이 프로토콜은 높은 특이성, 높은 감도, 또한 이소성, 동종, 소수성 및 소수성 분자를 포함하여 대사 산물의 많은 다른 클래스를 프로파일 수 있기 때문에 현재 사용 되는 효모 metabolomics에 비해 많은 장점을 갖는다. 이 프로토콜에 사용되는 담금질 방법은 모든 효소 반응을 중지하는 동시에 세포에서 대사 산물의 누출을 현저히 줄입니다. 이 프로토콜에 내장된 MS1 라이브러리는 다양한 MS2 실행에서 나온 것입니다.
야간 배양 후 섭씨 30도 및 분당 200회전 후, 배양의 밀리리터당 효모 세포의 수를 결정하고 플라스크 당 45밀리리터의 오토클레이브 YP 배지를 함유한 2개의 Erlenmeyer 플라스크각각에 살균된 20% 스톡 용액 5개를 추가합니다. 멸균 전달 파이펫을 사용하여 7번째 효모 세포에 5배 10번을 추가하고 분당 200회전에서 섭씨 30도에서 적어도 24시간 동안 효모 세포를 성장시다. 대사 산물 추출의 경우, 배양 후, 원심분리에 의해 효모 세포를 수집하고 신속하게 상체를 제거합니다.
튜브를 드라이 아이스에 놓고 영하 20도 의 밀리리터, 영하 20도의 밀리리터, 얼음 차가운 나노 순수 수의 1 밀리리터, 425 ~600 미크론 산 세척 유리 구슬 200 마이크로리터를 첨가합니다. 구슬이 추가되면 알루미늄 호일로 덮인 튜브를 리테이너가 있는 폼 튜브 홀더 키트에 넣고 4도에서 중간 속도로 30분 동안 샘플을 소용돌이쳐 대사 산물 추출을 용이하게 합니다. 다음으로, 중간 파편과 단백질 및 하부 유기 상으로부터 상부 수성 상의 분리를 허용하기 위해 시료를 원심분리하기 전에 얼음에 15분 동안 튜브를 배양한다.
마이크로피펫을 사용하여 상부 수성 상의 약 400마이크로리터를 영하 20도의 800 마이크로리터를 함유한 세척 및 라벨이 부착된 1.5 밀리리터 튜브로 이송합니다. 그런 다음 원심분리하고 액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광분석 분석전까지 0도 저장을 위해 표기된 질량 분광법 바이알로 상부의 800 마이크로리터를 전송한다. 추출된 대사 산물을 분리하려면 시료 바이알을 15분 동안 초음파처리한 다음 실온에서 10초 의 3개의 소용돌이가 있습니다.
소용돌이 후, 유리병을 액체 크로마토그래퍼의 우물 판에 넣고 분당 0.25 밀리리터의 유량과 웰 플레이트를 섭씨 0도로 섭씨 45도로 설정합니다. 그런 다음 테이블을 사용하여 분석을 위해 액체 크로마토그래피 그라데이션을 설정합니다. 분리 후, 가열된 전기스프레이 이온화가 장착된 질량 분광계에서 전기분무 양성 및 음극모두에서 10개의 마이크로리터 샘플 부피를 사용하여 수용성 대사산물을 식별하고 정량화한다.
분석의 끝에서, 적절한 화합물 분석 소프트웨어 프로그램에서 원시 데이터를 열고 질량 스펙트럼 단편화 라이브러리를 사용하여 분석에서 확인된 대사 산물에 주석을 달아 질량 스펙트럼에 일치한다. MS1 및 동위원소 패턴의 정확한 질량은 또한 온라인 데이터베이스를 사용하여 대사 산물의 부조를 허용하도록 식별 될 수있다. 그런 다음 데이터베이스 및 스펙트럼 라이브러리를 사용하여 원시 데이터의 MS2 스펙트럼을 검색합니다.
다음 날, 효모 세포를 담금질 한 후, 철저하게 ABC 버퍼의 15 밀리리터로 세포를 세척하고 원심 분리에 의해 세포를 수집합니다. 신선한 ABC 버퍼의 1 밀리리터에 펠릿을 다시 중단하고 세포에 프로피듐 요오드 용액의 500 마이크로 리터를 추가합니다. 소용돌이 당 10 초 동안 샘플을 세 번 소용돌이와 빛으로부터 보호 얼음에 10 분 동안 세포를 배양.
인큐베이션의 끝에서, 원심 분리에 의해 세포를 수집하고 세척 당 신선한 ABC 버퍼의 1 밀리리터로 세포를 세 번 세척. 마지막 세척 후, 신선한 ABC 버퍼의 300 마이크로 리터에 펠릿을 다시 중단하고 현미경 슬라이드에 결과 세포 현탁액의 10 마이크로 리터를 추가합니다. 형광 현미경을 사용하여 593 나노미터의 발산 파장및 636 나노미터의 방출 파장에 설정된 필터를 사용하여 세포의 차분 간섭 대비 및 형광 현미경 이미지를 캡처합니다.
그런 다음 적절한 이미지 분석 프로그램을 사용하여 밝은 필드 및 형광 이미지에서 세포의 총 세포 수를 계산하고 개별 세포에 대한 염색의 형광 강도를 결정합니다. 상기 변형된 세포 담금질 방법은 영하 40도에서 완충되지 않은 80%메탄올보다 플라즈마 막 및 세포벽에 현저히 낮은 손상을 일으킨다. 실제로, 거의 모든 세포가 수정된 방법을 사용하여 담금질을 실시하여 혈장 막과 세포벽이 손상되지 않는 효모 세포의 특징인 적색 형광 방출을 나타낸다.
대조적으로, 거의 모든 세포는 플라즈마 막과 세포벽이 현저히 손상된 효모 세포의 특징인 녹색 형광 방출을 표시한 섭씨 40도에서 비완충제 80%메탄올을 사용하여 담금질을 실시한다. 상기 변형된 세포 담금질 방법은 또한 영하 40도에서 완충되지 않은 80%메탄올보다 효모 세포로부터 의수용 성대사산물의 유의하를 유발한다. 수용성 대사산물 표준의 보존 시간 이동 값은 현저히 낮으며, 역상 열에 비해 zwitterionic 위상 컬럼의 경우 피크 셰이프가 상당히 선명합니다.
액체 크로마토그래피 탠덤 질량 분광법 방법의 또 다른 장점은 zwitterionic 상 열을 사용하여 다양한 구조적, 물리적 및 화학적 특성으로 다른 수용성 대사 산물을 효율적으로 분리하는 기능입니다. 어두울에 서 있는 공형요요함을 하고 중간 단계를 방해하지 않으면서 상층을 수집해야 합니다. MS2 스펙트럼 라이브러리의 부족으로 인해 MSP에 주석을 지정할 수 없는 경우 NMR을 사용하여 이 구조를 설명합니다.
