동굴 동물은 다양한 형태학, 발달 및 행동 특성을 조사하기위한 강력한 시스템을 제공합니다. 그러나 이 모형 시스템을 설치하는 한계 요인의 한은 우리가 유전자 기능을 조작하는 것을 허용하는 유전 공구의 부족입니다. 여기에서 우리는 멕시코 동굴 물고기, Astyanax 멕시코에서 유전자 기능을 조작하는 세 가지 다른 접근 법을 보여줍니다.
이 공구는 표면 물고기와 동굴 물고기 사이 자연적인 변이의 근본적인 유전자의 조사를 가능하게 하고 표현형과 어떻게 관련되는지. 베다니 스탈, 내 실험실에서 재능있는 postdoc이 절차를 보여줍니다. 시술을 시작하기 전에, 물고기 시스템 물에 용해 된 따뜻한 3 %의 아가로즈로 100 밀리리터 페트리 접시를 채우고 조심스럽게 45도 각도로 아가로즈에 계란 사출 몰드를 넣고 곰팡이 아래에 공기를 포획하지 않도록 아가로즈로 천천히 낮추십시오.
아가로즈가 고화되면 금형을 조심스럽게 제거한 다음 최대 1주일 동안 섭씨 4도에 플레이트를 보관하십시오. 그런 다음 제조업체의 지침에 따라 보로실리케이트 유리 모세 혈관과 전극 바늘 풀러에서 바늘을 가져옵니다. 주사 당일, 유리 파이펫을 사용하여 단일 세포 계란을 주사 판으로 옮기고 행당 30~40개의 계란으로 최대 5열의 주사판을 채웁니다.
소량의 생선 계통물로 수분을 공급하는 계란을 유지하십시오. 얼음에 Morpholino를 해동하고 포몰리노의 400 picograms가 긴 마이크로 로더 파이펫 팁을 사용하거나 끝에 2 ~ 4 마이크로 리터 볼러스를 추가하여 계란 당 주입되도록 주입 솔루션을 준비합니다. 모든 바늘이 로드되었을 때, 집게를 사용하여 주사 바늘 끝에서 초과 길이를 손질하고 첫 번째 바늘을 피콜리터 마이크로 인젝터에 연결된 미세 조작기로 장착하십시오.
그런 다음, 분사 접시를 해부 현미경 아래에 놓고 마이크로 조작기를 사용하여 모폴리노 주입 용액 1 나노리터를 노른자에 직접 주입하기 전에 바늘로 각 계란을 관통합니다. CRISPR 주입의 경우, 가이드 RNA 25 피코그램을 CRISPR 관련 단백질 9 메신저 RNA의 300 피코그램과 혼합하고 생성된 RNA 용액의 2나노리터를 각 배아에 주입한다. Tol2 transposase 및 Tol2 측면 플라스미드 주사의 경우 Tol2 메신저 RNA의 마이크로리터 당 25 나노그램과 Tol2 플라스미드 구조의 마이크로리터 당 25 나노그램, RNase 가없는 물에 페놀 레드를 결합합니다.
그런 다음 각 배아에 용액 1 나노리터를 주입하면 방금 입증되었습니다. 모폴리노 주입 후 4일 후 주사시 스크리닝을 하기 위해, 스테레오 현미경으로 물고기 애벌레를 시각화하여 주입된 동물의 표현형을 관찰하거나 비디오 기록을 사용하여 행동을 측정한다. CRISPR indels를 검사하기 위해 CRISPR 주입된 배아를 PCR 튜브로 이송하고 폴리머라제 연쇄 반응 또는 PCR 분석을 위한 표준 DNA 추출 프로토콜에 따라 DNA를 추출합니다.
돌연변이 발생을 평가하려면 3시간 동안 70볼트에서 3%의 아가로즈 젤에 PCR 제품의 5마이크로리터를 실행합니다. 야생형, 비돌연변이 DNA는 뚜렷한 대역을 초래하며 돌연변이 DNA는 얼룩밴드가 생성됩니다. 동굴 제어 모르폴리노주입 멕시코는 스크램블 모폴리노주입된 표면 물고기에 비해 24시간 동안 훨씬 더 많은 운동 활동과 수면 감소를 나타낸다.
저규경 오렉스 소림모폴리노의 주사는 제어 주입 물고기에 비해 표면 물고기의 수면에 거의 영향을 미치지 않습니다. 대조적으로, Morpholino 주입을 통해 hypocretin orexin 녹다운은 동굴 주거 물고기에 있는 잠에 중요한 효력이 있습니다, hypocretin orexin 발현과 잠 손실 사이 직접적인 링크를 제공하. 표면 물고기에서 백색증 유전자 OCA2의 CRPSR 매개 돌연변이 발생은 야생 형 OCA2 양성 대립유전자에 대한 일부 개인 에게 homozygous 결과, 그리고 CRISPR 돌연변이 OCA2 음성 대립 유전자의 두 복사본을 가지고 개인은 albino, 돌연변이 OCA2 유전자 사이의 직접적인 연결을 제공하는 반면, 색소 침착을 항구와 관련이있다.
안정적인 F1 라인을 생성하기 위해 Tol2 전송된 변형유전자에 대한 F0의 포티브를 선택하여 야생 형으로 크로스합니다. 이를 통해 신경 활동의 차이를 밝히고, 동굴 환경의 행동 변화를 중재하고, A mexicanus에서 유전자 기능을 특성화하고 조작하기 위해 많은 추가 전분의 발현을 위한 기초를 마련할 수 있습니다. 기억해야 할 가장 중요한 것은 접시에 계란을 단단히 싣고 바늘을 제대로 다듬고 미세 주입을 최적화하는 것입니다.
성공적인 유전 적 녹다운 후, 유전자 통합, 또는 CRISPR 중재 유전자 편집, 이러한 물고기는 개발, 행동, 및 뇌 활동 분석에 사용할 수 있습니다.
