infected cells were monitored after 2 hr of incubation with C. neoformans and their phagocytic index was calculated. Cholesterol depletion resulted in a significant reduction in the phagocytic index. The presented protocols offer a convenient method to mimic the initiation of the infection process in a laboratory environment and study the role of host lipid composition on infectivity.

Macrophage Cholesterol Depletion and Its Effect on the Phagocytosis of Cryptococcus neoformans

In this article, a protocol for infection of macrophages with Cryptococcus neoformans is described. Also, a method for sterol depletion from the macrophages is explained. These protocols provide a guide to study fungal infections in vitro and examine the role of sterols in such infections.

대 식세포 콜레스테롤 고갈과의 식균 작용에 미치는 영향<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em

Cryptococcosis is a life-threatening infection caused by pathogenic fungi of the genus Cryptococcus. Infection occurs upon inhalation of spores, which are ...

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal meningitis worldwide resulting in more than 625,000 deaths per year worldwide.&#160;Although electroporation has been developed for the transformation of plasmids in Cryptococcus, only&#160;biolistic&#160;delivery provides&#160;an effective means to transform&#160;linear&#160;DNA&#160;that can be integrated into the genome by homologous recombination.&#160;
Acetate has been shown to be a major fermentation product during cryptococcal infection, but the significance of this is not yet known.&#160;A bacterial pathway composed of the enzymes xylulose-5-phosphate/fructose-6-phosphate phosphoketolase (Xfp) and acetate kinase (Ack) is one of three potential pathways for acetate production in C. neoformans. Here, we demonstrate the biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding Ack fused to the fluorescent tag mCherry, into&#160;C. neoformans. We then confirm integration of the ACK-mCherry fusion into the&#160;ACK&#160;locus.

Biolistic Transformation of a Fluorescent Tagged Gene into the Opportunistic Fungal Pathogen Cryptococcus neoformans

Biolistic transformation is a method used to generate stable integration of DNA into the genome of the opportunistic pathogen Cryptococcus neoformans through homologous recombination. We will demonstrate biolistic transformation of a construct, which has the gene encoding acetate kinase fused to the fluorescent tag mCherry into&#160;C. neoformans.

편의적 곰팡이 병원균에 형광 태그 유전자의과 유전자 변형<em&gt; 크립토 콕 쿠스 네오 포르</em

The basidiomycete Cryptococcus neoformans, an invasive opportunistic pathogen of the central nervous system, is the most frequent cause of fungal ...

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the viral capsid (CA) core into the cytoplasm. Subsequently, the viral Reverse Transcriptase (RT), as part of a namesake nucleoprotein complex termed the Reverse Transcription Complex (RTC), converts the viral single-stranded RNA genome into a double-stranded DNA copy (vDNA). This leads to the biogenesis of another nucleoprotein complex, termed the pre-integration complex (PIC), composed of the vDNA and associated virus proteins and host factors. The PIC-associated viral integrase (IN) orchestrates the integration of the vDNA into the host chromosomal DNA in a temporally and spatially regulated two-step process. First, the IN processes the 3&#39; ends of the vDNA in the cytoplasm and, second, after the PIC traffics to the nucleus, it mediates integration of the processed vDNA into the chromosomal DNA. The PICs isolated from target cells acutely infected with HIV-1 are functional in vitro, as they are competent to integrate the associated vDNA into an exogenously added heterologous target DNA. Such PIC-based in vitro integration assays have significantly contributed to delineating the mechanistic details of retroviral integration and to discovering IN inhibitors. In this report, we elaborate upon an updated HIV-1 PIC assay that employs a nested real-time quantitative Polymerase Chain Reaction (qPCR)-based strategy for measuring the in vitro integration activity of isolated native PICs.

Measurement of In Vitro Integration Activity of HIV-1 Preintegration Complexes

This report describes an in vitro assay for measuring the human immunodeficiency virus type 1 (HIV-1) preintegration complex (PIC)-associated integration activity in the cytoplasmic extracts of acutely infected cells. The integration of PIC-associated HIV-1 DNA into heterologous target DNA is quantified by using a nested real-time polymerase chain reaction strategy.

측정<em&gt; 체외</em&gt; HIV-1 사전 통합 단지의 통합 활동

HIV-1 envelope proteins engage cognate receptors on the target cell surface, which leads to viral-cell membrane fusion followed by the release of the ...

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
First, a threshold image is generated based on intensity values uniquely calculated for each image. Then, circles are detected based on contrast between the object and background using the well-established Circle Hough Transformation (CHT) algorithm. Finally, the detected cell capsules and bodies are matched according to center coordinates and radius size, and data is exported to the user in a manageable spreadsheet.
The advantages of this technique are simple but significant. First, because these calculations are performed by an algorithm rather than a human both accuracy and reliability are increased. There is no decline in accuracy or reliability regardless of how many samples are analyzed. Second, this approach establishes a potential standard operating procedure for the Cryptococcus field instead of the current situation where capsule measurement varies by lab. Third, given that manual capsule measurements are slow and monotonous, automation allows rapid measurements on large numbers of yeast cells that in turn facilitates high throughput data analysis and increasingly powerful statistics.
The major limitations of this technique come from how the algorithm functions. First, the algorithm will only generate circles. While Cryptococcus cells and their capsules take on a circular morphology, it would be difficult to apply this technique to non-circular object detection. Second, due to how circles are detected the CHT algorithm can detect enormous pseudo-circles based on the outer edges of several clustered circles. However, any misrepresented cell bodies caught within the pseudo-circle can be easily detected and removed from the resulting data sets.
This technique is meant for measuring the circular polysaccharide capsules of Cryptococcus species based on India Ink bright field microscopy; though it could be applied to other contrast based circular object measurements.

Automated Measurement of Cryptococcal Species Polysaccharide Capsule and Cell Body

This technique describes an automated batch image processor designed to measure polysaccharide capsule and body radii. While initially designed for Cryptococcus neoformans capsule measurements the automated image processor can also be applied to other contrast based detection of circular objects.

Cryptococcal 종 다 당 류 캡슐과 세포 체의 자동화 된 측정

The purpose of this technique is to provide a consistent, accurate, and manageable process for large numbers of polysaccharide capsule measurements.
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A Method for the Measurement of Salivary Gland Function in Mice

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced saliva production. Similarly, saliva production is severely compromised in patients receiving radiation treatment for head and neck cancers. Rodent models, developed to mimic these clinical conditions, facilitate an understanding of the disease pathogenesis and allow for the development of new therapeutic strategies. Therefore, the ability to accurately, reproducibly, and repeatedly measure salivary gland function in animal models is critical. Building on procedures previously described in the literature, a method was developed that meets these criteria and was used to evaluate salivary gland function in mice. An additional advantage of this new method is that it is easily mastered, and has little inter-operator variation. Salivary gland function is evaluated as the amount (weight or volume) or rate (mL/min) of saliva produced in response to pilocarpine stimulation. The collected saliva is a good source for the analyses of protein content, immunoglobulin concentrations, and other biomolecules.

Salivary gland hypofunction is a frequent consequence of autoimmune disease and radiation therapy. Reproducible evaluation of salivary gland function in mouse models of these diseases is a technical challenge. Here, a simple method for accurate and reproducible measurement of saliva production in mice is described.

쥐에 있는 침 샘 기능의 측정 하는 방법

Patients with Sj&#246;gren&#39;s syndrome, an autoimmune disease affecting the exocrine glands, develop salivary gland inflammation and have reduced ...