이 작품은 건강의 국가 학회에 의해 지원 되었다 (R21CA182197 J.O.), 랄 프 W.와 그레이스 M. Showalter 연구 신뢰, 그리고 퍼듀 농업 과학 경제 개발 (AgSEED) 프로그램에 대 한 확장에 의해. 생어 시퀀싱 데이터 P30 CA023168에서 지 원하는 퍼듀 유전체학 핵심 시설에 의해 인수 되었다. 메리 Witucki 퍼듀 대학 센터에서 암 연구 여름 학부 연구 프로그램 캐롤 카운티 암 협회 지원 지원 한다. Funders 연구 설계, 데이터 수집 및 분석, 결정 게시 또는 원고의 준비에 전혀 역할을 했다. 우리 감사 벤자민 카터, 런 닝, 그리고 테일러 Sabato 원고에 중요 한 피드백을 제공. 우리는이 작품의 생화학의 부 그리고 Zebrafish 관심과 우리의 zebrafish 식민지의 복지에 그들의 헌신에 대 한 퍼듀 대학에서 연구를 위한 센터 감사합니다. 마지막으로, 우리는 퍼듀 유전체학 핵심 시설, 감사 하 고 필립 산 미 구 엘의 기여에 대해서 NGS 서비스.

저자는 공개 없다.

이 프로토콜 CRISPR Cas9 기술을 사용 하 여 zebrafish 척추 동물 모델 시스템에서 유전자 녹아웃의 생산을 설명 합니다. 프로토콜의 수는 이전 zebrafish15,25,26,50,,5152CRISPR 중재 게놈 엔지니어링 수행을 설명 되었습니다. HMA와 여러 heterozygous 생선, 만들려고 간단, 경제적, 그리고 실험적으로 강력한 프로토콜의 NGS이이 프로토콜 수 간단 하 고 그러나 reproducibly 일관 된 실험 기법, 특히에서 결합 하 여 노력 이전에 빌드 CRISPR 중재 mutagenesis zebrafish에서 실험실 다양 한 훈련 및 경험, 뿐만 아니라 교육 연구소 직원과 직원에 대 한 적절 한입니다.
RNAs는이 프로토콜에 포함 된 설명서의 설계 및 합성에 대 한 권장 사항. 가이드 RNA 설계에에서 주요 고려 대상에서 효과의 최소화입니다. CRISPR-사용자가 사용자 친화적인 그래픽 인터페이스 모두 대상에 가이드의 활동 및 오프 대상 효과34, 의 기회를 예측 하는 계산 도구를 액세스할 수 있도록 여러 가지 예측 알고리즘 개발 되었습니다 35,36. 특정 zebrafish 시스템의 장점은 오프 대상 효과의 저하 속도 Cas9 배아에 주입 되며 따라서 식 과도, 있는 감소에서 대상 효과53을 마우스에 표시 되었습니다 때문에. 그럼에도 불구 하 고, 오프 대상 효과 zebrafish54에 입증 되었습니다. 한 오프 대상 효과 대 한 제어 방법은이 가이드는 매우 다른 오프 대상 사이트에 영향을 미칠 가능성이 있을 것 이라고 동일한 유전자를 대상으로 하는 두 개의 독립적인 가이드 RNAs에 의해 생성 된 표현 형 설립자 zebrafish에. 이 프로토콜에서 설명 되지 않은 대상 오프 효과 최소화 하기 위해 다른 방법을 높은 효율으로 수리 대상 DNA 단일 가닥 휴식을 생성 하는 돌연변이 Cas9의 사용 이다. 반대로 보완 서로 근접 내의 DNA 닉스 페어링 원하는 장소에서 효과적인 indel 형성에 결과 긴 고 오프 대상 효과55,56를 최소화 합니다.
-대상 효과의 다른 요금 이외, 다른 sgRNAs mutagenesis 원하는 대상57,,5859의 다른 비율을 가질 수 있습니다. 이 프로토콜의 heteroduplex 밴드 형성33,40을 사용 하 여 주어진된 sgRNA mutagenesis의 효율성을 분석 하 HMA를 사용 합니다. Heteroduplex 밴드와 젤 전기 이동 법을 사용 하 여 쉽게 해결할 수 있습니다 불일치를 포함 하는 PCR에서 생성 된 DNA 가닥의 교 잡에 의해 만들어집니다. 일반적으로 indel 형성을 측정 하는 데 사용 하는 다른 메서드와 달리 T7 endonuclease 등 분석 결과 또는 높은 해상도 분석25,26, HMA 잘라 일치 하지 않는 DNA, 비싼 효소를 필요 하지 않습니다.를 녹여 필요 하지 않습니다. PCR의 복잡 한 분석 곡선 녹아 있습니다. 중요 한 것은, 물고기와 함께 돌연변이 식별 하는 비용을 줄일 수 있는 노크 아웃 라인의 다음 생산에 필요한 수를 최소화 하기 위해 수 사관 수 또한 HMA를 사용 하 여 주입 된 인구에서 indel 형성의 높은 속도 확인 하는 원하는 특성.
CRISPR 기반 indels 생성의 비교적 쉽게 한 번에 여러 여러 유전자의 대립 유전자의 생성을 수 있습니다. 웹 기반 소프트웨어는 생어를 사용 하 여 heterozygous 물고기에서 단일 돌연변이의 분석에 사용할 수 있는 PCR 제품49의 연속. 경우 3 개 이상의 CRISPR 돌연변이 대립 유전자 분석은 NGS는 indel의 자연 하는 가능성이 더 비용 효과적이 접근으로 indel의 자연 하 수 오에 특징을 최대 50 다른 대립 유전자의 풀 후부 터 (참조 테이블의 재료)60,,6162. 이러한 경제 규모의 가능성이 학부 실험실 환경에서 특히 유용 것입니다.
요약 하자면,이 프로토콜 reproducibly 필요가 적은 성인 생선을 만들어 분석 성공적으로 관심의 돌연변이 체 대립 유전자를 식별 하는 (특히, sgRNA)에서 높은 품질 CRISPR 시 약을 생성 하기 위한 단계별 지침을 제공 하 또한 원하는 라인 생성의 비용과 시간을 줄일 수 있습니다. 중요 한 것은,이 프로토콜을 저렴 한 방식으로 돌연변이 제 브라를 생산 하는 한정 된 자원 가진 실험실에 의해 적용할 수 있는 설계 되었습니다. 또한, 우리는이 이렇게 학부생에 적합 하 고 따라서 교육 및 CRISPR 기반 게놈 편집 실습에 관심 있는 학부 학생 들의 교육 기회를 확장 발견 했다.

진핵생물에서 분자 기계의 보전 기초 연구를 위한 모형 유기 체를 사용 하 여 전원. 이러한 모델 시스템의 많은 타겟된 유전자 녹아웃 유전자 제품의 생물 학적 또는 질병 과정에의 기여 하 등 역 유전 접근의 사용을 촉진 한다. 제 브라와 같은 유기 체에서 유전자 중단 기법 역사적 DSBs1,2의 부정확 한 수리 결과 frameshift 돌연변이의 대상된 도입에 의존 했습니다. 보편적으로 거의 모든 세포 유형 및 유기 체에 존재 하는 두 경로 중 하나를 통해 DNA 병 변 복구는 DSB 게놈에 도입 하는 경우: 비 동종 끝 결합 (NHEJ)과 상 동 감독 수리 (HDR)3,4 . NHEJ 기계의 정확 하지 않은 자연 자주 다양 한 길이5,6,7,,89의 indels를 생성합니다. Frameshift 돌연변이 유전자의 코딩 순서에의 소개는 종종 유전자 작동 하지 않는 렌더링 조 숙한 정지 codon를 생성할 수 있습니다.
초기 게놈 엔지니어링 전략 홍보 indels zebrafish 포함 meganucleases, 아연 손가락 nucleases, 및 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 nucleases, nuclease 특정 게놈을 대상으로 DNA 단백질 상호 작용을 활용 하는 모두의 대상 DSB10,11,12,13,,1415를 도입. 그러나, 이러한 기술은 종종 힘들고 복잡 한 엔지니어링 nuclease을 대상으로 관심사의 DNA 순서를 생성 하는 데 필요한 때문에 적용 하기 어려운 있습니다. 이전 전략, 달리 CRISPR 기반 유전자 편집 하지 대상에 대 한 단백질 DNA 상호 작용에 의존지 않습니다. 대신, CRISPR 관련 (Cas) endonuclease 관심16,,1718,19의 게놈 사이트 대상 염기 기본 쌍 상호 작용을 사용 하는 RNA 가이드를 통해 감독 ,,2021. 설계는 RNA의 단순 그것을 대상에 대 한 상호 작용을 페어링 원하는 자료와 가이드는 상대적으로 쉽게 원하는 장소에 Cas endonuclease 대상입니다. 유형 II CRISPR 시스템 특히 널리 개발 되었습니다는 단일 다중 도메인 Ca nuclease (Cas9) endonuclease 활동을 자극 하는 DNA와 상호 작용을 필요로 하는의 사용을 포함 한 여러 유리한 기능 게놈 편집 응용 프로그램에 대 한 사용 하는 단일 가이드 RNA (sgRNA)의 동족 DNA 시퀀스18대상. 동족 sgRNA의 대상에 대 한 필요한 순서 요구 사항을 잘 이해19, 고 원하는 sgRNA 쉽게 체 외에 전사에 의해 생성 된. 단순 하 고 CRISPR/Cas9 접근의 견고성 크게 zebrafish 및 다양 한 다른 유기 체에 타겟된 유전자 조작 용이.
크게는 타겟된 게놈 CRISPR 기반 시 약 개발의 결과로 제 브라에서 편집을 수행 하는 향상 된 능력 증가 프로세스 중앙 신경의 개발 같은 척추 생물의 상징을 공부 하는 기회 시스템입니다. Zebrafish 게놈 orthologs를 뿐만 아니라 인간22질병와 관련 된 유전자의 84%는 인간 게놈에서 발견 단백질 코딩 유전자의 70% 포함 되어 있습니다. Zebrafish 개발 전시 역 유전자 연구에 그것의 사용을 강화 하는 몇 가지 주요 자질: 배아 큰 클러치에서 누워 있다, microinjection, 및 성인 zebrafish 의무가 유전자 조작 하는 어머니 로부터 외부 개발 3 개월, 원하는 라인23의 급속 한 전파에 대 한 허용에 의해 성적으로 성숙.
수많은 프로토콜 사용할 수 있는 다양 한 생성 하 고 식별 zebrafish24,25,26,,2728,29 CRISPR 파생 indels 접근법을 설명 하는 ,,3031. 그러나,이 절차의 많은 시간 집중, 고가의 장비에 대 한 액세스를 필요 되며 제한 된 전문 기술 연구소에 대 한 일 수 있다. 여기 설명 하는 단계는 간단 하 고 강력 하 고 경제적인 CRISPR/Cas9-전략 엔지니어 zebrafish 녹아웃 라인을 제공 합니다. SgRNAs DNA oligonucleotides (oligos)를 사용 하 여 합성 하는 매우 효율적인 키트를 사용 하 여가이 프로토콜에 설명 합니다, 그리고 되었습니다 다른 접근 비슷합니다 이전32설명. 설명된 프로토콜 포함 두 단계 특히 크게 라인 CRISPR 돌연변이의 분석을 단순화 하는: 쉽게 결정 게놈 수정의 존재 및 시퀀싱 분석의 PCR 기반 HMA33 의 단계별 사용 heterozygous zebrafish 신속 하 고 쉽게 여러 indels 경제적인 방식으로의 성격을 결정 하. 또한, 단계별 지침은 강력한 선택, 믿을 수 있는 생산 및 가이드 RNAs의 주입에 대 한 포함 되어 있습니다. 여기에 제공 된 단계에는 다양 한 전문 실험실 인원 zebrafish에 유전자 녹아웃의 식별을 가능 하 게 강력 하 고 상대적으로 저렴 한 프로토콜을 예증 하다.

<table><tbody><tr><td>CRISPOR</td><td></td><td></td><td>sgRNA analysis software. http://crispor.tefor.net/</td></tr><tr><td>Breaking-Cas</td><td></td><td></td><td>sgRNA analysis software. https://omictools.com/breaking-cas-tool</td></tr><tr><td>ChopChop</td><td></td><td></td><td>sgRNA analysis software. https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/</td></tr><tr><td>Primer 3</td><td></td><td></td><td>PCR primer design. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/</td></tr><tr><td>Rnase free technique</td><td></td><td></td><td>http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf</td></tr><tr><td>RNase-free water</td><td>Any brand</td><td></td><td>Synthesis of guide RNAs. Thermo Fisher and Qiagen both carry suitable water.</td></tr><tr><td>Rnase-free ethanol</td><td>Any brand</td><td></td><td>Molecular biology grade ethanol is Rnase free. Fischer, VWR sell suitable ethanol.</td></tr><tr><td>Cas9 Protein</td><td>PNA Bio</td><td>CP01</td><td>Cas9 protein with nuclear localization signal.</td></tr><tr><td>Target specific oligos</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td>Synthesize guide RNAs.</td></tr><tr><td>PCR primers flanking guide RNA cut site</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td>Use for heteroduplex analysis, 100-300 bp product.</td></tr><tr><td>PCR primers flanking guide RNA cut site</td><td>Integrated DNA Technologies (IDT)</td><td></td><td>Use for sequencing CRISPR-alleles,300-600 bp product recommended.</td></tr><tr><td>EnGen sgRNA Synthesis Kit</td><td>New England BioLabs</td><td>E3322</td><td>In vitro transccribe guide RNAs.</td></tr><tr><td>10X TBE</td><td>Thermo Fisher</td><td>B52</td><td>RNase-free buffer for electrophoresis of nucleic acids.</td></tr><tr><td>6X Load Dye</td><td>New England BioLabs</td><td>B7025S</td><td>Loading DNA for electropheresis.</td></tr><tr><td>5M Ammonium acetate</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9071</td><td>Clean up reagent for purification of guide RNAs.</td></tr><tr><td>Ethanol (200 proof, nuclease-free)</td><td>Any brand</td><td></td><td>Clean up reagent for purification of guide RNAs. Molecular grade materials are RNase free.</td></tr><tr><td>Nuclease-free Water</td><td>Any brand</td><td></td><td>For synthesis and purification of guide RNAs.</td></tr><tr><td>RNase away</td><td>Thermo Fisher</td><td>10328011</td><td>Eliminates RNase contamination from surfaces, equipment, glassware.</td></tr><tr><td>DNA Ladder, 100 bp</td><td>New England BioLabs</td><td>N0467S</td><td>Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.</td></tr><tr><td>DNA Ladder, 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N0552S</td><td>Molecular weight standards for gel electrophoresis of DNA.</td></tr><tr><td>RNA Ladder</td><td>New England BioLabs</td><td>N0364S</td><td>Single strand RNA marker to verify that full length sgRNA has been synthesized</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo Fisher</td><td>17919</td><td>Casting polyacrylamide gel.</td></tr><tr><td>Ammonium persulfate (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>Casting polyacrylamide gel.</td></tr><tr><td>40% Polyacrylamide (19:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0154</td><td>Casting denaturing polyacrylamide gel.</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-100G</td><td>Casting denaturing polyacrylamide gel.</td></tr><tr><td>RNA Gel Loading Dye (2x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0641</td><td>Loading guide RNA onto denaturing gel for electrophoresis.</td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>Visualization of nucleic acids.</td></tr><tr><td>SYBER Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>S7563</td><td>Alternate method to ethidium bromide for detection of dsDNA in agarose or polyacrylamide gels.</td></tr><tr><td>Microcentrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>RNA clean up, PCR purification.</td></tr><tr><td>MyTaq Polymerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21105</td><td>For amplification of DNA using PCR.</td></tr><tr><td>Thermocycler</td><td>Any brand</td><td></td><td>PCR amplification.</td></tr><tr><td>Spectrophotometer</td><td>Any brand</td><td></td><td>NanoDrop or related product to quantify the amout of DNA/RNA.</td></tr><tr><td>E3 embryo media</td><td>Made in house</td><td></td><td>Media for raising embryos and making injeciton plate. Recipe: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449</td></tr><tr><td>Methylene Blue</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>Added to 1x E3 media to prevent fungal growth on embryos.</td></tr><tr><td>Petri dish</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB0875711Z</td><td>Store embryos, cast injection plate.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Denville</td><td>CA3510-8</td><td>Casting injection plate, agarose gels.</td></tr><tr><td>Microinection mold</td><td>Adaptive Science Tools</td><td>TU-1</td><td>To create wells to hold embryos during injection.</td></tr><tr><td>Phenol Red</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290&amp;nbsp;</td><td>Dye for visualization of injection.</td></tr><tr><td>Mineral Oil</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904-5ML</td><td>To calibrate needle injection volume.</td></tr><tr><td>Transfer pipettes</td><td>Any brand</td><td></td><td>Moving embryos.</td></tr><tr><td>Razor blade</td><td>Thermo Fisher</td><td>11295-10</td><td>Cutting injection needle, tail clipping adult fish.</td></tr><tr><td>Incubator</td><td>Any brand</td><td></td><td>Maintaining embryos at 28.5 &lt;sup&gt;o&lt;/sup&gt;C.</td></tr><tr><td>Verticle pipette puller</td><td>David Kopf Instruments</td><td>700C</td><td>Geneate needles for injection. Additional needle pulling instructions: http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long</td></tr><tr><td>Capillary tubes</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Geneate needles for injection.</td></tr><tr><td>Microloader tips</td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Load solution into injection needles.</td></tr><tr><td>Microinjector</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV 820</td><td>Injecting embryos.</td></tr><tr><td>Disecting microscope</td><td>Leica</td><td></td><td>Injecting embryos.</td></tr><tr><td>30% Polyacylamide (29:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0156</td><td>Heteroduplex gel casting.</td></tr><tr><td>MS-222 (Tricaine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td>Anesthetize zebrafish for tail clipping and gDNA extraction from embryos. Recipe: https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</td></tr><tr><td>Microwave</td><td>Any brand</td><td></td><td>Casting injection plate, agarose gels.</td></tr><tr><td>Scale</td><td>Any brand</td><td></td><td>Casting injection plate, agarose gels.</td></tr><tr><td>Gloves</td><td>Any brand</td><td></td><td>For all aspects of the protocol.</td></tr><tr><td>N2</td><td>Any brand</td><td></td><td>To expell liquid from the capillary for embryo injection.</td></tr><tr><td>1,000 &amp;micro;L&amp;nbsp; tips</td><td>Any brand</td><td></td><td>For all aspects of the protocol.</td></tr><tr><td>200 &amp;micro;L tips</td><td>Any brand</td><td></td><td>For all aspects of the protocol.</td></tr><tr><td>10 &amp;micro;L tips</td><td>Any brand</td><td></td><td>For all aspects of the protocol.</td></tr><tr><td>PCR strip tubes</td><td>Any brand</td><td></td><td>For all aspects of the protocol.</td></tr><tr><td>Micropipettes</td><td>Any brand</td><td></td><td>For all aspects of the protocol.</td></tr><tr><td>NGS Sequencing platform: Wideseq</td><td></td><td></td><td>If your institution does not offer this servicce visit: https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (External cost: $35).</td></tr><tr><td>Software for sequence analysis</td><td></td><td></td><td>For Sanger sequencing of heterozygous fish. Visit: http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/</td></tr><tr><td>Software for sequence analysis</td><td></td><td></td><td>SnapGene Viewer, Sequence Scanner for analysis of NGS sequencing.</td></tr></tbody></table>

efficient production and identification of crispr/cas9-generated gene knockouts in the model system danio rerio

클러스터, 정기적으로 interspaced, 짧은, 구조 반복의 연쇄 상 구 균 pyogenes (CRISPR) 시스템의 다양 한 유전자 수정을 빠르게 생성 하는 사용자 정의 플랫폼의 개발 활성화 생물, zebrafish를 포함 하 여 CRISPR 기반 게놈 편집 사용 하 여 단일 가이드 RNA (sgRNA)의 관심, genomic DNA (gDNA) 대상에 CRISPR 관련 (Cas) endonuclease 대상 Cas endonuclease 두 배 물가 틈 (DSB)을 생성. 삽입 또는 삭제 (indels) 오류가 메커니즘 리드에 의해 DSBs의 수리. 이 종종 소개 함으로써 단백질 null 대립 유전자를 만드는 코딩 시퀀스 내에서 조 숙한 정지 codon frameshift 돌연변이 일으킬 수 있습니다. CRISPR 기반 게놈 엔지니어링만 몇 분자 구성 요소를 필요로 하 고 쉽게 microinjection에 의해 zebrafish 태아에 도입. 이 프로토콜 zebrafish microinjection에 대 한 시 약 CRISPR를 생성 하 고 CRISPR 수정 유전자의 생식 전송 전시 물고기를 식별 하는 데 사용 하는 방법을 설명 합니다. 이러한 방법은 sgRNAs, microinjection CRISPR 시 약의 indels heteroduplex 이동성 분석 결과 (HMA), 및 특성화는 indels의 PCR 기반 메서드를 사용 하 여 대상 사이트에 유도의 식별에 생체 외 녹음 포함 낮은 처리량 및 강력한 차세대 시퀀싱 (NGS)를 사용 하 여-기반 접근 heterozygous 물고기에서 수집 하는 여러 PCR 제품을 분석할 수 있습니다. 이 프로토콜은 필요한 물고기의 수와 종류의 분석을 수행 하는 데 필요한 장비를 최소화 하기 위해 유선형의. 또한,이 프로토콜은 되도록 설계 되었습니다 사용에 대 한 의무가 학부생, CRISPR 기반 수행에 관심이 있는 연구 그룹에 의해 경제적으로 고용 될이 강력한 도구를 사용 하면 포함 하는 경험의 모든 수준의 실험실 개인에 의해 제 브라에 게놈 수정입니다.

이 프로토콜에서 설명 하는 실험 방법의 제 브라 노크 아웃 라인 CRISPR/Cas9 기술을 사용 하 여 효율적이 고 비용 효율적인 생산을 위한 수 있습니다. 다음 수치 해석 및이 프로토콜을 사용 하 여 얻은 결과의 문제 해결이 문서에 포함 되었습니다. 다음 성공적인 생산 그리고 CRISPR 시 약의 microinjection, zebrafish 태아 명백한 고기 및 indel 형성 HMA를 사용 하 여 분석할 수 있습니다. CRISPR 실험의 성공을 시각화 하는 유용한 컨트롤은 안료 생산 유전자를 대상으로 1.5 단계에서 설명 하는 sgRNA 사용 하 여 tyrosinase. Cas9 유도 indel tyrosinase 에서 염색의 손실에 결과 형성과 48에 의해 쉽게 득점 hpf (그림 1). 주입에 성공 했다에 대 한 CRISPR 시 약의 그 준비를 위해 또 다른 유용한 제어는 전체 길이 확인 하는 것입니다 (120 nt) sgRNA 변성 polyacrylamide 젤 (그림 2, 레인 1와 2)를 사용 하 여 합성 되어 있다. RNA를 타락 하는 경우 그것은 나타날 수 있습니다 얼룩, 예를 들어 레인 3 (그림 2)은 저하 RNA 사출에 적합 하지 않습니다.
Tyrosinase, 같은 명백한 고기 초래 하지 않는 CRISPR Cas9 대상 유전자의 indel 형성 주파수 분석을 HMA 분석은 간단 하 고 신뢰할 수 있는 방법입니다. sgRNA/Cas9 heteroduplex 밴드의 형성 및 homoduplex 밴드 (그림 4)의 강렬의 감소에서 HMA 결과 사용 하 여 분석 하는 배아를 주입. Heteroduplex 밴드의 존재는 더 잠재적인 설립자 물고기 (그림 4 및 그림 5), 성인 설립자 ( 의 생식 전송 효율을 분석 하 고 microinjected 배아에서 식별 하기 위해이 프로토콜에 활용 그림 6), 그리고는 indel heterozygous F1 물고기 (그림 7)의 존재를 확인 하. Heterozygous 물고기는 indel을 포함 하는 후보로 NGS는 indel의 성격을 파악 하 고 조 숙한 정지 codon 대상 유전자의 코딩 지구에 존재 여부를 확인 하는.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig1.jpg"> 그림 1 : Zebrafish 태아 전시 tyrosinase 1 셀 단계에서 대상으로 하는 sgRNA와 함께 주입 했을 때 안료 결함. (A) 야생-타입, uninjected 48에 배아 hpf와 (B) 주입 48에서 배아 hpf. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig1large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig2.jpg"> 그림 2 : 합성 키트를 사용 하 여 sgRNA의 녹음 방송 생체 외에서 . Oligos는 sgRNA 종합 키트 지침에 따르면 녹음 방송 생체 외에서 를 사용 하 여 합성 했다. 500 ng RNA의 설명 된 대로 요소/페이지 젤에 실행 했다. sgRNA 레인 1과 2에 로드 밴드 전체 길이 그대로 120 nt RNA에 해당 표시 됩니다. 레인 3에 sgRNA 사출에 적합 하지 않습니다 저하 RNA 샘플을 보여 줍니다.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig3.jpg"> 그림 3 : 24 hpf 주입 태아의 건강의 비교. 24 생활 배아 (A) 개발 hpf, (B) 개발 중단은 배아에서 쉽게 구별 된다. (B)를 닮은 나 크게 있는 태아 척추 곡률 등 (a) 기능을 변경 또는 머리를 변경 및 눈 개발 접시에서 제거 되어야 합니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig3large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig4.jpg"> 그림 4 : SgRNA Cas9의 Heteroduplex 이동성 분석 결과 zebrafish 태아 microinjected. 샘플 당 5 배아의 풀 72에서 수집 된 hpf 및 gDNA 추출 되었다. Heteroduplex 분석 수행, 설명 된 대로 샘플 500 동등 하 게 로드 된 DNA의 ng. 레인: M = 100 bp 마커; 1 = uninjected 제어; 2 사출 샘플 1; = 3 = 사출 샘플 2. 예상 밴드 크기 98 = 혈압.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig5.jpg"> 그림 5 : Heteroduplex 이동성 분석 결과 gDNA 성인 CRISPR 주입 zebrafish의 꼬리에서 추출의. 배아는 sgRNA와 Cas9 단백질 주입 했다 성인 (3 개월)로 성장 했다. 물고기 B와 C heteroduplex 악대를 전시 하 고 이후에 생식 전송 indels;을 식별 하기 위해 사육 했다 긍정적인 heteroduplex 밴드를 전시 하지 않습니다 때문에 물고기 A는 이후 분석에 사용 되지 않습니다. 레인: 1 야생-타입 컨트롤; = 2 = 물고기; 3 = 물고기 B; 4 물고기 C. 예상 밴드 크기 = 98 = bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig5large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig6.jpg"> 그림 6 : Heteroduplex 이동성 분석 결과 단일 배아 전송 생식 indels를 식별 하는 야생-타입 물고기 F0 CRISPR 주입 제 브라를 번 식에 의해 생성 된의. Zebrafish 성관계 했다 F1 배아 72 h. 단일 배아에 대 한 성장 수집 그리고 heteroduplex 분석 수행 설명 된 대로. 레인: 1 야생-타입 컨트롤; = 2-10 차선 당 하나의 F1 배아를 =. 이 젤 10 중 7 배아는 indel의 70%의 생식 전송 속도 나타내는 긍정적인 heteroduplex 밴드 표시 보여줍니다. 밴드 크기 예상 = 98 bp. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig6large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig7.jpg"> 그림 7 : Heteroduplex 이동성 분석 결과 성인 F1 zebrafish 꼬리 클립의. 성인 F1 물고기 HMA indels를 식별 하 여 득점 했다. 긍정적인 heteroduplex 밴드 전시 물고기가 했다 PCR 증폭 및 넓은 시퀀싱 분석에 대 한 돌연변이의 특성을 확인 하. (A) 차선: 1 야생-타입 컨트롤; = 2 = 물고기 (4 혈압 삭제, 1 bp 불일치). (B)이이 F1 생선과 같은 설립자에서 확인 되었다 아직 다른 heteroduplex 패턴화, 하나의 설립자에서 여러 수정 된 대립 유전자의 생식 전송을 나타내는 표시. 레인: 1 야생-타입 컨트롤; = 2 물고기 (4 bp 삽입, 7 bp 불일치), B = 3 = 물고기 C (4 혈압 삭제, 4 혈압 불일치). 각 이러한 indels NGS 정한 대상 유전자의 코딩 순서에서 조 숙한 정지 codon를 만들었습니다. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig7large.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.</a>

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Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

타겟된 게놈 모델 시스템 Danio rerio (zebrafish)에서 편집 CRISPR-기반 접근의 출현에 의해 크게 촉진 되어 있다. 여기, 우리 생성 및 heteroduplex 이동성 분석 결과 통합 하는 CRISPR에서 파생 된 말도 대립 유전자의 식별 및 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 돌연변이의 id에 대 한 간소화 된, 강력한 프로토콜을 설명 합니다.

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

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Research

JoVE Journal

Genetics

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

21.8K 조회수.  Purdue University. 타겟된 게놈 모델 시스템 Danio rerio (zebrafish)에서 편집 CRISPR-기반 접근의 출현에 의해 크게 촉진 되어 있다. 여기, 우리 생성 및 heteroduplex 이동성 분석 결과 통합 하는 CRISPR에서 파생 된 말도 대립 유전자의 식별 및 차세대 시퀀싱을 사용 하 여 돌연변이의 id에 대 한 간소화 된, 강력한 프로토콜을 설명 합니다.

비디오: Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Using a Fluorescent PCR-capillary Gel Electrophoresis Technique to Genotype CRISPR/Cas9-mediated Knockout Mutants in a High-throughput Format

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play in the functioning of cells and whole organisms. This cause has been tremendously aided by the recent introduction of the CRISPR/Cas9 system-a versatile tool that allows researchers to manipulate the genome and transcriptome in order to, among other things, knock out, knock down, or knock in genes in a targeted manner. For the purpose of knocking out a gene, CRISPR/Cas9-mediated double-strand breaks recruit the non-homologous end-joining DNA repair pathway to introduce the frameshift-causing insertion or deletion of nucleotides at the break site. However, an individual guide RNA may cause undesirable off-target effects, and to rule these out, the use of multiple guide RNAs is necessary. This multiplicity of targets also means that a high-volume screening of clones is required, which in turn begs the use of an efficient high-throughput technique to genotype the knockout clones. Current genotyping techniques either suffer from inherent limitations or incur high cost, hence rendering them unsuitable for high-throughput purposes. Here, we detail the protocol for using fluorescent PCR, which uses genomic DNA from crude cell lysate as a template, and then resolving the PCR fragments via capillary gel electrophoresis. This technique is accurate enough to differentiate one base-pair difference between fragments and hence is adequate in indicating the presence or absence of a frameshift in the coding sequence of the targeted gene. This precise knowledge effectively precludes the need for a confirmatory sequencing step and allows users to save time and cost in the process. Moreover, this technique has proven to be versatile in genotyping various mammalian cells of various tissue origins targeted by guide RNAs against numerous genes, as shown here and elsewhere.

The genotyping technique described here, which couples fluorescent polymerase chain reaction (PCR) to capillary gel electrophoresis, allows for high-throughput genotyping of nuclease-mediated knockout clones. It circumvents limitations faced by other genotyping techniques and is more cost effective than sequencing methods.

CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

The development of programmable genome-editing tools has facilitated the use of reverse genetics to understand the roles specific genomic sequences play ...

연구

유전학

Selection-dependent and Independent Generation of CRISPR/Cas9-mediated Gene Knockouts in Mammalian Cells

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide RNA (sgRNA) that confers specificity, the Cas9 protein cleaves both DNA strands at the targeted locus. The DNA break can trigger either non-homologous end joining (NHEJ) or homology directed repair (HDR). NHEJ can introduce small deletions or insertions which lead to frame-shift mutations, while HDR allows for larger and more precise perturbations. Here, we present protocols for generating knockout cell lines by coupling established CRISPR/Cas9 methods with two options for downstream selection/screening. The NHEJ approach uses a single sgRNA cut site and selection-independent screening, where protein production is assessed by dot immunoblot in a high-throughput manner. The HDR approach uses two sgRNA cut sites that span the gene of interest. Together with a provided HDR template, this method can achieve deletion of tens of kb, aided by the inserted selectable resistance marker. The appropriate applications and advantages of each method are discussed.

Recent advances in the ability to genetically manipulate somatic cell lines hold great potential for basic and applied research. Here, we present two approaches for CRISPR/Cas9 generated knockout production and screening in mammalian cell lines, with and without the use of selectable markers.

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

The CRISPR/Cas9 genome engineering system has revolutionized biology by allowing for precise genome editing with little effort. Guided by a single guide ...

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene function. Gene knockout has been used to study these gene functions in vivo. The clustered regularly interspaced short palindromic repeats/CRISPR associated protein 9 (CRISPR/Cas9) system is a powerful tool used to edit genomic DNA sequences to alter gene function. While the traditional approach has been to introduce CRISPR/Cas9 mRNA into the single cell embryos through microinjection, this can be a slow and inefficient process in catfish. Here, a detailed protocol for microinjection of channel catfish embryos with CRISPR/Cas9 protein is described. Briefly, eggs and sperm were collected and then artificial fertilization performed. Fertilized eggs were transferred to a Petri dish containing Holtfreter's solution. Injection volume was calibrated and then guide RNAs/Cas9 targeting the toll/interleukin 1 receptor domain-containing adapter molecule (TICAM 1) gene and rhamnose binding lectin (RBL) gene were microinjected into the yolk of one-cell embryos. The gene knockout was successful as indels were confirmed by DNA sequencing. The predicted protein sequence alterations due to these mutations included frameshift and truncated protein due to premature stop codons.

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

A simple and efficient microinjection protocol for gene editing in channel catfish embryos using the CRISPR/Cas9 system is presented. In this protocol, guide RNAs and Cas9 protein were microinjected into the yolk of one-cell embryos. This protocol has been validated by knocking out two channel catfish immune-related genes.

The complete genome of the channel catfish, Ictalurus punctatus, has been sequenced, leading to greater opportunities for studying channel catfish gene ...

Highly Efficient Gene Disruption of Murine and Human Hematopoietic Progenitor Cells by CRISPR/Cas9

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. Complete gene ablation in HSCs required the generation of knockout mice from which HSCs could be isolated, and gene ablation in primary human HSCs was not possible. Viral transduction could be used for knock-down approaches, but these suffered from variable efficacy. In general, genetic manipulation of human and mouse hematopoietic cells was hampered by low efficiencies and extensive time and cost commitments. Recently, CRISPR/Cas9 has dramatically expanded the ability to engineer the DNA of mammalian cells. However, the application of CRISPR/Cas9 to hematopoietic cells has been challenging, mainly due to their low transfection efficiencies, the toxicity of plasmid-based approaches and the slow turnaround time of virus-based protocols.
A rapid method to perform CRISPR/Cas9-mediated gene editing in murine and human hematopoietic stem and progenitor cells with knockout efficiencies of up to 90% is provided in this article. This approach utilizes a ribonucleoprotein (RNP) delivery strategy with a streamlined three-day workflow. The use of Cas9-sgRNA RNP allows for a hit-and-run approach, introducing no exogenous DNA sequences in the genome of edited cells and reducing off-target effects. The RNP-based method is fast and straightforward: it does not require cloning of sgRNAs, virus preparation or specific sgRNA chemical modification. With this protocol, scientists should be able to successfully generate knockouts of a gene of interest in primary hematopoietic cells within a week, including downtimes for oligonucleotide synthesis. This approach will allow a much broader group of users to adapt this protocol for their needs.

A protocol for fast CRISPR/Cas9-mediated gene disruption in mouse and human primary hematopoietic cells is described in this article. Cas9-sgRNA ribonucleoproteins are introduced via electroporation with sgRNAs generated through in vitro transcription and commercial Cas9. High editing efficiencies are achieved with limited time and financial cost.

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

Advances in the hematopoietic stem cell (HSCs) field have been aided by methods to genetically engineer primary progenitor cells as well as animal models. ...

Manipulation of Gene Function in Mexican Cavefish

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, including eye degeneration, albinism, sleep loss, hyperphagia, and sensory processing. Species of cavefish from around the world display a convergent evolution of morphological and behavioral traits due to shared environmental pressures between different cave systems. Diverse cave species have been studied in the laboratory setting. The Mexican tetra, Astyanax mexicanus, with sighted and blind forms, has provided unique insights into biological and molecular processes underlying the evolution of complex traits and is well-poised as an emerging model system. While candidate genes regulating the evolution of diverse biological processes have been identified in A. mexicanus, the ability to validate a role for individual genes has been limited. The application of transgenesis and gene-editing technology has the potential to overcome this significant impediment and to investigate the mechanisms underlying the evolution of complex traits. Here, we describe a different methodology for manipulating gene expression in A. mexicanus. Approaches include the use of morpholinos, Tol2 transgenesis, and gene-editing systems, commonly used in zebrafish and other fish models, to manipulate gene function in A. mexicanus. These protocols include detailed descriptions of timed breeding procedures, the collection of fertilized eggs, injections, and the selection of genetically modified animals. These methodological approaches will allow for the investigation of the genetic and neural mechanisms underlying the evolution of diverse traits in A. mexicanus.&#160;

We describe approaches for the manipulation of genes in the evolutionary model system Astyanax mexicanus. Three different techniques are described: Tol2-mediated transgenesis, targeted manipulation of the genome using CRISPR/Cas9, and knockdown of expression using morpholinos. These tools should facilitate the direct investigation of genes underlying the variation between surface- and cave-dwelling forms.

멕시코 Cavefish에서 유전자 기능 조작

Cave animals provide a compelling system for investigating the evolutionary mechanisms and genetic bases underlying changes in numerous complex traits, ...

Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants

Early development depends on a pool of maternal factors incorporated into the mature oocyte during oogenesis that perform all cellular functions necessary for development until zygotic genome activation. Typically, genetic targeting of these maternal factors requires an additional generation to identify maternal-effect phenotypes, hindering the ability to determine the role of maternally-expressed genes during development. The discovery of the biallelic editing capabilities of CRISPR-Cas9 has allowed screening of embryonic phenotypes in somatic tissues of injected embryos or "crispants," augmenting the understanding of the role zygotically-expressed genes play in developmental programs. This article describes a protocol that is an extension of the crispant method. In this method, the biallelic editing of germ cells allows for the isolation of a maternal-effect phenotype in a single generation, or "maternal crispants." Multiplexing guide RNAs to a single target promotes the efficient production of maternal crispants, while sequence analysis of maternal crispant haploids provides a simple method to corroborate genetic lesions that produce a maternal-effect phenotype. The use of maternal crispants supports the rapid identification of essential maternally-expressed genes, thus facilitating the understanding of early development.

Early development is dependent on maternally-inherited products, and the role of many of these products is currently unknown. Herein, we described a protocol that uses CRISPR-Cas9 to identify maternal-effect phenotypes in a single generation.

모성 크리스펀트를 사용한 초기 발달에서 모계 발현 유전자의 역할 결정

Early development depends on a pool of maternal factors incorporated into the mature oocyte during oogenesis that perform all cellular functions necessary ...

Screening Sperm for the Rapid Isolation of Germline Edits in Zebrafish

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging model systems. CRISPR-Cas genome editing systems use a synthetic guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to specific genomic DNA loci, where the Cas endonuclease generates a double-strand break. The repair of double-strand breaks by intrinsic error-prone mechanisms leads to insertions and/or deletions, disrupting the locus. Alternatively, the inclusion of double-stranded DNA donors or single-stranded DNA oligonucleotides in this process can elicit the inclusion of precise genome edits ranging from single nucleotide polymorphisms to small immunological tags or even large fluorescent protein constructs. However, a major bottleneck in this procedure can be finding and isolating the desired edit in the germline. This protocol outlines a robust method for screening and isolating germline mutations at specific loci in Danio rerio (zebrafish); however, these principles may be adaptable in any model where in vivo sperm collection is possible.

CRISPR-Cas technologies have revolutionized the field of genome editing. However, finding and isolating the desired germline edit remains a major bottleneck. Therefore, this protocol describes a robust method for quickly screening F0 CRISPR-injected zebrafish sperm for germline edits using standard PCR, restriction digest, and gel electrophoresis techniques.

제브라피쉬에서 생식계열 편집의 신속한 분리를 위한 정자 스크리닝

The advent of targeted CRISPR-Cas nuclease technologies has revolutionized the ability to perform precise genome editing in both established and emerging ...

<meta charset="utf8"></head><body>CRISPR/Cas9 Knock-In을 사용한 제브라피시 유충의 형광 단백질 태깅

Fluorescence Labeling to Visualize Low-Expressed Proteins in Zebrafish

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in vivo imaging due to its transparency during the early developmental stage. Here, we provide a detailed protocol for performing high-efficiency fluorescence gene KI, rapid screening for KI founders, and low-abundance protein tracing in zebrafish larvae, which will lay a critical foundation for subsequent physio-pathological studies in zebrafish. The current protocol includes complete steps for the sgRNA design for the gene of interest, sgRNA in vitro transcription, Cas9 mRNA in vitro transcription, in vivo sgRNA screen for the one with the highest efficiency, donor plasmid design and construction, microinjection in zebrafish larvae, KI founder screen and zebrafish live imaging. Critical steps, troubleshooting tips, quality control methods, and advantages and applications of this protocol are included and discussed. This protocol assures quick and accurate results at a low cost and has been validated by multiple trials.

<meta charset="utf8"></head><body>제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

Here, we present a protocol to label proteins with a fluorescence protein tag in zebrafish larvae, a newly developed and modified in vivo system especially useful for visualizing low-abundance proteins in zebrafish.

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

CRISPR/Cas9-mediated knock-in (KI) technology allows for easier fluorescent-protein tagging in zebrafish (Danio rerio), a preferred model organism for in ...

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

요약

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CRISPR을 유전자형하기 위해 형광 PCR-모세관 젤 전기 영동 기술을 사용 / 높은 처리량 형식으로 녹아웃 돌연변이를 Cas9 매개

포유류 세포에서 CRISPR / Cas9 매개 유전자 knockouts의 선택 의존 및 독립적 생성

Microinjection of CRISPR/Cas9 Protein into Channel Catfish, Ictalurus punctatus, Embryos for Gene Editing

CRISPR/Cas9에 의해 Murine 인간과 조 혈 조상 세포의 고효율 유전자 장애

멕시코 Cavefish에서 유전자 기능 조작

모성 크리스펀트를 사용한 초기 발달에서 모계 발현 유전자의 역할 결정

제브라피쉬에서 생식계열 편집의 신속한 분리를 위한 정자 스크리닝

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링

제브라피시에서 저발현 단백질을 시각화하기 위한 형광 라벨링